Rozwój i zastosowanie fosfataz tyrozynowych regulowanych rapamycyną

Summary

Ten protokół opisuje projektowanie, tworzenie i stosowanie fosfataz regulowanych rapamycyną. Metoda ta zapewnia wysoką swoistość i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach.

Abstract

Fosfatazy tyrozynowe to ważna rodzina enzymów, które regulują kluczowe funkcje fizjologiczne. Są one często rozregulowane w chorobach ludzkich, co czyni je kluczowymi celami badań biologicznych. Narzędzia, które umożliwiają regulację aktywności fosfatazy, odgrywają zasadniczą rolę w analizie ich funkcji. Tradycyjne podejścia, takie jak nadekspresja konstytutywnie aktywnych lub dominujących mutantów ujemnych lub regulacja w dół za pomocą siRNA, nie mają kontroli czasowej. Inhibitory fosfatazy często mają słabą swoistość i pozwalają badaczom jedynie określić, na jakie procesy wpływa hamowanie fosfatazy.

Opracowaliśmy podejście chemogenetyczne, system regulowany przez Rapamycynę (RapR), który pozwala na allosteryczne regulowanie domeny katalitycznej fosfatazy, co umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy. System RapR składa się z domeny iFKBP wprowadzonej do miejsca allosterycznego w fosfatazie. Wewnętrzna dynamika strukturalna domeny RapR zakłóca domenę katalityczną, prowadząc do inaktywacji enzymu. Dodatek rapamycyny pośredniczy w tworzeniu kompleksu między iFKBP a koeksprymowanym białkiem FRB, który stabilizuje iFKBP i przywraca aktywność domenie katalitycznej fosfatazy.

Ten system zapewnia wysoką specyficzność i ścisłą kontrolę czasową aktywacji fosfatazy w żywych komórkach. Unikalne możliwości tego systemu umożliwiają identyfikację zdarzeń przejściowych i badanie poszczególnych szlaków sygnałowych za fosfatazą. Protokół ten opisuje wytyczne dotyczące rozwoju fosfatazy RapR, jej charakterystyki biochemicznej oraz analizy jej wpływu na dalszą sygnalizację i regulację morfodynamiki komórki. Zawiera również szczegółowy opis strategii inżynierii białek, testów in vitro analizujących aktywność fosfatazy oraz eksperymentów obrazowania żywych komórek identyfikujących zmiany w morfologii komórek.

Introduction

Białkowe fosfatazy tyrozynowe to kluczowa rodzina białek biorących udział w wielu zdarzeniach sygnalizacji komórkowej. Wykazano, że odgrywają one kluczową rolę w regulacji proliferacji, migracji i apoptozy komórek^1,2,3. W związku z tym rozregulowanie białkowych fosfataz tyrozynowych prowadzi do wielu wyniszczających chorób i zaburzeń^4,5,6,7. Badanie fizjologicznej funkcji fosfataz tyrozynowych i ich roli w rozwoju tych patologii było historycznie utrudnione przez brak narzędzi potrzebnych do badania zawiłości sygnalizacji fosfatazy⁸.

Tradycyjnie, fosfatazy są badane przy użyciu metod, które nie mają pożądanej specyficzności i/lub nie zapewniają czasowej kontroli nad ich aktywnością. Te krytyczne ograniczenia dostępnych narzędzi sprawiają, że trudno jest przeanalizować konkretne role fosfataz w szlakach sygnałowych. Nadekspresja konstytutywnie aktywnych i dominujących mutantów ujemnych lub obniżenie ekspresji fosfatazy zapewnia specyficzność, ale brakuje jej kontroli czasowej i często może uruchomić mechanizmy kompensacyjne, które maskują prawdziwą funkcję enzymu.

Inhibitory farmakologiczne pozwalają na czasową regulację fosfataz. Jednak wiele inhibitorów fosfatazy jest notorycznie niespecyficznych ze względu na dobrze zachowany skład miejsca aktywnego w fosfatazach tyrozynowych⁹. Dodatkowo, ze względu na ograniczenia konstrukcyjne, inhibitory ukierunkowane na miejsce katalityczne wykazują słabą przepuszczalność błony komórkowej¹⁰. Innym ograniczeniem inhibitorów jest to, że pozwalają one jedynie na badanie skutków inaktywacji fosfatazy¹¹. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na narzędzia, które umożliwią specyficzną, regulowaną czasowo aktywację fosfataz. Narzędzia te pozwolą naukowcom zidentyfikować bezpośrednie skutki aktywacji fosfatazy, oddzielając je od wielu równoległych kaskad sygnałowych, często aktywowanych przez bodźce biologiczne. Co ważne, ścisła kontrola czasowa aktywności umożliwia identyfikację przejściowych zdarzeń indukowanych przez fosfatazę i oddziela skutki ostrej i przedłużonej aktywności fosfatazy. Połączenie regulacji czasowej z analizą mutacyjną pozwoli na szczegółową analizę konkretnych ról poszczególnych domen fosfatazy i zbadanie jej dalszej sygnalizacji¹².

Aby rozwiązać problem braku pożądanych możliwości w istniejących narzędziach, grupa Karginova opracowała system Rapamycin Regulated (RapR)^13,14,15. System RapR wykorzystuje zmodyfikowaną domenę przełączającą iFKBP, która pozwala na allosteryczną regulację białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI). Wprowadzenie domeny iFKBP w pozycji allosterycznie sprzężonej z miejscem katalitycznym punktu POI sprawia, że jest ona podatna na regulację przez rapamycynę. W przypadku braku rapamycyny, iFKBP zakłóca działanie katalityczne ze względu na wewnętrznie wysoką dynamikę strukturalną iFKBP, a tym samym dezaktywuje POI. Dodatek rapamycyny indukuje interakcję iFKBP z białkiem FRB o koekspresji (Rysunek 1). Powoduje to stabilizację domeny przełączającej, co w konsekwencji przywraca strukturę i funkcję domeny katalitycznej punktu POI. W związku z tym narzędzie pozwala na konkretną i regulowaną czasowo aktywację punktu POI.

Rysunek 1: Schemat systemu regulowanego rapamycyną RapR-Shp2. RapR pozwala na allosteryczną aktywację interesującego białka z dodatkiem rapamycyny. Ten rysunek został zmodyfikowany z Fauser et al.¹². Skróty: iFKBP = insertable FKBP12; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę; R = rapamycyna; Shp2 = Src homologia-2 białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Narzędzie RapR może być stosowane do różnych rodzin białek. Może być stosowany do regulacji kinaz białkowych, a także fosfataz^12,14. Protokół ten skupi się na zastosowaniu narzędzia RapR do kontroli fosfatazy Shp2. Shp2 to wszechobecna w ekspresji białko fosfataza tyrozynowa, która bierze udział w procesach sygnalizacyjnych, takich jak proliferacja, migracja, immunomodulacja i różnicowanie^1,16,17,18. Rozregulowanie Shp2 jest związane z wieloma nowotworami litymi, białaczką szpikową i zaburzeniami rozwojowymi^5,7. Jednak Shp2 padł ofiarą tych samych niedociągnięć narzędzia, jak opisano powyżej. Aby zwalczyć te ograniczenia, opracowano i scharakteryzowano RapR-Shp2, specyficznie i czasowo regulowany konstrukt Shp2¹².

Przed opracowaniem RapR-Shp2 było wiadomo, że Shp2 bierze udział w migracji komórek^19,20,21. Jednak jego konkretna rola w sygnalizacji zaangażowanej w ten proces była nieznana. Nie wiadomo było również, w jakiej skali czasowej Shp2 reguluje migrację komórek i jakie specyficzne zmiany morfodynamiczne wywołuje w różnych punktach czasowych swojej aktywacji. Co więcej, nie było jasne, czy ostra i przedłużona aktywacja Shp2 spowoduje różne skutki. Za pomocą RapR-Shp2 stwierdzono, że ostra aktywacja Shp2 indukuje przejściowe rozprzestrzenianie się komórek, wzrost wypukłości, polaryzację komórek i migrację. Zidentyfikowano również specyficzne szlaki za Shp2, które regulują wyraźne zmiany morfodynamiczne¹². Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat projektowania i charakterystyki RapR-Shp2, które mogą być wykorzystane do kierowania rozwojem i zastosowaniem innych fosfataz RapR.

Protocol

1. Projektowanie fosfataz RapR

1. Planowanie
   UWAGA: Używając RapR-Shp2 jako przykładu, protokół ten szczegółowo opisuje ważne kroki tworzenia fosfatazy tyrozynowej regulowanej rapamycyną. Opisany protokół jest zoptymalizowany pod kątem Shp2 i mogą być potrzebne dodatkowe modyfikacje, aby dopasować je do określonych właściwości poszczególnych fosfataz.
   1. Aby zapewnić, że aktywność katalityczna Shp2 jest kontrolowana wyłącznie przez rapamycynę, a nie przez mechanizmy endogenne, wprowadź mutację do fosfatazy, aby utrzymać ją w konstytutywnie aktywnej konformacji. W przypadku Shp2 należy wprowadzić mutację D61A.
      UWAGA: Jeśli mutacja aktywująca nie zostanie wprowadzona dla określonej PTPazy, wówczas jej wariant RapR będzie funkcjonował jako system bramkowany AND regulowany przez sygnały endogenne i rapamycynę.
   2. Zidentyfikuj miejsca insercji iFKBP w domenie katalitycznej fosfatazy, korzystając ze struktury krystalicznej, aby pokierować wyborem, jak opisano wcześniej¹³. Jeśli struktura nie jest dostępna, wykonaj wyrównanie sekwencji aminokwasów z domeną katalityczną fosfatazy Shp2, aby zidentyfikować miejsca insercji (Rysunek 2A). Upewnij się, że miejsce wprowadzenia znajduje się w elastycznej pętli, która jest strukturalnie sprzężona z kieszenią katalityczną, ale umieszczona z dala od kieszeni, aby zapobiec sterycznej przeszkodzie wiązaniu substratu przez iFKBP.
      UWAGA: Dalsze szczegóły dotyczące wstawiania są omówione w Dyskusji.
   3. Rozważ typ sekwencji łącznika, która ma być używana między wstawioną domeną iFKBP a fosfatazą będącą przedmiotem zainteresowania. Wybór optymalnej sekwencji łącznika jest niezwykle ważny dla sukcesu narzędzia RapR i jest omawiany w dalszej części dyskusji (Rysunek 2B).

Rysunek 2: Schemat rozważań przy projektowaniu fosfatazy RapR. (A) Wyrównanie Shp2 (fioletowy), PTP1B (zielony) i PTP-PEST (różowy) z podświetlonymi konserwatywnymi miejscami wstawiania. (B) Reprezentacja wstawiania łącznika między Shp2 i iFKBP. (C) Domena fosfatazy Shp2 w kolorze beżowym z miejscami insercji zaznaczonymi na niebiesko. Ten rysunek został zmodyfikowany z Fauser et al.¹². Skróty: Shp2 = Src homologia-2 białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę; iFKBP = wkładany FKBP12; PTP = białkowa fosfataza tyrozynowa; RapR = regulowany przez rapamycynę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Tworzenie fosfatazy RapR

1. Wprowadzenie iFKBP do fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania przy użyciu zmodyfikowanej mutagenezy ukierunkowanej
   1. Wygeneruj "megaprimer" kodujący iFKBP za pomocą PCR.
      1. Zaprojektuj startery do syntezy "megaprimerów", które zawierają 20-25 nukleotydów wyżarzających się do końca 5' lub 3' iFKPB, sekwencji łącznikowej, która połączy iFKPB z fosfatazą będącą przedmiotem zainteresowania, oraz 28-32 nukleotydy odpowiadające miejscu insercji (Rysunek 3). Potwierdzić, że otrzymany produkt zawiera iFKPB otoczony fragmentami wyżarzającymi się przed i po miejscu wprowadzenia do fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania.
      2. Zsyntetyzować iFKBP zawierający "megaprimer" metodą PCR (10 μL 5x buforu polimerazy, 1 μL 50 ng/μL matrycy DNA zawierającej iFKBP, 2 μL 10 mM dNTP, 0,5 μL 100 μM zapasu każdego startera "megaprimer" [do przodu i do tyłu], 35 μL wody, 1 μL polimerazy DNA). Podziel tę reakcję PCR na 2 oddzielne reakcje po 25 μl przed uruchomieniem PCR. Uruchom cykl PCR zgodnie z zaleceniami producenta polimerazy DNA lub następującym standardowym cyklem PCR: (i) 98 °C przez 2 min, (ii) 98 °C przez 30 s, (iii) 55-70 °C przez 30 s, (iv) 72 °C przez 30 s, (v) powtórz kroki II-IV 25x, (vi) 72 °C przez 2 min.
      3. Oczyść "megaprimer" za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Załaduj zawartość PCR z poprzedniego kroku do 1% żelu agarozowego i zastosuj 120 V przez około 30 minut. Poszukaj w żelu "megastartera" o długości 400 nukleotydów, wytnij fragment i oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).
         UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
   2. Zmodyfikowana mutageneza kierowana na miejsce
      1. Przygotować zmodyfikowaną reakcję mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, używając plazmidu zawierającego gen fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania jako matrycę (5 μL 5x buforu polimerazy, 2 μL 50 ng/μL matrycy, 2 μL 10 mM dNTP, 10 μL ekstrahowanego "megaprimera", 2,5 μL wody, 2,5 μl DMSO, 1 μl polimerazy DNA).
         UWAGA: Dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej obniża temperaturę wyżarzania²².
      2. Uruchom następujący cykl PCR: początkowy etap denaturacji w temperaturze 98 °C przez 3 minuty, a następnie 18 cykli kolejnych etapów inkubacji w temperaturze 98 °C przez 30 s, 65 °C przez 20 s, 60 °C przez 20 s, 55 °C przez 20 s, 50 °C przez 20 s, 72 °C przez 18 min. Uruchom cykl przez noc (czas cyklu wynosi 7 godzin). Po zakończeniu cyklu przechowywać reakcję PCR w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
      3. Po zakończeniu cyklu dodać 1 μl enzymu DpnI i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 h.
         UWAGA: DpnI trawi pozostałą matrycę, zwiększając wydajność nowo zsyntetyzowanego produktu.
      4. Przekształć strawiony produkt w DH5α kompetentne komórki zgodnie z instrukcjami producenta. Przemianę należy rozlać na płytki agarowe LB z odpowiednim antybiotykiem do selekcji (karbenicylina dla konstruktu pcDNA RapR-Shp2). Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Po wyrośnięciu kolonii należy przechowywać płytki LB w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
         UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Izolacja pożądanego konstruktu DNA zawierającego fosfatazę RapR
   1. Wykonaj badanie przesiewowe PCR kolonii bakteryjnych²³. Ponieważ nie wszystkie kolonie wyhodowane na płytce LB będą zawierały pożądany plazmid, należy przeprowadzić badania przesiewowe przed izolacją DNA plazmidu.
      UWAGA: Użyj starterów do sita, które będą wyżarzać się do szablonu i w genie iFKBP. Badanie przesiewowe można wykonać przy użyciu mastermixu polimerazy Taq (patrz tabela materiałów).
   2. Po zidentyfikowaniu pozytywnych kolonii zaszczepić jedną pozytywną kolonię w 3 ml bulionu LB, w tym odpowiednim antybiotyku, inkubować i wstrząsać w temperaturze 37 °C przez noc.
   3. Ekstrahować plazmidowe DNA z płynnej kultury zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA (patrz tabela materiałów)
      UWAGA: Zaleca się sekwencjonowanie nowo utworzonego konstruktu PTPazy RapR przed kontynuowaniem oceny in vitro.

Rysunek 3: Schemat projektu startera i zmodyfikowanej strategii klonowania mutagenezy kierowanej na miejsce. Etap 1 to synteza iFKBP zawierającego "megaprimer" z "lepkimi końcami" wyżarzającymi się do miejsca insercji fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania, a etap 2 to wprowadzenie "megaprimera" do fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania. Ten rysunek został zmodyfikowany z Karginov et al.¹³. Skrót: iFKBP = insertable FKBP12. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ocena RapR-PTPazy za pomocą testu aktywności in vitro

UWAGA: Ten protokół jest używany do oceny regulacji aktywności zmodyfikowanej RapR-PTPazy. Poniżej opisano analizę immunoprecypitowanego Shp2 z wykorzystaniem ufosforylowanego N-końcowego fragmentu paxilliny jako substratu. Może być konieczne wybranie innego substratu dla określonej interesującej nas PTPazy.

1. Dzień 1
   1. Umieść 800 000 HEK293T komórek/studzienkę na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w pożywce DMEM uzupełnionej suplementem L-glutaminy (końcowe stężenie 2 mM) i 10% objętościowo FBS. Umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
2. Dzień 2
   1. Gdy komórki zlewają się w ~60–80%, należy je transfekować zgodnie z preferowanym protokołem producenta transfekcji regenta (patrz tabela materiałów).
      1. Przykład protokołu transfekcji: Dodać 1 μg plazmidowego DNA (pcDNA-mCherry-FRB i pcDNA-flag-RapR-Shp2, każdy) do 200 μl DMEM bez surowicy i 6 μl odczynnika do transfekcji i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodać 100 μl mieszaniny transfekcji na studzienkę komórek. Włączyć próbki transfekowane konstytutywnie aktywnymi i dominującymi ujemnymi konstruktami Shp2 jako kontrole. Inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
3. Dzień 3
   1. Przygotowanie białka-g Sepharose
      UWAGA: Przygotuj pocięte końcówki pipet przed użyciem Sepharose. Końcówki tnące powinny być używane na każdym kroku, na którym ma się do czynienia z Sepharose. Sefaroza musi być dokładnie zawieszona na każdym etapie pipetowania.
      1. Ponownie zawiesić i pobrać odpowiednią ilość sefarozy Protein-G do probówki o pojemności 1,5 ml. Do każdej studzienki w 6-dołkowej płytce użyj 10 μl sefarozy Protein-G. Aby uzyskać pełną płytkę 6-dołkową, użyj 60 μl sepharose.
      2. Przemyć sefarozę 1 ml buforu do lizy (patrz tabela materiałów). Mikrowirować przez 1 minutę przy 2,000 × g i ostrożnie usunąć bufor do lizy. Powtórz 2 razy.
      3. Zawiesić sefarozę w 380 μl buforu do lizy. Dodać BSA do końcowego stężenia 1 mg/ml i przeciwciała (0,5 μl dla każdej próbki IP, przeciwciało anty-Flag [patrz tabela materiałów]). Odwrócić na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 1,5 h.
         UWAGA: Optymalna ilość przeciwciała powinna być określona doświadczalnie dla każdego użytego przeciwciała.
   2. Przygotuj komórki do immunoprecypitacji.
      1. Dodać odpowiednią ilość rapamycyny (1 mM roztwór podstawowy w etanolu) do końcowego stężenia 1 μM lub dodać taką samą objętość etanolu (kontrola ujemna) do próbek. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
      2. Umieść 6-dołkową płytkę z komórkami na lodzie i delikatnie umyj komórki 3 ml zimnego PBS. Odessać PBS i dodać 300 μl buforu do lizy (z 1 μM rapamycyną dla aktywowanej próbki fosfatazy lub równoważną objętością etanolu w próbce kontroli ujemnej) i zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i mikrowirować przez 10 minut w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 4 °C.
      3. Przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml w celu sprawdzenia poziomu odciągu. Dodać 20 μl 2x Laemmli buforu z 5% β-merkaptoetanolem do każdej probówki, która ma być użyta do sprawdzenia ekspresji i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 minut. Pozostałą część supernatantu należy użyć do immunoprecypitacji w kroku 3.3.3.3.
   3. Immunoprecypitacja RapR-Shp2
      1. Przemyć sefalozę Protein-G z kroku 3.3.1.3. 1 ml buforu do lizy. Za każdym razem należy odwirowywać mikrowirówkę przez 1 minutę w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 4 °C i ostrożnie zasysać bufor do lizy. Powtórz ten krok 2 razy.
      2. Za pomocą odciętych końcówek ponownie zawieś sefarozę w buforze do lizy (50 μl na próbkę, więc w przypadku płytki 6-dołkowej należy ponownie zawiesić w 300 μl buforu do lizy). Pobrać pipetą 50 μl zawieszonej mieszaniny sefarozy do oddzielnej nowej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki.
         UWAGA: Ze względu na objętość sefalozy pozostanie ponownie zawieszona w roztworze buforu do lizy.
      3. Dodać pozostały supernatant z przygotowanych komórek z kroku 3.3.2.3 do każdej probówki sepharose. Obracać w temperaturze 4 °C przez 1,5–2 godziny.
   4. Oznaczenie aktywności fosfatazy
      UWAGA: Substrat Shp2 powinien być przygotowany przez fosforylację oczyszczonego N-końcowego fragmentu paxilliny przy użyciu konstytutywnie aktywnej kinazy Src zgodnie z wcześniej opisanym protokołem reakcji kinazy¹².
      1. Pod koniec etapu 3.3.3.3 przygotować roztwór fosfo-paksyliny. Na próbkę dodać roztwór fosfo-paksyliny (końcowe stężenie 3 μg/ml) do 40 μl całkowitego buforu imidazolowego (patrz tabela materiałów). Dodać rapamycynę do końcowego stężenia 1 μM do podwielokrotności roztworu fosfo-paksyliny dla aktywowanych próbek RapR-Shp2 i równoważną objętość etanolu do roztworu dla próbek nieaktywowanych.
      2. Ustaw wytrząsarkę grzewczą na 32 °C.
         UWAGA: Inne fosfatazy mogą wymagać innej temperatury dla optymalnej aktywności.
      3. Przepłukać sefalozę próbkami z kroku 3.3.3.3 2x 0,5 ml buforu do lizy (patrz tabela materiałów). Przemyć próbki 2x 0,5 ml buforu do mycia. Każdy bufor powinien zawierać rapamycynę o stężeniu 1 μM dla próbek aktywowanych lub równoważną objętość etanolu dla próbek nieaktywowanych. Po ostatnim płukaniu należy usunąć jak najwięcej buforu.
         UWAGA: Po osiągnięciu tego etapu pomocne może być użycie pipety do powolnego i ostrożnego usuwania końcowych ilości buforu, aby upewnić się, że żadna część sepharozy nie została zasysana. Wszelkie resztki buforu wpłyną na stężenie fosfo-paksyliny i doprowadzą do niedokładnego odczytu.
      4. Dodać 40 μl przygotowanej mieszaniny buforu imidazolowego fosfo-paksyliny do każdej próbki, z rapamycyną lub bez rapamycyny (w zależności od próbki). Trzepotać bardzo delikatnie, aby wymieszać i natychmiast umieścić w wytrząsarce grzewczej i inkubować przez 40 minut w temperaturze 32 °C. Ustawić wytrząsarkę grzewczą na minimum 1 000 obr./min, aby upewnić się, że próbka jest w pełni wymieszana przez cały czas inkubacji.
      5. Zatrzymać reakcję, dodając 40 μl 2x buforu Laemmli do każdej próbki. Próbki inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 minut. Ostudzić próbki.
      6. Załadować 15 μl każdej próbki (w tym próbek lizatu z kroku 3.3.2.3) na żel poliakrylamidowy SDS o gradiacji 4–15% i uruchomić standardowy protokół western blot przy użyciu membran PVDF.
      7. Osusz za pomocą przeciwciała anty-Flag do wykrycia konstruktu RapR-Shp2, anty-mCherry do wykrycia mCherry-FRB i anty-pY118 lub anty-pY31 paxillin do wykrycia fosforylacji paxillin.
         UWAGA: Wynikowe western bloty powinny wyglądać podobnie do Rysunek 4.

4. Analiza aktywności RapR-Shp2 w żywych komórkach

UWAGA: Ten protokół jest używany do określenia zdolności RapR-Shp2 do defosforylacji endogennych substratów i indukowania dalszej sygnalizacji. Inne RapR-PTPazy będą wymagały analizy ich specyficznych substratów i szlaków.

1. Dzień 1
   1. Umieść 198 000 komórek A431 / dołek na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i L-glutaminą (końcowe stężenie 2 mM). Umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .}
2. Dzień 2
   1. Zainfekuj komórki konstruktami adenowirusowymi eksprymującymi RapR-Shp2 i FRB, dodając adenowirusa bezpośrednio do pożywki już znajdującej się w naczyniu. Pozostawić adenowirusa na komórkach w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 na} noc. Używaj komórek zakażonych FRB tylko jako kontroli negatywnej.
      UWAGA: Ilości adenowirusa będą musiały być ustalane indywidualnie dla każdego przypadku w zależności od miana.
3. Dzień 3
   1. Zagłodzić komórki A431 przez inkubację w DMEM z 0,5% FBS przez 4 godziny przed eksperymentem.
   2. Dodać rapamycynę do końcowego stężenia 1 μM lub tej samej objętości etanolu (kontrola ujemna) do komórek przez 2–4 godziny
      UWAGA: Inkubacja może być inna dla innych fosfataz.
   3. Umieść 6-dołkową płytkę z komórkami na lodzie i delikatnie umyj komórki 3 ml zimnego PBS. Odessać PBS, dodać 300 μl buforu do lizy (patrz tabela materiałów) i energicznie zeskrobać za pomocą skrobaka do komórek. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml i mikrowirować przez 5 minut w temperaturze 2 000 × g w temperaturze 4 °C.
   4. Przenieść 250 μl każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 250 μl 2x buforu Laemmli z 5% β-merkaptoetanolem i inkubować w temperaturze 95–100 °C przez 5 minut.
   5. Załaduj 25 μl każdej próbki na żel SDS-PAGE o gradiencie 4–15% i uruchom standardowy protokół western blot przy użyciu membran PVDF.
   6. Oceń defosforylację EGFR i PLCγ za pośrednictwem RapR-Shp2 przy użyciu przeciwciał anty-pY992 EGFR i anty-pY783 PLCγ. Oceń dalszą aktywację kinazy MAP Erk1/2, oceniając jej fosforylację na resztach pT202/pY204.
      UWAGA: Wynikowe western bloty powinny wyglądać podobnie do Rysunek 5.

5. Analiza zmian morfodynamicznych wywołanych aktywacją RapR-Shp2 w komórkach HeLa za pomocą obrazowania żywych komórek

UWAGA: Ten protokół jest używany do określenia wpływu aktywacji RapR-Shp2 na tworzenie wypukłości komórek, rozprzestrzenianie się komórek i migrację.

1. Dzień 1
   1. Umieść 700 000 komórek HeLa w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Pozwól komórkom przylegać do naczynia (~2–3 godziny).
   2. Transfekcję komórek należy przeprowadzić zgodnie z preferowanym protokołem producenta odczynnika do transfekcji (patrz Tabela materiałów).
      1. Przykładowy protokół transfekcji: Dodać 0,5 μg DNA (plazmidy pcDNA-mCherry-FRB i pcDNA-Venus-RapR-Shp2, każdy) do 100 μl DMEM bez surowicy i 6 μl odczynnika do transfekcji. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać mieszaninę transfekcji do komórek i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Używaj komórek transfekowanych pcDNA-mCherry-FRB tylko jako kontroli negatywnej.
   3. Okrągłe szkiełko nakrywkowe #1.5 o średnicy 25 mm pokryć fibronektyną (5 mg/l) przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
2. Dzień 2
   1. Umyj szkiełko nakrywkowe z powlekanego szkła PBS.
   2. Pokryj transfekowane komórki HeLa na szkiełku nakrywkowym z powlekanego szkła w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FBS i L-glutaminą (końcowe stężenie 2 mM), aby osiągnąć 30% konfluencję na 4 godziny przed obrazowaniem.
   3. Dwie godziny po posiewie delikatnie zmień podłoże w płytce na wstępnie podgrzane podłoże Leibovitz L-15 bez surowicy na 2 godziny.
   4. Wybarwić komórki barwnikiem błony plazmatycznej CellMask Deep Red zgodnie z protokołem producenta.
   5. Umieść szkiełko nakrywkowe w czystej komorze celi obrazowania (patrz tabela materiałów). Dodaj 1 ml podgrzanego podłoża L-15 i przykryj 1 ml podgrzanego oleju mineralnego, aby zapobiec parowaniu. Przechowywać komorę w temperaturze 37 °C do czasu wykonania obrazowania.
   6. Zobrazuj komórki w temperaturze 37 °C za pomocą podgrzewanego stolika.
      1. Wybierz odpowiednie kanały do obrazowania konstruktu RapR i CellMask do obrazowania epifluorescencyjnego. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć wspomnianego obiektywu 40x (patrz tabela materiałów) i następujących zestawów filtrów: filtry wzbudzenia 514/10 i emisji 540/21 do obrazowania Venus-RapR-Shp2, filtry wzbudzenia 561/10 i filtry emisji 595/40 do obrazowania mCherry-FRB oraz filtry wzbudzenia 640/20 i emisji 655LP do obrazowania CellMask Deep Red. Użyj wielopasmowego lustra polichroicznego dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych (patrz tabela materiałów).
      2. Rób zdjęcia co 2 minuty przez 4–4,5 godz.
         UWAGA: Szybsze zmiany morfodynamiczne będą wymagały częstszej akwizycji.
      3. Po 1 godzinie obrazowania dodać rapamycynę do końcowego stężenia 1 μM w celu stymulacji RapR-Shp2.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Ten protokół opisuje tworzenie masek komórkowych w oparciu o . Pliki stosu TIF zebrane z eksperymentów obrazowania na żywo. Następnie opisze, jak utworzyć makro w ImageJ w celu przeanalizowania masek, co spowoduje powstanie arkusza kalkulacyjnego obszaru komórki, który jest następnie analizowany pod kątem zmian w czasie. Na koniec aktywność protruzyjna i retrakcyjna komórek zostanie przeanalizowana za pomocą Metamorph.

1. Wygeneruj maskę binarną obrazów CellMask za pomocą funkcji MovThresh z pakietu oprogramowania CellGeo²⁴.
2. Skopiuj folder MovThresh do folderu analizy obrazu.
3. Skopiuj obrazy kanału CellMask lub innego znacznika membrany do folderu MovThresh.
   1. Jeśli wiele komórek zostało zobrazowanych w jednej pozycji, przytnij obrazy, aby wygenerować pliki zawierające tylko jedną komórkę przed utworzeniem maski w MatLab.
4. Upewnij się, że katalog jest poprawnie ustawiony na folder MovThresh w MatLab.
5. Uruchom MovThresh.
6. Importuj stosy obrazów pojedynczo.
7. Wybierz opcję Wygładzona krzywa, a następnie uruchom polecenie Rethreshold.
8. Zapisz jako numer Mask_Image w nowym folderze o nazwie Maski.
9. Gdy wszystkie stosy obrazów zostaną przekształcone w maski, otwórz je w oprogramowaniu ImageJ²⁵.
   1. Analiza obszaru komórki w ImageJ
      1. Otwórz wszystkie stosy obrazów maski w ImageJ.
      2. Dostosuj ustawione pomiary do obszaru.
      3. Kliknij Wtyczki | Makra | Rekord.
      4. Kliknij opcję Process (Proces) | Binarny | Utwórz plik binarny.
         1. Wybierz opcję domyślną.
            UWAGA: Nie klikaj niczego dodatkowego podczas nagrywania makra. Jeśli dołączono dodatkowe kroki, zaleca się ponowne uruchomienie od kroku 6.9.1.3.
      5. Kliknij pozycję Analizuj | Analizuj cząstki.
         1. Odznacz wszystkie pola oprócz Podsumowania.
      6. Zakończ nagrywanie i kliknij Utwórz Utwórz makro.
      7. Naciśnij Uruchom dla każdego stosu obrazów po jego wybraniu i zapisz tabelę wyników dla każdego stosu obrazów. Domyślna opcja zostanie zapisana jako plik csv.
      8. Zapisz makro i wykorzystaj je ponownie do przyszłych analiz (opcjonalnie).
   2. Przetwarzanie danych obszaru w arkuszu kalkulacyjnym
      1. Dla każdej analizowanej komórki należy uśrednić obszar komórki z obrazów wykonanych przed aktywacją rapamycyną.
      2. Podziel wszystkie wartości powierzchni przez średnią powierzchnię komórki poprzedzającej dodanie rapamycyny.
      3. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i określ 90% przedziały ufności. Wykreśl dane.
   3. Analiza aktywności wystającej komórek
      1. Skopiuj folder ProActive do folderu analizy obrazu.
      2. Skopiuj stosy zamaskowanych obrazów z MovThresh do nowo utworzonego folderu ProActive.
      3. Otwórz MatLab i ustaw katalog na folder ProActive.
      4. Uruchom aplikację ProActive.
      5. Zaimportuj pliki stosu obrazów komórek maskowanych do graficznego interfejsu użytkownika ProActive.
      6. Określ typ działania. Analiza aktywności wystającej wygeneruje dane o pozyskanym obszarze; analiza aktywności retrakcyjnej wygeneruje dane o utraconym obszarze; a całkowita aktywność wygeneruje ogólne dane o zmianie obszaru (zarówno utracone, jak i uzyskane).
      7. Ustaw obszar do Zdefiniuj normalizację.
      8. Wygładź krzywą przy użyciu sugerowanych wartości progowych lub przy użyciu średniej, aby ponownie określić próg dla każdego punktu czasowego. Spowoduje to uśrednienie progów w określonym oknie, minimalizując niespójności w progowaniu między punktami czasu.
      9. Kliknij pozycję Plik | Zapisz jako | Wyniki (.mat)
         1. W przypadku przetwarzania wszystkich trzech typów aktywności obszaru należy nadać przetwarzanym plikom danych nazwy w następujący sposób: ProResultData #, RetResultData # lub ResultData #.
            UWAGA: Uwzględnij spację przed liczbą i ponumeruj dane, zaczynając od 1.
      10. Powtórz te czynności od kroku 6.9.3.6 dla wszystkich zaimportowanych stosów zamaskowanych obrazów.
      11. Po przetworzeniu wszystkich komórek zamknij graficzny interfejs użytkownika ProActive.
      12. Otwórz DataToFileTotalArea w edytorze Matlab, aby przetworzyć pliki "ResultData" całkowitej aktywności.
      13. Zmień liczbę komórek, aby dopasować liczbę wygenerowanych plików wynikowych. Jeśli w krokach 6.9.3.5–6.9.3.10 przetworzono 7 komórek, upewnij się, że pierwsze trzy wiersze skryptu są następujące:
          filename='Dane wynikowe ';
          komórki=1:7;
          lag=1;
      14. Naciśnij Uruchom i powtórz tę czynność dla DataToFileProtArea i DataToFileRetArea, aby przetworzyć odpowiednio dane wystające i wycofane. W wyniku tej analizy powstaną trzy pliki tekstowe "AllCells.txt", "AllCellsPro.txt" i "AllCellsRet.txt"
      15. Otwórz pliki .txt w arkuszu kalkulacyjnym i znormalizuj jak w sekcji 6.9.2. Oblicz średnią wartość dla każdego punktu czasowego dla wszystkich obrazowanych komórek i określ 90% przedziały ufności. Wykreśl dane.
          UWAGA: Wykresy wynikowe z powyższych kroków powinny wyglądać podobnie do Rysunek 6.

Results

Rysunek 4 pokazuje wyniki, których można oczekiwać po teście aktywności fosfatazy opartej na paxillina. W tym eksperymencie porównano konstytutywnie aktywną i dominującą ujemną aktywność fosfatazy Shp2 z aktywnością aktywnego i nieaktywnego RapR-Shp2 przy użyciu fosfo-paksyliny jako odczytu. Konstrukty Shp2 poddano immunoprecypitacji i poddano testowi aktywności opisanemu w protokole. Odczyty fosfo-paksyliny dla konstytutywnie aktywnego Shp2 i aktywnego RapR-Shp2 były podobne, co wskazuje, że wprowadzenie domeny RapR nie wpłynęło negatywnie na aktywny RapR-Shp2 i zachował pełną aktywność po aktywacji. Dominujący ujemny Shp2 i nieaktywny RapR-Shp2 były również podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 nie ma aktywności, gdy jest nieaktywny. Wskazuje to na udane zaprojektowanie fosfatazy RapR. Fosfosubstrat użyty do tego testu może się różnić w zależności od fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 5, podobny do Rysunek 4, porównuje konstytutywnie aktywny, dominujący negatywny oraz aktywny i nieaktywny RapR-Shp2. Eksperyment ten przeprowadzono bez immunoprecypitacji konstruktów. Zamiast tego zaprojektowano go w celu scharakteryzowania dalszych efektów sygnalizacyjnych konstruktu RapR-Shp2 w komórkach. Tutaj konstrukty Shp2 uległy ekspresji w HEK293T komórkach. Wykazano, że efektor ERK1/2 zwiększa fosforylację w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2, podobnie jak w próbce konstytutywnie aktywnej. Nieaktywny RapR-Shp2 nie wywołał tej zmiany. Oznacza to, że dalsza sygnalizacja Shp2 jest zachowana wraz z włączeniem domeny RapR. Podobnie, znane fosfosubstraty EGFR i PLCγ uległy defosforylacji w odpowiedzi na aktywację RapR-Shp2 w komórkach A431.

Na koniec, Rysunek 6 przedstawia wyniki aktywacji RapR-Shp2 na morfodynamice komórek HeLa. Po aktywacji RapR-Shp2 komórki wykazały wzrost aktywności wystającej, a także powierzchni komórki. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 jest wystarczająca do wywołania zmian morfodynamicznych w komórkach HeLa i może pozwolić naukowcom na zbadanie specyficznych szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za ten efekt.

Rysunek 4: Wyniki testu aktywności opartego na paxillin: Konstytutywnie aktywne, dominująco ujemne i RapR-Shp2 zostały poddane immunoprecypitacji i poddane testowi aktywności przy użyciu opisanego protokołu. Poziomy pY31 paxillin zarówno w CA, jak i RapR-Shp2 były podobne, co wskazuje, że konstrukt RapR-Shp2 miał podobną aktywność w porównaniu z CA Shp2 po aktywacji. Nieaktywowana próbka RapR-Shp2 nie wykazywała żadnej aktywności, podobnie jak próbka DN, co wskazuje, że nie była "nieszczelna". Ten rysunek został zmodyfikowany z Fauser et al.¹². Skróty: RapR = Rapamycyna-regulowany; Shp2 = Src homologia-2 białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę; DN = dominanta ujemna; CA = konstytutywnie czynny; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyniki testu lizatu na całych komórkach: Konstytutywnie aktywne, dominująco ujemne i RapR-Shp2 uległy ekspresji w HEK293T komórkach i protokół lizatu całego komórkowego został zakończony. Gdy RapR-Shp2 był nieaktywny, nie aktywował ERK1/2 przez fosforylację, podobnie jak próbka DN Shp2. Oznacza to, że RapR-Shp2 nie ma aktywności, gdy jest nieaktywny. Po aktywacji poziom fosforylacji ERK1/2 był podobny do poziomu próbki CA Shp2, co wskazuje na pomyślną aktywację i dalszą sygnalizację Shp2. Podobnie, komórki A431 eksprymujące RapR-Shp2 wykazały zmniejszenie fosforylacji zarówno EGFR, jak i PLCγ, obu znanych substratów Shp2. Ten rysunek został zmodyfikowany z Fauser et al.¹². Skróty: RapR = Rapamycyna-regulowany; Shp2 = Src homologia-2 białkowa fosfataza tyrozynowa zawierająca domenę; DN = dominanta ujemna; CA = konstytutywnie czynny; ERK = kinaza regulowana sygnałem zewnątrzkomórkowym; GAPDH = dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego; EGFR = receptor naskórkowego czynnika wzrostu; PLCγ = fosfolipaza C gamma; FRB = domena wiążąca FKBP-rapamycynę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza danych dotyczących obszaru komórki i aktywności wystającej na podstawie obrazowania na żywo: Komórki HeLa zostały transfekowane RapR-Shp2 i poddane opisanemu protokołowi obrazowania na żywo. Dane zostały przeanalizowane zgodnie z opisem w protokole analizy danych. Po aktywacji (oznaczonej pionową szarą linią) komórki HeLa wykazywały wzrost zarówno aktywności wypukłości komórek, jak i powierzchni komórek. W próbkach ujemnych, które wykazywały tylko ekspresję FRB, aktywność ta nie była obecna. Wskazuje to, że aktywacja RapR-Shp2 indukuje szybkie zmiany morfodynamiczne w komórkach HeLa i sprzyja rozprzestrzenianiu się i wypukaniu komórek. Ten rysunek został zmodyfikowany z Fauser et al.¹². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten zawiera szczegółowe kroki w zakresie opracowywania, charakterystyki i stosowania fosfataz kontrolowanych chemicznie. Narzędzie RapR-Shp2 opiera się na przełączniku regulowanym rapamycyną umieszczonym w domenie katalitycznej Shp2. Mocną stroną tego narzędzia jest specyficzność i ścisła kontrola czasowa aktywności fosfatazy. Narzędzie ma zastosowanie do innych fosfataz i w połączeniu z wcześniej opisaną technologią RapR-TAP pozwala na rekonstrukcję poszczególnych dalszych szlaków sygnałowych²⁶. Unikalne możliwości podejścia RapR pozwoliły naukowcom zidentyfikować przejściowe zdarzenia wywołane aktywacją Shp2 i przeanalizować specyficzne szlaki sygnałowe regulujące poszczególne procesy morfodynamiczne.

Na konstrukcję fosfatazy RapR wpływa kilka krytycznych czynników. Dobrze rozdzielona struktura krystaliczna domeny katalitycznej badanej fosfatazy jest bardzo pomocna w wyborze miejsca insercji iFKBP. Jednak ze względu na duże podobieństwo strukturalne między fosfatazami tyrozynowymi, wyrównanie sekwencji aminokwasowych domen katalitycznych może dostarczyć wystarczających informacji do identyfikacji miejsca insercji, jak pokazano na podstawie wyrównania Shp2 do PTP1B i PTPPest (Figura 2). Dla RapR-Shp2, Val406, znajdujący się w miejscu sprzężonym z krytyczną katalityczną pętlą WPD przez β-nić, został wybrany jako najbardziej optymalne miejsce insercji. To samo miejsce insercji może skutkować skuteczną regulacją innych PTPaz, jak wykazano dla PTP1B i PTP-PEST¹² (Figura 2A).

Jeśli fosfataza, która jest przedmiotem zainteresowania, jest białkiem wielodomenowym, informacje strukturalne o organizacji domen pomogą zapobiec zakłócaniu innych funkcji PTPazy. Kolejnym czynnikiem wpływającym na konstrukcję optymalnej RapR-PTPazy jest to, ile aminokwasów powinno zostać zastąpionych przez wstawiony iFKBP. Większe i bardziej elastyczne pętle indukcyjne w PTPazie mogą wymagać dodatkowego skrócenia, aby zapewnić ścisłą regulację aktywności katalitycznej przez iFKBP. Podobnie, długość i skład łączników łączących iFKBP z PTPazą będą miały wpływ na skuteczność regulacji. Krótkie łączniki składające się z pojedynczej reszty Gly zapewnią ściślejszą regulację, ale mogą zmniejszyć maksymalną aktywność enzymu, jeśli wprowadzą trwałe zniekształcenia strukturalne, nawet gdy iFKBP jest związany z rapamycyną i FRB. Średniej długości łączniki Gly-Ser-Gly zapewniają większą elastyczność, ale mogą nie być wystarczająco sztywne dla niektórych PTPaz. Długie łączniki złożone z Gly-Ser-Gly-Gly-Pro-Gly pomogą zapobiec tworzeniu się niezamierzonych struktur drugorzędowych, które mogą wpływać na regulację PTPazy. RapR-Shp2 został przetestowany ze wszystkimi trzema typami łączników; Łącznik Gly-Ser-Gly okazał się najbardziej optymalny.

Kluczowym aspektem decydującym o pomyślnym opracowaniu narzędzi RapR jest ustanowienie solidnego testu fosfatazy i obecność odpowiednich kontroli. Porównanie aktywności fosfatazy RapR z aktywnością dominująco-ujemnych i konstytutywnie aktywnych wersji POI pozwala ocenić nieszczelność konstruktu RapR i zakres aktywacji. Ponadto brak defosforylacji przez konstytutywnie aktywną fosfatazę lub zmniejszona fosforylacja przez dominującego mutanta ujemnego będzie wskazywał na niewłaściwe warunki reakcji.

W przypadku testu fosfatazy warunki reakcji będą wymagały optymalizacji dla każdej PTPazy. Dostosowanie temperatury, czasu reakcji i warunków buforowych będzie zależeć od interesującej PTPazy. Energiczne mieszanie próbek ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wystarczającego wymieszania PTPazy związanej z sefarozą i jej substratu. Wreszcie, jeśli opisany test fosfatazy nie jest optymalny dla konkretnej interesującej nas PTPazy, wówczas jako alternatywny test można zastosować reakcję fosfatazy z użyciem fosforanu p-nitrofenylu jako substratu²⁷.

W eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek podczas przygotowywania próbki należy wziąć pod uwagę kilka kryteriów. W przedstawionym protokole zastosowano pożywkę L-15 opartą na buforze HEPES, który nie jest wrażliwy na stężenie CO₂ . Jeśli pożądane jest użycie pożywki na bazie wodorowęglanów, należy uzupełnić HEPES w celu utrzymania pH próbki lub zastosować komorę do obrazowania środowiskowego uzupełniającą CO₂ . Protokół zaleca nałożenie warstwy oleju mineralnego na próbkę, aby zapobiec parowaniu i uprościć dodawanie rapamycyny. Można zastosować inne konfiguracje wykorzystujące komorę do obrazowania środowiskowego lub komorę zamkniętą, ale dodanie rapamycyny może być trudniejsze. Podczas dodawania rapamycyny do komórek podczas obrazowania należy upewnić się, że etap się nie przesunie, a komórki nie zostaną zakłócone. Wszelkie dodatkowe ruchy próbki podczas procesu obrazowania będą utrudniać gromadzenie danych. Intensywność oświetlenia i czas ekspozycji powinny być utrzymywane na niskim poziomie, aby zmniejszyć fototoksyczność, szczególnie w przypadku obrazowania długotrwałego. Kluczowe znaczenie ma również odpowiednia wydajność transfekcji komórek. Stosunek 1:1 DNA FRB do RapR-Shp2 zapewnia odpowiednią ekspresję, ale w przypadku nowych konstruktów stosunek ten będzie wymagał korekty. Aby zapewnić skuteczną aktywację, FRB powinien być wyrażany na wyższym poziomie niż fosfataza RapR.

Ograniczeniem narzędzi opartych na RapR jest brak możliwości szybkiej dezaktywacji. Zmiana pożywki usuwa zewnątrzkomórkową rapamycynę, ale dezaktywacja konstruktów RapR może trwać wiele godzin ze względu na bardzo ścisłe wiązanie rapamycyny z konstruktem RapR. Szybką inaktywację można osiągnąć poprzez dodanie inhibitora miejsca aktywnego PTPazy. Jednak potencjalne niezamierzone skutki inhibitora mogą sprawić, że interpretacja wyników będzie trudna. Ponadto, nawet w połączeniu z inhibitorem PTPazy, podejście RapR nie może być stosowane w cyklicznych eksperymentach aktywacji/inaktywacji. Kolejnym ograniczeniem systemu RapR jest brak kontroli przestrzennej. Konstrukty RapR ulegają globalnej ekspresji, a zatem są aktywowane w całym komórce. Jednym z potencjalnych rozwiązań jest zastosowanie rapamycyny w klatce, która może być uwalniana przez światło bliskie UV lokalnie w komórce^28,29. Co więcej, narzędzie RapR może być modyfikowane w celu uzyskania aktywacji fosfatazy będącej przedmiotem zainteresowania w określonym kompleksie białkowym lub w określonej lokalizacji subkomórkowej. Poprzez przyłączenie partnera wiążącego lub znacznika subkomórkowego do FRB, RapR-PTPaza będzie ukierunkowana na określone białko lub miejsce w komórce. Wreszcie, rapamycyna jest dobrze scharakteryzowanym immunosupresorem poprzez hamowanie mTOR i może wpływać na sygnalizację komórkową, potencjalnie zakłócając sygnalizację interesującej PTPazy. Aby przezwyciężyć ten problem, dobrą alternatywą są nieimmunosupresyjne analogi rapamycyny (iRap i AP21967). Wykazano, że oba związki regulują konstrukty RapR¹⁴.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Szkiełka nakrywkowe 25 mm okrągłe	Warner Instruments	64-0715
Probówki 1,5 ml	USA Scientific	cc7682-3394
2x Bufor			Na 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
A431 Komórki	ATCC	CRL-1555
Agarsos	GoldBiotech	A-201
Komora komórkowa attofluoru	invitrogen	A7816
Benchmark Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Potrójna inaktywowana termicznie 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowany
Brig 35,30 w/v %	Acros	329581000
BSA	GoldBiotech	A-420
CellGeo	N/A	N/A	Opublikowano w 10.1083/jcb.201306067
CellMask Deep Red barwnik błonowy plazmatyczny	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a kompetentny komórki	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DMSO	Thermo Scientific	F-515
Drabinka DNA	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DpnI Enzym	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Ditiothreitol, Odczynniki Clelanda
EGTA	Acros	409910250
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Sigma	F1141
Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6	Odczynnik do transfekcji	Promega	E2692
Zestaw do ekstrakcji żelu	Thermo Scientific	K0692	GeneJET Gel
Gel Zielony Kwas nukleinowy Barwnik	GoldBio	G-740-500
Żel ładujący Barwnik fioletowy 6x	NEB	B7024A
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Oprogramowanie do przetwarzania ImageJ	N/A	/A
Igepal CA-630 (NP40)	Sigma	I3021
Bufor			25 mM Imidazol pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
Bufor			do lizy20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
Do	CellGeo MathWorks	N/A	2022b
automatyzacji mikroskopii metamorficznej i analizy obrazu	NIE	DOTYCZY
NIE DOTYCZY MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Olej mineralny	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele 12 dołków	Bio-Rad	4561085
Biologia molekularna Klasa wodna	Corning	46-000-CV
Wielopasmowe lustro polichroiczne	Technologia Chroma	89903BS
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
Olympus UPlanObiektyw SAPO 40x	Olympus	N/A
PBS bez Ca i Mg	Corning	21-031-CV
Probówki do PCR	labForce	1149Z65	0,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski Indywidualnie mocowane kołpaki
Polimeraza DNA Phusion Plus Thermo	Scientific	F630S
Startery	IDT
Protein-G Sepharose	Millipore	16-266
Membrany PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Bibuła filtracyjna Kanapki
Rapamycin	Fisher	AAJ62473MF
0,25% Trypsyna, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sód	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	do elektroforezy
Bufor			20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40
β-merkaptoetanol	Fisher Chemical	O3446I-100
przeciwciała
Anty-EGFR	Sygnalizacja komórkowa	przeciwciała 2232
Przeciwciało anty-ERK 1/2	Sygnalizacja komórkowa	9102
Przeciwciało antyflagowe	Millipore-Sigma	F3165
Przeciwciało anty-GAPDH	invitrogen	AM4300
Przeciwciało anty-GFP	Clontech	632380
Przeciwciało anty-mCherry	invitrogen	M11217
Przeciwciało anty-paxillin	Thermo Fischer	BDB612405
Przeciwciało anty-fosfo-EGFR Y992	Sygnalizacja komórkowa	przeciwciała 2235
Anty-fosfo-erk 1/2 T202/Y204 Sygnalizacja	komórkowa	9101
Przeciwciało anty-fosfo-paksyliny Y31	Millipore-Sigma	05-1143
Anty-fosfo-PLCγ Y783	Sygnalizacja komórkowa przeciwciała	14008
Anty-PLCγ	Sygnalizacja komórkowa	5690