Artykuł metodologiczny

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67141

⸱

12 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Streszczenie

Wapń jest ważną cząsteczką sygnałową podczas przejścia z oocytu do zarodka (OET) i wczesnej embriogenezy. Nicień hermafrodytyczny Caenorhabditis elegans zapewnia kilka unikalnych zalet w badaniu OET, ponieważ jest przezroczysty i ma uporządkowaną gonadę, która wytwarza jeden dojrzały oocyt co ~ 23 minuty w temperaturze 20 °C. Zmodyfikowaliśmy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia jGCaMP7s tak, aby fluorescencyjnie wskazywał moment zapłodnienia w żywym organizmie. Nazwaliśmy ten reporter "CaFE" dla wapnia podczas nawożenia u C. elegans. Reporter CaFE został zaprojektowany jako locus bezpiecznej przystani w pojedynczej kopii, nie ma znaczącego wpływu na fizjologię ani płodność, a po zapłodnieniu wytwarza silny sygnał. W tym miejscu przedstawiono szereg protokołów wykorzystania reportera CaFE jako narzędzia in vivo do analizy OET i embriogenezy. Uwzględniamy metody synchronizacji robaków, badania skutków knockdownu RNAi, montowania robaków do obrazowania oraz wizualizacji wapnia w oocytach i zarodkach. Dodatkowo przedstawiamy generację dodatkowych szczepów robaków, które mają pomóc w tego typu analizach. Demonstrując przydatność reportera CaFE do wizualizacji czasu zapłodnienia, informujemy, że podwójna owulacja występuje, gdy ipp-5 jest celem RNAi i że tylko pierwszy oocyt ulega natychmiastowemu zapłodnieniu. Co więcej, odkrycie jednokomórkowych stanów przejściowych wapnia podczas wczesnej embriogenezy zostało tutaj przedstawione, co pokazuje, że reporter CaFE utrzymuje się we wczesnym rozwoju. Co ważne, narzędzie do zgłaszania CaFE w robakach jest na tyle proste, że można je włączyć do zajęć laboratoryjnych w ramach badań licencjackich opartych na kursach (CURE). Reporter CaFE, w połączeniu z uporządkowaną gonadą i łatwością RNAi u robaków, ułatwia badanie dynamiki komórka-komórka wymaganej do regulacji wewnętrznego zapłodnienia i wczesnej embriogenezy.

Wprowadzenie

Zapłodnienie oznacza początek nowego cyklu życia, ale określenie dokładnego momentu zapłodnienia jest trudne. Zachowaną cechą zapłodnienia jest fala wapnia przez oocyt bezpośrednio po fuzji plemników1. Chociaż charakter fali wapniowej, pod względem częstotliwości i prędkości, różni się w zależności od gatunku, prawie wszystkie organizmy wykazują przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia po zapłodnieniu. Fala wapniowa odgrywa kluczową rolę w blokowaniu polispermii, aktywacji komórek jajowych i innych ważnych zdarzeń komórkowych2. Ponieważ fala wapniowa inicjuje się w miejscu fuzji plemników, wapń służy jako marker zapłodnienia3.

Caenorhabditis elegans to idealny organizm modelowy do badania wczesnego rozwoju. Robaki są przezroczystymi hermafrodytami, które są genetycznie podatne na manipulacje4. Co najważniejsze dla badań nad zapłodnieniem, dorosłe osobniki C. elegans w sposób ciągły wytwarzają oocyty przy użyciu ściśle uporządkowanej gonad5. W rzeczywistości oocyty są jedynymi nowymi komórkami produkowanymi, ponieważ soma jest postmitotyczna w wieku dorosłym6. Rysunek 1 przedstawia gonadę, która składa się z 2 symetrycznych jajówek w kształcie litery U. Oocyt znajdujący się najbliżej spermateki (narządu magazynującego plemniki) jest określany jako oocyt -1. Ta konstrukcja linii montażowej gonady robaka owuluje dojrzały oocyt do spermateki co ~23 minuty w temperaturze 20 °C u młodych dorosłych7. Nowo zapłodniony zarodek następnie przenosi się do wspólnej macicy, zanim zostanie złożony przez pojedynczy srom.

Poprzednie techniki wizualizacji wapnia podczas nawożenia u C. elegans polegały na mikroiniekcji barwników wrażliwych na wapń3,8. Aby łatwiej zobaczyć falę wapniową po fuzji plemnika z jajem, genetycznie kodowany wskaźnik wapnia oparty na jGCaMP7s został wstawiony w pojedynczej kopii w locus bezpiecznej przystani przy użyciu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)7,9. Reporter został nazwany CaFE dla wapnia podczas nawożenia u C. elegans. Osoba zgłaszająca nie wykazuje istotnych wad fizjologii ani płodności.

Tutaj przedstawione są protokoły wizualizacji fali wapniowej w oocytach i zarodkach C. elegans za pomocą reportera CaFE. W połączeniu z niezliczonymi narzędziami dostępnymi w społeczności robaków, takimi jak interferencja RNA (RNAi) i markery gonad mCherry, reporter CaFE ułatwia badanie regulacji wewnętrznych zdarzeń zapłodnienia, w szczególności kompetencji nawożenia i czasu nawożenia. Dodatkowo, reporter CaFE utrzymuje się we wczesnym rozwoju i jest unikalnym narzędziem do badania embriogenezy.

Protokół

1. C. elegans hodowla

  1. Przygotowanie płytek z pożywką dla nicieni (Nematode Growth Medium, NGM)
    1. W kolbie o pojemności 4 L połączyć 3 g chlorku sodu (NaCl), 2,5 g Bacto-Peptonu, 20 g agaru oraz 1 L wody dejonizowanej (patrz Tabela materiałów). Przed autoklawowaniem przykryć wlot kolby folią aluminiową.
    2. Sterylizować w autoklawie, korzystając z ustawień cyklu sterylizacji cieczy. Zaleca się cykl sterylizacji w temperaturze 121 °C przez 30 min.
    3. Pozostawić mieszaninę do ochłodzenia do temperatury ~50 °C, co zajmuje około 20 min w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Dodać 25 mL sterylnego 1 M KH2PO4 (rozpuszczonego w wodzie, pH = 6), 1 mL sterylnego 1 M CaCl2 (rozpuszczonego w wodzie), 1 mL sterylnego 1 M MgSO4 (rozpuszczonego w wodzie) oraz 1 mL cholesterolu w stężeniu 5 mg/mL (rozpuszczonego w 100% etanolu), delikatnie mieszając po każdym dodaniu (patrz Tabela materiałów).
    5. Stosując technikę sterylną, przenieść część mieszaniny do sterylnego zlewki o pojemności 300 mL w celu ułatwienia nalewania. Wylać ciepłą pożywkę tak, aby pokryła dno płytki.
      UWAGA: Około 10 mL na płytkę w sterylnych płytkach Petri o wymiarach 60 mm x 15 mm (patrz Tabela materiałów) pozwoli na przygotowanie 100 płytek. Alternatywnie można użyć sterylnych płytek Petri o wymiarach 35 mm x 10 mm, gdzie ~4 mL na płytkę pozwoli na przygotowanie ~250 płytek.
    6. Pozostawić płytki NGM do wyschnięcia w temperaturze RT przez co najmniej 1 dobę przed wysianiem bakterii. Przechowywać płytki odwrócone dnem do góry w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.
  2. Przygotowanie trawnika bakteryjnego OP50
    1. Przygotować bulion Luria Broth (LB), łącząc 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g Bacto-Tryptonu, 5 g NaCl i 1 L wody dejonizowanej w kolbie o pojemności 2 L (patrz Tabela materiałów). Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego i magnesu do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Rozlać LB do butelek i wysterylizować w autoklawie, korzystając z ustawień cyklu sterylizacji cieczy. Zaleca się cykl sterylizacji w temperaturze 121 °C przez 30 min. W przypadku użycia pojemnika z zakrętką śrubową, należy ją poluzować o ćwierć obrotu, aby zapewnić właściwą wentylację podczas cyklu autoklawowania.
    3. Pozostawić bulion do ochłodzenia do temperatury RT przed użyciem.
    4. Stosując technikę sterylną, zaszczepić 50 mL LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 mL bakteriami OP50 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
    5. Stosując technikę sterylną, przenieść 300 μL nasyconej kultury na środek płytki NGM 60 mm x 15 mm. Dla płytek 35 mm x 10 mm zaleca się użycie 100 μL nasyconej kultury.
    6. Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze RT przez 1-3 dni, aż plamka bakteryjna OP50 przestanie być płynna. Przed użyciem upewnić się, że płytki są suche i wolne od zanieczyszczeń. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia. Przechowywanie płytek odwróconych dnem do góry ogranicza kondensację na powierzchni płytki.
  3. Konstrukcja pęsety do nicieni (worm pick)
    1. Poluzować srebrną obręczą w stronę głowicy uchwytu pęsety (patrz Tabela materiałów), delikatnie odkręcając, aż cztery sekcje rozdzielą się.
    2. Odciąć nożyczkami odcinek drutu platynowego (patrz Tabela materiałów) o długości 1,5 cala (około długości kciuka) i umieścić go pośrodku czterech sekcji; około cal drutu powinien wystawać z uchwytu.
    3. Przytrzymać drut w centrum podczas dokręcania obręczy; cztery sekcje złączą się na środku i utrzymają drut platynowy na miejscu.
    4. Ostrożnie uformować drut za pomocą szczypiec płaskich. Kształt tęczy lub łuku zazwyczaj sprawdza się najlepiej podczas pobierania.
    5. Utworzyć na końcu drutu „stopkę” o długości około 2-3 mm poprzez kilkukrotne dociśnięcie szczypcami płaskimi. Używać tej „stopki” do podnoszenia nicieni, utrzymując ją płasko przy powierzchni płytki.
      UWAGA: Zbyt mocne dociśnięcie może przeciąć drut platynowy. Należy unikać tworzenia ostrych krawędzi przy użyciu szczypiec płaskich (lub ich odpowiednika), aby zapobiec przebiciu nicieni lub płytek.
  4. Obsługa nicieni
    1. Trzymać pęsetę podobnie jak ołówek i wysterylizować „stopkę”, umieszczając drut w płomieniu lampy spirytusowej z 95% etanolem, aż stanie się jasnopomarańczowy.
    2. Umieścić płytkę z wysianym OP50 na stole mikroskopu stereoskopowego i zdjąć pokrywkę. Delikatnie dotknąć „stopką” pęsety obszaru trawnika bakteryjnego i wykonać delikatny ruch przesuwający, aby zebrać bakterie na spodzie. Bakterie przyklejone do pęsety (nazywane „lepikiem”/„goo”) będą działać jak klej do podnoszenia nicieni.
    3. Przenieść płytkę z nicieniami na stole mikroskopu stereoskopowego i zdjąć pokrywkę, dbając o to, aby pęseta nie dotykała innych powierzchni. Szybko i delikatnie dotknąć „stopką” pęsety nicienia, aby go podnieść. Technika ta umożliwia jednoczesne przenoszenie wielu nicieni między płytkami.
    4. Delikatnie dotknąć „stopką” pęsety niezasianej części nowej płytki, aby przenieść nicienie; zazwyczaj jest to ta sama płytka, z której pobrano bakterie w sekcji 1.4.2.
    5. Sterylizować pęsetę pomiędzy każdą płytką i/lub szczepem nicieni, aby uniknąć kontaminacji, oraz pozwolić pęsety ostygnąć po sterylizacji.
      UWAGA: Dotknięcie nicienia gorącą pęsetą spowoduje stres lub śmierć zwierzęcia. Pęseta ostygnie po dotknięciu trawnika bakteryjnego w celu pobrania „lepika” do przeniesienia nicieni.
  5. Utrzymywać nicienie w temperaturze 20 °C na płytkach NGM (krok 1.1) wysianych bakteriami Escherichia coli OP50 (krok 1.2). Prowadzić pasażowanie nicieni 2-3 razy w tygodniu poprzez przenoszenie kilku osobników dorosłych na świeże płytki (60 mm x 15 mm) za pomocą pęsety (kroki 1.3-1.4), aby uniknąć głodowania, które może zmienić fizjologię.
    UWAGA: Szczepy C. elegans oraz bakterie OP50 są dostępne w Caenorhabditis Genetics Center (CGC).

2. Synchronizacja rozwoju C. elegans

  1. Zsynchronizuj wiek nicieni, stosując metodę czasowego składania jaj (opisano tutaj). Jeśli do celów dydaktycznych lub innych potrzeb wymagana jest duża liczba nicieni, przeprowadź synchronizację z użyciem podchlorynu sodu zgodnie z opisem w Golden et al.10.
  2. Przenieś dorosłe nicienie na nową płytkę z posiewem OP50 za pomocą platynowej pętelki (opisano w sekcji 1). Liczba nicieni zależy od potrzeb eksperymentu. Nicienie w 1. dniu dorosłości składają około 3 jaja na godzinę. Zatem 10 nicieni złoży około 30 jaj w ciągu 1 h. Zaleca się stosowanie nicieni w pierwszym dniu dorosłości (Day 1).
  3. Po około 1 h usuń dorosłe nicienie z płytki, pozostawiając jedynie jaja.
    UWAGA: Częstym błędem jest przypadkowe pozostawienie nicienia na płytce. Nicienie, które pozostaną, będą nadal składać jaja, co zaburzy synchronizację. Nicienie osiągają stadium dorosłego osobnika Day 1 około 72 h po złożeniu jaja, przy inkubacji w temperaturze 20°C.

3. Montowanie nicieni do obrazowania

  1. Podczas obrazowania zdarzeń zapłodnienia należy używać osobników dorosłych w 1. dniu życia, aby zmaksymalizować możliwości wizualizacji.
    UWAGA: U osobników dorosłych w 1. dniu życia zapłodnienie oocytu następuje co ok. 23 min. Jednakże owulacja zwalnia wraz z wiekiem, a typowy hermafrodyta przestaje składać jaja po 4. dniu.
  2. Przygotować 3% roztwór agarozy w wodzie, mieszając 3 g agarozy w 100 mL wody. Podgrzewać roztwór agarozy w mikrofalówce, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Aby ponownie wykorzystać stężały roztwór, podgrzewać go do pełnego rozpuszczenia. Po kilku zastosowaniach należy przygotować świeży roztwór.
  3. Umieścić czyste szkiełko przedmiotowe przeznaczone do obrazowania pomiędzy dwoma innymi szkiełkami, które mają pojedynczą warstwę taśmy laboratoryjnej naklejonej wzdłuż długiej osi szkiełka (patrz Tabela materiałów). Taśma tworzy dystans dla podkładki agarozowej, co zapewnia równomierne rozłożenie i jednolityą szerokość. Należy upewnić się, że trzy szkiełka znajdują się w jednym rzędzie, a ich długie boki się stykają: dwa szkiełka z taśmą flankują czyste szkiełko przedmiotowe.
    1. Za pomocą pipety 1 mL nanieść na środek szkiełka przedmiotowego znajdującego się między szkiełkami z taśmą kroplę podgrzanego 3% roztworu agarozy (~100-150 μL).
    2. Szybko położyć nowe szkiełko przedmiotowe na kropli agarozy, dbając o to, aby nowe szkiełko było prostopadłe do szkiełka z kroplą agarozy i opierało się na sąsiednich szkiełkach z taśmą.
    3. Delikatnie rozdzielić szkiełka. Unikać rozdarcia podkładki.
    4. Podkładki agarozowe należy przygotowywać na świeżo każdego dnia obrazowania. Zaleca się przygotowanie wielu podkładek podczas przygotowań do obrazowania, jednak należy unikać wystawiania więcej niż jednej podkładki jednocześnie. Odsłonięte podkładki szybko wysychają.
  4. Za pomocą pipety 20 μL dodać małą kroplę (~7 μL) 1 mM lewamisolu w buforze M9 na środek podkładki agarozowej, aby sparaliżować nicienie. Do przygotowania 1 mM roztworu roboczego należy użyć sterylnego (filtrowanego) 100 mM roztworu stokowego lewamisolu.
    1. Aby przygotować bufor M9, połączyć 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl, 1 g NH4Cl oraz 1 L wody dejonizowanej w odpowiednim naczyniu (patrz Tabela materiałów).
    2. Autoklawować roztwór, korzystając z ustawień cyklu sterylizacji cieczy, i pozostawić do ochłodzenia do RT przed użyciem. W przypadku użycia naczynia z nakrętką, należy poluzować ją o około jedną czwartą obrotu dla zapewnienia właściwej wentylacji. Zaleca się cykl sterylizacji w 121 °C przez 30 min.
  5. Wybrać co najmniej 5 zsynchronizowanych nicieni i delikatnie dotknąć „ogona” do kropli lewamisolu, aby przenieść wszystkie nicienie. Należy użyć co najmniej 5 nicieni na szkiełko, ponieważ orientacja ciała może spowodować, że jelito przesłoni linię zarodkową, blokując wizualizację fali wapniowej w oocycie.
    UWAGA: Należy upewnić się, że nicienie są przenoszone szybko, ponieważ lewamisol wyparuje, jeśli pozostanie na podkładce agarozowej dłużej niż 5 min.
  6. Ostrożnie przykryć podkładkę agarozową szkiełkiem nakrywką. Sprawdzić położenie nicieni, ponieważ szkiełko nakrywka może spowodować ich rozproszenie z pierwotnego miejsca. Opisać szkiełko przedmiotowe, podając odpowiednie szczegóły, takie jak nazwa szczepu nicieni (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Należy przeprowadzić obrazowanie jak najszybciej po zamontowaniu nicieni, ponieważ przedłużona ekspozycja na lewamisol jest toksyczna.

4. Obrazowanie wapnia podczas zapłodnienia u  C. elegans

  1. Zlokalizuj nicienie, używając obiektywu o małym powiększeniu, np. 4x, w wybranym mikroskopie. Zastosuj oświetlenie w świetle przechodzącym.
  2. Do wyraźnej wizualizacji fali wapniowej w oocytach użyj obiektywu powietrznego o powiększeniu co najmniej 20x. Zastosuj obiektyw imersyjny 40x lub większy.
  3. W zależności od używanego systemu intensywność wzbudzenia jest zazwyczaj wartością stałą. Aby zoptymalizować wizualizację reporterów fluorescencyjnych, dostosuj wzmocnienie (gain) lub czas ekspozycji.
    UWAGA: Ciągłe naświetlanie światłem o wysokiej intensywności uszkodzi próbkę i wpłynie negatywnie na zdrowie nicieni. W razie potrzeby wyłącz laser podczas oczekiwania na zdarzenie zapłodnienia, aby uniknąć ciągłego naświetlania GFP. Cechy charakterystyczne dla zdarzenia zapłodnienia opisano w sekcjach 4.8 - 4.9.
  4. Upewnij się, że kanał GFP 488 nm jest ustawiony na taką moc lasera, przy której sygnał reportera CaFE jest wyraźnie widoczny.
    1. W przypadku konfokalnego mikroskopu skaningowego Nikon ECLIPSE Ti2 detekcję reportera CaFE prowadź przy mocy lasera 30% dla kanału GFP i wzmocnieniu 75. Rozmiar otworu przesłony (pinhole) dla konfokalnego mikroskopu skaningowego Nikon ECLIPSE Ti2 wynosi 30 μm.
    2. W przypadku konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly z kamerą Zyla detekcję reportera CaFE prowadź przy mocy lasera 30% dla kanału GFP. Rozmiar otworu przesłony (pinhole) dla konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly wynosi 40 μm.
    3. Dostosuj ustawienia lasera i czas ekspozycji dla każdej badanej próbki.
  5. W przypadku użycia szczepu EAG28 (CaFE; PH-mCherry) lub EAG25 (CaFE; H2B-mCherry) upewnij się, że kanał czerwony jest ustawiony na taką moc lasera, aby sygnał mCherry był wyraźnie widoczny obok kanału GFP.
    1. W przypadku konfokalnego mikroskopu skaningowego Nikon ECLIPSE Ti2 detekcję reportera mCherry prowadź przy mocy lasera 15 dla kanału RFP i wzmocnieniu 130.
    2. W przypadku konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly z kamerą Zyla detekcję reportera mCherry prowadź przy mocy lasera 30% dla kanału RFP.
    3. Dostosuj ustawienia lasera i czas ekspozycji dla każdej badanej próbki.
  6. Ustaw częstotliwość klatek lub liczbę klatek na sekundę (fps) na najwyższą, jaką pozwala system.
    UWAGA: Reporter CaFE jest zazwyczaj obserwowany przy prędkości ok. 1 fps w konfokalnym mikroskopie skaningowym Nikon ECLIPSE Ti2 oraz 10 fps w konfokalnym mikroskopie z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly z kamerą Zyla.
  7. Wybierz protokół time-lapse lub serii czasowych i dostosuj go do pożądanych ustawień. Pozyskuj obrazy time-lapse przez maksymalnie 30 min, ustawiając opcję powtórzeń na „1”.
    UWAGA: Jeśli zdarzenie zapłodnienia nastąpi przed zakończeniem interwału czasowego, zatrzymaj nagrywanie w celu ograniczenia rozmiaru pliku.
  8. Zlokalizuj nicienie na szkiełku i wybierz osobnika, u którego widoczna jest proksymalna część gonady. Jelito i gonada skręcają się wokół siebie wewnątrz ciała nicienia. W związku z tym ramię gonady jest często przesłonięte przez jelito, co uniemożliwia wizualizację zapłodnienia. Jeśli oocyt -1 jest przesłonięty, wybierz innego nicienia do wizualizacji. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo wybrania nicienia z widocznym ramieniem gonady, zamontuj na szkiełku co najmniej 5 osobników. Do wizualizacji zapłodnienia używaj młodych dorosłych z 1. dnia życia.
  9. Zbadaj każdy oocyt -1 w ramionach gonady nicienia, aby określić, czy zapłodnienie jest bliskie.
    UWAGA: Przed zapłodnieniem, podczas dojrzewania meiotycznego, jądro w oocycie -1 migruje do tylnej części komórki, a otoczka jądrowa ulega rozpuszczeniu. Zjawiska te są widoczne zarówno w kanale Nomarski, jak i w kanale GFP przy użyciu reportera CaFE; wskazują one, że owulacja nastąpi w ciągu najbliższych ok. 10 min.
  10. Po rozpadzie otoczki jądrowej cytoszkielet najbardziej proksymalnego oocytu -1 ulegnie reorganizacji, komórka przyjmie zaokrąglony kształt i oddzieli się od oocytu -2. W tym momencie owulacja nastąpi w najbliższym czasie. Jeśli zaobserwowano te zjawiska, natychmiast rozpocznij nagrywanie filmu. Filmy nagrywaj w trybie szerokopolowym (widefield).
    UWAGA: Jeśli po 20 min ruch jądra lub zaokrąglenie oocytu nie są widoczne, owulacja prawdopodobnie nie nastąpi. Skup się na innym nicieniu i/lub przygotuj nowe szkiełko.

5. Ilościowe oznaczanie przejściowych wzrostów poziomu wapnia podczas zapłodnienia C. elegans

  1. Ilościowo określ przejściowe stężenia wapnia z filmów z zapłodnienia, korzystając z oprogramowania systemu mikroskopowego, takiego jak Nikon NIS Elements (opisanego tutaj). Do analizy obrazów odpowiednie są również programy ImageJ/FIJI11.
  2. Aby ilościowo określić zmianę fluorescencji w filmach z zapłodnienia, należy użyć następujących wartości sygnału: sygnału w czasie 0, sygnału z klatki docelowej oraz sygnału bazowego.
  3. Zidentyfikuj czas i klatkę, w której występuje pierwszy gwałtowny wzrost fluorescencji w oocycie -1. Zdefiniuj tę klatkę jako czas 0.
  4. Aby uzyskać sygnał z klatki docelowej, wyznacz obszar zainteresowania (ROI), który obejmie następujące obszary: oocyt -1 przed zapłodnieniem, spermatekę oraz nowo zapłodniony oocyt w macicy. Sygnał wyświetlany w ROI określa się jako F1.
    UWAGA: Upewnij się, że ROI obejmuje cały obszar, przez który przemieszcza się oocyt. ROI powinno być identyczne w każdej klatce analizowanego nagrania time-lapse.
  5. Zdefiniuj pusty obszar obrazu bez fluorescencji o tych samych wymiarach co ROI określone w kroku 5.4, aby obliczyć sygnał tła w każdej klatce. Odejmij sygnał tła od każdej klatki.
  6. Aby uzyskać sygnał bazowy (F0), zlokalizuj klatkę w przedziale co najmniej 15 klatek przed czasem 0. Korzystając z tego samego ROI co w kroku 5.4, odnotuj sygnał w każdej klatce aż do czasu 0. Oblicz średnią z sygnałów (po odjęciu tła) od klatki początkowej do czasu 0, aby wyznaczyć sygnał bazowy.
  7. Oblicz zmianę fluorescencji (ΔF), korzystając z następującego wzoru: figure-protocol-1. F1 jest definiowany w każdej klatce jako sygnał w ROI bez sygnału tła. F0 to uśredniony bazowy sygnał fluorescencji z ≥15 klatek przed czasem 0, obliczony zgodnie z sekcją 5.6. 
  8. Wyznacz szybkość zmiany między klatkami, odejmując zmianę fluorescencji między 2 klatkami i dzieląc wynik przez czas.

6. RNAi w C. elegans

  1. Przygotowanie płytek RNAi
    1. Przygotować płytki zgodnie z krokiem 1.1, a następnie dodać następujące dodatkowe odczynniki, aby umożliwić wyciszenie genów za pomocą RNAi w kroku 6.1.4.
    2. Dodać 1 ml 1 M sterylnie filtrowanego izopropanolu β-d-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) (rozpuszczony w wodzie dejonizowanej) do uzyskania stężenia końcowego 1 mM IPTG w pożywce (patrz Tabela materiałów).
    3. Dodać 1 ml ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml, przefiltrowanej sterylnie (rozpuszczonej w wodzie dejonizowanej), aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 100 μg/mL ampicylina w pożywce (patrz Tabela materiałów). Alternatywnie należy użyć 40 μg/mL karbenycylina12.
    4. Delikatnie, lecz dokładnie wymieszaj roztwór przez obracanie naczyniem, a następnie zalej płytki zgodnie z opisem w krokach 1.1.4 – 1.1.5.
  2. Przygotowanie hodowli nasyconej RNAi
    1. Oblicz ilość kultury nasyconej poprzez zwiększenie liczby niezbędnych płytek z zasianymi komórkami do RNAi przez 300 μL przy użyciu płytek o wymiarach 60 mm x 15 mm lub poprzez 100 μL przy użyciu płytek o wymiarach 35 mm x 10 mm.
    2. Stosując technikę sterylną, należy wyhodować odpowiednie bakterie RNAi w podłożu LB (opisanym w krokach 1.2.1-1.2.3) zawierającym 100 μg/mL ampicylinę przez noc w temperaturze 37 °C do momentu nasycenia. W ramach kontroli negatywnej należy uwzględnić szczep bakteryjny zawierający pusty wektor L4440, a w ramach kontroli pozytywnej RNAi szczep bakteryjny zawierający (np. jajo-5) w celu zweryfikowania działania RNAi. Dodatkowo należy dołączyć "Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia." kontrola zawierająca wyłącznie pożywkę LB w celu zweryfikowania braku kontaminacji w zapasie pożywki LB.
    3. Do nasyconej hodowli nocnej, w celu indukcji ekspresji dsRNA, dodać przefiltrowany sterylnie IPTG do stężenia końcowego 1 mM i inkubować przez co najmniej 2 h 30 min w temperaturze 37 °C przed wysiewaniem. Alternatywnie, przed indukcją za pomocą IPTG, można rozcieńczyć nasyconą kulturę z hodowli nocnej, aby wyprowadzić ją z fazy logarytmicznej.
      UWAGA: IPTG jest dodawany zarówno do płytek, jak i do kultury nasyconej w celu optymalizacji ekspresji dsRNA.
    4. Przenieść, stosując technikę sterylną, 300 μL indukowanej hodowli na środek utwardzonej płytki RNAi o wymiarach 60 mm x 15 mm. Alternatywnie należy użyć 100 μL nasyconej kultury dla płytki o wymiarach 35 mm x 10 mm.
    5. Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 1–3 dni, aż plamka bakteryjna RNAi przestanie być płynna. Przed użyciem upewnić się, że płytki są suche i wolne od kontaminacji. Przechowywać płytki w 4 °C odwrócić do góry dnem do późniejszego użycia.
      UWAGA: W celu uzyskania optymalnego wyciszenia genów należy użyć płytek RNAi tak szybko, jak to możliwe, ponieważ skuteczność RNAi spada wraz z upływem czasu. Należy je zutylizować, jeśli >1 miesiąc życia.
  3. Zgodnie z opisem w sekcji 2, należy zsynchronizować nicienie na płytkach RNAi.
    1. Sprawdzić nicienie pod kątem opóźnień rozwojowych 1–2 dni po synchronizacji zniesienia jaj.
    2. Niektóre techniki RNAi mogą powodować wady rozwojowe, jeśli wyciszenie genów rozpoczyna się w momencie składania jaj. W razie potrzeby należy przenieść nicienie na płytki RNAi na późniejszym etapie, np. w stadium L3.
  4. Zgodnie z opisem w sekcjach 3 i 4, należy unieruchomić nicienie i przygotować je do obrazowania przy użyciu dowolnego systemu mikroskopowego wyposażonego w detekcję fluorescencji GFP.

7. Obrazowanie wapnia podczas wczesnej embriogenezy u C. elegans

  1. Zsynchronizuj nicienie zgodnie z opisem w sekcji 2. Użyj szczepu EAG28, który łączy reporter CaFE z markerem mCherry z domeną homologii plekstryny, podkreślającym granicę błony plazmatycznej. Alternatywnie, aby zwizualizować zapłodnione embriony ex utero, ostrożnie rozetnij nicienia wzdłuż macicy za pomocą sterylnej igły strzykawki, aby uwolnić embriony.
  2. Przygotuj nicienie lub embriony do obrazowania zgodnie z opisem w sekcji 3 i postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 4 w celu ustawienia parametrów obrazowania.
  3. Wycentruj obszar zainteresowania na macicy nicienia, aby zwizualizować embriony lub złożone jajo.
    1. W przypadku embrionów in utero upewnij się, że macica nie znajduje się za jelitem, nie jest zbyt zagęszczona, a poszczególne komórki embrionu są wyraźne w płaszczyźnie ogniskowej.
    2. W przypadku jaj ex utero upewnij się, że stadium rozwoju komórek nie przekroczyło stadium przecinka w cyklu życiowym nicienia.
  4. Wybierz protokół lapse czasowy lub szereg czasowy i dostosuj go do pożądanych ustawień.
    1. Aby uzyskać optymalną wizualizację przejściowych zmian poziomu wapnia w embrionie, zwiększ ustawienia czasu dla dłuższych nagrań. Należy pamiętać, że stała ekspozycja na laser będzie szkodliwa dla embrionu w długich okresach czasu.
  5. Nagraj filmy lub wykonaj zdjęcia, skupiając się na komórkach w embrionach w pożądanym stadium rozwoju komórkowego.
  6. Do obrazowania użyj obiektywu imersyjnego 40x lub o większym powiększeniu, choć zmiany przejściowe są łatwo wykrywalne przy użyciu obiektywu powietrznego 20x.

Wyniki

Stosując protokoły opisane w niniejszym manuskrypcie, zaobserwowano dynamiczne wzorce sygnalizacji wapniowej podczas zapłodnienia i embriogenezy u C. elegans.

Typowy przebieg zapłodnienia u nicieni zawierających reporter CaFE przedstawiono na Rysunku 2. W celu ułatwienia analizy wykorzystano szczep EAG28, który łączy reporter CaFE z transgenem kodującym domenę homologii plecstryny (PH-mCherry)13. Marker PH-mCherry lokalizuje się w błonie plazmatycznej i pozwala na łatwiejszą wizualizację granic komórkowych, szczególnie w ramieniu gonady. Szczep EAG28 powstał poprzez skrzyżowanie szczepu EAG16 zawierającego reporter CaFE ze szczepem reporterowym OD70 PH-mCherry13. U C. elegans owulacja i zapłodnienie zachodzą jednocześnie. Za czas 0 zapłodnienia uznaje się pierwszą klatkę, w której wykryto sygnał fluorescencyjny w owulującym oocycie (Rysunku 2). Jasny błysk fluorescencji pojawia się w miejscu fuzji z plemnikiem, gdy tylko przednia krawędź oocytu wnika do spermateki, będącej organem magazynującym plemniki7. Sygnał pojawia się przed całkowitym zakończeniem owulacji. Fala wapniowa jest dwufazowa: następuje gwałtowny początkowy błysk, po którym podąża fala fluorescencji od punktu wniknięcia w kierunku przeciwległego bieguna. Cały oocyt staje się fluorescencyjny w czasie <30 s.

Należy zauważyć, że reporter CaFE występuje w pojedynczej kopii, w związku z czym sygnał nie jest tak silny jak w przypadku innych transgenów. Z-stack time-lapse nie jest zalecany podczas owulacji, chyba że dostępny i zoptymalizowany jest konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym. Obrazy Z-stack można uzyskać przed lub po nagraniu filmu, aby zarejestrować trójwymiarowe zmiany w morfologii gonad. Chociaż przedstawione tutaj obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego, stany przejściowe zaobserwowano również przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii szerokopolowej, która jest bardziej powszechna i przystępniejsza cenowo niż mikroskopia konfokalna. W przypadku zastosowania konfokalnego mikroskopu skaningowego szybkość klatek wynosi około 1 fps. W przypadku konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym szybkość klatek wynosi 10 fps lub więcej. Sygnał tła reportera CaFE jest wystarczający, aby oświetlić dojrzewające oocyty w ramieniu gonady. Po zapłodnieniu zazwyczaj obserwuje się 1,5-2-krotny wzrost intensywności sygnału GFP.

Istnieje kilka alternatywnych metod ilościowego oznaczania danych. Na przykład oprogramowanie do analizy obrazu Imaris, stworzone przez Oxford Instruments (tę samą spółkę matkę co konfokalny mikroskop dyskowy Andor Dragonfly), posiada funkcję ilościowego oznaczania sygnału w każdej klatce wyłącznie dla przechodzącego oocyta, zamiast dla większego ROI. Oprogramowanie Imaris nie jest jednak bezpłatne. Ponadto szczegółowa strategia analizy obrazu w celu pomiaru fal wapniowych w oocycie została drobiazgowo opisana przez Takayamę, Fujitę i Onami i wykorzystuje program ImageJ, który jest dostępny bezpłatnie14. Alternatywnie, kymografy służące do ilustrowania fali sygnału fluorescencyjnego w pojedynczym oocycie wymagają bardziej rozbudowanej manipulacji obrazem niż opisano w niniejszej pracy, lecz są opisane w pracy Takayamy i Onami3.

Wyraźną zaletą C. elegans jest możliwość wyciszenia ekspresji niemal każdego genu poprzez karmienie nicieni bakteriami wykazującymi ekspresję dsRNA w celu wywołania endogennego RNAi15,16. Dla optymalnej ekspresji dsRNA zarówno pożywki RNAi, jak i nasycona kultura RNAi zawierają IPTG. dsRNA jest wytwarzane poprzez ekspresję badanego genu z flankującymi promotorami. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy bibliotekę Ahringera, która obejmuje większość genomu nicienia dzięki zastosowaniu 16 256 szczepów bakteryjnych17. Alternatywnie, przez laboratorium Vidala za pomocą systemu Gateway stworzono ORFeome składający się z około 11 000 klonów RNAi, który jest dostępny w sprzedaży za pośrednictwem Horizon Discovery18.

Aby zademonstrować użyteczność reportera CaFE w połączeniu z RNAi, zbadaliśmy przedwczesną owulację. Częściowa delecja w genie ipp-5 indukuje zdarzenie podwójnej owulacji, podczas której zarówno oocyt -1, jak i oocyt -2 dostają się do spermateki podczas tej samej owulacji19. IPP-5 jest fosfatazą działającą na IP3, która skutecznie obniża poziom drugiego przekaźnika IP3. Stwierdziliśmy, że wyciszenie ipp-5 za pomocą RNAi wywołuje fenotyp podwójnej owulacji podobny do obserwowanego u mutantów.

Analiza reportera CaFE podczas podwójnej owulacji wywołanej wyciszeniem genu ipp-5 za pomocą RNAi ujawniła nowe aspekty OET. Po pierwsze, sygnał wapniowy zaobserwowano natychmiast po wejściu do spermateki w prowadzącym oocycie -1, ale nie w następującym za nim oocycie -2 (Rysunek 3). Mimo że owulacji ulega 2 oocyty, oocyt -1 jest wciąż jedynym oocytem wykazującym oznaki prawidłowego dojrzewania, w szczególności rozpad otoczki jądrowej (NEBD). Dane te sugerują, że mimo obecności plemników, oocyt -2 nie jest zdolny do zapłodnienia, ponieważ nie dojrzał on jeszcze prawidłowo. Po drugie, w oocycie -2 występuje opóźniona fala wapniowa, zazwyczaj w momencie opuszczania spermateki i przechodzenia do macicy. Choć dojrzewanie oocytu jest zazwyczaj warunkiem koniecznym do owulacji, dane te sugerują, że dojrzewanie oocytu i zdolność do zapłodnienia mogą nadal wystąpić po owulacji. Wizualizacja opóźnionej fali wapniowej podczas wyciszenia ipp-5 podkreśla zalety reportera CaFE w badaniu czasu i zdolności do zapłodnienia.

Ponadto odkryliśmy, że reporter CaFE jest wykrywalny w zniesionych jajach i ujawnia jednokomórkowe przejściowe wzrosty poziomu wapnia podczas wczesnej embriogenezy u C. elegans. Embriony z synchronizowanych jednodniowych dorosłych nicieni EAG28 (CaFE; PH-mCherry) obrazowano zgodnie z protokołami z sekcji 1-5 przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly i kamery Zyla (Rycina 4). Przejściowe wzrosty poziomu wapnia są ograniczone do pojedynczych komórek i trwają krócej niż fala wapniowa podczas zapłodnienia (~9 s, n=11). Jednakże fala wapniowa podczas embriogenezy nie wydaje się być dwufazowa. Przejściowych wzrostów poziomu wapnia nie zaobserwowano przed stadium 8 komórek. Co istotne, wapń nie lokalizuje się w bruździe podziałowej u C. elegans, co ma miejsce u wielu innych organizmów, w tym u ludzi i Xenopus20,21,22. Jednokomórkowe przejściowe wzrosty poziomu wapnia obserwowano znacznie po gastrulacji (~200 min po zapłodnieniu) oraz w zniesionych jajach. Pojedynczy embrion wykazuje w czasie wiele przejściowych wzrostów poziomu wapnia, lecz w różnych komórkach i zazwyczaj w jednej komórce naraz. Należy pamiętać, że ciągła ekspozycja na stymulację laserową uszkodzi embriony. Zaleca się zmniejszenie mocy LED/lasera lub stosowanie ekspozycji przerywanej. Jednakże, ponieważ fale wapniowe są stosunkowo krótkie i trwają ~9 s, nie zalecamy odstępów dłuższych niż 2 s między zdarzeniami stymulacji LED/laserem.

figure-results-1
Rycina 1: Ramię gonady C. elegans. Obraz jednego ramienia gonady z linii robaków EAG25, pokazujący reporter CaFE GFP (zielony) oraz marker histony 2B-mCherry (czerwony), który uwidacznia jądra komórkowe w linii zarodkowej. Proksymalny oocyt jest oznaczony jako -1 bezpośrednio przed spermateką, w której przechowywane są plemniki (strzałka). Zarodek znajdujący się najbliżej spermateki, ale wewnątrz macicy, jest zarodkiem najmłodszym. Obraz został wykonany przy użyciu konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego Nikon ECLIPSE Ti2. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2: Wizualizacja fali wapniowej podczas zapłodnienia. Obrazy z serii czasowej przedstawiające fluorescencję odzwierciedlającą stężenie wapnia wewnątrzkomórkowego podczas zapłodnienia u szczepu robaków EAG28. Szczep EAG28 zawiera zarówno reporter CaFE (zielony), jak i fuzję domeny homologii plekstryny z mCherry (żółty), która podkreśla błony plazmatyczne. Czas 0 oznacza pierwszą klatkę obrazu przedstawiającą wyraźny wzrost sygnału fluorescencyjnego w oocycie. Czas 24,4 s odzwierciedla pierwszą klatkę pokazującą fluorescencję całego oocytu. Obrazy z serii czasowej zostały wykonane przy użyciu konfokalnego mikroskopu dyskowego Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Fale wapnia podczas zdarzenia podwójnej owulacji wywołanej RNAi ipp-5 .Obrazy z lapse-time przedstawiające sekwencyjne fale wapnia w oocycie -1 i oocycie -2 w szczepie EAG16 (CaFE w kolorze zielonym GFP) poddanym działaniu RNAi ipp-5 . Klatka z czasu -40,0 s zawiera oznaczenia dla oocytu -1 (-1), oocytu -2 (-2), spermateki (*) i zarodka +1 (+1). Czas 0 s pokazuje początkowy wzrost fluorescencji fali wapnia w oocycie -1. Czas 4,5 s pokazuje rozprzestrzenianie się fali wapnia w kierunku przeciwległego bieguna w oocycie -1. Czas 70,5 s przedstawia fluorescencję całej komórki w oocycie -1, przy jednoczesnym sygnale GFP o poziomie podstawowym w oocycie -2; oba oocyty znajdują się w spermatece. Zapłodniony oocyt -1 i niezapłodniony oocyt -2 dostają się do macicy w czasie 158,3 s. W 219,3 s oocyt -2 wykazuje późną fluorescencyjną falę wapnia. Obrazy zostały wykonane przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 30 µM Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Pojedyncze przejściowe zmiany poziomu wapnia w komórkach we wczesnej embriogenezie. (A) Zarodki in utero oraz (B) ex utero (zniesione jajo) wykazały sygnał fluorescencyjny w pojedynczej komórce podczas embriogenezy. Obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym Andor Dragonfly z kamerą Zyla. Pasek skali = 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Proste narzędzie z solidnym protokołem to potężne połączenie, które pozwala radzić sobie z trudnymi pytaniami naukowymi. W tym miejscu przedstawiono metody wizualizacji wapnia jako łatwo wykrywalnego wskaźnika zastępczego dla nawożenia za pomocą reportera CaFE. Ten sam reporter utrzymuje się we wczesnej embriogenezie, a także umożliwia wizualizację stanów przejściowych wapnia w dalszym rozwoju. Sygnalizacja wapniowa służy jako krytyczny drugi przekaźnik, który wyznacza główne zmiany w funkcjonowaniu komórek, szczególnie w biologii rozwojowej. W oocycie pierwsza faza pękania fali wapniowej wyznacza nie tylko czas zapłodnienia, ale także miejsce fuzji plemników3. U C. elegans oś A-P jest również określana przez miejsce fuzji plemników23. Dlatego zdolność do wizualizacji wapnia w oocytach i zarodkach pozwala na badanie złożonych pytań, które mają kluczowe znaczenie dla biologii komórki i rozwoju.

Opisana tutaj metoda z reporterem CaFE powinna być wystarczająco prosta dla nowicjuszy w dziedzinie nicieni. Dotychczasowe metody wykrywania fal wapniowych w oocytach C. elegans opierały się na iniekcji barwnika 3,8,14. Chociaż badania te były ważne i pouczające, wstrzykiwanie barwnika jest pracochłonne, a sprzęt do wstrzykiwania nie jest dostępny w każdym laboratorium.

Przedstawione tutaj protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem zdrowych robaków. Aby zmaksymalizować szansę na sukces, upewnij się, że nie ma zanieczyszczeń na podłożu robaków lub na trawniku bakteryjnym, na którym żerują robaki. Nie wystawiaj robaków na warunki stresowe, takie jak temperatura, ponieważ wpłyną one na owulację i zapłodnienie. Dodatkowo, kontrole skuteczności RNAi powinny być włączone do każdego eksperymentu, ponieważ skuteczność zmniejsza się z czasem. Użyj kontroli pozytywnej dla skuteczności RNAi, takiej jak jajo 5, które generuje zarodki, ale nie ma zdolnego do życia potomstwa, ponieważ tworzenie skorupki jaja jest zagrożone24. Ponadto parametry przechwytywania obrazu muszą być zoptymalizowane dla każdego systemu mikroskopowego. Nasze specyfikacje są tutaj zawarte jako odniesienie, ale należy spodziewać się odchyleń. Chociaż system ten z łatwością wykrywa cytoplazmatyczny wapń jako wskaźnik zastępczy dla zapłodnienia, niekoniecznie reprezentuje on zdarzenie fuzji plemnika z oocytem w dobrej wierze.

Szeroki wachlarz narzędzi i mutantów, swobodnie dystrybuowanych w społeczności robaków, zwiększa użyteczność CaFE Reporter. Reporter jest zintegrowany z genomem robaka i można go łatwo skrzyżować z innymi zmutowanymi lub reporterowymi szczepami C. elegans 25. Doniesiono tutaj o utworzeniu EAG25 wyrażającego reporter CaFE za pomocą markera histonowego H2B-mCherry w celu wizualizacji jąder (ryc. 1) i EAG28 zarówno z reporterem CaFE, jak i markerem domeny pleckstrin-homologia mCherry, który podkreśla peryferia komórki (ryc. 2) 13,26. Oba szczepy pomagają w wizualizacji komórek w linii zarodkowej i podczas embriogenezy. Ponadto zakład RNAi w
C. elegans, w połączeniu z CaFE reporter, ujawnił nowe informacje na temat kompetencji nawożenia. Jak pokazano w podwójnej owulacji wywołanej przez knockdown ipp-5 RNAi na rycinie 3, obecność plemnika i owulacji oocytu jest niewystarczająca do stymulacji zapłodnienia.

Wyniki te wskazują, że musi istnieć inny sygnał lub brak inhibitora, który umożliwia zapłodnienie oocytu. Przedwcześnie owulowana komórka jajowa wykazuje opóźniony stan przejściowy wapnia, gdy oocyt przemieszcza się do macicy. Ta późna fala wapniowa sugeruje, że przedwcześnie owulowany oocyt -2 może z czasem rozwinąć kompetencję do zapłodnienia. Przewidujemy, że badania nad czasem zapłodnienia, szczególnie w odniesieniu do sygnalizacji i regulacji komórka-komórka, będą wspomagane przez zastosowanie reportera CaFE. Dodatkowo, reporter CaFE utrzymuje się w embriogenezie i wykazuje jednokomórkowe stany przejściowe wapnia. Ta embrionalna sygnalizacja wapniowa została również zgłoszona w ciągu pierwszych 24 godzin od rozwoju danio pręgowanego27. Rola stanów przejściowych wapnia jest nieznana, ale obecność sugeruje zdarzenie sygnalizacji komórkowej podczas rozwoju, które nie zostało jeszcze zbadane. Warto zauważyć, że nie zaobserwowano przejściowych stanów wapnia w nowo zapłodnionych zygotach. Dlatego wapń nie lokalizuje się w bruździe łupliwej, jak udokumentowano u kilku innych organizmów, w tym Xenopus i ludzi 20,21,22.

Co ważne, reporter CaFE jest na tyle łatwy, że może być używany przez studentów po minimalnym przeszkoleniu. Zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy 1-punktowe laboratorium CURE (course-based undergraduate research experience) dla studentów biologii z opisanymi tutaj szczepami i protokołami. W ciągu semestru klasa spotykała się raz w tygodniu przez 3 godziny lub dwa razy w tygodniu po 1 godzinę i 30 minut. Uczniowie mieli do wyboru pracę samodzielnie lub w grupach 2-osobowych. Każdy uczeń/para wybrała inny gen do zbadania z wyselekcjonowanej listy. Wykonali RNAi przeciwko wybranemu genowi w szczepie EAG28 i zbadali robaki pod kątem wpływu na płodność, zapłodnienie i/lub morfologię gonad. Opierając się na uzyskanych wynikach i lekturze podstawowej literatury, studenci opracowali hipotezy, które mogli przetestować w kolejnych eksperymentach. Ten iteracyjny projekt miał kluczowe znaczenie dla zwiększenia zaangażowania uczniów28. Studenci zdobyli autentyczne doświadczenie badawcze i zdobyli umiejętności w zakresie organizmów modelowych, badań genetycznych i mikroskopii fluorescencyjnej. Biorąc pod uwagę łatwość obsługi reportera CaFE, studenci bez doświadczenia badawczego byli w stanie odnieść sukces. Następnie studenci w przeważającej większości wyrazili preferencję dla formatu CURE w stosunku do tradycyjnych zajęć laboratoryjnych, a wielu studentów wyraziło chęć kontynuowania badań. Podsumowując, te narzędzia i protokoły pomagają zarówno w edukacji, jak i badaniach nad wczesnymi procesami rozwojowymi.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

KSKG został sfinansowany z grantu od Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R15HD111986). Niektóre szczepy zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD4010440). Dziękujemy firmie WormBase.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarFisher ScientificDF0140-07-42 kg; Proszek rozpuszcza się łatwiej niż płatki
AgarozaMidSciBE-A125500 g
Lampa alkoholowaFisher ScientificS13475Do stosowania z 95% etanolem
Chlorek amonu (NH4Cl)Fisher ScientificAAA1500030250 g
AmpicylinaFisher ScientificBP1760-55 g
Mały sterylizator parowy AMSCO serii 400Steris Opieka zdrowotnaN/A
Bactoo-peptonFisher ScientificBP1420-500500 g
Baktoo-tryptonFisher ScientificDF0123-17-3500 g
Chlorek wapnia (CaCl2)Fisher ScientificC69-500500 g
CholesterolThermo ScientificA11470.1850 g
Dragonfly 200 wirujący dysk konfokalnyOxford Instruments AndorN/AUżywany z mikroskopem Leica
Fisherbrand Superfrost Cytogenics Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific22-035-900144 szkiełka w opakowaniu
Szczypce płaskie, gładka szczękaHome Depot305530604Upewnij się, że szczypce mają gładką szczękę
Izopropyl β- d-1-tiogalaktopiranozyd ( IPTG)Fisher ScientificBP1755-1010 g; bez dioksanu
Taśma laboratoryjnaFisher Scientific15-901-10RTaśma 0,5 cala służy do oklejania szkiełek mikroskopowych
LewamizolFisher ScientificAC18787010010 g
Siarczan magnezu (MgSO4)Fisher ScientificM63-500500 g
Szkło nakrywkowe mikroskopuFisher Scientific12541016Opakowanie 1 uncji
Nikon ECLIPSE Ti2 skaning laserowy konfokalnyNikonN/A
Oprogramowanie Nikon NIS ElementsNikonN/AKonfokalny
OP50 Escherichia coliCaenorhabditis Centrum Genetyki (CGC)OP50
Platinum WireTriTechPT-9010
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500500 g
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Fisher ScientificAA1159436500 g
Chlorek sodu (NaCl)Fisher ScientificS271-500500 g
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny (Na2HPO4)Fisher ScientificS471-33 kg
Mikroskop stereoskopowyLeicaKL300 LED
Sterylne Petri szalka (35 mm x 10 mm)CellTreat229638960 szalek Petriego w opakowaniu
Sterylna szalka Petriego (60 mm x 15 mm)CellTreat229665500 szalek Petriego w opakowaniu
Szczep EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1uCaenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG16Stworzony przez Kim Guisbert
Lab Szczep EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: PIE-1U; ujIs113 II.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG25Stworzony przez Kim Guisbert Lab
Szczep EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.Caenorhabditis Genetics Center (CGC)EAG28Stworzony przez Kim Guisbert
Lab Szczep JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)JIM113Created by E. Preston - Murray Lab
Szczep OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OD70Stworzony przez Audhya/Oegema - Greenstein Lab
Tritech Worm Uchwyt do kilofówTriTechTWPH1
Ekstraktdrożdżowy IBI ScientificIB49160500 g

Bibliografia

  1. Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. Modulators of calcium signalling at fertilization. Open Biol. 10 (7), 200118(2020).
  2. McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs. Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).
  3. Takayama, J., Onami, S. The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte. Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).
  4. Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans. Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).
  5. Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).
  6. Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans. Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).
  7. Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator. Biol Open. 12 (9), 059832(2023).
  8. Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. Calcium dynamics during fertilization in C. elegans. BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).
  9. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  10. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (161), e61030(2020).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Kamath, R., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  13. Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans. Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).
  14. Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans. Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).
  15. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  16. Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. RNA Interference in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).
  17. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  18. Reboul, J., et al. elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression. Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).
  19. Bui, Y. K., Sternberg, P. W. Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation. Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).
  20. Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin. J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).
  21. Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease. Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).
  22. Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development. Biomolecules. 14 (1), 138(2024).
  23. Goldstein, B., Hird, S. N. Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans. Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).
  24. Johnston, W. L., Dennis, J. W. The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition. Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).
  25. Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans. G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).
  26. Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans. PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).
  27. Webb, S. E., Miller, A. L. Calcium signalling during zebrafish embryonic development. BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).
  28. Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills. J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zap odnienie C elegansod oocytu do embrionuwska nik kodowany genetycznieobrazowanie wapniawczesna embriogenezawyciszanie za pomoc RNAireporter fluorescencyjnysynchronizacja nicienimonta na podk adce agarozowej

Powiązane artykuły