Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67139

⸱

9 sierpnia 2024

 , 
1Department of Physiology, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Charles and Jane Pak Center for Mineral Metabolism and Clinical Research, University of Texas Southwestern Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy test przesunięcia termicznego, wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, używaną do badania wiązania małych cząsteczek z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Streszczenie

Definiowanie biologicznego znaczenia białek o nieznanych funkcjach stanowi istotną przeszkodę w zrozumieniu procesów komórkowych. Chociaż przewidywania bioinformatyczne i strukturalne przyczyniły się do badań nad nieznanymi białkami, walidacje eksperymentalne in vitro są często utrudnione ze względu na optymalne warunki i kofaktory wymagane do aktywności biochemicznej. Wiązanie kofaktora jest nie tylko niezbędne dla aktywności niektórych enzymów, ale może również zwiększać stabilność termiczną białka. Jednym z praktycznych zastosowań tego zjawiska jest wykorzystanie zmiany stabilności termicznej, mierzonej zmianami temperatury topnienia białka, do badania wiązania ligandów.

Test przesunięcia termicznego (TSA) może być użyty do analizy wiązania różnych ligandów z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub znalezienia warunków stabilizujących do przeprowadzenia eksperymentów, takich jak krystalografia rentgenowska. Tutaj opiszemy protokół TSA wykorzystujący pseudokinazę, selenoproteinę O (SelO), w celu uzyskania prostej i wysokoprzepustowej metody testowania wiązania metalu i nukleotydu. W przeciwieństwie do kinaz kanonicznych, SelO wiąże ATP w odwróconej orientacji, aby katalizować transfer AMP do hydroksylowych łańcuchów bocznych białek w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylacja białek. Wykorzystując zmianę temperatur topnienia, dostarczamy kluczowych informacji na temat interakcji molekularnych leżących u podstaw funkcji SelO.

Wprowadzenie

Znaczna część ludzkiego proteomu pozostaje słabo scharakteryzowana. "Efekt światła ulicznego" opisany przez Dunhama i Kustatschera i in. odnosi się do zjawiska, w którym szeroko badanym białkom poświęca się więcej uwagi, pozostawiając niedobadane białka pomijane1,2. Czynniki przyczyniające się do tego efektu obejmują znaczenie biologiczne i znaczenie chorobowe niektórych białek. Co więcej, wcześniejsze badania, które oferują podstawową wiedzę, a także dostępność narzędzi do analizy funkcjonalnej, dodatkowo stymulują badania nad wysoko zbadanymi białkami1,2. Projekty takie jak Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium i Enzyme Function Initiative mają na celu scharakteryzowanie niedostatecznie badanych białek za pomocą proteomiki strukturalnej i funkcjonalnej2,3,4. Uzupełniającym podejściem do identyfikacji funkcji molekularnych niedostatecznie badanych białek jest badanie interakcji tych białek z małymi cząsteczkami w celu uzyskania cennych informacji na temat regulacji i swoistości substratów.

Wiązanie małych cząsteczek może zwiększyć stabilność termiczną białka5. Zjawisko to, znane jako stabilizacja konformacji indukowana przez ligand, często powoduje wzrost temperatury topnienia białka, co stanowi mierzalne wskazanie wiązania liganda6. Stabilność termiczną białka można zmierzyć za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej (DSF), znanej również jako Thermofluor lub test przesunięcia termicznego (TSA)7,8,9,10. W TSA próbka białka jest poddawana działaniu rosnących temperatur w obecności wrażliwego na środowisko barwnika o wysokiej klasie barwników6. W miarę rozwoju i denaturacji białka barwnik wiąże się z odsłoniętymi hydrofobowymi obszarami białka i emituje fluorescencję. Zewnętrzne barwniki fluorescencyjne lub barwniki wrażliwe na środowisko nie mają wewnętrznej fluorescencji, a zamiast tego fluoryzują po interakcji z cząsteczką docelową9,11,12. Najczęściej stosowany barwnik, SYPRO Orange, oferuje kilka zalet, takich jak zwiększona stabilność i minimalna fluorescencja tła8,9,12. Warto zauważyć, że SYPRO Orange jest kompatybilny z systemami reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) ze względu na długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio około 470 nm i 570 nm. Ta unikalna funkcja pozwala na wykonywanie pomiarów o wysokiej przepustowości, dokładnych i czułych, które są kompatybilne z systemami detekcji fluorescencji powszechnie stosowanymi w systemach RT-PCR8.

TSA to wszechstronne narzędzie do badania interakcji białek z potencjalnymi kofaktorami lub lekami oraz do identyfikowania warunków stabilizujących krystalografię. Niektóre z jej zalet w porównaniu z innymi metodami przesiewowymi to względna prostota konfiguracji i wysoka przepustowość z płytkami 96- lub 384-dołkowymi13,14,15. Rozwój tej techniki był przełomowy dla badań nad odkrywaniem leków, oferując wygodę i umożliwiając badanie różnych dodatków, takich jak jony, ligandy i leki6,16. Co więcej, zdolności adaptacyjne TSA zachęciły naukowców do rozszerzenia jego użyteczności, ułatwiając pomiar powinowactwa wiązania wraz z testami przesiewowymi17,18. TSA jest skutecznym narzędziem w badaniach biologii strukturalnej do identyfikacji warunków, które sprzyjają stabilizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania do krystalizacji19. W związku z tym jego elastyczność i względna łatwość sprawiły, że TSA stała się podstawową techniką w charakterystyce białek. Tutaj użyjemy TSA do analizy wiązania metali i nukleotydów z niedostatecznie zbadaną pseudokinazą, selenoproteiną O (SelO), jako przykładem.

Kinazy są jedną z najbardziej pożądanych rodzin białek w odkrywaniu leków20. Przewiduje się, że około 10% ludzkich kinaz jest nieaktywnych i nazywa się je pseudokinazami, ponieważ brakuje im kluczowych reszt katalitycznych wymaganych do katalizy21,22. Selenoproteina O (SelO) jest ewolucyjnie konserwatywną pseudokinazą, która nie ma konserwatywnego asparaginianu w katalitycznym motywie HRD23. U eukariontów SelO lokalizuje się w mitochondriach i chroni komórki przed stresem oksydacyjnym24,25. Analizy strukturalne i biochemiczne pokazują, że SelO przenosi monofosforan adenozyny (AMP) z ATP do substratów białkowych w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylation25. Ostatnie badania wskazują, że enzymy katalizujące AMPylację mogą wiązać alternatywne nukleotydy, takie jak UTP in vitro26,27. Warto zauważyć, że badania wykazały, że homolog SelO z Salmonella typhimurium katalizuje białko UMPylacja, czyli transfer UMP, w sposób zależny od manganu28. Biorąc pod uwagę te intrygujące obserwacje, testujemy wiązanie SelO z ATP i UTP w obecności magnezu i manganu, służąc jako reprezentatywny przykład zastosowań TSA. Poniższy protokół można łatwo dostosować w celu optymalizacji i zbadania interakcji innych białek i dodatków będących przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konfiguracja eksperymentalna

  1. Użyj termocyklera, który może wykryć fluorescencję, takiego jak instrument RT-PCR, aby wykonać opisany protokół. W przypadku korzystania z SYPRO Orange, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, należy użyć trybu skanowania, który pozwala na wzbudzenie około 470 nm i detekcję emisji około 570 nm. Zaprogramować termocykler tak, aby utrzymywał próbkę w temperaturze 20 °C przez 2 minuty, a następnie wzrastał o 0,5 °C/1 min do 95 °C; mierzyć intensywność fluorescencji co 1 °C.
    UWAGA: Zalecamy opcjonalny krok na końcu cyklu, aby przywrócić blok próbki do temperatury 20 °C (Rysunek 1).
  2. Każda reakcja zawiera cztery składniki: bufor, białko będące przedmiotem zainteresowania, dodatek i zewnętrzny barwnik fluorescencyjny. Zaprojektuj eksperyment tak, aby zawierał kontrole, takie jak brak białka, brak barwnika, białko bez dodatków i same dodatki, aby określić wszelką fluorescencję tła, która może mieć wpływ na interpretację wyników. Jeśli to możliwe, należy dołączyć kontrolę pozytywną, taką jak dodatek, o którym wiadomo, że wiąże i stabilizuje białko będące przedmiotem zainteresowania.
  3. Do testu należy użyć oczyszczonego białka. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, użyj E. coli SelO, wyrażonego i oczyszczonego zgodnie z wcześniejszym opisem25,29. Krótko mówiąc, wyraź SelO oznaczone His-sumo (E. coli SelO ppSumo) w komórkach Rosetta DE3 i oczyść go za pomocą powinowactwa Ni2+-NTA. Rozszczepić znacznik His-sumo za pomocą proteazy Ulp i dalej oczyścić SelO za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.
  4. Fluorescencja SYPRO Orange będzie zależeć od jego interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ponieważ interakcje te będą się różnić w zależności od białka, zoptymalizuj stężenie białka i barwnika, aby uzyskać maksymalny stosunek sygnału do szumu sygnału fluorescencji.
    UWAGA: SYPRO Orange nie jest kompatybilny z niektórymi białkami i dodatkami, takimi jak detergenty11,30. Dodatkowe barwniki zewnętrzne wymienione w 12 mogą być w razie potrzeby badane.

2. Określenie optymalnego stężenia barwnika (Rysunek 2A)

  1. Przygotuj 20 μl rozcieńczeń 50x, 40x, 30x, 20x i 10x SYPRO Orange z roztworu podstawowego, który jest dostarczany w dawce 5,000x w DMSO.
  2. Dozować 8 μl białka 6,25 μM rozcieńczonego w buforze TSA do sześciu oddzielnych dołków 384-dołkowej płytki PCR.
    UWAGA: W naszym przykładzie użyliśmy następującego bufora TSA do przeprowadzenia rozcieńczeń: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT. Próbki można badać w trzech egzemplarzach w celu poprawy wiarygodności wyników.
  3. Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki.
    UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.
  4. Dodać 1 μl każdego seryjnego rozcieńczenia roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka. Dodać 1 μl buforu bez barwnika do ostatniego dołka w celu kontroli bez barwnika.
  5. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
  6. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
  7. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

3. Określenie optymalnego stężenia białka (Rysunek 2B)

  1. Przygotować 20 μl seryjnych rozcieńczeń 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM i 1,56 μM białka przy użyciu buforu TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT).
  2. Dozować 8 μl seryjnych rozcieńczeń białka do pięciu oddzielnych dołków płytki 384-dołkowej.
  3. Dozuj bufor tylko w 6dołku jako kontrola bez białka.
  4. Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki.
    UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.
  5. Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.
  6. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
  7. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
  8. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

4. Przygotowanie eksperymentu TSA (Rysunek 3A)

UWAGA: Po optymalizacji stężenia białka i barwnika SYPRO Orange, test może być przeprowadzony z dodatkiem pożądanych małych cząsteczek w celu analizy wiązania.

  1. Zdefiniuj liczbę warunków, biorąc pod uwagę kontrpróby i odpowiednie kontrole.
    UWAGA: Na przykład przetestujemy wiązanie SelO z ośmioma warunkami w trzech egzemplarzach. Łącznie z kontrolami (bez dodatku, bez białka i bez barwnika) mamy 11 reakcji x 3 (potrójnie) = 33 reakcje ogółem.
  2. W oparciu o optymalne stężenie białka i barwnika obserwowane dla SelO, upewnij się, że każda reakcja zawiera 8 μl białka 6,25 μM, 1 μl dodatku i 1 μl 50x barwnika SYPRO Orange, co daje łącznie 10 μl objętości reakcji. Tak więc końcowe stężenie to 5 μM białka i 5x barwnik SYPRO Orange.
  3. Przygotować 288 μl 6,25 μM roztworu białkowego za pomocą buforu TSA. Ta objętość białkowego roztworu roboczego odpowiada za 36 reakcji (33 reakcje z dodatkowymi 10% dla zmian w pipetowaniu).
  4. Dozuj 8 μl białka 6,25 μM do oddzielnych dołków na płytce 384-dołkowej. Dozować bufor tylko w celu kontroli braku białka.
  5. Dodaj 1 μl małych cząsteczek o stężeniu 10x, aby uzyskać końcowy 1x. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, dodaj 1 μl z 20 mM MgCl2, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Dozować bufor tylko w celu kontroli bez dodatków.
  6. Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.
  7. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
  8. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
  9. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

5. Analiza danych

  1. Eksport danych z urządzenia RT-PCR dla względnych jednostek fluorescencji (RFU) w odniesieniu do temperatury (°C).
  2. Użyj wybranego oprogramowania, aby wyodrębnić i wykreślić punkty danych do najwyższej intensywności zmierzonej dla każdej krzywej topnienia. Co ważne, potwierdź, że kontrole bez białka i bez barwnika wykazują niską fluorescencję tła bez zależnego od temperatury wzrostu fluorescencji (Rysunek 3A, B i tabela uzupełniająca S1). Wykonuj analizę danych za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak MoltenProt31 lub DSFWorld32.
  3. Określ temperaturę topnienia za pomocą Boltzmann Sigmoidal Fit dla danych. Temperatura topnienia (Tm) jest definiowana jako temperatura, w której obserwuje się 50% denaturację lub połowę maksymalnej intensywności (Rysunek 3C).
  4. Przesunięcie termiczne krzywej topnienia może sugerować dodatki stabilizujące lub destabilizujące. Aby obliczyć zmianę temperatury topnienia (Tm), należy skorzystać ze wzoru: Tm = Tm dodatek - Tm bufor. Wartość dodatnia opisuje stan stabilizujący lub dodatek oddziałujący; wartość ujemna opisuje stan destabilizujący (Rysunek 3D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Eukariotyczne SelO składa się z N-końcowej sekwencji kierującej do mitochondriów, domeny przypominającej kinazę oraz silnie konserwowanej selenocysteiny na C-końcu białka23. Ten enzym zlokalizowany w mitochondriach koduje domenę pseudokinazy, która jest konserwowana od bakterii do ludzi23. Analiza strukturalna homologu SelO z Pseudomonas syringae ujawniła zmiany aminokwasowe w centrum aktywnym, które ułatwiają wiązanie ATP w orientacji odwróconej w porównaniu do ka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test przesunięcia termicznego (TSA) służy jako skuteczna metoda badań przesiewowych interakcji białko-ligand, w tym tych z kofaktorami i inhibitorami. W tym protokole użyliśmy TSA do pomiaru wiązania pseudokinazy SelO z nukleotydami i kationami dwuwartościowymi. Nasze odkrycia pokazują, że SelO wykazuje zwiększoną stabilność termiczną w obecności ATP i Mg2+/Mn2+. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że homologi SelO z E. coli, S. cerevisiae i H. sapiens...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

A.S. jest stypendystą W.W. Caruth, Jr. w dziedzinie badań biomedycznych, stypendystą Instytutu Zapobiegania i Badań nad Rakiem w Teksasie (CPRIT) oraz stypendystą Centrum Metabolizmu Minerałów i Badań Klinicznych im. Charlesa i Jane Pak. Prace te były wspierane przez NIH Grant K01DK123194 (AS), CPRIT Grant RR190106 (AS), Welch (I-2046-20200401) i Welch (I-2046-20230405).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrat soli disodowej adenozyno-5&trifosforanuSigma AldrichA2383-10Gużywany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA
Avanti J-15R z zespołem nośnika mikropłytekBeckman CoulterC19416
CFX Opus 384 System PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Płytki, cienkościenne, z listwą przypodłogową, przezroczyste/białeBio-RadHSP3805
Chlorek magnezuSigma AldrichM8266-100Gstosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania TSA
Tetrahydrat chlorku manganu (II)Sigma AldrichM3634-500Gstosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania folii
uszczelniającej do PCR TSA Microseal "B", klej, optycznyBio-RadMSB1001
SYPRO Pomarańczowa plama białkowa w żeluSigma AldrichS5692-500UL
Hydrat soli trisodowej 5&trifosforanuurydyny SigmaAldrich U6625-100MGstosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA

Bibliografia

  1. Dunham, I. Human genes: Time to follow the roads less traveled. PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).
  2. Kustatscher, G., et al. An open invitation to the understudied proteins initiative. Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).
  3. Jones, M. M., et al. The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary. Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).
  4. Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools. J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).
  5. Pace, C. N., Mcgrath, T. Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation. J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).
  6. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  7. Huynh, K., Partch, C. L. Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).
  8. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  9. Wu, T., et al. Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry. bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).
  10. Wu, T., et al. Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments. STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).
  11. Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery. Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).
  12. Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization. Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).
  13. Lucet, I. S., Murphy, J. M. Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay. Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).
  14. Murphy, J. M., et al. A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties. Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).
  15. Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. Thermal denaturation assays in chemical biology. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).
  16. Lo, M. C., et al. Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery. Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).
  17. Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities. Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).
  18. Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry. J Vis Exp. (91), e51809(2014).
  19. Vedadi, M., et al. Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).
  20. Taujale, R., et al. Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome. Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).
  21. Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome. Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).
  22. Kung, J. E., Jura, N. Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases. Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).
  23. Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life. PLoS One. 7 (2), e32138(2012).
  24. Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein. PLoS One. 9 (4), e95518(2014).
  25. Sreelatha, A., et al. Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase. Cell. 175 (3), 809-821 (2018).
  26. Frese, M., et al. The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).
  27. Mostert, D., et al. Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases. Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).
  28. Yang, Y., et al. The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation. Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).
  29. Mukherjee, M., Sreelatha, A. Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog. Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).
  30. Kroeger, T., et al. Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay. PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).
  31. Kotov, V., et al. In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot. Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).
  32. Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data. Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).
  33. Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).
  34. Ribeiro, A. J. M., et al. Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling. Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).
  35. Goldberg, T., Sreelatha, A. Emerging functions of pseudoenzymes. Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).
  36. Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases. IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).
  37. Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure. Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ampylacja białekwiązanie ligandutemperatura topnieniawiązanie nukleotydówwiązanie metaliaktywność pseudokinazywysokoprzepustowe przesiewaniestabilność białek
Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.