Wykorzystanie testu przesunięcia termicznego do badania wiązania substratu z selenoproteiną O

Summary

Tutaj prezentujemy test przesunięcia termicznego, wysokoprzepustową technikę opartą na fluorescencji, używaną do badania wiązania małych cząsteczek z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania.

Abstract

Definiowanie biologicznego znaczenia białek o nieznanych funkcjach stanowi istotną przeszkodę w zrozumieniu procesów komórkowych. Chociaż przewidywania bioinformatyczne i strukturalne przyczyniły się do badań nad nieznanymi białkami, walidacje eksperymentalne in vitro są często utrudnione ze względu na optymalne warunki i kofaktory wymagane do aktywności biochemicznej. Wiązanie kofaktora jest nie tylko niezbędne dla aktywności niektórych enzymów, ale może również zwiększać stabilność termiczną białka. Jednym z praktycznych zastosowań tego zjawiska jest wykorzystanie zmiany stabilności termicznej, mierzonej zmianami temperatury topnienia białka, do badania wiązania ligandów.

Test przesunięcia termicznego (TSA) może być użyty do analizy wiązania różnych ligandów z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania lub znalezienia warunków stabilizujących do przeprowadzenia eksperymentów, takich jak krystalografia rentgenowska. Tutaj opiszemy protokół TSA wykorzystujący pseudokinazę, selenoproteinę O (SelO), w celu uzyskania prostej i wysokoprzepustowej metody testowania wiązania metalu i nukleotydu. W przeciwieństwie do kinaz kanonicznych, SelO wiąże ATP w odwróconej orientacji, aby katalizować transfer AMP do hydroksylowych łańcuchów bocznych białek w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylacja białek. Wykorzystując zmianę temperatur topnienia, dostarczamy kluczowych informacji na temat interakcji molekularnych leżących u podstaw funkcji SelO.

Introduction

Znaczna część ludzkiego proteomu pozostaje słabo scharakteryzowana. "Efekt światła ulicznego" opisany przez Dunhama i Kustatschera i in. odnosi się do zjawiska, w którym szeroko badanym białkom poświęca się więcej uwagi, pozostawiając niedobadane białka pomijane^1,2. Czynniki przyczyniające się do tego efektu obejmują znaczenie biologiczne i znaczenie chorobowe niektórych białek. Co więcej, wcześniejsze badania, które oferują podstawową wiedzę, a także dostępność narzędzi do analizy funkcjonalnej, dodatkowo stymulują badania nad wysoko zbadanymi białkami^1,2. Projekty takie jak Understudy Proteins Initiative, Structural Genomics Consortium i Enzyme Function Initiative mają na celu scharakteryzowanie niedostatecznie badanych białek za pomocą proteomiki strukturalnej i funkcjonalnej^2,3,4. Uzupełniającym podejściem do identyfikacji funkcji molekularnych niedostatecznie badanych białek jest badanie interakcji tych białek z małymi cząsteczkami w celu uzyskania cennych informacji na temat regulacji i swoistości substratów.

Wiązanie małych cząsteczek może zwiększyć stabilność termiczną białka⁵. Zjawisko to, znane jako stabilizacja konformacji indukowana przez ligand, często powoduje wzrost temperatury topnienia białka, co stanowi mierzalne wskazanie wiązania liganda⁶. Stabilność termiczną białka można zmierzyć za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej (DSF), znanej również jako Thermofluor lub test przesunięcia termicznego (TSA)^7,8,9,10. W TSA próbka białka jest poddawana działaniu rosnących temperatur w obecności wrażliwego na środowisko barwnika o wysokiej klasie barwników6. W miarę rozwoju i denaturacji białka barwnik wiąże się z odsłoniętymi hydrofobowymi obszarami białka i emituje fluorescencję. Zewnętrzne barwniki fluorescencyjne lub barwniki wrażliwe na środowisko nie mają wewnętrznej fluorescencji, a zamiast tego fluoryzują po interakcji z cząsteczką docelową^9,11,12. Najczęściej stosowany barwnik, SYPRO Orange, oferuje kilka zalet, takich jak zwiększona stabilność i minimalna fluorescencja tła^8,9,12. Warto zauważyć, że SYPRO Orange jest kompatybilny z systemami reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR) ze względu na długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio około 470 nm i 570 nm. Ta unikalna funkcja pozwala na wykonywanie pomiarów o wysokiej przepustowości, dokładnych i czułych, które są kompatybilne z systemami detekcji fluorescencji powszechnie stosowanymi w systemach RT-PCR⁸.

TSA to wszechstronne narzędzie do badania interakcji białek z potencjalnymi kofaktorami lub lekami oraz do identyfikowania warunków stabilizujących krystalografię. Niektóre z jej zalet w porównaniu z innymi metodami przesiewowymi to względna prostota konfiguracji i wysoka przepustowość z płytkami 96- lub 384-dołkowymi^13,14,15. Rozwój tej techniki był przełomowy dla badań nad odkrywaniem leków, oferując wygodę i umożliwiając badanie różnych dodatków, takich jak jony, ligandy i leki^6,16. Co więcej, zdolności adaptacyjne TSA zachęciły naukowców do rozszerzenia jego użyteczności, ułatwiając pomiar powinowactwa wiązania wraz z testami przesiewowymi^17,18. TSA jest skutecznym narzędziem w badaniach biologii strukturalnej do identyfikacji warunków, które sprzyjają stabilizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania do krystalizacji¹⁹. W związku z tym jego elastyczność i względna łatwość sprawiły, że TSA stała się podstawową techniką w charakterystyce białek. Tutaj użyjemy TSA do analizy wiązania metali i nukleotydów z niedostatecznie zbadaną pseudokinazą, selenoproteiną O (SelO), jako przykładem.

Kinazy są jedną z najbardziej pożądanych rodzin białek w odkrywaniu leków²⁰. Przewiduje się, że około 10% ludzkich kinaz jest nieaktywnych i nazywa się je pseudokinazami, ponieważ brakuje im kluczowych reszt katalitycznych wymaganych do katalizy^21,22. Selenoproteina O (SelO) jest ewolucyjnie konserwatywną pseudokinazą, która nie ma konserwatywnego asparaginianu w katalitycznym motywie HRD²³. U eukariontów SelO lokalizuje się w mitochondriach i chroni komórki przed stresem oksydacyjnym^24,25. Analizy strukturalne i biochemiczne pokazują, że SelO przenosi monofosforan adenozyny (AMP) z ATP do substratów białkowych w modyfikacji potranslacyjnej znanej jako AMPylation²⁵. Ostatnie badania wskazują, że enzymy katalizujące AMPylację mogą wiązać alternatywne nukleotydy, takie jak UTP in vitro^26,27. Warto zauważyć, że badania wykazały, że homolog SelO z Salmonella typhimurium katalizuje białko UMPylacja, czyli transfer UMP, w sposób zależny od manganu²⁸. Biorąc pod uwagę te intrygujące obserwacje, testujemy wiązanie SelO z ATP i UTP w obecności magnezu i manganu, służąc jako reprezentatywny przykład zastosowań TSA. Poniższy protokół można łatwo dostosować w celu optymalizacji i zbadania interakcji innych białek i dodatków będących przedmiotem zainteresowania.

Protocol

1. Konfiguracja eksperymentalna

1. Użyj termocyklera, który może wykryć fluorescencję, takiego jak instrument RT-PCR, aby wykonać opisany protokół. W przypadku korzystania z SYPRO Orange, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, należy użyć trybu skanowania, który pozwala na wzbudzenie około 470 nm i detekcję emisji około 570 nm. Zaprogramować termocykler tak, aby utrzymywał próbkę w temperaturze 20 °C przez 2 minuty, a następnie wzrastał o 0,5 °C/1 min do 95 °C; mierzyć intensywność fluorescencji co 1 °C.
   UWAGA: Zalecamy opcjonalny krok na końcu cyklu, aby przywrócić blok próbki do temperatury 20 °C (Rysunek 1).
2. Każda reakcja zawiera cztery składniki: bufor, białko będące przedmiotem zainteresowania, dodatek i zewnętrzny barwnik fluorescencyjny. Zaprojektuj eksperyment tak, aby zawierał kontrole, takie jak brak białka, brak barwnika, białko bez dodatków i same dodatki, aby określić wszelką fluorescencję tła, która może mieć wpływ na interpretację wyników. Jeśli to możliwe, należy dołączyć kontrolę pozytywną, taką jak dodatek, o którym wiadomo, że wiąże i stabilizuje białko będące przedmiotem zainteresowania.
3. Do testu należy użyć oczyszczonego białka. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, użyj E. coli SelO, wyrażonego i oczyszczonego zgodnie z wcześniejszym opisem^25,29. Krótko mówiąc, wyraź SelO oznaczone His-sumo (E. coli SelO ppSumo) w komórkach Rosetta DE3 i oczyść go za pomocą powinowactwa Ni²⁺-NTA. Rozszczepić znacznik His-sumo za pomocą proteazy Ulp i dalej oczyścić SelO za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.
4. Fluorescencja SYPRO Orange będzie zależeć od jego interakcji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Ponieważ interakcje te będą się różnić w zależności od białka, zoptymalizuj stężenie białka i barwnika, aby uzyskać maksymalny stosunek sygnału do szumu sygnału fluorescencji.
   UWAGA: SYPRO Orange nie jest kompatybilny z niektórymi białkami i dodatkami, takimi jak detergenty^11,30. Dodatkowe barwniki zewnętrzne wymienione w ¹² mogą być w razie potrzeby badane.

2. Określenie optymalnego stężenia barwnika (Rysunek 2A)

1. Przygotuj 20 μl rozcieńczeń 50x, 40x, 30x, 20x i 10x SYPRO Orange z roztworu podstawowego, który jest dostarczany w dawce 5,000x w DMSO.
2. Dozować 8 μl białka 6,25 μM rozcieńczonego w buforze TSA do sześciu oddzielnych dołków 384-dołkowej płytki PCR.
   UWAGA: W naszym przykładzie użyliśmy następującego bufora TSA do przeprowadzenia rozcieńczeń: 10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT. Próbki można badać w trzech egzemplarzach w celu poprawy wiarygodności wyników.
3. Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki.
   UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.
4. Dodać 1 μl każdego seryjnego rozcieńczenia roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka. Dodać 1 μl buforu bez barwnika do ostatniego dołka w celu kontroli bez barwnika.
5. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
6. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
7. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

3. Określenie optymalnego stężenia białka (Rysunek 2B)

1. Przygotować 20 μl seryjnych rozcieńczeń 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM i 1,56 μM białka przy użyciu buforu TSA (10 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl i 1 mM DTT).
2. Dozować 8 μl seryjnych rozcieńczeń białka do pięciu oddzielnych dołków płytki 384-dołkowej.
3. Dozuj bufor tylko w 6^dołku jako kontrola bez białka.
4. Dodać 1 μl buforu TSA do każdej studzienki.
   UWAGA: Ta objętość buforu zostanie zastąpiona dodaniem małych cząsteczek po optymalizacji stężenia barwnika i białka.
5. Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.
6. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
7. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
8. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

4. Przygotowanie eksperymentu TSA (Rysunek 3A)

UWAGA: Po optymalizacji stężenia białka i barwnika SYPRO Orange, test może być przeprowadzony z dodatkiem pożądanych małych cząsteczek w celu analizy wiązania.

1. Zdefiniuj liczbę warunków, biorąc pod uwagę kontrpróby i odpowiednie kontrole.
   UWAGA: Na przykład przetestujemy wiązanie SelO z ośmioma warunkami w trzech egzemplarzach. Łącznie z kontrolami (bez dodatku, bez białka i bez barwnika) mamy 11 reakcji x 3 (potrójnie) = 33 reakcje ogółem.
2. W oparciu o optymalne stężenie białka i barwnika obserwowane dla SelO, upewnij się, że każda reakcja zawiera 8 μl białka 6,25 μM, 1 μl dodatku i 1 μl 50x barwnika SYPRO Orange, co daje łącznie 10 μl objętości reakcji. Tak więc końcowe stężenie to 5 μM białka i 5x barwnik SYPRO Orange.
3. Przygotować 288 μl 6,25 μM roztworu białkowego za pomocą buforu TSA. Ta objętość białkowego roztworu roboczego odpowiada za 36 reakcji (33 reakcje z dodatkowymi 10% dla zmian w pipetowaniu).
4. Dozuj 8 μl białka 6,25 μM do oddzielnych dołków na płytce 384-dołkowej. Dozować bufor tylko w celu kontroli braku białka.
5. Dodaj 1 μl małych cząsteczek o stężeniu 10x, aby uzyskać końcowy 1x. Aby postępować zgodnie z tym przykładem, dodaj 1 μl z 20 mM MgCl₂, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mM. Dozować bufor tylko w celu kontroli bez dodatków.
6. Dodaj 1 μl każdego 50x roztworu barwnika SYPRO Orange do każdego dołka.
7. Przykryj płytkę optycznie przezroczystą folią samoprzylepną.
8. Krótko odwirować płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę w wirówce wyposażonej w adapter płytki PCR.
9. Umieść płytkę w maszynie RT-PCR i uruchom protokół termocyklingu opisany w kroku 1.1.

5. Analiza danych

1. Eksport danych z urządzenia RT-PCR dla względnych jednostek fluorescencji (RFU) w odniesieniu do temperatury (°C).
2. Użyj wybranego oprogramowania, aby wyodrębnić i wykreślić punkty danych do najwyższej intensywności zmierzonej dla każdej krzywej topnienia. Co ważne, potwierdź, że kontrole bez białka i bez barwnika wykazują niską fluorescencję tła bez zależnego od temperatury wzrostu fluorescencji (Rysunek 3A, B i tabela uzupełniająca S1). Wykonuj analizę danych za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania, takiego jak MoltenProt³¹ lub DSFWorld³².
3. Określ temperaturę topnienia za pomocą Boltzmann Sigmoidal Fit dla danych. Temperatura topnienia (T_m) jest definiowana jako temperatura, w której obserwuje się 50% denaturację lub połowę maksymalnej intensywności (Rysunek 3C).
4. Przesunięcie termiczne krzywej topnienia może sugerować dodatki stabilizujące lub destabilizujące. Aby obliczyć zmianę temperatury topnienia (T_m), należy skorzystać ze wzoru: T_m = T_m dodatek _- T_m bufor. Wartość dodatnia opisuje stan stabilizujący lub dodatek oddziałujący; wartość ujemna opisuje stan destabilizujący (Rysunek 3D).

Results

Eukariotyczny SelO składa się z N-końcowej sekwencji ukierunkowanej na mitochondria, domeny podobnej do kinazy i wysoce konserwatywnej selenocysteiny na C-końcu białka²³. Ten enzym rezydujący w mitochondriach koduje domenę pseudokinazy, która jest zachowana od bakterii do ludzi²³. Analiza strukturalna homologu SelO z Pseudomonas syringae ujawniła zmiany aminokwasowe w miejscu aktywnym, które ułatwiają wiązanie ATP w orientacji odwróconej w porównaniu z kinazami kanonicznymi²⁵. W związku z tym SelO katalizuje AMPylację, a nie fosforylację, wielu białek biorących udział w sygnalizacji antyoksydacyjnej w celu ochrony komórek przed uszkodzeniem oksydacyjnym i śmiercią komórki²⁵. Oprócz AMPylacji, wykazano, że niektóre prokariotyczne i eukariotyczne AMPylazy katalizują UMPylację^27,28.

Użyliśmy oczyszczonego rekombinowanego E. coli SelO w TSA, aby zbadać wiązanie nukleotydów ATP i UTP z SelO w obecności kationów dwuwartościowych. Podobnie jak kinazy kanoniczne, SelO zawiera motyw DFG, w którym asparaginian wiąże jon metalu, aby koordynować nukleotyd w miejscu aktywnym. Po pierwsze, zoptymalizowaliśmy stężenie białka i barwnika dla solidnych pomiarów fluorescencji w TSA, określając, że od 5 μM do 10 μM E. coli SelO było optymalne dla 5x SYPRO Orange (Rysunek 2). Co więcej, wykazaliśmy, że białko no, jak również grupa kontrolna bez barwnika, miały sygnał o niskiej fluorescencji, który nie reagował na wzrost temperatury. Wykryliśmy około +4 °C i +12 °C wzrostu stabilności termicznej E. coli SelO w obecności odpowiednio ATP-Mg²⁺ i ATP-Mn²⁺ (Rysunek 3). Nie zaobserwowaliśmy jednak zmiany stabilności termicznej po inkubacji z UTP, co wskazuje, że E. coli SelO może nie wykazywać wykrywalnego wiązania z UTP.

Rysunek 1: Konfiguracja termocyklera. Przykład programu termocyklera służącego do zwiększania temperatury próbki o +0,5 °C/min podczas pomiaru fluorescencji SYPRO Orange za pomocą kanału FRET. Zalecenie obejmuje również inkubację w temperaturze otoczenia na początku i na końcu protokołu. Skrót: FRET = transfer energii rezonansu Förstera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Optymalizacja stężeń białek i barwników. (A) Reprezentatywne wyniki optymalizacji stężenia barwnika SYPRO Orange przy użyciu 5 μM Escherichia coli SelO. (B) Reprezentatywne wyniki optymalizacji stężenia E. coli SelO przy użyciu 5x barwnika SYPRO Orange. Krzywa denaturacji termicznej przedstawia względne jednostki fluorescencji (oś y) w odniesieniu do temperatury (oś x). Wyniki reprezentują średnią ± SD z trzech dołków (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Termiczne krzywe denaturacji i analizy ΔT_m SelO w obecności nukleotydów i kationów dwuwartościowych. (A) Surowe dane krzywych denaturacji termicznej próbek (5 μM Escherichia coli SelO w obecności 200 μM ATP lub UTP i 2 mM kationów dwuwartościowych, 5x SYPRO Orange) wyeksportowanych z maszyny RT-PCR i wykreślonych. SelO ATP-Mg reprezentuje próbki z SelO, ATP i MgCl₂, SelO ATP-Mn reprezentuje próbki z SelO, ATP i MnCl₂, SelO UTP-Mg reprezentuje próbki z SelO, UTP i MgCl₂, SelO UTP-Mn reprezentuje próbki z SelO, UTP i MnCl₂. Należy pamiętać, że kontrole bez barwnika i białka wykazują niską fluorescencję. Wyniki reprezentują średnią ± SD z trzech dołków (n = 3). (B) Krzywe denaturacji termicznej wykreślone z najwyższą intensywnością i zgodne z równaniem sigmoidalnym Boltzmanna. Chociaż UTP nie miała wpływu na denaturację termiczną SelO, zaobserwowaliśmy wyraźną zmianę w denaturacji termicznej w obecności ATP (fioletowe krzywe). Wyniki reprezentują średnią ± SD z trzech dołków (n = 3). (C) Histogram przedstawiający wartości T_m wynikające z dopasowania sigmoidalnego Boltzmanna danych reprezentowanych w Rysunek 3B. Wyniki reprezentują średnią ± SD z trzech dołków (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histogram przedstawiający zmianę temperatury topnienia ΔT_m (dodatek T_{m –} bufor T_m). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Przykładowe dane dla TSA SelO w obecności metali i nukleotydów. Arkusz kalkulacyjny z surowymi danymi wyeksportowanymi z maszyny RT-PCR oraz danymi przetworzonymi w celu usunięcia wartości po maksymalnej intensywności RFU, zgodnie z opisem w krokach protokołu 5.1 i 5.2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Test przesunięcia termicznego (TSA) służy jako skuteczna metoda badań przesiewowych interakcji białko-ligand, w tym tych z kofaktorami i inhibitorami. W tym protokole użyliśmy TSA do pomiaru wiązania pseudokinazy SelO z nukleotydami i kationami dwuwartościowymi. Nasze odkrycia pokazują, że SelO wykazuje zwiększoną stabilność termiczną w obecności ATP i Mg²⁺/Mn²⁺. Obserwacja ta jest zgodna z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że homologi SelO z E. coli, S. cerevisiae i H. sapiens katalizują przenoszenie AMP z ATP do hydroksylowego łańcucha bocznego substratów białkowych^25,29. Chociaż TSA dostarcza cennych informacji na temat wiązania nukleotydów, może nie zidentyfikować substratu in vivo. Inne cząsteczki, nie tylko substrat, mogą również wpływać na stabilność termiczną białka. Aby dokładnie zidentyfikować substrat, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak stężenie komórkowe i powinowactwo wiązania. Niemniej jednak TSA jest doskonałym narzędziem do badań przesiewowych szerokiego zakresu warunków, takich jak wiązanie małych cząsteczek, przy użyciu stabilizacji termicznej jako odczytu.

Użyteczność TSA wykracza poza jej zastosowanie w analizie wiązania małych cząsteczek z aktywnymi lub regulatorowymi miejscami białek. TSA znacząco przyczyniło się do biofizycznej charakterystyki białek, zapewniając warunki stabilizujące, które sprawiają, że białko bardziej sprzyja eksperymentom krystalograficznym. Warto zauważyć, że TSA oferuje kilka zalet, w tym prostą konfigurację i wysoką przepustowość przy użyciu powszechnie dostępnych materiałów laboratoryjnych, takich jak płytki PCR i maszyny RT-PCR. Te zalety pozwalają na testowanie wielu warunków, które mogą być niewykonalne lub tak proste przy użyciu innych technik. W wielu badaniach wykorzystano TSA do pomiaru stabilności termicznej rekombinowanych białek z biblioteką związków w celu określenia optymalnych warunków krystalizacji białek^19,33.

Włączenie odpowiednich kontroli jest konieczne, aby uniknąć błędnej interpretacji krzywych topnienia, przy czym autofluorescencja z płytek lub dodatków jest powszechnym problemem. TSA może nie być odpowiedni dla związków, które wykazują autofluorescencję lub wygaszają fluorescencję pomarańczy SYPRO. Potencjalnym rozwiązaniem jest badanie przesiewowe alternatywnych barwników opisanych w ^{punkcie 12}. Przedstawiony tutaj protokół TSA można łatwo dostosować do innych białek i dodatków będących przedmiotem zainteresowania. Dodatki nie ograniczają się wyłącznie do związków rozpuszczalnych w wodzie, jak wykazano w naszym protokole z nukleotydami i kationami dwuwartościowymi. Zamiast tego dodatki mogą obejmować szeroki zakres warunków, takich jak zmienne pH, ligandy lub leki rozpuszczone w DMSO⁸. Co więcej, preinkubacja liganda z białkiem może zapewnić bardziej powtarzalne wyniki poprzez zmniejszenie zakłóceń i artefaktów z barwnika. Dodatki, takie jak lipidy i detergenty, mogą prowadzić do wysokiej fluorescencji ze względu na ich interakcje z SYPRO Orange. Przykład krzywej denaturacji pokazano na rysunku 3A , który przedstawia niską fluorescencję tła w połączeniu ze znacznym wzrostem fluorescencji po denaturacji termicznej białka. Optymalne stężenie barwnika i białka zapewni maksymalny stosunek sygnału do szumu przy jednoczesnym utrzymaniu spójnego sygnału fluorescencji we wszystkich powtórzeniach.

TSA oferuje tę zaletę, że jest prostota z minimalną liczbą komponentów, zmniejszając w ten sposób liczbę zmiennych do optymalizacji. Krytyczne kroki obejmują określenie optymalnych stężeń zarówno barwnika, jak i białka. Ważne jest, aby pamiętać, że TSA wymaga oczyszczonego, "dobrze zachowującego się" białka. Białko i dodatek muszą być stabilne w buforze przy stężeniach stosowanych w TSA. Białka lub warunki, które są podatne na agregację lub oligomeryzację, mogą powodować błędne odczyty fluorescencji. Zagregowane lub niesfałdowane białka mogą początkowo wykazywać wysoką fluorescencję z niewielkim wzrostem po denaturacji. Oligomeryzacja białek może również powodować wiele stanów przejściowych, co komplikuje analizę¹⁰. Stężenie białka można precyzyjnie dostosować, aby zapobiec agregacji.

TSA jest kompatybilny z szeroką gamą i soli, co pozwala na optymalizację warunków stabilizacji białka i dodatku¹¹. Objętości roztworów białek i dodatków mogą być dostosowane w celu przezwyciężenia ograniczeń stężeń białek i dodatków. Na przykład zamiast 10-krotnego roztworu stosowanego w reprezentatywnych wynikach można zastosować niższe stężenia dodatku, takie jak 5x. Warto zauważyć, że względna ilość białka i dodatku wymagana do przeprowadzenia testu jest niska, ponieważ 384-dołkowe płytki PCR mogą pomieścić objętości tak niskie, jak 10 μl całkowitej próbki.

Biorąc pod uwagę mocne strony TSA, idealnie nadaje się do badania niedostatecznie zbadanych białek, takich jak pseudokinazy. Pseudoenzymy to katalitycznie nieaktywne białka, które są strukturalnie homologiczne do aktywnych enzymów³⁴. Ostatnie badania strukturalne i biochemiczne wykazały, że kilka pseudoenzymów jest enzymami aktywnymi, podczas gdy większość z nich pełni funkcje niekatalityczne^35,36. Chociaż katalitycznie nieaktywne, pseudoenzymy są zaangażowane w różne choroby i odgrywają ważną rolę, w tym rusztowanie i modulację allosteryczną³⁷. Jednak mechanizm działania i znaczenie funkcjonalne wielu pseudoenzymów są nieznane. Aktywność niektórych pseudoenzymów jest regulowana przez wiązanie ligandów, co skutkuje zwiększoną stabilnością termiczną, co jest związane ze zmianami konformacyjnymi białka¹⁴. Sugerujemy, że TSA jest cennym narzędziem do badania wiązania ligandów z pseudoenzymami w celu określenia optymalnego liganda dla aktywności funkcjonalnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydrat soli disodowej adenozyno-5&trifosforanu	Sigma Aldrich	A2383-10G	używany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA
Avanti J-15R z zespołem nośnika mikropłytek	Beckman Coulter	C19416
CFX Opus 384 System PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	12011452
Hard-Shell 384-Well PCR Płytki, cienkościenne, z listwą przypodłogową, przezroczyste/białe	Bio-Rad	HSP3805
Chlorek magnezu	Sigma Aldrich	M8266-100G	stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania TSA
Tetrahydrat chlorku manganu (II)	Sigma Aldrich	M3634-500G	stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale niewymagany do wykonania folii
uszczelniającej do PCR TSA Microseal "B", klej, optyczny	Bio-Rad	MSB1001
SYPRO Pomarańczowa plama białkowa w żelu	Sigma Aldrich	S5692-500UL
Hydrat soli trisodowej 5&trifosforanu	urydyny Sigma	Aldrich U6625-100MG	stosowany do uzyskania reprezentatywnych wyników, ale nie jest wymagany do wykonania TSA