Artykuł metodologiczny

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

6 września 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Streszczenie

Fosfatazy tyrozynowe to ważna rodzina enzymów, które regulują kluczowe funkcje fizjologiczne. Są one często rozregulowane w chorobach ludzkich, co czyni je kluczowymi celami badań biologicznych. Narzędzia, które umożliwiają regulację aktywności fosfatazy, odgrywają zasadniczą rolę w analizie ich funkcji. Tradycyjne podejścia, takie jak nadekspresja konstytutywnie aktywnych lub dominujących mutantów ujemnych lub regulacja w dół za pomocą siRNA, nie mają kontroli czasowej. Inhibitory fosfatazy często mają słabą swoistość i pozwalają badaczom jedynie określić, na jakie procesy wpływa hamowanie fosfatazy.

Opracowaliśmy podejście chemogenetyczne, system regulowany przez Rapamycynę (RapR), który pozwala na allosteryczne regulowanie domeny katalitycznej fosfatazy, co umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy. System RapR składa się z domeny iFKBP wprowadzonej do miejsca allosterycznego w fosfatazie. Wewnętrzna dynamika strukturalna domeny RapR zakłóca domenę katalityczną, prowadząc do inaktywacji enzymu. Dodatek rapamycyny pośredniczy w tworzeniu kompleksu między iFKBP a koeksprymowanym białkiem FRB, który stabilizuje iFKBP i przywraca aktywność domenie katalitycznej fosfatazy.

Ten system zapewnia wysoką specyficzność i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach. Unikalne możliwości tego systemu umożliwiają identyfikację zdarzeń przejściowych i badanie poszczególnych szlaków sygnałowych za fosfatazą. Protokół ten opisuje wytyczne dotyczące rozwoju fosfatazy RapR, jej charakterystyki biochemicznej oraz analizy jej wpływu na dalszą sygnalizację i regulację morfodynamiki komórki. Zawiera również szczegółowy opis strategii inżynierii białek, testów in vitro analizujących aktywność fosfatazy oraz eksperymentów obrazowania żywych komórek identyfikujących zmiany w morfologii komórek.

Wprowadzenie

Proteinowe fosfatazy tyrozynowe stanowią krytyczną rodzinę białek uczestniczących w licznych zdarzeniach sygnalizacyjnych komórek. Wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w regulacji proliferacji, migracji i apoptozy komórek1,2,3. W konsekwencji dysregulacja proteinowych fosfataz tyrozynowych prowadzi do szeregu wyniszczających chorób i zaburzeń4,5,6,7. Badanie funkcji fizjologicznych fosfataz tyrozynowych oraz ich roli w rozwoju tych patologii było historycznie utrudnione z powodu braku narzędzi niezbędnych do badania zawiłości sygnalizacji fosfataz8.

Tradycyjnie fosfatazy bada się za pomocą metod, które nie posiadają pożądanej swoistości i/lub nie zapewniają kontroli czasowej nad ich aktywnością. Te krytyczne ograniczenia dostępnych narzędzi utrudniają analizę specyficznych ról fosfataz w szlakach sygnałowych. Nadekspresja mutantów konstytutywnie aktywnych i dominująco negatywnych lub obniżenie ekspresji fosfatazy zapewniają swoistość, lecz brakuje im kontroli czasowej, a ponadto często mogą one wywołać mechanizmy kompensacyjne, które zamaskują rzeczywistą funkcję enzymu.

Inhibitory farmakologiczne umożliwiają czasową regulację fosfataz. Jednakże wiele inhibitorów fosfataz wykazuje znaczną niespecyficzność ze względu na silnie konserwatywny skład centrum aktywnego w fosfatazach tyrozynowych9. Ponadto, z powodu ograniczeń konstrukcyjnych, inhibitory celujące w centrum katalityczne wykazują słabą przepuszczalność przez błony komórkowe10. Kolejnym ograniczeniem inhibitorów jest fakt, że pozwalają one jedynie na badanie efektów inaktywacji fosfataz11. Istnieje zatem potrzeba opracowania narzędzi umożliwiających specyficzną, regulowaną czasowo aktywację fosfataz. Narzędzia te pozwolą badaczom zidentyfikować bezpośrednie efekty aktywacji fosfataz, oddzielając je od wielu równoległych kaskad sygnalizacyjnych, często aktywowanych przez bodźce biologiczne. Co istotne, ścisła czasowa kontrola aktywności umożliwia identyfikację przejściowych zdarzeń indukowanych przez fosfatazę oraz pozwala odróżnić efekty ostrej od przedłużonej aktywności fosfatazy. Połączenie regulacji czasowej z analizą mutacyjną pozwoli na szczegółowe przeanalizowanie specyficznych ról poszczególnych domen fosfatazy oraz zbadanie jej sygnalizacji w dół kaskady12.

Aby zniwelować brak pożądanych właściwości w istniejących narzędziach, grupa Karginova opracowała system regulowany rapamycyną (RapR)13,14,15. System RapR wykorzystuje zmodyfikowaną domenę przełączającą, iFKBP, która umożliwia allosteryczną regulację białka docelowego (POI). Wstawienie domeny iFKBP w pozycji allosterycznie sprzężonej z centrum katalitycznym POI sprawia, że staje się ono podatne na regulację za pomocą rapamycyny. Wobec braku rapamycyny domena iFKBP zaburza centrum katalityczne ze względu na immanentnie wysoką dynamikę strukturalną iFKBP, co prowadzi do inaktywacji POI. Dodanie rapamycyny indukuje oddziaływanie iFKBP z współwyrażanym białkiem FRB (Rysunek 1). Powoduje to stabilizację domeny przełączającej, co w konsekwencji przywraca strukturę i funkcję domeny katalitycznej POI. W ten sposób narzędzie to umożliwia specyficzną i regulowaną czasowo aktywację POI.

Schemat aktywacji białka; aktywacja Shp2 poprzez tworzenie kompleksu iFKBP/FRB; oddziaływanie molekularne.
Rycina 1: Schemat systemu RapR-Shp2 regulowanego rapamycyną. RapR umożliwia allosteryczną aktywację białka docelowego po dodaniu rapamycyny. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: iFKBP = wstawialne FKBP12; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę; R = rapamycyna; Shp2 = fosfataza tyrosynowa białka zawierająca domenę homologii Src-2. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Narzędzie RapR można zastosować do różnych rodzin białek. Może ono służyć do regulacji kinaz białkowych, jak i fosfataz12,14. Niniejszy protokół skupia się na zastosowaniu narzędzia RapR do kontroli fosfatazy Shp2. Shp2 jest powszechnie ekspresowaną białkową fosfatazą tyrozynową, która bierze udział w procesach sygnalizacyjnych, takich jak proliferacja, migracja, immunomodulacja i różnicowanie1,16,17,18. Dysregulację Shp2 powiązano z licznymi nowotworami litego narządu, białaczką szpikową oraz zaburzeniami rozwojowymi5,7. Jednakże Shp2 stała się obiektem tych samych niedoskonałości narzędziowych, które opisano powyżej. Aby przeciwdziałać tym ograniczeniom, opracowano i scharakteryzowano RapR-Shp2, czyli konstrukt Shp2 podlegający specyficznej i czasowej regulacji12.

Przed opracowaniem RapR-Shp2 wiadomo było, że Shp2 bierze udział w migracji komórek19,20,21. Jednak jego konkretna rola w sygnalizacji zaangażowanej w ten proces nie była znana. Nie wiadomo było również, w jakiej skali czasowej Shp2 reguluje migrację komórek oraz jakie konkretne zmiany morfodynamiczne wywołuje w różnych punktach czasowych swojej aktywacji. Ponadto nie było jasne, czy ostra i przedłużona aktywacja Shp2 wywoła różne efekty. Dzięki zastosowaniu RapR-Shp2 odkryto, że ostra aktywacja Shp2 indukuje przejściowe rozprzestrzenianie się komórek, zwiększenie liczby wypustek, polaryzację komórek oraz migrację. Zidentyfikowano również specyficzne szlaki sygnałowe poniżej Shp2, które regulują odrębne zmiany morfodynamiczne12. Niniejszy protokół zawiera szczegółowe informacje na temat projektu i charakterystyki RapR-Shp2, które mogą posłużyć jako wytyczne przy opracowywaniu i stosowaniu innych fosfataz RapR.

Protokół

1. Projekt fosfataz RapR

  1. Planowanie
    UWAGA: Na przykładzie RapR-Shp2 niniejszy protokół szczegółowo opisuje istotne kroki tworzenia fosfatazy tyrozynowej regulowanej rapamycyną. Opisany protokół został zoptymalizowany dla Shp2; w przypadku innych fosfataz mogą być wymagane dodatkowe modyfikacje w celu dostosowania do ich specyficznych właściwości.
    1. Aby zapewnić, że aktywność katalityczna Shp2 jest kontrolowana wyłącznie przez rapamycynę, a nie przez mechanizmy endogenne, należy wprowadzić do fosfatazy mutację utrzymującą ją w konformacji konstytutywnie aktywnej. W przypadku Shp2 należy wprowadzić mutację D61A.
      UWAGA: Jeśli dla konkretnej PTPazy nie wprowadzono mutacji aktywującej, wariant RapR będzie funkcjonował jako system z bramką logiczną AND, regulowany przez sygnały endogenne oraz rapamycynę.
    2. Zidentyfikuj miejsca insercji iFKBP w domenie katalitycznej fosfatazy, wykorzystując strukturę krystaliczną do przeprowadzenia selekcji, zgodnie z wcześniejszym opisem13. Jeśli struktura nie jest dostępna, przeprowadź dopasowanie sekwencji aminokwasowej do domeny katalitycznej fosfatazy Shp2, aby zidentyfikować miejsca insercji (Rysunek 2A). Upewnij się, że miejsce insercji znajduje się w elastycznej pętli, która jest strukturalnie powiązana z kieszenią katalityczną, ale oddalona od niej, aby zapobiec zawadzie sterycznej wiązania substratu przez iFKBP.
      UWAGA: Dalsze szczegóły dotyczące insercji omówiono w sekcji Dyskusja.
    3. Rozważ rodzaj sekwencji łącznika (linkera), który zostanie zastosowany pomiędzy wstawioną domeną iFKBP a badaną fosfatazą. Wybór optymalnej sekwencji łącznika jest niezwykle istotny dla sukcesu narzędzia RapR i zostanie omówiony szerzej w sekcji Dyskusja (Rysunek 2B).

Schemat miejsca insercji białka z iFKBP, dopasowaniem Shp2 i diagramem strukturalnym 3D.
Rysunek 2: Schemat zagadnień przy projektowaniu RapR-fosfatazy. (A) Dopasowanie Shp2 (fioletowy), PTP1B (zielony) i PTP-PEST (różowy) z zaznaczonymi konserwowanymi miejscami insercji. (B) Przedstawienie insercji łącznika między Shp2 a iFKBP. (C) Domena fosfatazowa Shp2 w kolorze beżowym z zaznaczonymi na niebiesko miejscami insercji. Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Fauser et al.12. Skróty: Shp2 = kinaza tyrozynowa białek zawierająca domenę homologii Src-2; iFKBP = inserowalne FKBP12; PTP = tyrozynowa fosfataza białkowa; RapR = regulowane rapamycyną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Utworzenie fosfatazy RapR

  1. Wprowadzenie iFKBP do badanej fosfatazy za pomocą zmodyfikowanej mutagenezy celowanej
    1. Wytworzenie „megaprimeru” kodującego iFKBP za pomocą PCR.
      1. Zaprojektować primery do syntezy „megaprimeru”, które zawierają 20-25 nukleotydów hybrydyzujących z końcem 5' lub 3' iFKPB, sekwencję łącznikową (linker), która połączy iFKPB z badaną fosfatazą, oraz 28-32 nukleotydy odpowiadające miejscu wstawienia (Rycina 3). Potwierdzić, że otrzymany produkt zawiera iFKPB flankowany przez fragmenty hybrydyzujące przed i po miejscu wstawienia w badanej fosfatazie.
      2. Zsyntetyzować „megaprimer” zawierający iFKBP za pomocą PCR (10 µL buforu polimerazy 5x, 1 µL matrycy DNA o stężeniu 50 ng/µL zawierającej iFKBP, 2 µL dNTP 10 mM, 0,5 µL roztwoku każdego z primerów „megaprimeru” [forward i reverse] o stężeniu 100 µM, 35 µL wody, 1 µL polimerazy DNA). Przed rozpoczęciem PCR podzielić tę reakcję PCR na 2 oddzielne reakcje o objętości 25 µL. Przeprowadzić cykl PCR zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy DNA lub według następującego standardowego cyklu PCR: (i) 98 °C przez 2 min, (ii) 98 °C przez 30 s, (iii) 55-70 °C przez 30 s, (iv) 72 °C przez 30 s, (v) powtórzyć kroki ii-iv 25x, (vi) 72 °C przez 2 min.
      3. Oczyścić „megaprimer” za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Nałożyć zawartość PCR z poprzedniego kroku na 1% żel agarozowy i przyłożyć napięcie 120 V przez około 30 min. Odnaleźć w żelu „megaprimer” o długości 400 nukleotydów, wyciąć fragment i oczyścić go za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu (patrz Tabela materiałów).
        UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
    2. Zmodyfikowana mutageneza celowana
      1. Przygotować reakcję zmodyfikowanej mutagenezy celowanej, używając jako matrycy plazmidu zawierającego gen badanej fosfatazy (5 µL buforu polimerazy 5x, 2 µL matrycy 50 ng/µL, 2 µL dNTP 10 mM, 10 µL wyekstrahowanego „megaprimeru”, 2,5 µL wody, 2,5 µL DMSO, 1 µL polimerazy DNA).
        UWAGA: Dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej obniża temperaturę hybrydyzacji22.
      2. Przeprowadzić następujący cykl PCR: początkowy etap denaturacji w 98 °C przez 3 min, a następnie 18 cykli składających się z następujących kroków inkubacji: 98 °C przez 30 s, 65 °C przez 20 s, 60 °C przez 20 s, 55 °C przez 20 s, 50 °C przez 20 s, 72 °C przez 18 min. Cykl przeprowadzić przez noc (czas cyklu wynosi 7 h). Po zakończeniu cyklu przechowywać reakcję PCR w 4 °C.
        UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
      3. Po zakończeniu cyklu dodać 1 µL enzymu DpnI i inkubować w 37 °C przez 1 h.
        UWAGA: DpnI strawi pozostałą matrycę, zwiększając wydajność nowo zsyntetyzowanego produktu.
      4. Przenieść strawiony produkt do kompetentnych komórek DH5α zgodnie z instrukcjami producenta. Wysiać transformaty na płytkach z agarem LB z odpowiednim antybiotykiem do selekcji (karbenycylina dla konstruktu pcDNA RapR-Shp2). Inkubować w 37 °C przez noc. Po wyrośnięciu kolonii przechowywać płytki LB w 4 °C do 1 miesiąca.
        UWAGA: W tym miejscu można przerwać protokół.
  2. Izolacja pożądanego konstruktu DNA zawierającego RapR-fosfatazę
    1. Przeprowadzić przesiew PCR kolonii bakteryjnych23. Ponieważ nie wszystkie kolonie wyrosłe na płytce LB będą zawierać pożądany plazmid, należy pamiętać o wykonaniu przesiewu przed izolacją plazmidowego DNA.
      UWAGA: Do przesiewu użyć primerów, które będą hybrydyzować z matrycą oraz w genie iFKBP. Przesiew można przeprowadzić z użyciem mastermixu polimerazy Taq (patrz Tabela materiałów).
    2. Po zidentyfikowaniu pozytywnych kolonii, zaszczepić jedną pozytywną kolonię do 3 mL pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem, inkubować i mieszać w 37 °C przez noc.
    3. Wyekstrahować plazmidowe DNA z hodowli płynnej zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Zaleca się zsekwencjonowanie nowo utworzonego konstruktu RapR PTPase przed przejściem do oceny in vitro.

Schemat projektowania starterów i mutagenezy celowanej; metoda PCR; proces manipulacji DNA.
Rysunek 3: Schemat projektowania starterów i zmodyfikowanej strategii klonowania z mutagenezą celowaną. Krok 1 obejmuje syntezę „megastartera” zawierającego iFKBP z „lepkimi końcami” hybrydyzującymi z miejscem insercji interesującej fosfatazy, a krok 2 polega na insercji „megastartera” do interesującej fosfatazy. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Karginov et al.13. Skrót: iFKBP = insertable FKBP12. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

3. Ocena RapR-PTPase za pomocą testu aktywności in vitro

UWAGA: Niniejszy protokół służy do oceny regulacji aktywności zmodyfikowanej enzymatycznie RapR-PTPazy. Poniżej opisano analizę immunoprecypitatowanej Shp2 z wykorzystaniem fosforylowanego fragmentu N-końcowego paksylliny jako substratu. W zależności od analizowanej PTPazy może być konieczny wybór innego substratu.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 800 000 komórek HEK293T na dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek w pożywce DMEM z dodatkiem suplementu L-glutaminy (stężenie końcowe 2 mM) i 10% FBS (v/v). Inkubować przez noc w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2.
  2. Dzień 2
    1. Gdy komórki osiągną ok. 60–80% konfluencji, przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem producenta wybranego odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów).
      1. Przykład protokołu transfekcji: dodać 1 µg plazmidowego DNA (po tyle samo pcDNA-mCherry-FRB oraz pcDNA-flag-RapR-Shp2) do 200 µL DMEM bez surowicy oraz 6 µL odczynnika do transfekcji i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać 100 µL mieszaniny do transfekcji na każdy dołek z komórkami. Jako kontrole uwzględnić próbki transfektowane konstruktami Shp2 konstytutywnie aktywnymi i dominująco negatywnymi. Inkubować przez noc w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2 .
  3. Dzień 3
    1. Przygotowanie Sepharose Protein-G
      UWAGA: Przed kontaktem z Sepharose przygotować przycięte końcówki pipet. Przyciętych końcówek należy używać na każdym etapie manipulacji z Sepharose. Sepharose musi być dokładnie resuspendTime na każdym etapie przed pipetowaniem.
      1. ZresuspendTime i przenieść odpowiednią ilość Sepharose Protein-G do probówki 1,5 mL. Na każdy dołek w płytce 6-dołkowej należy użyć 10 µL Sepharose Protein-G. Dla całej płytki 6-dołkowej użyć 60 µL Sepharose.
      2. Przemyć Sepharose 1 mL buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów). Wirować w mikrocentryfudze przez 1 min przy 2 000 × g i ostrożnie usunąć bufor do lizy. Powtórzyć 2x.
      3. ZresuspendTime Sepharose w 380 µL buforu do lizy. Dodać BSA do stężenia końcowego 1 mg/mL oraz przeciwciało (0,5 µL na każdą próbkę IP, przeciwciało anty-Flag [patrz Tabela Materiałów]). Inkubować na rotatorze przy 4 °C przez 1,5 h.
        UWAGA: Optymalną ilość przeciwciała należy wyznaczyć doświadczalnie dla każdego użytego przeciwciała.
    2. Przygotowanie komórek do immunoprecypitacji.
      1. Dodać odpowiednią ilość rapamycyny (roztwór stokowy 1 mM w etanolu) do stężenia końcowego 1 µM lub dodać taką samą objętość etanolu (kontrola negatywna) do próbek. Inkubować przez 1 h w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2 .
      2. Umieścić płytkę 6-dołkową z komórkami na lodzie i delikatnie przemyć komórki 3 mL zimnego PBS. Odssać PBS, dodać 300 µL buforu do lizy (z 1 µM rapamycyny dla próbki z aktywowaną fosfatazą lub równoważną objętość etanolu w próbce kontrolnej negatywnej) i zebrać komórki skrobakiem. Przenieść próbki do probówek 1,5 mL i wirować w mikrocentryfudze przez 10 min przy 1 000 × g w 4 °C.
      3. Przenieść 20 µL supernatantu do nowej probówki 1,5 mL w celu sprawdzenia poziomu ekspresji. Do każdej probówki przeznaczonej do kontroli ekspresji dodać 20 µL 2x buforu Laemmli z 5% β-merkaptoetanolem i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 min. Pozostały supernatant wykorzystać do immunoprecypitacji w kroku 3.3.3.3.
    3. Immunoprecypitacja RapR-Shp2
      1. Przemyć Sepharose Protein-G z kroku 3.3.1.3 1 mL buforu do lizy. Za każdym razem wirować w mikrocentryfudze przez 1 min przy 2 000 × g w 4 °C i ostrożnie odessać bufor do lizy. Powtórzyć ten krok 2x.
      2. Używając przyciętych końcówek, zresuspendTime Sepharose w buforze do lizy (50 µL na próbkę, zatem dla płytki 6-dołkowej zresuspendTime w 300 µL buforu do lizy). Pipetować 50 µL zawiesiny Sepharose do oddzielnej nowej probówki 1,5 mL dla każdej próbki.
        UWAGA: Ze względu na objętość Sepharose w roztworze buforu do lizy pozostanie nadmiar resuspendTime Sepharose.
      3. Dodać pozostały supernatant z przygotowanych komórek z kroku 3.3.2.3 do każdej probówki z Sepharose. Rotować przy 4 °C przez 1,5–2 h.
    4. Analiza aktywności fosfatazy
      UWAGA: Podłoże dla Shp2 należy przygotować poprzez fosforylację oczyszczonego fragmentu N-końcowego paksylliny przy użyciu konstytutywnie aktywnej kinazy Src zgodnie z wcześniej opisanym protokołem reakcji kinazowej12.
      1. Pod koniec kroku 3.3.3.3 przygotować roztwór fosfo-paksylliny. Na każdą próbkę dodać roztwór fosfo-paksylliny (stężenie końcowe 3 µg/mL) do 40 µL całkowitego buforu imidazolowego (patrz Tabela Materiałów). Do alikwoty roztworu fosfo-paksylliny dla próbek z aktywowanym RapR-Shp2 dodać rapamycynę do stężenia końcowego 1 µM, a do roztworu dla próbek nieaktywowanych dodać równoważną objętość etanolu.
      2. Ustawić ogrzewany wytrząsarkę na 32 °C.
        UWAGA: Inne fosfatazy mogą wymagać innej temperatury dla optymalnej aktywności.
      3. Przemyć Sepharose z próbkami z kroku 3.3.3.3 2x przy użyciu 0,5 mL buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów). Przemyć próbki 2x przy użyciu 0,5 mL buforu do płukania. Każdy bufor powinien zawierać rapamycynę w stężeniu 1 µM dla próbek aktywowanych lub równoważną objętość etanolu dla próbek nieaktywowanych. Po ostatnim płukaniu usunąć jak najwięcej buforu.
        UWAGA: Po dotarciu do tego etapu pomocne może być użycie pipety do powolnego i ostrożnego usuwania końcowych ilości buforu, aby upewnić się, że Sepharose nie zostanie odessany. Jakikolwiek pozostały bufor wpłynie na stężenie fosfo-paksylliny i doprowadzi do niedokładnego odczytu.
      4. Dodać 40 µL przygotowanej mieszaniny fosfo-paksylliny w buforze imidazolowym do każdej próbki, z rapamycyną lub bez niej (zależnie od próbki). Bardzo delikatnie wymieszać poprzez potrząśnięcie, natychmiast umieścić w ogrzewanej wytrząsarce i inkubować przez 40 min przy 32 °C. Ustawić wytrząsarkę na minimum 1 000 rpm, aby zapewnić pełne mieszanie próbki przez cały czas inkubacji.
      5. Zatrzymać reakcję, dodając 40 µL 2x buforu Laemmli do każdej próbki. Inkubować próbki w temperaturze 95–100 °C przez 5 min. Schłodzić próbki.
      6. Nanieść 15 µL każdej próbki (w tym próbki lizatu z kroku 3.3.2.3) na żel SDS-poliakrylamidowy z gradientem 4–15% i przeprowadzić standardowy protokół western blot przy użyciu membran PVDF.
      7. Przeprowadzić detekcję przeciwciałem anty-Flag w celu wykrycia konstruktu RapR-Shp2, anty-mCherry w celu wykrycia mCherry-FRB oraz anty-pY118 lub anty-pY31 paksylliny w celu wykrycia fosforylacji paksylliny.
        UWAGA: Uzyskane wyniki western blot powinny być zbliżone do Rysunku 4.

4. Analiza aktywności RapR-Shp2 w żywych komórkach

UWAGA: Niniejszy protokół jest stosowany w celu określenia zdolności RapR-Shp2 do defosforylacji endogennych substratów i indukowania sygnalizacji w dół szlaku. W przypadku innych RapR-PTPaz konieczna będzie analiza ich specyficznych substratów i szlaków.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 198 000 komórek A431 na studnię w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w medium DMEM uzupełnionym o 10% FBS i L-glutaminę (stężenie końcowe 2 mM). Umieścić w 37 °C i 5% CO22 inkubator przez noc.
  2. Dzień 2
    1. Zainfekuj komórki konstruktami adenowirusowymi wykazującymi ekspresję RapR-Shp2 oraz FRB, dodając adenowirusa bezpośrednio do pożywki znajdującej się w naczyniu. Pozostaw adenowirusa na komórkach w 37 °C oraz 5% CO22 inkubator przez noc. Jako kontrolę negatywną należy wykorzystać wyłącznie komórki zainfekowane samym FRB.
      UWAGA: Ilość adenowirusa zostanie określona indywidualnie, w zależności od miana.
  3. Dzień 3
    1. Przed eksperymentem należy poddać komórki A431 głodzeniu poprzez inkubację w medium DMEM z 0,5% FBS przez 4 h.
    2. Dodać rapamycynę do stężenia końcowego wynoszącego 1 µM lub taką samą objętość etanolu (kontrola negatywna) do komórek na 2–4 h.
      UWAGA: Inkubacja może być inna w przypadku pozostałych fosfataz.
    3. Umieść płytkę 6-dołkową z komórkami na lodzie i delikatnie przemyj komórki 3 ml zimnego PBS. Odessij PBS, dodaj 300 µL buforu lizującego (patrz Tabela materiałów), a następnie energicznie zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieść próbki do probówek 1,5 ml i wirować w mikrocentryfużce przez 5 min przy 2 000 × g w 4 °C.
    4. Transfer 250 µL każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 250 µL buforu Laemmliego 2x z 5% β-merkaptoetanolem i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 min.
    5. Obciążenie 25 µL każdej próbki na żel SDS-PAGE z gradientem 4–15% i przeprowadzić standardowy protokół western blot z użyciem membran PVDF.
    6. Oceń zapośrednicowaną przez RapR-Shp2 defosforylację EGFR i PLCγ przy użyciu przeciwciał anty-pY992 EGFR oraz anty-pY783 PLCγ. Oceń aktywację kinazy MAP Erk1/2 w szlaku sygnałowym poprzez analizę jej fosforylacji w obrębie reszt pT202/pY204.
      UWAGA: Wynikowe analizy western blot powinny wyglądać podobnie do Rycina 5.

5. Analiza zmian morfodynamicznych indukowanych przez aktywację RapR-Shp2 w komórkach HeLa z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek

UWAGA: Niniejszy protokół służy do określenia wpływu aktywacji RapR-Shp2 na tworzenie wypustek komórkowych, rozprzestrzenianie się komórek oraz ich migrację.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 700 000 komórek HeLa do 35 mm szalki do hodowli komórek i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Pozostawić komórki do przywarcia do szalki (~2–3 h).
    2. Przeprowadzić transfekcję komórek zgodnie z protokołem producenta preferowanego odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów).
      1. Przykładowy protokół transfekcji: dodać 0,5 µg DNA (plazmidy pcDNA-mCherry-FRB oraz pcDNA-Venus-RapR-Shp2, po tyle samo z każdego) do 100 µL bezserowkowego DMEM i 6 µL odczynnika do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać mieszaninę do transfekcji do komórek i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Komórki transfekowane wyłącznie pcDNA-mCherry-FRB stosować jako kontrolę negatywną.
    3. Pokryć okrągłe szkiełko nakrywkę 25 mm nr 1,5 do obrazowania na żywo fibronektyną (5 mg/L), inkubując przez 1 h w 37 °C.
  2. Dzień 2
    1. Przemyć pokryte szkiełko nakrywkę buforem PBS.
    2. Wysiać transfekowane komórki HeLa na pokryte szkiełko nakrywkę w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i L-glutaminę (stężenie końcowe 2 mM), aby uzyskać 30% konfluencji na 4 h przed obrazowaniem.
    3. Dwie godziny po wysianiu, ostrożnie wymienić pożywkę w szalce na uprzednio ogrzaną bezserowkową pożywkę Leibovitz L-15 na 2 h.
    4. Przebarwić komórki barwnikiem do błony komórkowej CellMask Deep Red zgodnie z protokołem producenta.
    5. Umieścić szkiełko nakrywkę w czystej komorze do obrazowania (patrz Tabela Materiałów). Dodać 1 mL uprzednio ogrzanej pożywki L-15 i przykryć 1 mL uprzednio ogrzanego oleju mineralnego, aby zapobiec odparowaniu. Przechowywać komorę w temperaturze 37 °C do czasu obrazowania.
    6. Obrazować komórki w 37 °C, korzystając z grzanego stolika.  
      1. Wybrać odpowiednie kanały do obrazowania konstruktu RapR oraz CellMask w trybie epifluorescencji. W celu realizacji niniejszego protokołu należy użyć wskazanego obiektywu 40x (patrz Tabela Materiałów) oraz następujących zestawów filtrów: filtrów wzbudzenia 514/10 i emisji 540/21 dla obrazowania Venus-RapR-Shp2, filtrów wzbudzenia 561/10 i emisji 595/40 dla obrazowania mCherry-FRB oraz filtrów wzbudzenia 640/20 i emisji 655LP dla obrazowania CellMask Deep Red. Dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych należy zastosować wielopasmowe lustro polichromatyczne (patrz Tabela Materiałów).
      2. Przechwytywać obrazy co 2 min przez 4–4,5 h.
        UWAGA: Szybsze zmiany morfodynamiczne będą wymagały częstszego przejmowania obrazów.
      3. Po 1 godzinie obrazowania dodać rapamycynę do stężenia końcowego 1 µM w celu stymulacji RapR-Shp2.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje tworzenie masek komórkowych na podstawie plików stosów .TIF zebranych podczas eksperymentów obrazowania żywych komórek. Następnie opisano sposób tworzenia makra w programie ImageJ do analizy masek, co pozwoli na uzyskanie arkusza kalkulacyjnego z powierzchnią komórek, która zostanie następnie przeanalizowana pod kątem zmian w czasie. Na koniec, za pomocą programu Metamorph, przeanalizowana zostanie aktywność protrusyjna i retrakcyjna komórek.

  1. Wygeneruj binarną maskę obrazów CellMask, używając funkcji MovThresh z pakietu oprogramowania CellGeo24.
  2. Skopiuj folder MovThresh do folderu analizy obrazów.
  3. Skopiuj obrazy z kanału CellMask lub innego znacznika błony do folderu MovThresh.
    1. Jeśli w jednej pozycji obrazowano wiele komórek, przytnij obrazy tak, aby wygenerować pliki zawierające tylko jedną komórkę przed stworzeniem maski w programie MatLab.
  4. Upewnij się, że w programie MatLab katalog jest poprawnie ustawiony na folder MovThresh.
  5. Uruchom funkcję MovThresh.
  6. Importuj stosy obrazów pojedynczo.
  7. Wybierz opcję Smoothed Curve, a następnie uruchom funkcję Rethreshold.
  8. Zapisz jako Mask_NumerObrazu w nowym folderze o nazwie Masks.
  9. Po przekonwertowaniu wszystkich stosów obrazów na Maski, otwórz stosy obrazów w oprogramowaniu ImageJ25.
    1. Analiza powierzchni komórek w programie ImageJ
      1. Otwórz wszystkie stosy obrazów Mask w programie ImageJ.
      2. W ustawieniach Set Measurements wybierz Area.
      3. Kliknij Plugins | Macros | Record.
      4. Kliknij Process | Binary | Make Binary.
        1. Wybierz opcję default.
          UWAGA: Podczas nagrywania Makra nie klikaj żadnych dodatkowych elementów. Jeśli do nagrania trafią dodatkowe kroki, zaleca się ponowne rozpoczęcie od punktu 6.9.1.3.
      5. Kliknij Analyze | Analyze Particles.
        1. Odznacz wszystkie pola poza Summary.
      6. Zakończ nagrywanie i kliknij Create, aby stworzyć Makro.
      7. Kliknij Run dla każdego stosu obrazów po jego wybraniu i zapisz tabelę wyników dla każdego stosu. Opcja domyślna zapisze dane jako plik csv.
      8. Zapisz Makro i wykorzystaj je ponownie w przyszłych analizach (opcjonalnie).
    2. Przetwarzanie danych powierzchniowych w arkuszu kalkulacyjnym
      1. Dla każdej analizowanej komórki oblicz średnią powierzchnię komórki z obrazów wykonanych przed aktywacją rapamycyną.
      2. Podziel wszystkie wartości powierzchni przez średnią powierzchnię komórki przed dodaniem rapamycyny.
      3. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i wyznacz 90% przedziały ufności. Przedstaw dane na wykresie.
    3. Analiza aktywności protruzyjnej komórek
      1. Skopiuj folder ProActive do folderu analizy obrazów.
      2. Skopiuj maskowane stosy obrazów z MovThresh do nowo utworzonego folderu ProActive.
      3. Otwórz program MatLab i ustaw katalog na folder ProActive.
      4. Uruchom funkcję ProActive.
      5. Zaimportuj pliki maskowanych stosów obrazów komórek do interfejsu ProActive GUI.
      6. Zdefiniuj rodzaj aktywności. Analiza aktywności protruzyjnej wygeneruje dane o powierzchni przybytej (area gained); analiza aktywności retrakcyjnej wygeneruje dane o powierzchni utraconej (area lost); a całkowita aktywność wygeneruje dane o ogólnej zmianie powierzchni (overall area change) (zarówno utraconej, jak i przybytej).
      7. Ustaw obszar na Define Normalization.
      8. Wygładź krzywą, korzystając z sugerowanych wartości progowych lub używając średniej do ponownego ustalenia progu (rethreshold) dla każdego punktu czasowego. Pozwala to na uśrednienie progów w określonym oknie, minimalizując niespójności w progowaniu między punktami czasowymi.
      9. Kliknij File | Save As | Results (.mat)
        1. W przypadku przetwarzania wszystkich trzech rodzajów aktywności powierzchniowej, nazwij przetworzone pliki danych w następujący sposób: ProResultData #, RetResultData # lub ResultData #.
          UWAGA: Uwzględnij spację przed numerem i numeruj dane począwszy od 1.
      10. Powtórz kroki od 6.9.3.6 dla wszystkich zaimportowanych maskowanych stosów obrazów.
      11. Po przetworzeniu wszystkich komórek zamknij interfejs ProActive GUI.
      12. Otwórz plik DataToFileTotalArea w edytorze Matlab, aby przetworzyć pliki „ResultData” całkowitej aktywności.
      13. Zmień liczbę komórek tak, aby odpowiadała liczbie wygenerowanych plików z wynikami. Jeśli w krokach 6.9.3.5–6.9.3.10 przetworzono 7 komórek, upewnij się, że pierwsze trzy linie skryptu wyglądają następująco:
        filename=’Result Data ‘;
        cells=1:7;
        lag=1;
      14. Kliknij Run i powtórz tę czynność dla DataToFileProtArea oraz DataToFileRetArea, aby przetworzyć odpowiednio dane protruzyjne i retrakcyjne. Analiza ta wygeneruje trzy pliki tekstowe: „AllCells.txt”, „AllCellsPro.txt” i „AllCellsRet.txt”
      15. Otwórz pliki .txt w arkuszu kalkulacyjnym i dokonaj normalizacji zgodnie z sekcją 6.9.2. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i wyznacz 90% przedziały ufności. Przedstaw dane na wykresie.
        UWAGA: Wykresy uzyskane z powyższych kroków powinny być podobne do Rysunku 6.

Wyniki

Rycina 4 przedstawia wyniki, jakich można spodziewać się w teście aktywności fosfatazy opartej na paksyllinie. W tym doświadczeniu aktywność konstytutywnie aktywnej i dominująco negatywnej fosfatazy Shp2 porównano z aktywnością aktywnego i nieaktywnego RapR-Shp2, wykorzystując poziom fosfo-paksylliny jako parametr odczytu. Konstrukty Shp2 poddano immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisem w protokole. Odczyty fosfo-paksylliny dla konstytutywnie aktywnego Shp2 oraz aktywnego RapR-Shp2 były zbliżone, co wskazuje, że wprowadzenie domeny RapR nie wpłynęło negatywnie na aktywny RapR-Shp2 i zachował on pełną aktywność po aktywacji. Wyniki dla dominująco negatywnego Shp2 i nieaktywnego RapR-Shp2 również były zbliżone, co dowodzi, że konstrukt RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Wskazuje to na prawidłowe zaprojektowanie fosfatazy RapR. Fosfo-substrat użyty w tym teście może się różnić w zależności od badanej fosfatazy.

Rycina 5, podobnie jak Rycina 4, porównuje konstytutywnie aktywną, dominująco negatywną oraz aktywną i nieaktywną formę RapR-Shp2. Eksperyment ten przeprowadzono bez immunoprecypitacji konstruktów. Został on zaprojektowany w celu scharakteryzowania efektów sygnalizacji downstream konstruktu RapR-Shp2 wewnątrz komórek. W tym przypadku konstrukty Shp2 wyekspresowano w komórkach HEK293T. Wykazano, że fosforylacja efektora downstream ERK1/2 wzrasta w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2, tak samo jak w próbce konstytutywnie aktywnej. Nieaktywny RapR-Shp2 nie wywołał tej zmiany. Wskazuje to, że sygnalizacja downstream Shp2 zostaje zachowana po włączeniu domeny RapR. Podobnie znane fosfo-substraty EGFR i PLCγ uległy defosforylacji w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2 w komórkach A431.

Wreszcie Rysunek 6 przedstawia wyniki aktywacji RapR-Shp2 w odniesieniu do morfodynamiki komórek HeLa. Po aktywacji RapR-Shp2 w komórkach zaobserwowano wzrost aktywności protrusyjnej oraz zwiększenie powierzchni komórek. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 jest wystarczająca do wywołania zmian morfodynamicznych w komórkach HeLa i może pozwolić badaczom na analizę specyficznych szlaków sygnałowych downstream odpowiedzialnych za ten efekt.

Western blot wykazujący ekspresję białek po traktowaniu rapamycyną; prążki Paxillin, Flag-Shp2.
Rycina 4: Wyniki testu aktywności opartego na paksyllinie: Formy konstytutywnie aktywne, dominująco negatywne oraz RapR-Shp2 zostały poddane immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisanym protokołem. Poziomy pY31 paksylliny w obu próbkach CA i RapR-Shp2 były podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 wykazywał aktywność zbliżoną do CA Shp2 po aktywacji. Próbka nieaktywnego RapR-Shp2 nie wykazywała aktywności, podobnie jak próbka DN, co świadczy o braku „przeciekania” (leaky expression). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę homologii do Src-2; DN = dominująco negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza Western blot, sygnalizacja phospho-ERK, efekty rapamycyny, porównanie ekspresji białek.
Rysunek 5: Wyniki analizy lizatów komórkowych: Wykazano ekspresję konstytutywnie aktywnej, dominująco negatywnej oraz RapR-Shp2 w komórkach HEK293T, a następnie przeprowadzono protokół analizy lizatów całokomórkowych. W stanie nieaktywnym RapR-Shp2 nie aktywowało ERK1/2 poprzez fosforylację, podobnie jak w próbce DN Shp2. Wskazuje to, że RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Po aktywacji poziom fosforylacji ERK1/2 był zbliżony do poziomu w próbce CA Shp2, co świadczy o skutecznej aktywacji i przekazywaniu sygnału w dół szlaku przez Shp2. Podobnie, w komórkach A431 wykazujących ekspresję RapR-Shp2 zaobserwowano spadek fosforylacji zarówno EGFR, jak i PLCγ, które są znanymi substratami Shp2. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = fosfataza tyrozynowa białka zawierająca domenę homologii Src-2; DN = dominujący negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; ERK = kinaza regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi; GAPDH = gliceraldehyd-3-fosforan dehydrogenaza; EGFR = receptor epidermalnego czynnika wzrostu; PLCγ = fosfolipaza C gamma; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza zmian powierzchni komórek; wykresy przedstawiają efekty RapR-Shp2, znormalizowaną powierzchnię komórek, aktywność protruzyjną.
Rycina 6: Analiza danych dotyczących powierzchni komórek i aktywności protruzyjnej na podstawie obrazowania na żywo: komórki HeLa zostały transfekowane RapR-Shp2 i poddane opisanemu protokołowi obrazowania na żywo. Dane analizowano zgodnie z protokołem analizy danych. Po aktywacji (oznaczonej pionową szarą linią) w komórkach HeLa zaobserwowano wzrost zarówno aktywności protruzyjnej, jak i powierzchni komórek. W próbkach negatywnych, w których wykazano jedynie ekspresję FRB, aktywność ta nie wystąpiła. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 indukuje szybkie zmiany morfodynamiczne w komórkach HeLa oraz sprzyja rozprzestrzenianiu się i tworzeniu wypustek komórkowych. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki w zakresie opracowywania, charakterystyki i stosowania fosfataz kontrolowanych chemicznie. Narzędzie RapR-Shp2 opiera się na przełączniku regulowanym rapamycyną umieszczonym w domenie katalitycznej Shp2. Mocną stroną tego narzędzia jest specyficzność i ścisła kontrola czasowa aktywności fosfatazy. Narzędzie ma zastosowanie do innych fosfataz i w połączeniu z wcześniej opisaną technologią RapR-TAP pozwala na rekonstrukcję poszczególnych dalszych szlaków sygnałowych26. Unikalne możliwości podejścia RapR pozwoliły naukowcom zidentyfikować przejściowe zdarzenia wywołane aktywacją Shp2 i przeanalizować specyficzne szlaki sygnałowe regulujące poszczególne procesy morfodynamiczne.

Na konstrukcję fosfatazy RapR wpływa kilka krytycznych czynników. Dobrze rozdzielona struktura krystaliczna domeny katalitycznej badanej fosfatazy jest bardzo pomocna w wyborze miejsca insercji iFKBP. Jednak ze względu na duże podobieństwo strukturalne między fosfatazami tyrozynowymi, wyrównanie sekwencji aminokwasowych domen katalitycznych może dostarczyć wystarczających informacji do identyfikacji miejsca insercji, jak pokazano na podstawie wyrównania Shp2 do PTP1B i PTPPest (Figura 2). Dla RapR-Shp2, Val406, znajdujący się w miejscu sprzężonym z krytyczną katalityczną pętlą WPD przez β-nić, został wybrany jako najbardziej optymalne miejsce insercji. To samo miejsce insercji może skutkować skuteczną regulacją innych PTPaz, jak wykazano dla PTP1B i PTP-PEST12 (Figura 2A).

Jeśli fosfataza, która jest przedmiotem zainteresowania, jest białkiem wielodomenowym, informacje strukturalne o organizacji domen pomogą zapobiec zakłócaniu innych funkcji PTPazy. Kolejnym czynnikiem wpływającym na konstrukcję optymalnej RapR-PTPazy jest to, ile aminokwasów powinno zostać zastąpionych przez wstawiony iFKBP. Większe i bardziej elastyczne pętle indukcyjne w PTPazie mogą wymagać dodatkowego skrócenia, aby zapewnić ścisłą regulację aktywności katalitycznej przez iFKBP. Podobnie, długość i skład łączników łączących iFKBP z PTPazą będą miały wpływ na skuteczność regulacji. Krótkie łączniki składające się z pojedynczej reszty Gly zapewnią ściślejszą regulację, ale mogą zmniejszyć maksymalną aktywność enzymu, jeśli wprowadzą trwałe zniekształcenia strukturalne, nawet gdy iFKBP jest związany z rapamycyną i FRB. Średniej długości łączniki Gly-Ser-Gly zapewniają większą elastyczność, ale mogą nie być wystarczająco sztywne dla niektórych PTPaz. Długie łączniki złożone z Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly pomogą zapobiec tworzeniu się niezamierzonych struktur drugorzędowych, które mogą wpływać na regulację PTPazy. RapR-Shp2 został przetestowany ze wszystkimi trzema typami łączników; Łącznik Gly-Ser-Gly okazał się najbardziej optymalny.

Kluczowym aspektem decydującym o pomyślnym opracowaniu narzędzi RapR jest ustanowienie solidnego testu fosfatazy i obecność odpowiednich kontroli. Porównanie aktywności fosfatazy RapR z aktywnością dominująco-ujemnych i konstytutywnie aktywnych wersji POI pozwala ocenić nieszczelność konstruktu RapR i zakres aktywacji. Ponadto brak defosforylacji przez konstytutywnie aktywną fosfatazę lub zmniejszona fosforylacja przez dominującego mutanta ujemnego będzie wskazywał na niewłaściwe warunki reakcji.

W przypadku testu fosfatazy warunki reakcji będą wymagały optymalizacji dla każdej PTPazy. Dostosowanie temperatury, czasu reakcji i warunków buforowych będzie zależeć od interesującej PTPazy. Energiczne mieszanie próbek ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wystarczającego wymieszania PTPazy związanej z sefarozą i jej substratu. Wreszcie, jeśli opisany test fosfatazy nie jest optymalny dla konkretnej interesującej nas PTPazy, wówczas jako alternatywny test można zastosować reakcję fosfatazy z użyciem fosforanu p-nitrofenylu jako substratu27.

W eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek podczas przygotowywania próbki należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. W przedstawionym protokole zastosowano pożywkę L-15 opartą na buforze HEPES, który nie jest wrażliwy na stężenie CO2 . Jeśli pożądane jest użycie pożywki na bazie wodorowęglanów, należy uzupełnić HEPES w celu utrzymania pH próbki lub zastosować komorę do obrazowania środowiskowego uzupełniającą CO2 . Protokół zaleca nałożenie warstwy oleju mineralnego na próbkę, aby zapobiec parowaniu i uprościć dodawanie rapamycyny. Można zastosować inne konfiguracje wykorzystujące komorę do obrazowania środowiskowego lub komorę zamkniętą, ale dodanie rapamycyny może być trudniejsze. Podczas dodawania rapamycyny do komórek podczas obrazowania należy upewnić się, że etap się nie przesunie, a komórki nie zostaną zakłócone. Wszelkie dodatkowe ruchy próbki podczas procesu obrazowania będą utrudniać gromadzenie danych. Intensywność oświetlenia i czas ekspozycji powinny być utrzymywane na niskim poziomie, aby zmniejszyć fototoksyczność, szczególnie w przypadku obrazowania długotrwałego. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednia wydajność transfekcji komórek. Stosunek 1:1 DNA FRB do RapR-Shp2 zapewnia odpowiednią ekspresję, ale w przypadku nowych konstruktów stosunek ten będzie wymagał korekty. Aby zapewnić skuteczną aktywację, FRB powinien być wyrażany na wyższym poziomie niż fosfataza RapR.

Ograniczeniem narzędzi opartych na RapR jest brak możliwości szybkiej dezaktywacji. Zmiana pożywki usuwa zewnątrzkomórkową rapamycynę, ale dezaktywacja konstruktów RapR może trwać wiele godzin ze względu na bardzo ścisłe wiązanie rapamycyny z konstruktem RapR. Szybką inaktywację można osiągnąć poprzez dodanie inhibitora miejsca aktywnego PTPazy. Jednak potencjalne niezamierzone skutki inhibitora mogą sprawić, że interpretacja wyników będzie trudna. Ponadto, nawet w połączeniu z inhibitorem PTPazy, podejście RapR nie może być stosowane w cyklicznych eksperymentach aktywacji/inaktywacji. Kolejnym ograniczeniem systemu RapR jest brak kontroli przestrzennej. Konstrukty RapR ulegają globalnej ekspresji, a zatem są aktywowane w całym komórce. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest zastosowanie rapamycyny w klatce, która może być uwalniana przez światło bliskie UV lokalnie w komórce28,29. Co więcej, narzędzie RapR może być modyfikowane w celu uzyskania aktywacji fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania w określonym kompleksie białkowym lub w określonej lokalizacji subkomórkowej. Poprzez przyłączenie partnera wiążącego lub znacznika subkomórkowego do FRB, RapR-PTPaza będzie ukierunkowana na określone białko lub miejsce w komórce. Wreszcie, rapamycyna jest dobrze scharakteryzowanym immunosupresorem poprzez hamowanie mTOR i może wpływać na sygnalizację komórkową, potencjalnie zakłócając sygnalizację interesującej PTPazy. Aby przezwyciężyć ten problem, dobrą alternatywą są nieimmunosupresyjne analogi rapamycyny (iRap i AP21967). Wykazano, że oba związki regulują konstrukty RapR14.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Jordan Fauser za jej wkład w rozwój RapR-Shp2 i związanych z nim protokołów. Prace zostały wsparte nagrodą 5R35GM145318 przyznaną przez NIGMS, nagrodą R33CA258012 przyznaną przez NCI oraz nagrodą P01HL151327 przyznaną przez NHLBI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Szkiełka nakrywkowe 25 mm okrągłeWarner Instruments64-0715
Probówki 1,5 mlUSA Scientificcc7682-3394
2x BuforNa 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żelBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 KomórkiATCCCRL-1555
AgarsosGoldBiotechA-201
Komora komórkowa attofluoruinvitrogenA7816
Benchmark Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio-products100-106Potrójna inaktywowana termicznie 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowany
Brig 35,30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/AOpublikowano w 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red barwnik błonowy plazmatycznyinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a kompetentny komórkiNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
Drabinka DNAGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI EnzymNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Ditiothreitol, Odczynniki Clelanda
EGTAAcros409910250
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigmaF1141
Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6Odczynnik do transfekcjiPromegaE2692
Zestaw do ekstrakcji żeluThermo ScientificK0692GeneJET Gel
Gel Zielony Kwas nukleinowy BarwnikGoldBioG-740-500
Żel ładujący Barwnik fioletowy 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T CellsATCCCRL-11268
HeLa CellsATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
Oprogramowanie do przetwarzania ImageJN/A/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Bufor25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
Bufordo lizy20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
DoCellGeo MathWorksN/A2022b
automatyzacji mikroskopii metamorficznej i analizy obrazuNIEDOTYCZY
NIE DOTYCZY MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Olej mineralnySigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele 12 dołkówBio-Rad4561085
Biologia molekularna Klasa wodnaCorning46-000-CV
Wielopasmowe lustro polichroiczneTechnologia Chroma89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanObiektyw SAPO 40xOlympusN/A
PBS bez Ca i MgCorning21-031-CV
Probówki do PCRlabForce1149Z650,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski Indywidualnie mocowane kołpaki
Polimeraza DNA Phusion Plus ThermoScientificF630S
StarteryIDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
Membrany PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Bibuła filtracyjna Kanapki
RapamycinFisherAAJ62473MF
0,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sódCorning25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1do elektroforezy
Bufor20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-merkaptoetanolFisher ChemicalO3446I-100
przeciwciała
Anty-EGFRSygnalizacja komórkowaprzeciwciała 2232
Przeciwciało anty-ERK 1/2Sygnalizacja komórkowa9102
Przeciwciało antyflagoweMillipore-SigmaF3165
Przeciwciało anty-GAPDHinvitrogenAM4300
Przeciwciało anty-GFPClontech632380
Przeciwciało anty-mCherryinvitrogenM11217
Przeciwciało anty-paxillinThermo FischerBDB612405
Przeciwciało anty-fosfo-EGFR Y992Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała 2235
Anty-fosfo-erk 1/2 T202/Y204 Sygnalizacjakomórkowa9101
Przeciwciało anty-fosfo-paksyliny Y31Millipore-Sigma05-1143
Anty-fosfo-PLCγ Y783Sygnalizacja komórkowa przeciwciała14008
Anty-PLCγ Sygnalizacja komórkowa5690
Laemmli N imidazolowy uruchomienia funkcji CellGeo użyto aktualizacji R Oprogramowanie do płuczący przeciwciała przeciwciał

Bibliografia

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja rapamycynąnarzędzia chemogenetyczneaktywacja fosfatazyregulacja allosterycznafosfataza SHIP-2komórki HEK-293Tanaliza immunoprecypitacyjnaWestern blotmorfodynamika komórek
Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.