Artykuł metodologiczny

Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

979 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67142

⸱

6 września 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Streszczenie

Fosfatazy tyrozynowe to ważna rodzina enzymów, które regulują kluczowe funkcje fizjologiczne. Są one często rozregulowane w chorobach ludzkich, co czyni je kluczowymi celami badań biologicznych. Narzędzia, które umożliwiają regulację aktywności fosfatazy, odgrywają zasadniczą rolę w analizie ich funkcji. Tradycyjne podejścia, takie jak nadekspresja konstytutywnie aktywnych lub dominujących mutantów ujemnych lub regulacja w dół za pomocą siRNA, nie mają kontroli czasowej. Inhibitory fosfatazy często mają słabą swoistość i pozwalają badaczom jedynie określić, na jakie procesy wpływa hamowanie fosfatazy.

Opracowaliśmy podejście chemogenetyczne, system regulowany przez Rapamycynę (RapR), który pozwala na allosteryczne regulowanie domeny katalitycznej fosfatazy, co umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy. System RapR składa się z domeny iFKBP wprowadzonej do miejsca allosterycznego w fosfatazie. Wewnętrzna dynamika strukturalna domeny RapR zakłóca domenę katalityczną, prowadząc do inaktywacji enzymu. Dodatek rapamycyny pośredniczy w tworzeniu kompleksu między iFKBP a koeksprymowanym białkiem FRB, który stabilizuje iFKBP i przywraca aktywność domenie katalitycznej fosfatazy.

Ten system zapewnia wysoką specyficzność i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach. Unikalne możliwości tego systemu umożliwiają identyfikację zdarzeń przejściowych i badanie poszczególnych szlaków sygnałowych za fosfatazą. Protokół ten opisuje wytyczne dotyczące rozwoju fosfatazy RapR, jej charakterystyki biochemicznej oraz analizy jej wpływu na dalszą sygnalizację i regulację morfodynamiki komórki. Zawiera również szczegółowy opis strategii inżynierii białek, testów in vitro analizujących aktywność fosfatazy oraz eksperymentów obrazowania żywych komórek identyfikujących zmiany w morfologii komórek.

Wprowadzenie

Proteinowe tyrozynofosfatazy stanowią krytyczną rodzinę białek uczestniczących w licznych zdarzeniach sygnalizacyjnych komórek. Wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w regulacji proliferacji, migracji i apoptozy komórek1,2,3. W konsekwencji dysregulacja proteinowych tyrozynofosfataz prowadzi do szeregu wyniszczających chorób i zaburzeń4,5,6,7. Badanie funkcji fizjologicznych tyrozynofosfataz oraz ich roli w rozwoju tych patologii było historycznie utrudnione przez brak narzędzi niezbędnych do badania zawiłości sygnalizacji fosfataz8.

Tradycyjnie fosfatazy bada się za pomocą metod, które nie posiadają pożądanej specyficzności i/lub nie zapewniają kontroli czasowej nad ich aktywnością. Te krytyczne ograniczenia dostępnych narzędzi utrudniają analizę specyficznych ról fosfataz w szlakach sygnalizacyjnych. Nadekspresja mutantów konstytutywnie aktywnych i dominujących negatywnych lub obniżenie ekspresji fosfatazy zapewniają specyficzność, lecz brakuje im kontroli czasowej i często mogą one wywoływać mechanizmy kompensacyjne, które maskują rzeczywistą funkcję enzymu.

Inhibitory farmakologiczne umożliwiają czasową regulację fosfataz. Jednakże wiele inhibitorów fosfataz jest znanych z braku specyficzności ze względu na dobrze zachowany skład centrum aktywnego w fosfatazach tyrozynowych9. Ponadto, ze względu na ograniczenia konstrukcyjne, inhibitory celujące w miejsce katalityczne wykazują słabą przepuszczalność przez błonę komórkową10. Kolejnym ograniczeniem inhibitorów jest to, że pozwalają one jedynie na badanie efektów inaktywacji fosfataz11. Istnieje zatem potrzeba opracowania narzędzi umożliwiających specyficzną, regulowaną czasowo aktywację fosfataz. Narzędzia te pozwolą badaczom zidentyfikować bezpośrednie efekty aktywacji fosfataz, oddzielając je od wielu równoległych kaskad sygnalizacyjnych często aktywowanych przez bodźce biologiczne. Co ważne, ścisła kontrola czasowa aktywności umożliwia identyfikację przejściowych zdarzeń indukowanych przez fosfatazę oraz oddzielenie efektów ostrej i przedłużonej aktywności fosfatazy. Połączenie regulacji czasowej z analizą mutacyjną pozwoli na szczegółowe przeanalizowanie specyficznych ról poszczególnych domen fosfatazy oraz badanie jej sygnalizacji downstream12.

Aby zniwelować brak pożądanych możliwości w istniejących narzędziach, grupa Karginova opracowała system regulowany rapamycyną (RapR)13,14,15. System RapR wykorzystuje zmodyfikowaną domenę przełączającą, iFKBP, która umożliwia allosteryczną regulację białka zainteresowania (POI). Wstawienie domeny iFKBP w pozycji sprzężonej allosterycznie z centrum katalitycznym POI sprawia, że staje się ono podatne na regulację za pomocą rapamycyny. Wobec braku rapamycyny iFKBP zakłóca strukturę centrum katalitycznego ze względu na wewnętrznie wysoką dynamikę strukturalną iFKBP, co prowadzi do dezaktywacji POI. Dodatek rapamycyny indukuje oddziaływanie iFKBP z koekspresyjnym białkiem FRB (Rysunek 1). Powoduje to stabilizację domeny przełączającej, co w konsekwencji przywraca strukturę i funkcję domeny katalitycznej POI. W ten sposób narzędzie to pozwala na specyficzną i regulowaną czasowo aktywację POI.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat systemu RapR-Shp2 regulowanego rapamycyną. RapR umożliwia allosteryczną aktywację białka zainteresowania po dodaniu rapamycyny. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fauser et al.12. Skróty: iFKBP = insertable FKBP12; FRB = domena wiążąca kompleks FKBP-rapamycyna; R = rapamycyna; Shp2 = tyrozynowa fosfataza białkowa zawierająca domenę homologii Src-2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Narzędzie RapR może być stosowane w odniesieniu do różnych rodzin białek. Można go użyć do regulacji kinaz białkowych, jak również fosfataz12,14. Niniejszy protokół skupia się na zastosowaniu narzędzia RapR do kontroli fosfatazy Shp2. Shp2 jest powszechnie ekspresowaną białkową tyrozynową fosfatazą, która bierze udział w procesach sygnalizacyjnych, takich jak proliferacja, migracja, immunomodulacja i różnicowanie1,16,17,18. Dysregulacja Shp2 została powiązana z licznymi nowotworami litymi, białaczką szpikową oraz zaburzeniami rozwojowymi5,7. Jednak Shp2 stała się ofiarą tych samych niedoskonałości narzędzi, które opisano powyżej. Aby wyeliminować te ograniczenia, opracowano i scharakteryzowano RapR-Shp2 – konstrukt Shp2 podlegający specyficznej i czasowej regulacji12.

Przed opracowaniem systemu RapR-Shp2 wiadomo było, że białko Shp2 bierze udział w migracji komórek19,20,21. Nie znano jednak jego specyficznej roli w sygnalizacji uczestniczącej w tym procesie. Nie było również wiadomo, w jakiej skali czasowej Shp2 reguluje migrację komórek oraz jakie konkretne zmiany morfodynamiczne indukuje w różnych punktach czasowych swojej aktywacji. Ponadto nie było jasne, czy gwałtowna i przedłużona aktywacja Shp2 wywoła odmienne efekty. Dzięki zastosowaniu RapR-Shp2 odkryto, że gwałtowna aktywacja Shp2 indukuje przejściowe rozprzestrzenianie się komórek, zwiększenie liczby wypustek, polaryzację komórek oraz ich migrację. Zidentyfikowano również specyficzne szlaki sygnałowe poniżej Shp2, które regulują odrębne zmiany morfodynamiczne12. Niniejszy protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące projektowania i charakterystyki RapR-Shp2, które mogą posłużyć jako wytyczne przy opracowywaniu i stosowaniu innych fosfataz typu RapR.

Protokół

1. Projektowanie fosfataz RapR

  1. Planowanie
    UWAGA: Na przykładzie RapR-Shp2, niniejszy protokół szczegółowo opisuje istotne kroki tworzenia fosfatazy tyrozynowej regulowanej rapamycyną. Opisany protokół został zoptymalizowany dla Shp2 i mogą być wymagane dodatkowe modyfikacje, aby dostosować go do specyficznych właściwości poszczególnych fosfataz.
    1. Aby upewnić się, że aktywność katalityczna Shp2 jest kontrolowana wyłącznie przez rapamycynę, a nie przez mechanizmy endogenne, wprowadź do fosfatazy mutację, która utrzyma ją w konformacji konstytutywnie aktywnej. W przypadku Shp2 wprowadź mutację D61A.
      UWAGA: Jeśli dla konkretnej PTPazy nie zostanie wprowadzona mutacja aktywująca, jej wariant RapR będzie funkcjonował jako system z bramką logiczną AND, regulowany przez sygnały endogenne oraz rapamycynę.
    2. Zidentyfikuj miejsca insercji iFKBP w domenie katalitycznej fosfatazy, wykorzystując strukturę krystaliczną do naprowadzenia wyboru, zgodnie z wcześniejszym opisem13. Jeśli struktura nie jest dostępna, wykonaj dopasowanie sekwencji aminokwasowej z domeną katalityczną fosfatazy Shp2, aby zidentyfikować miejsca insercji (Rysunek 2A). Upewnij się, że miejsce insercji znajduje się w elastycznej pętli, która jest strukturalnie sprzężona z kieszenią katalityczną, ale oddalona od niej, aby zapobiec zawadzie sterycznej wiązania substratu przez iFKBP.
      UWAGA: Dalsze szczegóły dotyczące insercji omówiono w sekcji Dyskusja.
    3. Rozważ rodzaj sekwencji łącznika, która zostanie zastosowana pomiędzy wstawioną domeną iFKBP a badaną fosfatazą. Wybór optymalnej sekwencji łącznika jest niezwykle istotny dla powodzenia narzędzia RapR i zostanie omówiony szerzej w sekcji Dyskusja (Rysunek 2B).

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat rozważań przy projektowaniu fosfatazy RapR. (A) Dopasowanie Shp2 (fioletowy), PTP1B (zielony) i PTP-PEST (różowy) z zaznaczonymi konserwatywnymi miejscami insercji. (B) Przedstawienie insercji łącznika pomiędzy Shp2 a iFKBP. (C) Domena fosfatazy Shp2 w kolorze beżowym z zaznaczonymi na niebiesko miejscami insercji. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Fauser i wsp.12. Skróty: Shp2 = białkowa tyrozynowa fosfataza zawierająca domenę homologii do Src; iFKBP = wstawialne białko FKBP12; PTP = białkowa tyrozynowa fosfataza; RapR = regulowany rapamycyną. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

2. Utworzenie fosfatazy RapR

  1. Wprowadzenie iFKBP do interesującej nas fosfatazy za pomocą zmodyfikowanej mutagenezy celowanej
    1. Generowanie „megaprimera” kodującego iFKBP za pomocą PCR.
      1. Zaprojektować primery do syntezy „megaprimera”, zawierające 20-25 nukleotydów przyłączających się do końca 5' lub 3' iFKPB, sekwencję łącznika, która połączy iFKPB z interesującą nas fosfatazą, oraz 28-32 nukleotydy odpowiadające miejscu insercji (Ryc. 3). Potwierdzić, że otrzymany produkt zawiera iFKPB flankowany fragmentami przyłączającymi się przed i po miejscu insercji w interesującej nas fosfatazie.
      2. Zsyntetyzować „megaprimer” zawierający iFKBP za pomocą PCR (10 µL buforu polimerazy 5x, 1 µL matrycy DNA o stężeniu 50 ng/µL zawierającej iFKBP, 2 µL dNTP 10 mM, 0,5 µL zapasu każdego primera „megaprimera” [forward i reverse] o stężeniu 10 µM, 35 µL wody, 1 µL polimerazy DNA). Przed uruchomieniem PCR podzielić tę reakcję PCR na 2 osobne reakcje po 25 µL. Przeprowadzić cykl PCR zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy DNA lub według następującego standardowego cyklu PCR: (i) 98 °C przez 2 min, (ii) 98 °C przez 30 s, (iii) 55-70 °C przez 30 s, (iv) 72 °C przez 30 s, (v) powtórzyć kroki ii-iv 25x, (vi) 72 °C przez 2 min.
      3. Oczyścić „megaprimer” za pomocą elektroforezy żelowej na agarozie. Nałożyć zawartość PCR z poprzedniego kroku na żel agarozowy 1% i przyłożyć napięcie 120 V przez około 30 min. Znaleźć w żelu „megaprimer” o długości 40 nukleotydów, wyciąć fragment i oczyścić go za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu (patrz Tabela materiałów).
        UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.
    2. Zmodyfikowana mutageneza celowana
      1. Przygotować reakcję zmodyfikowanej mutagenezy celowanej, używając w качестве matrycy plazmidu zawierającego gen interesującej nas fosfatazy (5 µL buforu polimerazy 5x, 2 µL matrycy 50 ng/µL, 2 µL dNTP 10 mM, 10 µL wyekstrahowanego „megaprimera”, 2,5 µL wody, 2,5 µL DMSO, 1 µL polimerazy DNA).
        UWAGA: Dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej obniża temperaturę przyłączania2.
      2. Przeprowadzić następujący cykl PCR: początkowa denaturacja przy 98 °C przez 3 min, a następnie 18 cykli następujących po sobie etapów inkubacji przy 98 °C przez 30 s, 65 °C przez 20 s, 60 °C przez 20 s, 5 °C przez 20 s, 50 °C przez 20 s, 72 °C przez 18 min. Przeprowadzić cykl przez noc (czas cyklu wynosi 7 h). Po zakończeniu cyklu przechowywać reakcję PCR w 4 °C.
        UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.
      3. Po zakończeniu cyklu dodać 1 µL enzymu DpnI i inkubować w 37 °C przez 1 h.
        UWAGA: DpnI strawi pozostałą matrycę, zwiększając wydajność nowo zsyntetyzowanego produktu.
      4. Przetransformować strawiony produkt do kompetentnych komórek DH5α zgodnie z instrukcjami producenta. Wysiać transformację na płytki LB agar z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym (karbenicylina dla konstruktu pcDNA RapR-Shp2). Inkubować w 37 °C przez noc. Po wzroście kolonii przechowywać płytki LB w 4 °C przez maksymalnie 1 miesiąc.
        UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.
  2. Izolacja pożądanego konstruktu DNA zawierającego RapR-fosfatazę
    1. Przeprowadzić przesiew PCR kolonii bakteryjnych23. Ponieważ nie wszystkie kolonie wyrosłe na płytce LB będą zawierały pożądany plazmid, należy pamiętać o przesiewie przed izolacją plazmidowego DNA.
      UWAGA: Do przesiewu użyć primerów, które będą przyłączać się do matrycy i w genie iFKBP. Przesiew można przeprowadzić, używając mastermixu polimerazy Taq (patrz Tabela materiałów).
    2. Po zidentyfikowaniu pozytywnych kolonii, zaszczepić jedną pozytywną kolonię do 3 mL pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk, inkubować i wytrząsać w 37 °C przez noc.
    3. Wyekstrahować plazmidowe DNA z hodowli płynnej zgodnie z instrukcją producenta zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA (patrz Tabela materiałów)
      UWAGA: Przed przejściem do oceny in vitro zaleca się zsekwencjonowanie nowo utworzonego konstruktu RapR PTPase.

figure-protocol-2
Rycina 3: Schemat projektowania starterów i zmodyfikowanej strategii klonowania z wykorzystaniem mutagenezy ukierunkowanej. Krok 1 obejmuje syntezę iFKBP zawierającego „megastarter” z „lepkimi końcami” hybrydyzującymi z miejscem insercji badanej fosfatazy, a krok 2 to insercja „megastartera” do badanej fosfatazy. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Karginov et al.13. Skrót: iFKBP = insertable FKBP12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Ocena RapR-PTPase za pomocą analizy aktywności in vitro

UWAGA: Niniejszy protokół służy do oceny regulacji aktywności zmodyfikowanej enzymatycznie RapR-PTPazy. Poniżej opisano analizę immunoprecypitowanej Shp2 z wykorzystaniem fosforylowanego fragmentu N-końcowego paksylliny jako substratu. W przypadku konkretnej analizowanej PTPazy może być konieczny wybór innego substratu.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 80 0 komórek HEK293T na studzienkę w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek w pożywce DMEM uzupełnionej o dodatek L-glutaminy (stężenie końcowe 2 mM) oraz 10% objętościowo FBS. Umieścić w 37 °C oraz 5% CO22 inkubator przez noc.
  2. Dzień 2
    1. Gdy komórki osiągną konfluencję na poziomie ~60–80%, należy przeprowadzić transfekcję zgodnie z protokołem producenta preferowanego odczynnika do transfekcji (patrz Tabela materiałów).
      1. Przykład protokołu transfekcji: Dodać 1 µg plazmidowego DNA (po tyle samo pcDNA-mCherry-FRB i pcDNA-flag-RapR-Shp2) do 200 µL bezsurowiczego DMEM i 6 µL odczynnika do transfekcji i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać 100 µL mieszaniny do transfekcji na każdą studzienkę z komórkami. Jako kontrole należy uwzględnić próbki transfekowane konstruktami Shp2 o aktywności konstytutywnej oraz dominantą negatywną. Inkubować przez noc w 37 °C oraz 5% CO22 inkubator
  3. Dzień 3
    1. Przygotowanie Sepharose Protein-G
      UWAGA: Przed pracą z Sepharose należy przygotować przycięte końcówki pipet. Przycięte końcówki powinny być stosowane na każdym etapie manipulacji przy Sepharose. Na każdym etapie, przed pobraniem próbek pipetą, Sepharose musi zostać dokładnie resuspendowany.
      1. Resuspender i przenieść odpowiednią ilość Protein-G Sepharose do probówki 1,5 ml. Dla każdego dołka w płytce 6-dołkowej należy użyć 10 µL Protein-G Sepharose. W przypadku pełnej płytki 6-dołkowej należy użyć 60 µL z Sepharose.
      2. Przemyj Sepharose 1 ml buforu do lizy (patrz Tabela materiałów). Wirowanie w mikrocentry fudze przez 1 min przy 2 0 obr./min × g i ostrożnie usunąć bufor do lizy. Powtórzyć 2 razy.
      3. Resuspender Sepharose w 380 µL buforu do lizy. Dodać BSA do stężenia końcowego 1 mg/ml oraz przeciwciało (0.5 µL dla każdej próbki IP, przeciwciało anty-Flag [patrz Tabela materiałów]). Odwrócić na rotatorze w 4 °C przez 1,5 h.
        UWAGA: Optymalną ilość każdego użytego przeciwciała należy ustalić drogą eksperymentalną.
    2. Przygotuj komórki do immunoprecypitacji.
      1. Dodaj odpowiednią ilość rapamycyny (roztwór stokowy 1 mM w etanolu), aby uzyskać stężenie końcowe wynoszące 1 µM lub dodać taką samą objętość etanolu (kontrola negatywna) do próbek. Inkubować przez 1 h w 37 °C oraz 5% CO22 inkubator
      2. Umieść płytkę 6-dołkową z komórkami na lodzie i delikatnie przemyć komórki 3 ml zimnego PBS. Odessać PBS i dodać 300 µL buforu do lizy (z albo 1 µM rapamycyny dla próbki z aktywowaną fosfatazą lub równoważnej objętości etanolu w próbce kontrolnej negatywnej) i zebrać za pomocą skrobaka do komórek. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i wirować w mikrocentry fudze przez 10 min przy 1 0 × g w 4 °C.
      3. Transfer 20 µL nadfiltru do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu sprawdzenia poziomów ekspresji. Dodać 20 µL buforu Laemmliego 2x z 5% β-merkaptoetanol do każdej probówki przeznaczonej do sprawdzenia ekspresji i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 min. Pozostałą nadbudowę należy wykorzystać do immunoprecypitacji w kroku 3.3.3.3.
    3. Immunoprecypitacja RapR-Shp2
      1. Przemyć Protein-G Sepharose z kroku 3.3.1.3. za pomocą 1 ml buforu do lizy. Wiruj w mikrocentryfudze przez 1 min przy 20 obr./min. × g w 4 °C każdorazowo, a następnie ostrożnie odessaj bufor do lizy (Lysis Buffer). Powtórz ten krok 2 razy.
      2. Używając odciętych końcówek pipet, resuspenduj Sepharose w buforze do lizy (50 µL na próbkę, zatem w przypadku płytki 6-dołkowej resuspender w 300 µL buforu lizującego). Pipetować 50 µL zawiesiny Sepharose do osobnej nowej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
        UWAGA: Ze względu na objętość Sepharose, po zakończeniu procesu pozostanie nadmiar zawiesiny Sepharose w buforze lizującym.
      3. Do każdej probówki z Sepharose należy dodać pozostały supernatant z komórek przygotowanych w kroku 3.3.2.3. Obracać przy 4 °C przez 1,5–2 h.
    4. Analiza aktywności fosfatazy
      UWAGA: Substrat Shp2 należy przygotować poprzez fosforylację oczyszczonego fragmentu N-końcowego paxylliny z wykorzystaniem konstytutywnie aktywnej kinazy Src zgodnie z wcześniej opisanym protokołem reakcji kinazy12.
      1. Pod koniec etapu 3.3.3.3 należy przygotować roztwór fosfo-paksylliny. Do każdej próbki należy dodać roztwór fosfo-paksylliny (stężenie końcowe wynoszące 3 µg/mL) do 40 µL całkowitej objętości buforu imidazolowego (patrz Tabela materiałów). Dodać rapamycynę do stężenia końcowego wynoszącego 1 µM do aliquoty roztworu fosfo-paksylliny dla próbek z aktywowanym RapR-Shp2 oraz równą objętość etanolu do roztworu dla próbek nieaktywowanych.
      2. Ustaw inkubator wytrząsowy na 32 °C.
        UWAGA: W przypadku innych fosfataz optymalna aktywność może wymagać zastosowania innej temperatury.
      3. Przemyj Sepharose próbkami z kroku 3.3.3.3 dwukrotnie 0,5 ml buforu do lizy (zob. Tabela materiałów). Próbki należy przemyć dwukrotnie 0,5 ml buforu do mycia. Każda porcja buforu powinna zawierać rapamycynę w stężeniu 1 µM dla próbek aktywowanych lub równą objętość etanolu dla próbek nieaktywowanych. Usuń jak największą ilość buforu po ostatnim przemyciu.
        UWAGA: Po dotarciu do tego etapu pomocne może być użycie pipety do powolnego i ostrożnego usunięcia pozostałej ilości buforu, aby upewnić się, że Sepharose nie został zassańy. Każda pozostała ilość buforu wpłynie na stężenie fosfo-paksylliny i doprowadzi do nieprawidłowego odczytu.
      4. Dodaj 40 µL przygotowanej mieszaniny buforu imidazolowego z fosfo-paksylliną do każdej próbki, z rapamycyną lub bez niej (zależnie od próbki). Bardzo delikatnie wymieszać poprzez potrząsanie i natychmiast umieścić w wytrząsarce grzewczej, inkubując przez 40 min w 32 °CUstaw inkubator wytrząsowy na prędkość co najmniej 10 obr./min, aby zapewnić pełne wymieszanie próbki przez cały czas trwania inkubacji.
      5. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 40 µL buforu Laemmliego 2x do każdej próbki. Inkubować próbki w temperaturze 95–100 °C przez 5 min. Schłodzić próbki.
      6. Załaduj 15 µL każdej próbki (w tym próbek lizatów z kroku 3.3.2.3.) na żel poliakrylamidowy SDS z gradientem 4–15% i przeprowadź standardowy protokół western blot z użyciem membran PVDF.
      7. Wykonaj analizę Western blot z użyciem przeciwciała anty-Flag w celu wykrycia konstruktu RapR-Shp2, przeciwciała anty-mCherry w celu wykrycia mCherry-FRB oraz przeciwciała anty-pY18 lub anty-pY31 paksylliny w celu wykrycia fosforylacji paksylliny.
        UWAGA: Wynikowe analizy western blot powinny wyglądać podobnie do Rysunek 4.

4. Analiza aktywności RapR-Shp2 w żywych komórkach

UWAGA: Niniejszy protokół służy do określenia zdolności RapR-Shp2 do defosforylacji substratów endogennych oraz indukowania sygnalizacji w dół szlaku. Inne RapR-PTPazy będą wymagały analizy ich specyficznych substratów i szlaków.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 198 00 komórek A431 na dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli tkanek w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i L-glutaminę (stężenie końcowe 2 mM). Inkubować w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2 przez noc.
  2. Dzień 2
    1. Zainfekować komórki konstruktami adenowirusowymi wykazującymi ekspresję RapR-Shp2 i FRB, dodając adenowirusa bezpośrednio do pożywki znajdującej się w płytce. Pozostawić adenowirusa na komórkach w inkubatorze przy 37 °C i 5% CO2 przez noc. Jako kontrolę negatywną wykorzystać komórki zainfekowane wyłącznie FRB.
      UWAGA: Ilość adenowirusa musi zostać określona indywidualnie w zależności od miana.
  3. Dzień 3
    1. Poddać komórki A431 głodzeniu poprzez inkubację w DMEM z 0,5% FBS przez 4 h przed eksperymentem.
    2. Dodać rapamycynę do stężenia końcowego 1 µM lub taką samą objętość etanolu (kontrola negatywna) do komórek na 2–4 h.
      UWAGA: Czas inkubacji może być inny dla innych fosfataz.
    3. Umieścić płytkę 6-dołkową z komórkami na lodzie i delikatnie przemyć komórki 3 mL zimnego PBS. Odessać PBS, dodać 30 µL buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów) i energicznie zebrać komórki skrobaczką. Przenieść próbki do probótek 1,5 mL i wirować w mikrocentryfudze przez 5 min przy 2 0 × g w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść 250 µL każdej próbki do nowej probótki 1,5 mL. Dodać 250 µL 2x buforu Laemmliego z 5% β-merkaptoetanolem i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 min.
    5. Nanieść 25 µL każdej próbki na żel SDS-PAGE z gradientem 4–15% i przeprowadzić standardowy protokół western blot z użyciem membran PVDF.
    6. Ocenić zależną od RapR-Shp2 defosforylację EGFR i PLCγ przy użyciu przeciwciał anty-pY92 EGFR oraz anty-pY783 PLCγ. Ocenić aktywację kinazy MAP Erk1/2 w szlaku downstream poprzez analizę jej fosforylacji w resztach pT202/pY204.
      UWAGA: Otrzymane wyniki western blot powinny być zbliżone do Rysunku 5.

5. Analiza zmian morfodynamicznych indukowanych przez aktywację RapR-Shp2 w komórkach HeLa z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek

UWAGA: Niniejszy protokół służy do określenia wpływu aktywacji RapR-Shp2 na tworzenie wypustek komórkowych, rozprzestrzenianie się komórek oraz ich migrację.

  1. Dzień 1
    1. Wysiać 70 00 komórek HeLa do 35-milimetrowej szalki hodowlanej i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Pozostawić komórki do czasu przytwierdzenia się do szalki (~2–3 h).
    2. Przeprowadzić transfekcję komórek zgodnie z protokołem producenta wybranego odczynnika do transfekcji (patrz Tabela materiałów).
      1. Przykładowy protokół transfekcji: dodać 0,5 µg DNA (plazmidy pcDNA-mCherry-FRB oraz pcDNA-Venus-RapR-Shp2, po tyle samo z każdego) do 10 µL bezserwatkowego DMEM i 6 µL odczynnika do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać mieszaninę do transfekcji do komórek i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Komórki transfektowane wyłącznie pcDNA-mCherry-FRB stosować jako kontrolę negatywną.
    3. Pokryć okrątłe szkiełko przedmiotowe nr 1,5 o średnicy 25 mm do obrazowania żywych komórek fibronektyną (5 mg/L), inkubując przez 1 h w temperaturze 37 °C.
  2. Dzień 2
    1. Przemyć pokryte szkiełko przedmiotowe PBS.
    2. Wysiać transfektowane komórki HeLa na pokryte szkiełko przedmiotowe w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i L-glutaminę (stężenie końcowe 2 mM), aby uzyskać 30% konfluencji na 4 h przed obrazowaniem.
    3. Dwie godziny po wysianiu, ostrożnie wymienić pożywkę w szalce na uprzednio ogrzaną, bezserwatkową pożywkę Leibovitz L-15 na 2 h.
    4. Zbarwić komórki barwnikiem błony plazmatycznej CellMask Deep Red zgodnie z protokołem producenta.
    5. Umieścić szkiełko przedmiotowe w czystej komorze do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Dodać 1 mL ogrzanej pożywki L-15 i przykryć 1 mL ogrzanego oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu. Przechowywać komorę w temperaturze 37 °C do momentu obrazowania.
    6. Obrazować komórki w temperaturze 37 °C, korzystając z podgrzewanego stolika.  
      1. Wybrać odpowiednie kanały do obrazowania konstruktu RapR oraz CellMask w mikroskopii epifluorescencyjnej. Aby zastosować ten protokół, należy użyć wskazanego obiektywu 40x (patrz Tabela materiałów) oraz następujących zestawów filtrów: filtry wzbudzania 514/10 i emisji 540/21 dla obrazowania Venus-RapR-Shp2, filtry wzbudzania 561/10 i emisji 595/40 dla obrazowania mCherry-FRB oraz filtry wzbudzania 640/20 i emisji 65LP dla obrazowania CellMask Deep Red. Dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych zastosować wielopasmowe lustro polichromatyczne (patrz Tabela materiałów).
      2. Przechwytywać obrazy co 2 min przez okres od 4 do 4,5 h.
        UWAGA: Szybsze zmiany morfodynamiczne będą wymagały częstszej akwizycji obrazów.
      3. Po 1 godzinie obrazowania dodać rapamycynę do stężenia końcowego 1 µM, aby stymulować RapR-Shp2.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje tworzenie masek komórkowych na podstawie plików stosu .TIF zebranych podczas eksperymentów z obrazowaniem na żywo. Następnie opisano sposób tworzenia makra w programie ImageJ do analizy masek, co pozwoli na uzyskanie arkusza z powierzchnią komórek, która zostanie następnie przeanalizowana pod kątem zmian w czasie. Na koniec, za pomocą programu Metamorph, przeanalizowana zostanie aktywność protrusyjna i retrakcyjna komórek.

  1. Wygeneruj binarną maskę obrazów CellMask, korzystając z funkcji MovThresh z pakietu oprogramowania CellGeo24.
  2. Skopiuj folder MovThresh do folderu analizy obrazów.
  3. Skopiuj obrazy z kanału CellMask lub innego markera błony do folderu MovThresh.
    1. Jeśli w jednej pozycji obrazowano wiele komórek, przytnij obrazy, aby wygenerować pliki zawierające tylko jedną komórkę przed utworzeniem maski w programie MatLab.
  4. Upewnij się, że w programie MatLab katalog roboczy jest prawidłowo ustawiony na folder MovThresh.
  5. Uruchom funkcję MovThresh.
  6. Importuj stosy obrazów pojedynczo.
  7. Wybierz opcję Smoothed Curve, a następnie uruchom funkcję Rethreshold.
  8. Zapisz jako Mask_NumerObrazu w nowym folderze o nazwie Masks.
  9. Po przekształceniu wszystkich stosów obrazów w maski otwórz stosy obrazów w oprogramowaniu ImageJ25.
    1. Analiza powierzchni komórek w programie ImageJ
      1. Otwórz wszystkie stosy obrazów masek w programie ImageJ.
      2. W ustawieniach Set Measurements wybierz opcję Area.
      3. Kliknij Plugins | Macros | Record.
      4. Kliknij Process | Binary | Make Binary.
        1. Wybierz opcję default.
          UWAGA: Podczas nagrywania makra nie klikaj żadnych dodatkowych opcji. Jeśli do nagrania trafiły nadmiarowe kroki, zaleca się ponowne rozpoczęcie od punktu 6.9.1.3.
      5. Kliknij Analyze | Analyze Particles.
        1. Odznacz wszystkie pola poza opcją Summary.
      6. Zakończ nagrywanie i kliknij Create, aby utworzyć makro.
      7. Uruchom makro funkcją Run dla każdego stosu obrazów po jego wybraniu i zapisz tabelę wyników dla każdego stosu. Opcja domyślna zapisze dane w formacie csv.
      8. Zapisz makro i wykorzystaj je w przyszłych analizach (opcjonalnie).
    2. Przetwarzanie danych o powierzchni w arkuszu kalkulacyjnym
      1. Dla każdej analizowanej komórki oblicz średnią powierzchnię komórki na podstawie obrazów wykonanych przed aktywacją rapamycyną.
      2. Podziel wszystkie wartości powierzchni przez średnią powierzchnię komórki przed dodaniem rapamycyny.
      3. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i wyznacz 90% przedziały ufności. Przedstaw dane na wykresie.
    3. Analiza aktywności protrusywnej komórek
      1. Skopiuj folder ProActive do folderu analizy obrazów.
      2. Skopiuj stosy obrazów z maskami z folderu MovThresh do nowo utworzonego folderu ProActive.
      3. Otwórz program MatLab i ustaw katalog roboczy na folder ProActive.
      4. Uruchom funkcję ProActive.
      5. Zaimportuj pliki stosów obrazów maskowanych komórek do interfejsu ProActive GUI.
      6. Zdefiniuj rodzaj aktywności. Analiza aktywności protrusywnej wygeneruje dane o powierzchni przyrostowej (area gained); analiza aktywności retrakcyjnej wygeneruje dane o powierzchni utraconej (area lost); a całkowita aktywność wygeneruje dane o ogólnej zmianie powierzchni (overall area change) (zarówno utraconej, jak i przyrostowej).
      7. Ustaw powierzchnię na Define Normalization.
      8. Wygładź krzywą, korzystając z sugerowanych wartości progowych lub używając średniej do ponownego ustalenia progu dla każdego punktu czasowego. Pozwala to na uśrednienie progów w określonym oknie, minimalizując niespójności w progowaniu między punktami czasowymi.
      9. Kliknij File | Save As | Results (.mat)
        1. W przypadku przetwarzania wszystkich trzech typów aktywności powierzchni, nazwij przetworzone pliki danych w następujący sposób: ProResultData #, RetResultData # lub ResultData #.
          UWAGA: Zachowaj spację przed numerem i numeruj dane zaczynając od 1.
      10. Powtórz kroki od 6.9.3.6 dla wszystkich zaimportowanych maskowanych stosów obrazów.
      11. Po przetworzeniu wszystkich komórek zamknij interfejs ProActive GUI.
      12. Otwórz skrypt DataToFileTotalArea w edytorze MatLab, aby przetworzyć pliki „ResultData” dotyczące aktywności całkowitej.
      13. Zmień liczbę komórek tak, aby odpowiadała liczbie wygenerowanych plików z wynikami. Jeśli w krokach 6.9.3.5–6.9.3.10 przetworzono 7 komórek, upewnij się, że pierwsze trzy linie skryptu wyglądają następująco:
        filename=’Result Data ‘;
        cells=1:7;
        lag=1;
      14. Kliknij Run i powtórz tę czynność dla skryptów DataToFileProtArea oraz DataToFileRetArea, aby odpowiednio przetworzyć dane protrusywne i retrakcyjne. Analiza ta wygeneruje trzy pliki tekstowe: „AllCells.txt”, „AllCellsPro.txt” i „AllCellsRet.txt”.
      15. Otwórz pliki .txt w arkuszu kalkulacyjnym i znormalizuj je zgodnie z sekcją 6.9.2. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i wyznacz 90% przedziały ufności. Przedstaw dane na wykresie.
        UWAGA: Wykresy uzyskane w powyższych krokach powinny być zbliżone do Rysunku 6.

Wyniki

Rycina 4 przedstawia wyniki, jakich można spodziewać się w teście aktywności fosfatazy opartym na paksyllinie. W tym eksperymencie aktywność fosfatazy Shp2 konstytutywnie aktywnej oraz dominująco negatywnej porównano z aktywnością aktywnej i nieaktywnej RapR-Shp2, wykorzystując poziom fosfo-paksylliny jako odczyt. Konstrukty Shp2 poddano immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisem w protokole. Odczyty fosfo-paksylliny dla konstytutywnie aktywnej Shp2 i aktywnej RapR-Shp2 były zbliżone, co wskazuje, że na aktywną RapR-Shp2 nie wpłynęło negatywnie wprowadzenie domeny RapR i zachowała ona pełną aktywność po aktywacji. Wyniki dla dominująco negatywnej Shp2 oraz nieaktywnej RapR-Shp2 były również podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Świadczy to o poprawnym zaprojektowaniu fosfatazy RapR. Fosfo-substrat użyty w tym teście może się różnić w zależności od badanego rodzaju fosfatazy.

Rysunek 5, podobnie jak Rysunek 4, porównuje konstytutywnie aktywną, dominująco negatywną oraz aktywną i nieaktywną formę RapR-Shp2. Eksperyment ten przeprowadzono bez immunoprecypitacji konstruktów. Został on zaprojektowany w celu charakterystyki efektów sygnalizacji w dół szlaku konstruktu RapR-Shp2 wewnątrz komórek. W tym przypadku konstrukty Shp2 wyeksprymowano w komórkach HEK293T. Wykazano, że fosforylacja efektora ERK1/2 w dół szlaku wzrasta w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2, analogicznie jak w próbce konstytutywnie aktywnej. Nieaktywny RapR-Shp2 nie indukował tej zmiany. Wskazuje to, że sygnalizacja Shp2 w dół szlaku zostaje zachowana po wbudowaniu domeny RapR. Podobnie, znane fosfosubstraty EGFR i PLCγ uległy defosforylacji w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2 w komórkach A431.

Na koniec Rysunek 6 przedstawia wyniki aktywacji RapR-Shp2 w odniesieniu do morfodynamiki komórek HeLa. Po aktywacji RapR-Shp2 w komórkach zaobserwowano wzrost aktywności protruzywnej oraz powierzchni komórek. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 jest wystarczająca do wywołania zmian morfodynamicznych w komórkach HeLa i może pozwolić badaczom na analizę specyficznych szlaków sygnałowych downstream odpowiedzialnych za ten efekt.

figure-results-1
Rycina 4: Wyniki testu aktywności opartego na paksyllinie: Formy konstytutywnie aktywną, dominująco negatywną oraz RapR-Shp2 poddano immunoprecypitacji, a następnie testowi aktywności zgodnie z opisanym protokołem. Poziomy pY31 paksylliny w próbkach CA i RapR-Shp2 były podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 po aktywacji wykazywał aktywność zbliżoną do CA Shp2. Próbka nieaktywnego RapR-Shp2 nie wykazała aktywności, podobnie jak próbka DN, co dowodzi braku tzw. „przecieku” (leaking). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser et al.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = fosfataza tyrozynowa białek zawierająca domenę homologii Src 2; DN = dominująco negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 5: Wyniki analizy lizatu całych komórek: W komórkach HEK293T wyeksponowano warianty konstytutywnie aktywne, dominująco negatywne oraz RapR-Shp2, a następnie przeprowadzono protokół analizy lizatu całych komórek. W stanie nieaktywnym RapR-Shp2 nie aktywował ERK1/2 poprzez fosforylację, co było podobne do próbki DN Shp2. Wskazuje to, że RapR-Shp2 nie wykazuje aktywności w stanie nieaktywnym. Po aktywacji poziom fosforylacji ERK1/2 był zbliżony do poziomu w próbce CA Shp2, co świadczy o prawidłowej aktywacji i przekazywaniu sygnału w dół kaskady przez Shp2. Podobnie w komórkach A431 wykazujących ekspresję RapR-Shp2 zaobserwowano spadek fosforylacji zarówno EGFR, jak i PLCγ, które są znanymi substratami Shp2. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Fauser et al.12. Skróty: RapR = regulowany rapamycyną; Shp2 = fosfataza tyrozinowa białka zawierająca domenę homologiczną do Src-2; DN = dominująco negatywny; CA = konstytutywnie aktywny; ERK = kinaza regulowana sygnałami zewnątrzkomórkowymi; GAPDH = dehydrogenaza gliceraldehydu 3-fosforanu; EGFR = receptory czynnika wzrostu naskórka; PLCγ = fosfolipaza C gamma; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 6: Analiza danych dotyczących pola powierzchni komórek i aktywności protrusyjnej na podstawie obrazowania na żywo: Komórki HeLa zostały przetransfekowane RapR-Shp2 i poddane opisanemu protokołowi obrazowania na żywo. Dane przeanalizowano zgodnie z protokołem analizy danych. Po aktywacji (oznaczonej pionową szarą linią) w komórkach HeLa zaobserwowano wzrost zarówno aktywności protrusyjnej, jak i pola powierzchni komórek. W próbkach negatywnych, wykazujących ekspresję jedynie FRB, aktywność ta nie wystąpiła. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 indukuje szybkie zmiany morfodynamiczne w komórkach HeLa oraz sprzyja rozprzestrzenianiu się i tworzeniu wypustek komórkowych. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fauser et al.12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki w zakresie opracowywania, charakterystyki i stosowania fosfataz kontrolowanych chemicznie. Narzędzie RapR-Shp2 opiera się na przełączniku regulowanym rapamycyną umieszczonym w domenie katalitycznej Shp2. Mocną stroną tego narzędzia jest specyficzność i ścisła kontrola czasowa aktywności fosfatazy. Narzędzie ma zastosowanie do innych fosfataz i w połączeniu z wcześniej opisaną technologią RapR-TAP pozwala na rekonstrukcję poszczególnych dalszych szlaków sygnałowych26. Unikalne możliwości podejścia RapR pozwoliły naukowcom zidentyfikować przejściowe zdarzenia wywołane aktywacją Shp2 i przeanalizować specyficzne szlaki sygnałowe regulujące poszczególne procesy morfodynamiczne.

Na konstrukcję fosfatazy RapR wpływa kilka krytycznych czynników. Dobrze rozdzielona struktura krystaliczna domeny katalitycznej badanej fosfatazy jest bardzo pomocna w wyborze miejsca insercji iFKBP. Jednak ze względu na duże podobieństwo strukturalne między fosfatazami tyrozynowymi, wyrównanie sekwencji aminokwasowych domen katalitycznych może dostarczyć wystarczających informacji do identyfikacji miejsca insercji, jak pokazano na podstawie wyrównania Shp2 do PTP1B i PTPPest (Figura 2). Dla RapR-Shp2, Val406, znajdujący się w miejscu sprzężonym z krytyczną katalityczną pętlą WPD przez β-nić, został wybrany jako najbardziej optymalne miejsce insercji. To samo miejsce insercji może skutkować skuteczną regulacją innych PTPaz, jak wykazano dla PTP1B i PTP-PEST12 (Figura 2A).

Jeśli fosfataza, która jest przedmiotem zainteresowania, jest białkiem wielodomenowym, informacje strukturalne o organizacji domen pomogą zapobiec zakłócaniu innych funkcji PTPazy. Kolejnym czynnikiem wpływającym na konstrukcję optymalnej RapR-PTPazy jest to, ile aminokwasów powinno zostać zastąpionych przez wstawiony iFKBP. Większe i bardziej elastyczne pętle indukcyjne w PTPazie mogą wymagać dodatkowego skrócenia, aby zapewnić ścisłą regulację aktywności katalitycznej przez iFKBP. Podobnie, długość i skład łączników łączących iFKBP z PTPazą będą miały wpływ na skuteczność regulacji. Krótkie łączniki składające się z pojedynczej reszty Gly zapewnią ściślejszą regulację, ale mogą zmniejszyć maksymalną aktywność enzymu, jeśli wprowadzą trwałe zniekształcenia strukturalne, nawet gdy iFKBP jest związany z rapamycyną i FRB. Średniej długości łączniki Gly-Ser-Gly zapewniają większą elastyczność, ale mogą nie być wystarczająco sztywne dla niektórych PTPaz. Długie łączniki złożone z Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly pomogą zapobiec tworzeniu się niezamierzonych struktur drugorzędowych, które mogą wpływać na regulację PTPazy. RapR-Shp2 został przetestowany ze wszystkimi trzema typami łączników; Łącznik Gly-Ser-Gly okazał się najbardziej optymalny.

Kluczowym aspektem decydującym o pomyślnym opracowaniu narzędzi RapR jest ustanowienie solidnego testu fosfatazy i obecność odpowiednich kontroli. Porównanie aktywności fosfatazy RapR z aktywnością dominująco-ujemnych i konstytutywnie aktywnych wersji POI pozwala ocenić nieszczelność konstruktu RapR i zakres aktywacji. Ponadto brak defosforylacji przez konstytutywnie aktywną fosfatazę lub zmniejszona fosforylacja przez dominującego mutanta ujemnego będzie wskazywał na niewłaściwe warunki reakcji.

W przypadku testu fosfatazy warunki reakcji będą wymagały optymalizacji dla każdej PTPazy. Dostosowanie temperatury, czasu reakcji i warunków buforowych będzie zależeć od interesującej PTPazy. Energiczne mieszanie próbek ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wystarczającego wymieszania PTPazy związanej z sefarozą i jej substratu. Wreszcie, jeśli opisany test fosfatazy nie jest optymalny dla konkretnej interesującej nas PTPazy, wówczas jako alternatywny test można zastosować reakcję fosfatazy z użyciem fosforanu p-nitrofenylu jako substratu27.

W eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek podczas przygotowywania próbki należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. W przedstawionym protokole zastosowano pożywkę L-15 opartą na buforze HEPES, który nie jest wrażliwy na stężenie CO2 . Jeśli pożądane jest użycie pożywki na bazie wodorowęglanów, należy uzupełnić HEPES w celu utrzymania pH próbki lub zastosować komorę do obrazowania środowiskowego uzupełniającą CO2 . Protokół zaleca nałożenie warstwy oleju mineralnego na próbkę, aby zapobiec parowaniu i uprościć dodawanie rapamycyny. Można zastosować inne konfiguracje wykorzystujące komorę do obrazowania środowiskowego lub komorę zamkniętą, ale dodanie rapamycyny może być trudniejsze. Podczas dodawania rapamycyny do komórek podczas obrazowania należy upewnić się, że etap się nie przesunie, a komórki nie zostaną zakłócone. Wszelkie dodatkowe ruchy próbki podczas procesu obrazowania będą utrudniać gromadzenie danych. Intensywność oświetlenia i czas ekspozycji powinny być utrzymywane na niskim poziomie, aby zmniejszyć fototoksyczność, szczególnie w przypadku obrazowania długotrwałego. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednia wydajność transfekcji komórek. Stosunek 1:1 DNA FRB do RapR-Shp2 zapewnia odpowiednią ekspresję, ale w przypadku nowych konstruktów stosunek ten będzie wymagał korekty. Aby zapewnić skuteczną aktywację, FRB powinien być wyrażany na wyższym poziomie niż fosfataza RapR.

Ograniczeniem narzędzi opartych na RapR jest brak możliwości szybkiej dezaktywacji. Zmiana pożywki usuwa zewnątrzkomórkową rapamycynę, ale dezaktywacja konstruktów RapR może trwać wiele godzin ze względu na bardzo ścisłe wiązanie rapamycyny z konstruktem RapR. Szybką inaktywację można osiągnąć poprzez dodanie inhibitora miejsca aktywnego PTPazy. Jednak potencjalne niezamierzone skutki inhibitora mogą sprawić, że interpretacja wyników będzie trudna. Ponadto, nawet w połączeniu z inhibitorem PTPazy, podejście RapR nie może być stosowane w cyklicznych eksperymentach aktywacji/inaktywacji. Kolejnym ograniczeniem systemu RapR jest brak kontroli przestrzennej. Konstrukty RapR ulegają globalnej ekspresji, a zatem są aktywowane w całym komórce. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest zastosowanie rapamycyny w klatce, która może być uwalniana przez światło bliskie UV lokalnie w komórce28,29. Co więcej, narzędzie RapR może być modyfikowane w celu uzyskania aktywacji fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania w określonym kompleksie białkowym lub w określonej lokalizacji subkomórkowej. Poprzez przyłączenie partnera wiążącego lub znacznika subkomórkowego do FRB, RapR-PTPaza będzie ukierunkowana na określone białko lub miejsce w komórce. Wreszcie, rapamycyna jest dobrze scharakteryzowanym immunosupresorem poprzez hamowanie mTOR i może wpływać na sygnalizację komórkową, potencjalnie zakłócając sygnalizację interesującej PTPazy. Aby przezwyciężyć ten problem, dobrą alternatywą są nieimmunosupresyjne analogi rapamycyny (iRap i AP21967). Wykazano, że oba związki regulują konstrukty RapR14.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Jordan Fauser za jej wkład w rozwój RapR-Shp2 i związanych z nim protokołów. Prace zostały wsparte nagrodą 5R35GM145318 przyznaną przez NIGMS, nagrodą R33CA258012 przyznaną przez NCI oraz nagrodą P01HL151327 przyznaną przez NHLBI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Szkiełka nakrywkowe 25 mm okrągłeWarner Instruments64-0715
Probówki 1,5 mlUSA Scientificcc7682-3394
2x BuforNa 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żelBiorad4561096
5x Phusion Plus BufferThermo ScientificF538L
A431 KomórkiATCCCRL-1555
AgarsosGoldBiotechA-201
Komora komórkowa attofluoruinvitrogenA7816
Benchmark Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gemini Bio-products100-106Potrójna inaktywowana termicznie 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowany
Brig 35,30 w/v %Acros329581000
BSAGoldBiotechA-420
CellGeoN/AN/AOpublikowano w 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red barwnik błonowy plazmatycznyinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMixGenesee42-138
DH5a kompetentny komórkiNEBC2987H
DMEMCorning15-013-CV
DMSOThermo ScientificF-515
Drabinka DNAGoldBioD010-500
dNTPsNEBN04475
DpnI EnzymNEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Ditiothreitol, Odczynniki Clelanda
EGTAAcros409910250
Fibronektyna z osocza bydlęcegoSigmaF1141
Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6Odczynnik do transfekcjiPromegaE2692
Zestaw do ekstrakcji żeluThermo ScientificK0692GeneJET Gel
Gel Zielony Kwas nukleinowy BarwnikGoldBioG-740-500
Żel ładujący Barwnik fioletowy 6xNEBB7024A
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T CellsATCCCRL-11268
HeLa CellsATCCCRM-CCL-2
HEPESFischerBP310-500
Oprogramowanie do przetwarzania ImageJN/A/A
Igepal CA-630 (NP40)SigmaI3021
Bufor25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KClSigmaP-4504
L-15 1xCorning10-045-CV
LB AgarFisherBP1425-2
Bufordo lizy20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
DoCellGeo MathWorksN/A2022b
automatyzacji mikroskopii metamorficznej i analizy obrazuNIEDOTYCZY
NIE DOTYCZY MgCl2Fisher ChemicalM33-500
Olej mineralnySigmaM5310
MiniPrep KitGene Choice96-308
Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele 12 dołkówBio-Rad4561085
Biologia molekularna Klasa wodnaCorning46-000-CV
Wielopasmowe lustro polichroiczneTechnologia Chroma89903BS
NaClFisher ChemicalS271-3
Olympus UPlanObiektyw SAPO 40xOlympusN/A
PBS bez Ca i MgCorning21-031-CV
Probówki do PCRlabForce1149Z650,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski Indywidualnie mocowane kołpaki
Polimeraza DNA Phusion Plus ThermoScientificF630S
StarteryIDT
Protein-G SepharoseMillipore16-266
Membrany PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Bibuła filtracyjna Kanapki
RapamycinFisherAAJ62473MF
0,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sódCorning25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50xFischerBP1332-1do elektroforezy
Bufor20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-merkaptoetanolFisher ChemicalO3446I-100
przeciwciała
Anty-EGFRSygnalizacja komórkowaprzeciwciała 2232
Przeciwciało anty-ERK 1/2Sygnalizacja komórkowa9102
Przeciwciało antyflagoweMillipore-SigmaF3165
Przeciwciało anty-GAPDHinvitrogenAM4300
Przeciwciało anty-GFPClontech632380
Przeciwciało anty-mCherryinvitrogenM11217
Przeciwciało anty-paxillinThermo FischerBDB612405
Przeciwciało anty-fosfo-EGFR Y992Sygnalizacja komórkowaprzeciwciała 2235
Anty-fosfo-erk 1/2 T202/Y204 Sygnalizacjakomórkowa9101
Przeciwciało anty-fosfo-paksyliny Y31Millipore-Sigma05-1143
Anty-fosfo-PLCγ Y783Sygnalizacja komórkowa przeciwciała14008
Anty-PLCγ Sygnalizacja komórkowa5690
Laemmli N imidazolowy uruchomienia funkcji CellGeo użyto aktualizacji R Oprogramowanie do płuczący przeciwciała przeciwciał

Bibliografia

  1. Amin, A. R. M. R., et al. SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).
  2. Niogret, C., et al. Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  3. Wang, Y. -C., et al. Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling. J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).
  4. Yu, M., et al. The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK. Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).
  5. Lauriol, J., et al. Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines. J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).
  6. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nat Genet. 29, 465-468 (2001).
  7. Xu, R., et al. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia. Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).
  8. Mustelin, T., et al. Protein tyrosine phosphatases. Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).
  9. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma. Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).
  10. Guo, M., et al. Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials. Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).
  11. Weiser, D. C., Shenolikar, S. Use of protein phosphatase inhibitors. Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).
  12. Fauser, J., et al. Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity. J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).
  13. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).
  14. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).
  15. Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineering proteins for allosteric control by light or ligands. Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).
  16. Wang, Y., et al. Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth. EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).
  17. Wang, L., et al. SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation. FASEB J. 35, e21106(2021).
  18. Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).
  19. Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials. Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).
  20. Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration. Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).
  21. Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion. J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).
  22. Kramer, M. F., Coen, D. M. Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization. Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).
  23. Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies. Biotechniques. 7, 689-690 (1989).
  24. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  26. Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. Kinase Signaling Networks. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).
  27. Mercan, F., Bennett, A. M. Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates. Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).
  28. Karginov, A. V., et al. Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP. J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).
  29. Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. Optochemical activation of kinase function in live cells. Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Regulacja rapamycynnarz dzia chemogenetyczneaktywacja fosfatazyregulacja allosterycznafosfataza SHIP 2kom rki HEK 293Tanaliza immunoprecypitacyjnaWestern blotmorfodynamika kom rek

Powiązane artykuły