Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie PET 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolu do wizualizacji ekspresji receptora estrogenowego α w ksenoprzeszczepach ludzkiego raka piersi u samic myszy po owariektomii

701 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67151

⸱

7 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health, 4Faculty of Medicine, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj demonstrujemy protokół użycia pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolu (18F-FES) jako narzędzia do wizualizacji ekspresji ERα w ERα-dodatnich ksenograftach piersi.

Streszczenie

Aby zademonstrować, w jaki sposób ksenoprzeszczepy raka piersi z dodatnim receptorem estrogenowym alfa (ERα) mogą być wizualizowane u nagich myszy BALB/c za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiolu (18F-FES), nagim myszom BALB/c po owariektomii wstrzyknięto ERα-dodatnie komórki raka piersi (MCF-7, 3 × 106 komórek; ramię [n = 10] lub 4th pachwinowa poduszeczka tłuszczowa sutka [n = 10]) lub ERα-ujemne komórki raka piersi (MDA-MB-231, 1 × 106 komórek; poduszeczka tłuszczowa sutka [n = 5]). Myszy z komórkami MCF-7 otrzymały podskórne zastrzyki 20 μg 17β-estradiolu (20 μg/20 μL; olej kukurydziany: etanol, 9:1) w kark 2 dni przed wstrzyknięciem komórek, a następnie codzienne zastrzyki pięć razy w tygodniu przez 5 tygodni. Objętość guza mierzono według wzoru: (L*W2)/2 (L; długość, W; szerokość). Gdy objętość guza osiągnęła około 100 mm3, wstrzyknięcia 17β-estradiolu zostały wstrzymane 2 dni przed otrzymaniem myszy 18F-FES do obrazowania PET, aby uniknąć konkurencyjnego wiązania z ERα. Po podaniu 18F-FES przez boczną żyłę ogonową, PET/MRI wykonywano przez 15 minut po 1 godzinie do 1,5 godziny po wstrzyknięciu. Rozdział 18Nie zaobserwowano wychwytu F-FES u myszy z ujemnym ERα MDA-MB-231 z nowotworem. Rozdział 18Wychwyt F-FES był najbardziej wyraźny u myszy z guzami MCF-7 w ramieniu. W guzach MCF-7 rosnących w pachwinowej poduszce tłuszczowej sutka, wychwyt 18F-FES był mniej widoczny, ponieważ wzorzec wydalania jelitowego 18F-FES zasłaniał radioaktywność wykrywalną w tych guzach. Aby użyć 18F-FES PET jako narzędzia do wizualizacji ERα ekspresji ERα w ERα-dodatnich ksenoprzeszczepach piersi, wykazujemy, że widoczność wychwytu 18F-FES jest wyraźna w guzach zlokalizowanych z dala od obszaru brzucha myszy, takich jak ramię.

Wprowadzenie

Rak piersi (BC) można podzielić na różne podtypy molekularne1. Guzy piersi, które są klasyfikowane jako podtyp luminalny, nadekspresja receptora estrogenowego alfa (ERα). W związku z tym ten podtyp BC jest również określany jako ERα-dodatni (ERα+). Na szczęście osoby, u których zdiagnozowano ERα+ BC, doświadczają najwyższego 10-letniego przeżycia w połączeniu z niskimi wskaźnikami odległych przerzutów2,3. Ze względu na ekspresję ERα tacy pacjenci mają dostęp do zbioru opcji terapii hormonalnej, w tym selektywnych modulatorów receptora estrogenowego (SERM), leków antyestrogenowych i inhibitorów aromatazy4.

Aby ocenić, czy pacjentka z rakiem piersi kwalifikuje się do terapii hormonalnej, należy określić poziomy ekspresji ERα w guzach piersi5,6,7. Chociaż złotym standardem testowania jest przeprowadzanie przy użyciu metod immunohistochemicznych (IHC), wiele raportów zwraca uwagę na kwestię zarówno odtwarzalności, jak i wiarygodności uzyskanych wyników6,8,9. IHC może powodować niezgodność wyników, ponieważ technika ma charakter półilościowy, gdzie różnice w przetwarzaniu tkanek i późniejszej interpretacji mogą prowadzić do zmienności6. Aby rozwiązać ten powtarzający się problem, w 2010 r. ustalono wytyczne i zaktualizowano je w 2020 r. przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej z zamiarem zmniejszenia zmienności między obserwatorami10. Obecnie klinicznie potwierdzone odcięcie wynosi ≥1%, przy czym ekspresja ERα nawet przy bardzo małych poziomach ekspresji wykazuje klinicznie znaczące korzyści przy użyciu terapii endokrynologicznej11.

W zaawansowanym BC, ekspresja ERα może różnić się między przerzutami a guzem pierwotnym. Niektóre obserwacje wskazują na 18%-55% rozbieżności w poziomach ekspresji ERα między zmianami przerzutowymi a guzem pierwotnym, wskazując na znaczenie określenia statusu ERα przerzutów BC 12. Aby temu zaradzić, wytyczne podkreślają znaczenie potwierdzania statusu receptorów hormonalnych w zmianach przerzutowych w celu opracowania świadomych planów leczenia13,14. Jednak wykonalność tego jest wątpliwa, szczególnie w przypadku metod IHC, biorąc pod uwagę, że przerzuty mogą istnieć w miejscach, z których trudno jest pobrać biopsje.

Metody obrazowania molekularnego stały się podstawowymi narzędziami do wykrywania i wizualizacji zmian nowotworowych u pacjentów z rakiem. W szczególności obrazowanie za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) wymaga użycia znaczników, a dokładniej radiofarmaceutyków, które mają na celu wykorzystanie pewnych cech nowotworów z zamiarem nieinwazyjnej wizualizacji tych zmian. Najpowszechniejszym znacznikiem PET stosowanym w onkologii jest 18F-fluorodeoksyglukoza (18F-FDG)15. W tym badaniu badamy zastosowanie znakowanej radioaktywnie formy estradiolu, 18F-fluoroestradiolu (18F-FES). Estradiol - ligand ERα - jest hormonem wytwarzanym głównie przez jajniki u kobiet16. Rozdział 18F-FES został niedawno zatwierdzony przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) i jest sprzedawany jako CeriannaTM. Ten środek do obrazowania jest przeznaczony do stosowania jako uzupełnienie biopsji u pacjentów z nawracającymi lub przerzutowymi BC17. Obrazowanie PET całego ciała za pomocą 18F-FES może być stosowane jako nieinwazyjna metoda wykrywania poziomów ERα zarówno w guzie pierwotnym, jak i w odległych przerzutach w regionach, z których trudno jest uzyskać biopsje18. Przewidywanie poziomów ERα przy użyciu obrazowania 18F-FES PET koreluje z wynikami IHC, a co więcej, niewielka lub żadna detekcja ERα przy użyciu obrazowania 18F-FES PET jest wiarygodnym predyktorem nowotworów, które prawdopodobnie nie zareagują na terapię hormonalną18. Aby zapewnić właściwe wykorzystanie 18F-FES w klinice, wytyczne zostały sformułowane w drodze konsensusu przez ekspertów w tej dziedzinie19. W tym badaniu oceniamy zastosowanie 18F-FES PET w przedklinicznych modelach raka piersi u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Szpitala w Austin (A2023/05812) i przeprowadzone zgodnie z Australijskim Kodeksem opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.

1. Przygotowanie komórek

  1. Stosując rutynowe procedury hodowli komórkowych, utrzymuj komórki MDA-MB-231 i MCF-7 w DMEM/F-12 uzupełnione penicyliną/streptomycyną i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w kolbach do hodowli tkankowych T175. Przed przygotowaniem komórek do wstrzyknięcia, komórki przechodzą co najmniej 3 razy po odrodzeniu z zapasów ciekłego azotu. Hodować komórki w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Rozmnażać komórki w taki sposób, aby w dniu przygotowania komórek do wstrzyknięcia na 15 myszy było 3 × 106 komórek MCF-7 na mysz na 15 myszy (tj. co najmniej 45 × 106 komórek MCF-7) i 1 × 106 komórek MDA-MB-231 na wstrzyknięcie na mysz dla 5 myszy (tj. co najmniej 5 × 106 komórek MDA-MB-231).
    UWAGA: Aby umożliwić równą liczbę komórek w każdej myszy, przygotuj wystarczającą liczbę komórek do pięciu dodatkowych wstrzyknięć (np. przygotuj wystarczającą liczbę komórek na 10 wstrzyknięć do wstrzyknięcia pięciu myszy).
  3. W dniu wstrzyknięcia komórki usuń pożywkę ze wszystkich kolb i umieść około 5 ml trypsyny-EDTA (0,25% trypsyny i 0,05% EDTA) w 1x roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (pH 7,4) na komórkach, aby ułatwić oderwanie komórek.
  4. Po odłączeniu komórek umieść około 10 ml kompletnej pożywki w kolbach, aby zahamować aktywność trypsyny. Ponownie zawiesić komórki i przenieść zawiesinę jednokomórkową do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy ~300 × g przez 2 minuty do komórek osadzania.
  5. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki i policzyć komórki, aby określić całkowitą liczbę zebranych komórek.
    UWAGA: Staraj się liczyć roztwory około 1 × 106 komórek na ml (50-100 komórek na 16 kwadratów, jeśli używasz komory liczącej). W przypadku komórek, które rosną w temperaturze 5 × 106 na pełną kolbę, należy zebrać komórki w 5 ml pożywki. W przypadku linii komórkowych o większej gęstości należy użyć 10 ml pożywki na kolbę.
  6. Wykonaj ten krok na lodzie w sterylnej komorze z przepływem laminarnym. Po osiągnięciu tej liczby należy ponownie odwirować zawiesinę komórek o masie 300 × g przez 2 minuty w celu osadzenia komórek. Zawiesić osad w zimnym PBS i lodowatym roztworze matrycy błony podstawnej, tak aby na 3 × 106 komórek MCF-7 przypadało 40 μl PBS i 10 μl roztworu matrycy błony podstawnej.
  7. Zawiesić osad komórkowy MDA-MB-231 z tymi samymi składnikami, tak aby na 1 × 106 komórek przypadało 40 μl PBS i 10 μl roztworu matrycy błony podstawnej. Przenieś mieszaninę macierzy błony podstawnej PBS z probówki o pojemności 50 ml do mniejszych probówek o pojemności 1,5 ml z zimną końcówką pipety i utrzymuj mieszaninę komórek na lodzie tuż przed wstrzyknięciem komórek myszom.
    UWAGA: Matryca błony podstawnej użyta w tym badaniu jest przechowywana w temperaturze -20 °C. Na dzień przed zapotrzebowaniem na roztwór matrycy błony podstawnej, podwielokrotność roztworu umieszcza się w temperaturze 4 °C w celu rozmrożenia przez noc. Następnego dnia jest gotowy do użycia w niskich temperaturach (na lodzie). Podczas pipetowania roztworu należy upewnić się, że końcówki pipet są zimne, aby zapobiec zestaleniu się roztworu matrycy membrany podstawnej. Dobrą praktyką jest przechowywanie w lodówce pudełka ze sterylnymi końcówkami do pipet przed dniem przygotowania komórek do wstrzyknięcia. Podczas ponownego zawieszania osadu komórkowego w lodowatym PBS i roztworze macierzy błony podstawnej, najpierw dodaje się PBS, a następnie wymaganą ilość roztworu macierzy błony podstawnej.

2. Wstrzyknięcie komórek myszom po owariektomii

  1. Pozwól 6-8-tygodniowym samicom nagich myszy BALB/c po owariektomii zaaklimatyzować się w pomieszczeniu dla zwierząt przez co najmniej 1 tydzień przed wstrzyknięciem komórek.
    UWAGA: W tym badaniu uzyskano dostęp do starszych, 12-14-tygodniowych myszy. Owariektomia zapewnia niski poziom endogennego estradiolu i zmniejsza konkurencję z ligandem 18F-FES. W zależności od badanego modelu, młodsze myszy (np. w wieku 4-8 tygodni) mogą nie wymagać wycięcia jajników ze względu na niższy poziom endogennego estradiolu20,21.
  2. Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą 4% izofluranu i tlenu z szybkością 4 l/min za pomocą komory indukcyjnej znieczulenia. Obserwuj mysz i sprawdź, czy nie ma utraty odruchu prostowania. Gdy przestaną się ruszać, przenieś mysz do sterylnej komory z przepływem laminarnym, umieść pysk w nasadce na nos i utrzymuj znieczulenie, dostosowując izofluran do 2% i tlen do szybkości 2 l/min.
    UWAGA: Znieczulaj jedną mysz na raz, aby zapewnić optymalną pielęgnację.
  3. W przypadku wstrzyknięć do poduszeczki tłuszczowej do sutka (IMF) przetrzyj skórę nad 4. pachwinową gruczołem sutkowym za pomocą alkoholu. Użyć wstępnie schłodzonej (na lodzie) strzykawki o pojemności 27 g w celu pobrania zawiesiny zimnych komórek i pozostawić strzykawkę na lodzie, aby zapobiec ogrzaniu/zestaleniu roztworu macierzy błony podstawnej przed wstrzyknięciem.
  4. Używając kciuka i palca wskazującego ręki niedominującej, delikatnie podnieś 4. gruczoł sutkowy i włóż igłę strzykawkową 27 G ręką dominującą, upewniając się, że skos igły jest skierowany do góry. Powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej zawierającej mieszaninę roztworu macierzy błony podstawnej komórki-PBS-błony podstawnej do poduszeczki tłuszczowej sutka.
    UWAGA: Podczas wstrzykiwania komórek między palcami powinien być wyczuwalny pęcherzyk. Sprawdzić, czy w miejscu wstrzyknięcia nie ma wycieków.
  5. Po zakończeniu wstrzykiwania należy wyłączyć izofluran i trzymać pysk myszy w stożku nosowym, aby wdychać tlen i odzyskać przytomność (powinno to zająć około minuty). Umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej, aby uzyskać optymalną regenerację.
  6. W przypadku wstrzyknięć do barku należy zastosować powyższą procedurę opisaną dla iniekcji IMF, jedyną różnicą jest miejsce wstrzyknięcia komórek.
    UWAGA: Alternatywnie, wstrzyknięcie w ramię można wykonać bez znieczulenia (patrz krok 2.7 poniżej).
  7. W przypadku wstrzyknięcia na ramię bez znieczulenia, należy przytrzymać i unieść skórę nad ramieniem myszy za pomocą ręki niedominującej między kciukiem a palcem wskazującym, tworząc "namiot" w skórze. Powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej zawierającej roztwór macierzy błony podstawnej komórki-PBS, używając igły strzykawkowej 27 G. Delikatnie wyjąć igłę i sprawdzić, czy nie ma wycieków.
    UWAGA: Alternatywnie, strzykawka Hamilton może być używana do wstrzykiwań o małej objętości, aby zapewnić dokładność podawania objętości. Pomiędzy wstrzyknięciami 80% v/v etanol jest używany do płukania strzykawki w przypadku korzystania z różnych linii komórkowych, a PBS służy do płukania i usuwania resztek etanolu ze strzykawki.

3. Przygotowanie roztworu estradiolu

  1. Używając wagi, która może dokładnie zmierzyć miligramy substancji, odważ 7 mg estradiolu w proszku do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodaj 700 μl 100% etanolu do 7 mg estradiolu w proszku. Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na delikatnym wytrząsarce na około 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub do momentu, gdy proszek estradiolu całkowicie się rozpuści.
  3. Podzielić roztwór na dziesięć probówek o pojemności 1,5 ml, z których każda zawiera 70 μl roztworu etanolu i estradiolu. Umieść probówki w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Zapasy estradiolu-etanolu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez około 2 tygodnie.

4. Podskórne wstrzyknięcie roztworu estradiolu

  1. W dniu, w którym wymagane jest wstrzyknięcie estradiolu, należy przygotować na świeżo następującą mieszaninę. Połączyć 630 μl oleju kukurydzianego jako nośnik w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 70 μl roztworu etanolu i estradiolu. Zmieszać roztwór do uzyskania jednorodności, upewniając się, że etanol nie oddzieli się i nie utworzy warstwy na wierzchu oleju samochodowego.
    UWAGA: Daje to 700 μl roztworu 20 μg/20 μl oleju kukurydzianego: etanol, 9:1. Każda mysz otrzymuje 20 μL tego roztworu. Zawsze przygotuj dodatkowy roztwór, ponieważ olej w mieszaninie ma tendencję do przylegania do zewnętrznej części strzykawki i po bokach probówki o pojemności 1,5 ml ze względu na swoją lepkość (np. dla 20 myszy, chociaż 400 μl wystarczy, co prawie podwoi ilość (700 μl) zapewnia wystarczająco dużo miejsca na błędy).
  2. Za pomocą igły 29 G dołączonej do strzykawki insulinowej powoli pobrać 20 μl roztworu estradiolu.
    UWAGA: Ponieważ roztwór zawiera 9 części oleju na 1 część etanolu estradiolu, mieszanina będzie potrzebowała czasu, aby wciągnąć ją do strzykawki.
  3. Myszy, którym wstrzyknięto roztwór estradiolu, to te, które mają guzy, które wyrażają ERα, a zatem polegają na estrogenie do wzrostu (MCF-7 w tym badaniu). Myszy z guzami, które nie wykazują ekspresji ERα (MDA-MB-231 w tym badaniu), nie otrzymują roztworu estradiolu. Delikatnie ustaw mysz do wstrzyknięcia z przodu, najlepiej na ręczniku, aby zapobiec zranieniu kończyn podczas krępowania.
  4. Używając ręki niedominującej, unieruchamiaj mysz, trzymając górną część jej ogona między palcem serdecznym a małym. Kciukiem i palcem wskazującym unieść luźną skórę w pobliżu szyi myszy, aby utworzyć "namiot" w skórze do podskórnego wstrzyknięcia roztworu estradiolu.
  5. Trzymając mysz w tym ograniczeniu, użyj dominującej ręki, aby wstrzyknąć myszowi roztwór estradiolu. Trzymając skos igły skierowany do góry, wepchnąć igłę pod "namiot" skóry, aż widoczna będzie mniej niż połowa igły.
    UWAGA: Po wstrzyknięciu roztworu skóra powinna widocznie wybrzuszyć się.
  6. Aby zapobiec cofaniu się roztworu, należy trzymać igłę pod skórą przez kilka sekund. Jeśli wystąpi jakikolwiek przepływ wsteczny, delikatnie osusz obszar chusteczką, aby usunąć resztki roztworu.
    UWAGA: W niektórych eksperymentach estradiol w połączeniu z olejem sezamowym był używany do podawania hormonu. Stosowanie oleju sezamowego jako nośnika prowadzi do miejscowego stanu zapalnego pod skórą w miejscach wstrzyknięcia estradiolu. W związku z tym olej kukurydziany został wybrany jako nośnik do kolejnych eksperymentów, w których oznaki stanu zapalnego w miejscach wstrzyknięcia estradiolu były nieobecne lub minimalne22. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
  7. Po wyjęciu igły delikatnie przetrzyj miejsce wstrzyknięcia miejscowym środkiem antyseptycznym za pomocą wacika. Ma to na celu zapobieżenie stanowi zapalnemu na powierzchni w miejscu wstrzyknięcia spowodowanym wprowadzeniem/wyjęciem igły przez skórę myszy.
  8. Wstrzyknij myszom z guzami wykazującymi ekspresję ERα (MCF-7) za pomocą podskórnych zastrzyków estradiolu 3 dni przed wstrzyknięciem komórek, a następnie 5 razy w tygodniu przez 5 tygodni (Ryc. 1). Wstrzymaj wstrzykiwanie estradiolu na 2 dni przed dniem obrazowania, aby uniknąć konkurencyjnego wiązania z sondą 18F-FES z jej celem, ERα.
    UWAGA: W tym badaniu myszom z guzami MCF-7 wstrzykiwano estradiol codziennie od poniedziałku do piątku. Jeśli mieli być zobrazowani w następnym tygodniu w środę, zastrzyki z estradiolu były kontynuowane w sobotę i niedzielę. Estradiol nie był podawany w poniedziałek i wtorek, zanim myszy nie zostały zobrazowane w środę.

5. 18Obrazowanie F-FES PET i MRI myszy po owariektomii

UWAGA: Używaj sprzętu ochronnego podczas pracy z radioaktywnością. Podczas obchodzenia się z promieniotwórczością należy przestrzegać wszystkich obowiązujących procedur regulacyjnych.

  1. Zważ mysz i zapisz jej wagę.
  2. Na potrzeby tego badania zsyntetyzowano 18F-FES i sformułowano go w klasie klinicznej23(uzyskany z Wydziału Obrazowania Molekularnego i Terapii, Austin Health) do stosowania w modelach zwierzęcych. Rozcieńczyć 18F-FES (109 min radioaktywnego okresu półtrwania) w 10% w/v roztworze soli etanolowej przy skorygowanym stężeniu wtrysku skorygowanym o rozpad wynoszącym około 150-300 μCi/100 μL.
    UWAGA: Specyficzna aktywność 1000 Ci/mmol jest wystarczająca do obrazowania PET in vivo ERα24, a 18otrzymanych F-FES miało określoną aktywność powyżej tej wartości wyjściowej.
  3. Pobrać 100 μl za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 29 G. Użyć kalibratora dawki, aby zmierzyć i zapisać dawkę promieniotwórczości i czas. Umieścić strzykawkę za osłoną ołowianą do czasu wstrzyknięcia.
    UWAGA: Zmierzyć ilość promieniotwórczości 18F-FES w każdej dawce za pomocą kalibratora dawki. Kalibrator dawki powinien być skalibrowany względem standardowego materiału referencyjnego, takiego jak cez-137, zgodnie z protokołem producenta. Czas odczytu jest ważny do zarejestrowania w celu określenia korekcji zaniku. Upewnij się, że czas wyświetlany na kalibratorze jest zgodny z czasem na komputerze używanym do akwizycji PET.
  4. Aby rozszerzyć żyły ogonowe do wstrzyknięcia dożylnego, umieść mysz pod elementem grzejnym w odległości 30 cm na 2 minuty. Przetrzyj ogon 70% w/v etanolem, aby zdezynfekować obszar przed wstrzyknięciem.
  5. Należy podać 100 μl 18F-FES (cała objętość w strzykawce) we wstrzyknięciu bolusa przez boczną żyłę ogonową i zanotować czas wstrzyknięcia. Uciskać miejsce wstrzyknięcia chusteczką, aby zatrzymać krwawienie z żyły ogonowej.
  6. Zmierzyć pozostałą dawkę w strzykawce wraz z tkanką za pomocą kalibratora dawki i zapisać pomiar oraz czas. Wstrzyknij myszy rozłożone w partiach po dwie, aby umożliwić obrazowanie za pomocą wielokomorowego.
    UWAGA: Część sondy pozostanie w strzykawce. Stosowanie strzykawek insulinowych jest preferowane w stosunku do strzykawek połączonych z igłami za pomocą zamków Luer ze względu na zmniejszoną objętość dawki uwięzioną w strzykawce/igle po podaniu wstrzyknięcia. Ponadto mierzy się radioaktywność w tkance, która jest używana do zatrzymania krwawienia, które może wystąpić po dożylnym wstrzyknięciu sondy. Dzieje się tak, ponieważ cofanie się krwi wchłoniętej przez tkankę może zawierać pewną radioaktywność z 18F-FES. Ponadto czas potrzebny do ogrzania bocznych żył ogonowych będzie zależał od zmiennych, takich jak intensywność źródła ciepła i to, jak blisko myszy się znajduje. W przypadku standardowych lamp grzewczych rozszerzenie żył może zająć do 15 minut. Myszy muszą być ściśle monitorowane pod kątem oznak przegrzania i w razie potrzeby usuwane ze źródła ciepła między wstrzyknięciami.
  7. W przypadku myszy, które są przydzielone do snu po wstrzyknięciu, umieść mysz, której wstrzyknięto, w komorze anestezjologicznej utrzymywanej na poziomie utrzymania izofluranu (2%-2,5%) i tlenu (2 l/min) przez 1 godzinę na poduszce grzewczej, aby umożliwić rozprowadzenie sondy przez krążenie ogólnoustrojowe myszy przed skanowaniem PET. Pozwól innym myszom w grupie swobodnie chodzić w klatce przez 1-1,5 godziny, aż PET skanować.
  8. Po 1-1,5 h umieść mysz w komorze obrazowania w znieczuleniu izofluranem stożkowym nosa. Włączyć podgrzewacz łóżka do 32 °C, wybrać konfigurację wielokomorową i włączyć system monitorowania oddechu. Umieść dwie myszy, które mają być sfotografowane, w pozycji leżącej. Umieść komorę obrazowania w urządzeniu do PET/MRI.
  9. Monitoruj oddech myszy podczas pozyskiwania obrazu. Użyj wykresu oddechu, aby zapewnić 60-80 oddechów na minutę w dowolnym momencie podczas skanowania. Jeśli częstość oddechów spadnie poniżej lub powyżej pożądanego zakresu, należy dostosować dawkę izofluranu zgodnie z wymaganiami.
    UWAGA: Oddychanie zwierzęcia może być monitorowane dzięki obecności czujnika w komorze obrazowania.
  10. Połącz statyczną 15-minutową akwizycję PET z osiowym skanem MRI 3D z echem gradientowym (GRE). Poniżej znajdują się parametry akwizycji:
    1. Aby skonfigurować protokół PET, należy otworzyć okno Radiopharmaceutical Editor w odpowiednim oprogramowaniu. Określić używany izotop, aktywność strzykawki (MBq), czas wstrzyknięcia i zastosowaną aktywność (MBq) oraz masę ciała. Wszystkie te parametry są niezbędne, aby pomóc w obliczeniu i ilościowym określeniu wychwytu sondy w tkance będącej przedmiotem zainteresowania.
    2. Aby upewnić się, że mysz jest prawidłowo ustawiona do obrazowania, użyj sekwencji 2D Scout (przód i tył), aby określić pole widzenia PET. Przejdź do 15-minutowej statycznej akwizycji PET przy użyciu okna energetycznego 400-600 keV, tryb koincydencji 1-5, 5 ns. Wykonaj osiowy skan MRI GRE3D przez około 27 minut.
  11. Zrekonstruuj pozyskane obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
    1. Wykonaj statyczną rekonstrukcję obrazu PET/MRI i użyj planera geometrycznego, aby zmodyfikować obszar rekonstrukcji, aby upewnić się, że obejmuje on całą mysz, zapewniając optymalny czas rekonstrukcji.
    2. W oknie Identyfikacja wyników przełącz losowe korekcje, korekcję tłumienia (AC) + rozproszenie, zakres pozycji na Wł. Ustaw czas odniesienia do zaniku na ADMIN. Ustaw próg powietrza w ciele na 30% i oprzyj korekcję tłumienia na mapie materiału.
  12. Korzystaj z odpowiedniego oprogramowania do separacji obrazów wielokomorowych, wspólnej rejestracji i rysowania obszarów zainteresowania (ROI). W celu jednoczesnej rejestracji należy wyrównać rezonans magnetyczny tak, aby pasował do PET, i zrekonstruować obraz PET.
  13. Aby oddzielić obrazy wielokomorowe, kliknij Przetwarzanie > Segmentacja obrazu > Separator hotelowy. Włącz tryb naukowy i dostosuj parametry progu i głośności zgodnie z potrzebami, aż zostaną znalezione 2 obiekty.
  14. Wprowadź dawkę w momencie wstrzyknięcia po uwzględnieniu dawki resztkowej pozostałej w strzykawce, aby przeliczyć dane PET na jednostkę procentowej dawki wstrzykniętej na gram (%ID/g) lub dodatkowo wprowadź masę ciała pacjenta, aby przeliczyć dane PET na jednostkę znormalizowanej wartości wychwytu (SUV). Wykonaj tę konwersję, klikając prawym przyciskiem myszy zestaw danych PET i znajdując pole %ID/g na karcie Informacje podstawowe. Wprowadź zarejestrowany wcześniej %ID/g.
  15. Aby narysować ROI na odcinkach guza, kliknij kartę Pomiary po lewej stronie okna programu. Narysuj ROI za pomocą wielokąta lub narzędzia odręcznego. Ostrożnie obrysuj obwód guza, upewniając się, że czynność jest wykonywana, gdy obraz PET znajduje się w aktywnym oknie (sprawdź za pomocą Fn-A). Wynik daje wartość ROI jako %ID/g.
    UWAGA: Analiza ROI daje dobre oszacowanie %ID/g. Dobrze skalibrowana kamera powinna dawać dokładność na poziomie ±5% w porównaniu z danymi biodystrybucji ex vivo.

6. Pobieranie i utrwalanie tkanki nowotworowej do immunohistochemii

  1. W eksperymentalnym punkcie końcowym należy poddać mysz eutanazji za pomocą śmiertelnego wdychania izofluranu w stężeniu 4%-5% lub nadmiernego wdychania CO2 .
  2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych i pęsety ostrożnie wykonaj małe nacięcie w pobliżu powierzchni guza i wytnij tkankę nowotworową. Jeśli skóra jest przyczepiona do tkanki nowotworowej, użyj ostrza skalpela, aby delikatnie oddzielić skórę od guza.
  3. Umieść tkankę nowotworową w fiolce o pojemności 5 ml zawierającej około 3 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny. Upewnij się, że cała tkanka jest pokryta roztworem, aby ułatwić utrwalenie tkanki. Utrzymuj tkankę zanurzoną w formalinie przez 24 godziny.
  4. Następnego dnia przenieś utrwaloną tkankę nowotworową do 5 ml fiolki zawierającej 70% etanolu. Oznacz kasetę tkankową specyficzną dla tkanki nowotworowej w ramach przygotowań do osadzania parafiny.
  5. Umieść tkankę nowotworową w kasecie na tkanki i przechowuj ją w 70% roztworze etanolu do momentu osadzenia się parafiny.
    UWAGA: W tym badaniu osadzanie parafiny zostało przeprowadzone przez patologów anatomicznych z Austin Health.

7. Immunohistochemia do wykrywania receptora estrogenowego alfa (ERα)

  1. Za pomocą mikrotomu wytnij odcinki tkanki nowotworowej o grubości 4 μm wymagane do barwienia, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami.
  2. Umieść szklane szkiełka mikroskopowe z wyciętymi skrawkami guza w stojaku na szkiełka i umieść stojak w piekarniku o temperaturze 37 °C do wyschnięcia przez noc i upewnienia się, że tkanki przylegają do szkiełek przed barwieniem.
  3. Następnego ranka umieść stojak ze szkiełkami zawierającymi wycięte skrawki guza w piekarniku o temperaturze 60 °C na 30 minut, aby ułatwić proces odparafinowania.
    UWAGA: Podczas pieczenia szkiełka powinny być skierowane do góry. Zapewnia to przyleganie tkanek, a każdy wosk, który topi się, topi się na własnym szkiełku, a nie na sąsiednich szkiełkach.
  4. Aby ponownie nawodnić sekcje, zanurz upieczone sekcje w ksylenie dwa razy po 5 minut (2x 5 min) 100% etanolu przez 2x 5 min, a następnie 70% etanolu przez 1x 5 min. Myj szkiełka w wodzie destylowanej przez 5 min.
  5. W celu pobrania antygenu zanurzyć szkiełka w pojemniku z 1x buforem EDTA, pH 8, na 25-30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 100 °C. Wyjmij szkiełka z łaźni wodnej i pozostaw je w pozycji RT przez co najmniej 1 godzinę. Gdy szkiełka ostygną, umyj je pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty, a następnie TBST (TBS z 0,01% Tween20) przez 2x 5 minut.
  6. Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj okrąg wokół sekcji na szkiełkach.
  7. Ugasić endogenne peroksydazy, umieszczając około 100 μl 3% roztworu H2O2 (rozcieńczonego w wodzie destylowanej) na skrawkach przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty, a następnie TBST przez 2 x 5 min.
  8. Blokować skrawki z około 100 μl/sekcję buforu blokującego (5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w TBST) przez 30 minut w suchej smołce.
  9. Odcedzić bufor blokujący, delikatnie wrzucając nadmiar roztworu do tacki inkubacyjnej. Dodać około 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego (ludzki anty-ERα wyhodowany u królika) do skrawków w rozcieńczeniu 1:300 (lub w optymalnym, wcześniej ustalonym rozcieńczeniu specyficznym dla zastosowanego przeciwciała). Uzupełnić rozcieńczenia przeciwciał w 1% BSA TBST i umieścić szkiełka do inkubacji z przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Tacka inkubacyjna powinna być wypełniona wodą na dole, aby sekcje nie wyschły przez noc.
  10. Następnego ranka przemyć szkiełka TBST przez 3 x 5 min. Dodać około 100 μl wtórnego przeciwciała anty-królika na skrawki i pozostawić na 45 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka TBST przez 3 x 5 min.
  11. W dygestorium dodać około 100 μl odczynnika 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) na odcinki i utrzymywać roztwór włączony przez około 3 minuty na sekcję. Zahamuj reakcję DAB, myjąc szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
  12. Przeciwbarwić szkiełka hematoksyliną przez 1 minutę i płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty. Zanurz szkiełka w wodzie Scotta na 1 minutę, a następnie spłucz pod bieżącą wodą z kranu przez kolejne 2 minuty.
  13. Aby odwodnić sekcje, zanurz je w 70% etanolu na 2 min, 100% etanolu na 2x 2 min, a następnie ksylenie na 2x 2 min.
  14. W dygestorii ostrożnie zamontuj sekcje z ftalanu dibutylu, polistyrenu i ksylenu (DPX) i umieść na nich szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że pęcherzyki nie zostaną uwięzione na interesującej tkance. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w dygestorium.
  15. Następnego dnia użyj skanera do slajdów, aby uchwycić obrazy i zwizualizować barwienie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić lokalizację, dla której guzy ERα mogą być wyraźnie wizualizowane za pomocą 18F-FES PET, w tym badaniu wykorzystano trzy kohorty myszy po owariektomii (Rysunek 1). Dwóm grupom myszy wstrzyknięto komórki MCF-7 - linię komórkową ERα dodatniego raka piersi - albo IMF, albo w ramię. Jako kontrolę negatywną, innej kohorcie myszy wstrzyknięto komórki MDA-MB-231, powszechnie stosowaną potrójnie ujemną linię komórkową raka piersi, która nie wykazuje ekspresji ERα (Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy przydatność 18F-FES PET/MRI w wykrywaniu nowotworów piersi charakteryzujących się ekspresją ERα. Jako przykład pokazujemy, że jednym z miejsc, w których można uwidocznić guzy ERα-dodatnie, jest ramię myszy - guzy te można wyraźnie zidentyfikować na podstawie wychwytu 18F-FES, w porównaniu z guzami zlokalizowanymi w 4. pachwinowej poduszce tłuszczowej sutka (ryc. 4). Rozdział 18Wychwyt F-FES nie był widoczny w guzach MDA-MB-2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Breast Cancer Foundation (IIRS-22-071). Przyjmujemy do wiadomości Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria. Badania te zostały również przeprowadzone przy użyciu Solid Target Laboratory, partnerstwa ANSTO-Austin-LICR, wspieranego również przez National Imaging Facility i rząd stanu Wiktoria. Autorzy doceniają naukową i techniczną pomoc National Imaging Facility, zdolności National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS), w węźle La Trobe-ONJCRI, Olivia Newton-John Cancer Research Institute (ONJCRI). Rysunki 1 i 3 zostały wykonane za pomocą BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,5% Trypsyna (10x)Gibco15090-046
27 G x 13 mm 0,5 mL strzykawka insulinowaTerumoSS*05M2713KADo wstrzykiwań komórkowych
29 G x 13 mm 0,5 ml strzykawka insulinowaTerumoSS*05M2913KA Dowstrzykiwań estradiolu
30% H2O2Chem-SupplyHA154Rozcieńczony do 3% roztworu roboczego za pomocą woda destylowana
Olej kukurydzianySigmaC8267
DAB Substrate KitAbcamab64238
Dako anti-rabbit-HRP, 110 mLAligent-DakoK4003Przeciwciało wtórne stosowane w IHC
DMEM/F-12 MediumGibco11320033
Kalibrator dawkiCapintec5130-3216
Estradiol SigmaE2758
Receptor estrogenowy i alfa; (D8H8) Technologiasygnalizacji komórkowej# 8644Przeciwciało pierwotne używane do IHC
FBSBovogenSFBS
Element grzewczy (lampa na podczerwień)Amcal12400Do rozszerzenia żył ogonowych
MatrigelCorning356225
MultiCell 4-kanałowy zestaw monitorujący do komory obrazowania myszy potrójnej lub poczwórnej MedisoPR-MC900200Do monitorowania oddychania myszy
NanoScan PET/MRI 3T SystemMedisoPR-RD000000Do akwizycji PET/MRI
PBS (1x)Gibco14190-144
TBSTThermoFisher#28360Bufor płuczący do
komory obrazowania IHC Trzy myszyMedisoPR-MC407300Do akwizycji PET/MRI
mAb królika

Bibliografia

  1. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  2. Ignatov, A., Eggemann, H., Burger, E., Ignatov, T. Patterns of breast cancer relapse in accordance to biological subtype. J Cancer Res Clin Oncol. 144 (7), 1347-1355 (2018).
  3. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  4. Gnant, M., Turner, N. C., Hernando, C. Managing a long and winding road: Estrogen receptor-positive breast cancer. Am Soc Clin Oncol Educ Book. 43, e390922(2023).
  5. Thomsen, C., Nielsen, S., Nielsen, B. S., Pedersen, S. H., Vyberg, M. Estrogen receptor-α quantification in breast cancer: Concordance between immunohistochemical assays and mRNA-in situ hybridization for ESR1 gene. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (5), 347-353 (2020).
  6. Shafi, S., et al. Integrating and validating automated digital imaging analysis of estrogen receptor immunohistochemistry in a fully digital workflow for clinical use. J Pathol Inform. 13, 100122(2022).
  7. Harvey, J. M., Clark, G. M., Osborne, C. K., Allred, D. C. Estrogen receptor status by immunohistochemistry is superior to the ligand-binding assay for predicting response to adjuvant endocrine therapy in breast cancer. J Clin Oncol. 17 (5), 1474-1474 (1999).
  8. Caruana, D., Wei, W., Martinez-Morilla, S., Rimm, D. L., Reisenbichler, E. S. Association between low estrogen receptor positive breast cancer and staining performance. NPJ Breast Cancer. 6 (1), 5(2020).
  9. Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., Hastah, F. Minimum formalin fixation time for consistent estrogen receptor immunohistochemical staining of invasive breast carcinoma. Am J Clin Pathol. 120 (1), 86-92 (2003).
  10. Hammond, M. E. H., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. Arch Pathol Lab Med. 134 (6), 907-922 (2010).
  11. Allison, K. H., et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: ASCO/CAP guideline update. J Clin Oncol. 38 (12), 1346-1366 (2020).
  12. Amir, E., et al. Tissue confirmation of disease recurrence in breast cancer patients: Pooled analysis of multi-centre, multi-disciplinary prospective studies. Cancer Treat Rev. 38 (6), 708-714 (2012).
  13. Cardoso, F., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L., Costa, A., Castiglione, M. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 21 (Suppl 5), v15-v19 (2010).
  14. Cardoso, F., et al. 5th ESO-ESMO international consensus guidelines for advanced breast cancer (ABC 5). Ann Oncol. 31 (12), 1623-1649 (2020).
  15. James, W. F., et al. Recommendations on the use of 18F-FDG PET in oncology. J Nucl Med. 49 (3), 480-508 (2008).
  16. Pedersen, M. A., et al. Dynamic whole-body [18F]FES PET/CT increases lesion visibility in patients with metastatic breast cancer. EJNMMI Res. 14 (1), 24(2024).
  17. Grabher, B. J. 18F-FES whole-body imaging protocol for evaluating tumor estrogen receptor status in patients with recurrent or metastatic breast cancer. J Nucl Med Technol. 51 (3), 188-193 (2023).
  18. Van Kruchten, M., et al. PET imaging of estrogen receptors as a diagnostic tool for breast cancer patients presenting with a clinical dilemma. J Nucl Med. 53 (2), 182-190 (2012).
  19. Ulaner, G. A., et al. Summary: Appropriate use criteria for estrogen receptor-targeted pet imaging with 16α-18F-fluoro-17β-fluoroestradiol. J Nucl Med. 64 (3), 351-354 (2023).
  20. He, S., Wang, M., Zhang, Y., Luo, J., Zhang, Y. Monitoring the early response of fulvestrant plus tanshinone IIA combination therapy to estrogen receptor-positive breast cancer by longitudinal 18F-FES PET/CT. Contrast Media Mol Imaging. 2019 (1), 2374565(2019).
  21. Joseph, J. D., et al. The selective estrogen receptor downregulator GDC-0810 is efficacious in diverse models of ER+ breast cancer. eLife. 5, e15828(2016).
  22. Alsina-Sanchis, E., et al. Intraperitoneal oil application causes local inflammation with depletion of resident peritoneal macrophages. Mol Cancer Res. 19 (2), 288-300 (2021).
  23. Sluka, P., et al. Characterization of an estrogen receptor α-selective 18F-estradiol PET tracer. World J Nucl Med. 23 (03), 153-160 (2024).
  24. Katzenellenbogen, J. A. The quest for improving the management of breast cancer by functional imaging: The discovery and development of 16α-[18f]fluoroestradiol (fes), a pet radiotracer for the estrogen receptor, a historical review. Nucl Med Biol. 92, 24-37 (2021).
  25. Boers, J., et al. Image quality and interpretation of [18F]-FES-PET: Is there any effect of food intake. Diagnostics (Basel). 10 (10), 756(2020).
  26. Caceres, S., et al. Tumor growth progression in ectopic and orthotopic xenografts from inflammatory breast cancer cell lines. Vet Sci. 8 (9), 194(2021).
  27. Kumar, M., Salem, K., Jeffery, J. J., Fowler, A. M. PET Imaging of Estrogen Receptors Using 18F-Based Radioligands. Estrogen Receptors. , Springer US. New York, NY. (2022).
  28. Zhang, W., et al. Comparative study of subcutaneous and orthotopic mouse models of prostate cancer: Vascular perfusion, vasculature density, hypoxic burden and BB2r-targeting efficacy. Sci Rep. 9 (1), 11117(2019).
  29. Lee, A. V., Oesterreich, S., Davidson, N. E. MCF-7 cells-changing the course of breast cancer research and care for 45 years. J Natl Cancer Inst. 107 (7), djv073(2015).
  30. Pedram, H., et al. 18F-fluoroestradiol PET guides dosing of selective estrogen receptor degraders. J Nucl Med. 55 (supplement 1), 11(2014).
  31. Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E., Strom, J. O. Methods for long-term 17β-estradiol administration to mice. Gen Comp Endocrinol. 175 (1), 188-193 (2012).
  32. Luengo-Mateos, M., et al. Protocol for ovariectomy and estradiol replacement in mice. STAR Protoc. 5 (1), 102910(2024).
  33. Yang, Z., et al. High specific activity is not optimal: 18F-fluoroestradio positron emission tomography-computed tomography results in a breast cancer xenograft. J Labelled Comp Radiopharm. 59 (13), 576-581 (2016).
  34. Aliaga, A., et al. Breast cancer models to study the expression of estrogen receptors with small animal PET imaging. Nucl Med Biol. 31 (6), 761-770 (2004).
  35. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. -M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: A visual demonstration. J Vis Exp. 64, e4013(2012).
  36. Pisaneschi, F., et al. Automated, resin-based method to enhance the specific activity of fluorine-18 clicked PET radiotracers. Bioconjug Chem. 28 (2), 583-589 (2017).
  37. Johannes, N., et al. Variation of specific activities of 68Ga-aquibeprin and 68Ga-avebetrin enables selective PET imaging of different expression levels of integrins α5β1 and αvβ3. J Nucl Med. 57 (10), 1618-1624 (2016).
  38. Liu, C., Ma, G., Xu, X., Song, S., Yang, Z. Can 18F-FES PET improve the evaluation of 18F-FDG PET in patients with metastatic invasive lobular carcinoma. Clin Nucl Med. 49 (4), 301-307 (2024).
  39. Heidari, P., et al. Pharmacodynamic imaging guides dosing of a selective estrogen receptor degrader. Clin Cancer Res. 21 (6), 1340-1347 (2015).
  40. Roswall, P., et al. Microenvironmental control of breast cancer subtype elicited through paracrine platelet-derived growth factor-CC signaling. Nat Med. 24 (4), 463-473 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Receptor estrogenowy alfaPET 18F FESkom rki MCF 7ekspresja receptora estrogenowego alfaobrazowanie PETtkanka t uszczowa gruczo u piersiowegowizualizacja guzapozytonowa tomografia emisyjna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły