Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ultraczułej biblioteki cDNA do sekwencjonowania nowej generacji mikroRNA z małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

DOI:

10.3791/67154

⸱

13 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Discovery and Innovation, Hackensack Meridian Health (HMH), 2Oncology department, Georgetown University, 3Department of Medicine B, Hadassah - Hebrew University Medical Center, 4EValuate Diagnostics LLC, 5Jersey Shore University Medical Center (JSUMC), 6Illumina Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) zawierają specyficzne dla komórek mikroRNA, które regulują komórki biorcy, a identyfikacja których może rzucić światło na ich funkcję i rolę jako biomarkerów. Nasz zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki cDNA wprowadza unikalne kody kreskowe, które umożliwiają multipleksowanie próbek i ulepszone przetwarzanie EV o niskim wkładzie przy użyciu sparowanych kodów kreskowych z podwójnym indeksem w celu zapewnienia kompatybilności z sekwenatorami Illumina.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania pokazują, że małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV), które znajdują się we wszystkich płynach biologicznych, odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej poprzez przekazywanie białek, DNA i RNA. MikroRNA (miRNA), które są upakowane w sEV, stały się krytycznymi regulatorami dostarczanymi w komórkach biorcy. Ponieważ sEV wydzielane przez normalne i chore komórki przenoszą różne ładunki miRNA, ostatnie badania profilowania sEV-miRNA sugerują, że mogą one pomóc w identyfikacji nowych krążących biomarkerów. Jednak specyficzne dla komórki/choroby sEV krążące w różnych płynach biologicznych, po wyizolowaniu, zapewniają niskie ilości miRNA, które są na ogół trudne do ilościowego określenia przy użyciu konwencjonalnych metodologii spektrometrycznych. Sekwencjonowanie nowej generacji małych niekodujących RNA (NGS), które pozwala na amplifikację sklonowanych sekwencji miRNA, oferuje cenną możliwość oceny ładunku miRNA sEV. Niestety, komercyjne procedury przygotowania biblioteki cDNA często wymagają danych wejściowych RNA znacznie przekraczających niewymierne ilości dostępne z izolowanych sEV.

Tak więc, biorąc pod uwagę solidność i możliwości multipleksowania naszej istniejącej procedury przygotowania biblioteki cDNA (tj. początkowo zoptymalizowanej do analizy niskowejściowego, wysoce zdegradowanego, utrwalonego w formalinie RNA zatopionego w parafinie (FFPE), staraliśmy się ocenić jego przydatność do analizy miRNA sEV. Co ważne, biorąc pod uwagę niedawne techniczne ulepszenia klastrów chipów do sekwencjonowania, staraliśmy się dostosować nasze podejście do kodowania kreskowego transkrypcji w ramach procesu przygotowania biblioteki cDNA z parami, kompatybilnymi z podwójnym indeksem, aby zwiększyć nasze możliwości sekwencjonowania i multipleksowania. Korzystając z RNA wyekstrahowanego z 8,4 × 109 sEV w 16 powtórzeniach oraz ze zmniejszających się ilości sEV z 1010 sEV do zaledwie 2,5 × 107 sEV, oceniliśmy odtwarzalność i czułość tej metodologii. Dane pokazują, że 16 3' adenylowanych kodów kreskowych DNA pozwala na wysoce powtarzalne i czułe wykrywanie profili sEV-miRNA w powtórzeniach przy użyciu zaledwie 3,15 pg całkowitych małych niekodujących RNA lub 1,35 pg miRNA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEVs) to nanocząsteczki (~30-200 nm średnicy) pochodzenia komórkowego otoczone dwuwarstwową membraną fosfolipidową, która jest dziedziczona po komórce, z której pochodzą i która solidnie chroni ich molekularne ładunki1,2. Powszechnie przyjmuje się, że praktycznie wszystkie komórki wytwarzają i uwalniają sEV do przedziału międzykomórkowego, który z kolei można wykryć w większości płynów biologicznych (tj. krwi, moczu, śliny itp.)2,3,4. Ostatnie badania wykazały, że stabilnie zamknięte ładunki molekularne (tj. DNA, RNA, białka, lipidy itp.)5,6,7 sEVs, raz w kontakcie lub dostarczone do komórek biorcy, pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej8. Obecne wysiłki badawcze koncentrują się na poprawie izolacji specyficznych dla komórek sEV z różnych płynów biologicznych, aby precyzyjnie identyfikować i monitorować te ładunki molekularne9,10. Biorąc pod uwagę, że sEV zawierają małe niekodujące RNA, a w szczególności mikroRNA (miRNA), które zachowują swoją funkcję regulacyjną po dostarczeniu komórkowym, wiele badań koncentrowało się na ocenie użyteczności miRNA jako biomarkerów, które mogą ujawnić stan komórki ich pochodzenia11,12,13.

MicroRNA (miRNAs) reprezentują dużą klasę (~2,000 znanych u ludzi) małych niekodujących RNA o rozmiarach od 19 do 25 nukleotydów (nt), które wiążą się z niedoskonałymi miejscami komplementarnymi w nieulegających translacji regionach 3' swoich celów mRNA i kierują ich degradacją i/lub represją potranskrypcyjną14,15. Funkcjonalnie opisano miRNA jako kontrolujące wiele procesów biologicznych, a deregulacja ich ekspresji wiąże się ze zmianami w procesach molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych, które przyczyniają się do inicjacji i rozwoju chorób, w tym raka16,17,18. Co ważne, badania wykazały, że chore komórki, a zwłaszcza komórki nowotworowe, nie tylko inaczej wyrażają miRNA w porównaniu z normalnymi komórkami18, ale także różnią się ich upakowaniem w sEVs19,20.

Podczas gdy kilka badań skupia się na ustaleniu procesów molekularnych i szlaków, które kierują pakowaniem sEVs w normalnych i chorych komórkach19,21,22, badania nad biomarkerami koncentrują się obecnie na identyfikacji małych niekodujących sygnatur RNA i/lub miRNA, które są pakowane i wydzielane przez określone chore/rakowe komórki za pośrednictwem sEVs. Ukierunkowana izolacja chorych specyficznych dla komórek sEV z różnych ludzkich płynów biologicznych i ocena ich wieloomicznych ładunków molekularnych może zatem umożliwić opracowanie testów diagnostycznych i prognostycznych do nieinwazyjnego wykrywania różnych chorób i nowotworów u ludzi23,24,25,26. Chociaż sEV-miRNA są najczęściej badanymi transkryptami niekodującymi, inne małe niekodujące gatunki RNA (tj. izoformy miRNA (isomiR), piwiRNA, transferowe fragmenty RNA (tRF), rRNA, sieroce niekodujące RNA (oncRNA)...) są również oceniane pod kątem ich potencjalnej przydatności jako krążących biomarkerów sEV, ze szczególnym naciskiem na wykrywanie różnych nowotworów27,28,29,30,31,32.

Korzystne, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) małych niekodujących transkryptów RNA (w tym miRNA), po ich kodowaniu kreskowym i przygotowaniu biblioteki cDNA, jest idealne do eksploracji znanych i/lub nieznanych małych niekodujących gatunków RNA zawartych w krążących sEVs, które mogą być związane z chorobami27. Rzeczywiście, sEV small-RNA NGS zapewnia wysokoprzepustowe podejście do odkrywania specyficznych dla komórki małych niekodujących transkryptów RNA, które w przeciwnym razie pozostałyby nieznane, gdyby zostały globalnie ocenione za pomocą technologii specyficznych dla celu (tj. Multiplex PCR, mikromacierzy, niestandardowe panele itp.)32,33,34. Biorąc pod uwagę, że wcześniej zoptymalizowaliśmy ultraczuły, wysoce powtarzalny protokół przygotowania biblioteki cDNA, który opracowaliśmy do analizy wysoce zdegradowanych i nisko stężonych RNA zatopionych w parafinie (FFPE) o niskim stężeniu35,36, staraliśmy się dostosować go do analizy małych niekodujących RNA i miRNA zamkniętych w sEVs37,38,39,40.

Wraz z zaprzestaniem produkcji instrumentu Illumina HiSeq2500, który dostarczył nam lat wysokiej jakości analizy miRNA z podwójnym indeksem pojedynczym końca ładunków sEV37,40, staraliśmy się zbadać odtwarzalność i czułość naszego protokołu po dostosowaniu do zaktualizowanych instrumentów sekwencjonowania przy użyciu teraz sparowanej chemii dwuindeksowej. Mając na celu zachowanie możliwości multipleksowania oryginalnego protokołu, zachowaliśmy istniejące 16 kodów kreskowych do przygotowania transkryptów cDNA małych RNA przed zintegrowaniem ich z chemią dwuindeksową o sparowanym końcu. Korzystając tylko z pary kodów kreskowych i5 i i7, umożliwiamy przygotowanie solidnej laboratoryjnej biblioteki cDNA, w której jednoczesne przetwarzanie i analiza do 16 pojedynczych próbek poprawia odtwarzalność analityczną niskowejściowego RNA sEV. W związku z tym przedstawiamy procesy biochemiczne, zaktualizowane kody kreskowe, startery PCR i markerów wielkości oraz etapy izolacji niezbędne do wygenerowania wysoce powtarzalnych bibliotek cDNA przy użyciu bardzo niskich ilości miRNA wyizolowanych z ludzkich osocza sEV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wszystkie odczynniki i oligonukleotydy są przygotowywane w następujący sposób:

UWAGA: Wszystkie nukleotydy użyte w tym protokole są szczegółowo opisane w Rysunek 1 i Plik uzupełniający 1 w stężeniach, które są używane do implementacji tego protokołu. Zobacz Plik uzupełniający 2, aby zapoznać się z sekwencjami starterów.

  1. Przygotować roztwór podstawowy koktajlu kalibracyjnego, który będzie używany w każdej pojedynczej ligacji jako kontrola różnych reakcji enzymatycznych:
    1. Zawiesić oligonukleotyd nośnikowy (0,5 μM) (plik uzupełniający 1) wodą wolną od RNaz.
    2. Połącz 10 kalibratorów (każdy po 10 μl, plik uzupełniający 1) w jednej probówce o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać zapas 100 μM, rozcieńczyć go za pomocą oligonukleotydu nośnikowego, aby uzyskać roztwór o stężeniu 0,0052 nM i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Ponownie zawieś każdy z 17 unikalnych (16 eksperymentalnych i 1 testowy adapter z kodem kreskowym) adenylowanych adapterów 3' (Rysunek 1A) wodą wolną od nukleaz o stężeniu 50 μM.
    UWAGA: Każdy adapter jest podzielony na osobne probówki zawierające 2,5 μl do przechowywania w temperaturze -80 °C przez okres do 2 lat, aby zapobiec cyklom zamrażania i rozmrażania większych zapasów.
  3. Ponownie zawiesić różne eksperymentalne oligonukleotydy RNA, w tym nośnik ekstrakcji RNA (plik uzupełniający 1), nośnik ligacji RNA 3' (plik uzupełniający 1), test ligacji RNA (plik uzupełniający 1) i ligację 3' (plik uzupełniający 1; adapter 19 nt-3' i adapter 24 nt-3') oraz ligację 5' (plik uzupełniający 1; Adapter 5'-19 nt-3' i adapter 5'-24 nt-3') markery wielkości DNA, do 250 ng / μL.
  4. Rozcieńczyć oczyszczony HPLC adapter 5' do 100 μM wodą wolną od nukleaz (Rysunek 1A).
  5. Ponownie zawiesić startery RT i pierwsze startery RT/PCR 5' i 3' RT/PCR do 100 μM wodą wolną od nukleaz (Rysunek 1B).
  6. Ponownie zawiesić drugie oligonukleotydy PCR 5' i 3' PCR i7 i i5 do 100 μM wodą wolną od nukleaz (Rysunek 1B).
    UWAGA: Każdą próbkę DNA należy podać na porcję do 10 eksperymentów i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Przygotować barwnik w żelu z poliakrylamidu (PAA), wymieszać i podwielokrotnić 1 ml do probówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    1. Przygotować roztwór 0,5 M Na2H2 EDTA, dodając 18,6 g Na2H2 EDTA do 50 ml wody wolnej od nukleaz. Powoli dodawać granulki NaOH do przygotowanego roztworu Na2H 2 EDTA, aby osiągnąć pH 8,0. Uzupełnić objętość do 100 ml za pomocą ddH2O, aby otrzymać roztwór podstawowy 0,5 M Na2H2 EDTA (pH 8,0)
    2. Odważyć 15 mg błękitu bromofenolowego do probówki o pojemności 15 ml, ponownie zawiesić proszek w 600 μl wody wolnej od nukleaz, dodać 14,25 ml dejonizowanego formamidu. Na koniec dodać 150 μl roztworu 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0. Końcowy roztwór PAA rozdzielić na 1 ml probówki i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotuj 5x barwnik ładujący żel agarozowy.
      1. Zważyć i rozpuścić 1,86 g Na2H 2-EDTA w 50 ml wody wolnej od RNaz i dostosować pH do 8,0 przez dodanie granulek NaOH. Dodaj wodę wolną od RNaz do 100 ml, aby uzyskać 50 mM Na2H2 EDTA.
      2. Do 5 ml 50 mM Na2H2 EDTA dodaj 20 mg błękitu bromofenolowego, 20 mg ksylenu cyjanolu FF i 2 g Ficollu typu 400. Zmieszać probówkę zawierającą trzy barwniki i dodać dodatkowe 5 ml 50 ml 50 mM Na2H2 EDTA. Porcjować pojedyncze tubki 1 ml z 5x żelem agarozowym ładującym barwnik i przechowywać w temperaturze -80°C.

2. Przygotowanie próbek RNA EV

  1. Po wyizolowaniu sEV należy ocenić ich morfologię za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM; Rysunek 2), stężenie przy użyciu analizy śledzenia nanocząstek (NTA; Rysunek 3), oraz rozkład białek powierzchniowych przy użyciu nanoobrazowania w superrozdzielczości (Rysunek 4) lub równoważnej technologii kwantyfikacji sEV.
  2. Podzielić równoważną liczbę sEV w różnych probówkach, dodać RNazę-A (12,5 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Zainicjuj ekstrakcję małych niekodujących RNA, w tym miRNA, z sEV za pomocą zestawu do ekstrakcji małego RNA i zainicjuj izolację faz RNA.
  4. Oddziel dolną fazę wodną buforu do lizy RNA, dodaj ją do nowej probówki, a następnie dodaj 4 ng oligonukleotydu nośnika RNA (plik uzupełniający 1) do każdej próbki RNA, przed przeprowadzeniem izolacji kolumny zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Szybko odkurz każdą pojedynczą próbkę RNA do 9,5 μl, aby zainicjować protokół przygotowania biblioteki cDNA.

3. Ustaw ligacje adaptera 3' z kodem kreskowym z 16 próbkami RNA i 1 próbką testową

  1. Zidentyfikuj 16 pojedynczych próbek sEV-RNA, podwielokrotn je w 9,5 μl wody wolnej od nukleaz do 1,5 ml silikonowanych probówek mikrowirówek i umieść je na lodzie co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentów.
  2. Przygotuj 10x bufor ligazy RNA (bez ATP) na świeżo przed eksperymentem.
    1. W silikonowanej probówce o pojemności 1,5 ml wymieszaj 343 μl podwójnie destylowanej wody bez nukleaz (ddH2O), 500 μl 1 M Tris pH 7,5, 100 μl 1 M MgCl2, 50 μl 20 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i 7 μl 14 M 2-merkaptoetanolu.
    2. Wymieszaj roztwór, przesuwając probówkę, odwiruj przez 2 s w temperaturze 2 000 × g w temperaturze pokojowej (RT) na wirówce stołowej, a następnie umieść na lodzie.
      UWAGA: Wszystkie kroki opisujące "wirówkę na 2 s" są wykonywane za pomocą mikrowirówki o temperaturze pokojowej z prędkością nie wyższą niż 2,000 × g.
  3. Rozmrozić koktajl kalibratora 0,0052 nM, umieszczając probówkę na lodzie na 10 minut.
  4. Przygotuj Ligation Master Mix do 18 reakcji w 1,5 ml silikonowanej probówce, łącząc 40 μl 10x buforu ligazy RNA, 10 μl koktajlu kalibracyjnego 0,0052 nM i 40 μl ddH2O bez nukleaz.
  5. Przesuń i zakręć probówką o pojemności 1,5 ml i umieść ją na lodzie.
  6. Dodać 4,5 μl Ligation Master Mix do każdej z 16 indywidualnie porcjowanych próbek RNA sEV i przeprowadzić reakcję ligacji testowej zawierającą 100 ng oligonukleotydu testowego ligacji RNA (plik uzupełniający 1) uprzednio porcjowanego i o objętości 9,5 μl. Przesuń, aby wymieszać i obrócić rurki przed umieszczeniem ich z powrotem na lodzie.
  7. Przenieść 16 próbek i przeprowadzić reakcję testową do bloku grzewczego na 1 minutę w temperaturze 90 °C, a następnie przenieść z powrotem do lodu.
  8. Przenieś indywidualnie 4 μl 50% PEG do każdej probówki, przesuń w celu wymieszania i odkręć probówki przed umieszczeniem ich z powrotem na lodzie.
  9. Rozmrozić 2,5 μl porcji z każdego z 17 adapterów z kodami kreskowymi 3' (16 eksperymentalnych (#1 do #16) i testowych (#17)) i umieść na lodzie w celu rozmrożenia.
  10. Przenieść 1 μl każdego z 17 łączników do odpowiednich 16 próbek zawierających sEV-RNA i jedną próbkę testową, z Ligation Master Mix (tj. 4,5 μL) i 50% PEG (tj. 4 μL).
    UWAGA: Wszystkie roztwory i reakcje miesza się poprzez przesuwanie probówek i obracanie ich, a nie pipetowanie roztworów w górę iw dół, aby zapobiec utracie materiału.
  11. Przygotować rozcieńczony enzym ligacyjny T4 RNA Ligazy 2 skróconej K227Q, dodając 10 μl enzymu z 10 μl ddH2O wolnego od nukleaz do nowej 1,5 ml silikonowanej probówki.
  12. Przenieś 1 μl rozcieńczonego enzymu ligacji T4 RNA Ligazy 2 skróconego K227Q do każdej z 17 probówek (16 eksperymentalnych i 1 testowa próbka RNA). Nie pipetować w górę i w dół, zmieniaj końcówki między każdą probówką, trzymaj probówki na lodzie, mieszaj mieszanki, odwiruj i umieść probówki na lodzie.
  13. Umieścić podwiązania na świeżym lodzie w uchwycie na probówkę w wiaderku na lód w chłodni, na noc do 18 godzin.

4. PAGE izolacja adaptera 3' Małe RNA

  1. Umieść 17 probówek na bloku grzewczym w temperaturze 90 °C na 1 minutę, aby dezaktywować ligazę T4 RNA 2 i umieść na lodzie na 2 minuty, aby ostygły.
  2. Połączyć 1 μl GlycoBlue i 26 μl 5 M wolnego od nukleaz NaCl do świeżej probówki i przenieść 1,2 μl tego roztworu strącającego do każdej z 17 probówek.
  3. Dodaj 63 μl 100% etanolu do każdej z 17 probówek, zamknij, przesuń i wiruj przez 2 sekundy przed ponownym umieszczeniem na lodzie.
  4. Połącz zawartość 16 probówek RNA sEV w jedną silikonowaną probówkę o pojemności 1,5 ml, zachowując oddzielnie probówkę do ligacji testowego RNA.
  5. Odwrócić probówkę zawierającą połączone próbki 3x w celu wymieszania, krótko odwirować przez 2 sekundy i umieścić na lodzie na 60 minut w celu wytrącenia.
  6. Przygotuj duży (16 x 20 cm2) 15% żel poliakryloamidowy (PAGE) w następujący sposób:
    1. Silikonizujemy (tj. za pomocą roztworu na bazie silikonu) i odlewamy krótkie i długie płytki szklane wraz z przekładkami o średnicy 0,1 cm.
    2. Przygotować 15% mieszaninę żelu PAGE, łącząc 9 ml rozcieńczalnika systemowego, 18 ml koncentratu systemowego, 3 ml buforu systemowego, 240 μl APS (9%) i 12 μl TEMED w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Szybko przenieś roztwór między szklanymi płytkami za pomocą pipety o pojemności 30 ml. Zanim żel ulegnie polimeryzacji, dodaj 14-dołkowy grzebień (o grubości 0,1 cm) i ustaw żel w pozycji pionowej na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Odzyskać probówkę z połączonymi próbkami RNA z lodu i odwirować ją w temperaturze 16 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  8. W międzyczasie zakończ ustawianie 15% PAGE, delikatnie wyjmując grzebień, czyszcząc studzienki za pomocą wolnego od nukleaz H2Oza pomocą butelki ze spryskiwaczem nad zlewem, przed wysuszeniem i ustawieniem 15% PAGE na aparacie żelowym, gdzie zarówno górny, jak i dolny zbiornik są wypełnione 0,5x roztworem Tris-Boran EDTA (TBE), przed 30-minutowym uruchomieniem wstępnym przy 450 V.
  9. Wyjąć probówkę z wirówki (krok 4.6) i ostrożnie wysuszyć osad RNA za pomocą pipety Pasteura z końcówką bez filtra o pojemności 10 μl na końcu, podłączonej do systemu próżniowego, nie naruszając osadu.
  10. Zawiesić osad RNA zawierający wytrącone 16 ligacji RNA w 20 μl ddH2O bez nukleaz i dodać 20 μl roztworu ładującego żel PAA. Przesuń probówkę, aby wymieszać, odwiruj przez 2 sekundy i umieść na lodzie.
  11. Zamień 0,5 x TBE aparatu żelowego na świeży 0,5 x TBE.
  12. Ustaw probówkę z drabinką o rozmiarze RNA 20 pz, dwie probówki z każdym z dwóch markerów krótkiego rozmiaru DNA 3'-ligacji (plik uzupełniający 1) i jedną probówkę zawierającą oligonukleotyd testu ligacji RNA (tj. Ligowany za pomocą adaptera z kodem kreskowym #17).
  13. Do każdej z probówek (tj. drabiny, 3' ligacji krótkich oligonukleotydów DNA i testu ligacji RNA) dodać 20 μl roztworu ładującego żel PAA.
  14. Ustawić 16 probówek z próbką ligowanego RNA i 1 probówkę do ligacji RNA w temperaturze 90 °C na 1 minutę i ponownie umieścić na lodzie.
  15. Wymień 0,5 x bufor TBE zarówno z dolnego, jak i górnego zbiornika (tj. dodaj bufor poniżej poziomu studni, aby nie było zanieczyszczenia krzyżowego między studzienkami podczas ładowania) i załaduj drabinkę na końce żelu, ligację testową RNA, dwa krótkie markery wielkości DNA po obu stronach studzienki zawierające 16 połączonych ligacji RNA z kodem kreskowym 3' (patrz Rysunek 5).
  16. Uruchom żel 15% PAGE ze wszystkimi próbkami przez 90 minut pod napięciem 450 V (~35 mA) w warunkach chłodzenia (tj. z wentylatorami nawiewającymi powietrze na szklane płytki).
  17. Usuń 15% PAGE ze szkła i lekko spryskaj go roztworem SYBR Gold (10 μL SYBR Gold w 25 ml 0,5x TBE) i pozostaw na 5 minut w ciemności.
  18. Umieść żel na transiluminatorze światła niebieskiego (Rysunek 5) i wyrównaj zarówno adapter 19 nt-3', jak i oba znaczniki rozmiaru adaptera 24 nt-3' krótkie oligonukleotydy DNA za pomocą linijki i wytnij obszar żelu zawierający zligowane konstrukty miRNA (Rysunek 6 przedstawia ligację 3' i wynikowy konstrukt). Oddzielnie należy wyciąć górne pasmo ligacji testowej RNA, które zostanie również użyte do testowej ligacji 5' następnego dnia.
  19. Umieścić dwa oddzielne wycięte kawałki żelu (tj. dla 16 próbek RNA i do ligacji testowej) w różnych probówkach do łamania żelu o pojemności 0,5 ml umieszczonych w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 16 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić dwa zestawy rozdrobnionych kawałków żelu w 300 μl 400 mM roztworu NaCl, Zamknij probówki i uszczelnij je parafilmem.
  20. Ustawić probówki na wytrząsarce z mieszaniem przy 1.100 obr./min w temperaturze 4 °C, przez noc (16-17 godzin).

5. Podwiązanie adaptera 5'

  1. Przenieś dwie oddzielne rozdrobnione żele i ich roztwory (16 x 3' próbek z kodami kreskowymi (kody kreskowe #1 do #16) i 3' testowe RNA z kodem kreskowym (kod kreskowy #17)) na dwie oddzielne probówki filtracyjne 5 μm, każda osadzona w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml, uszczelnij je parafilmem i wiruj przez 5 minut przy 2,300 × g w temperaturze pokojowej.
  2. Do każdego przefiltrowanego roztworu dodać 950 μl 100% etanolu, zamknąć probówki, odwrócić do mieszania, wirować przez 2 s, uszczelnić probówki parafilmem i umieścić je na lodzie na 1 godzinę.
  3. Świeżo przygotuj 50% wodny bulion DMSO, łącząc 1 ml wody wolnej od nukleaz z 1 ml DMSO, zawiń probówkę w folię aluminiową i przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Przygotuj żel 15% PAGE i uruchom go wstępnie, postępując zgodnie z krokami opisanymi w punkcie 4.6.
  5. Odwirować probówki zawierające 3' ligowane 16 próbek RNA i testową ligację RNA w temperaturze 16 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia ligowanych RNA.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania granulek RNA i wysuszyć próżniowo.
  7. Zawiesić 3' ligowany osad 16 próbek RNA i przetestować RNA w 8 μl ddH2O bez nukleaz bez pipetowania w górę iw dół. Lekko przesuń probówki, aby wymieszać, odwirować przez 2 s (2 000 × g) w temperaturze pokojowej i umieść probówki na lodzie.
  8. Przygotuj 10x bufor ligazy RNA (z ATP), mieszając 500 μL 1 M Tris (pH 7,5), 100 μL 1 M MgCl2, 50 μL 20 mg / ml acetylowanego BSA, 200 μL 10 mM ATP, 7 μL 2-merkaptoetanolu 14 M i 143 μL wody wolnej od RNaz w probówce 1,5 ml.
  9. Dodaj 2 μl 10x bufora ligazy RNA (tj. z ATP), 1 μl adaptera 100 μM 5' i 4 μl 50% wodnego DMSO do każdej probówki. Przesuń, aby wymieszać, wiruj przez 2 s w temperaturze natężenia światła, a następnie ustaw probówkę w temperaturze 90 °C na 1 minutę, aby zdenaturować RNA i umieść ją z powrotem na lodzie.
  10. Dodaj 3 μl 50% DMSO, strzepnij, aby wymieszać, odwiruj do osadu, dodaj 3 μl ligazy RNA T4 do każdej probówki, przesuń probówki, wiruj przez 2 s w temperaturze pokojowej i ustaw probówki na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 75 min.
    UWAGA: Nie pipetować w górę i w dół.
  11. Przygotować drabinkę DNA 20 nt i dwie oddzielne probówki zawierające marker 5' wielkości ligacji długich oligonukleotydów DNA (plik uzupełniający 1; adapter 5' - 19 nt-3' i adapter 5' - adapter 24 nt-3') i dodać 20 μl PAA do każdej z probówek.
  12. Po zakończeniu ligacji adapterem 5' dodaj 20 μl PAA do każdej z dwóch ligacji (tj. 16 próbek RNA i testowego RNA), wymieszaj przez strzepnięcie, odwiruj w dół i ustaw w temperaturze 90 °C na 1 minutę, po czym umieść probówki z powrotem na lodzie.
  13. Opróżnij górny i dolny zbiornik aparatu żelowego i dodaj świeży 0,5 x roztwór TBE poniżej poziomu studzienek górnego zbiornika.
  14. Załaduj drabinkę na końcu żelu, 5' ligowaną próbkę testowego RNA, dwa oligonukleotydy DNA o długim markerze wielkości (tj. adapter 5' - 19 nt-3' i adapter 5' - adapter 24 nt-3') do studzienek otaczających studzienkę, w której zostaną załadowane 5' ligowane próbki 16 RNA (Rysunek 6 przedstawia ligację 5' i wynikową konstrukcję). Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 450 woltów.
  15. Po zakończeniu cyklu usuń żel z aparatu i szkła i spryskaj go roztworem SYBR Gold (tj. 10 μl SYBR Gold w 25 ml 0,5 x TBE) i pozostaw w ciemności na 5 minut.
  16. Używając adaptera 5'-19 nt-3' i obu znaczników rozmiaru adaptera 5'-24 nt-3' długich oligonukleotydów DNA jako prowadnic rozmiaru, bezpośrednio wytnij odcinek żelu zawierający 5' ligowane 16 próbek RNA (Rysunek 7).
    UWAGA: Testowa ligacja RNA jest oceniana na żelu w celu wykazania, że ligacja adaptera 5' pozwala na przesunięcie rozmiaru równoważnego znacznikom rozmiaru. Testowa ligacja RNA nie jest wycinana z żelu; tylko zligowane 16 połączonych próbek RNA.
  17. Przenieś wycięty kawałek żelu zawierający 16 ligowanych próbek RNA do 0,5 ml probówki z łamaczem żelu umieszczonej w probówce o pojemności 1,5 ml, wiruj z prędkością 16 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj 300 μl 300 mM NaCl i 1 μl 100 μM 3' startera RT/PCR (Rysunek 1B) do pokruszonych kawałków żelu w probówce.
  18. Uszczelnić probówkę parafilmem i umieścić na wytrząsarce mieszającej z prędkością 1 100 obr./min w temperaturze 4 °C, przez noc (17-18 godzin) w chłodni.

6. Odwrotna transkrypcja małych niekodujących RNA i miRNA z kodami kreskowymi 5' i 3'

  1. Odpipetować roztwór z probówki zawierającej rozdrobniony żel do probówki filtracyjnej o średnicy 5 μm włożonej do 1,5 ml probówki bez silikonów RNaz i krótko obrócić, aby roztwór mógł przejść przez filtr.
  2. Dodaj 950 μl 100% etanolu do tego przefiltrowanego roztworu, odwróć probówkę do wymieszania, wiruj przez 2 s i pozostaw na lodzie na 60 minut.
  3. Wytrącić osad RNA przez odwirowanie probówki w temperaturze 16 000 × g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
  4. Odzyskać probówkę, ostrożnie usunąć supernatant bez dotykania osadu i wysuszyć próżniowo osad przed ponownym zawieszeniem go w 5,6 μl H2Owolnym od nukleaz
    5. .
  5. Ustaw reakcję RT, dodając 3 μl 5x buforu pierwszej nici, 4,2 μl 10x dNTP (każdy przy 2 mM) i 1,5 μl ditiotreitolu (DTT) do probówki. Przesuń palcem, aby wymieszać i obracaj przez 2 sekundy.
  6. Ustawić reakcję w temperaturze 90 °C dokładnie na 30 s, a następnie przenieść probówkę do bloku w temperaturze 50 °C na 2 minuty.
  7. Reakcję RT należy rozpocząć od dodania 0,75 μl enzymu odwrotnej transkryptazy do roztworu, wymieszać i ustawić w temperaturze 50 °C na 35 minut.
  8. Przenieś probówkę w temperaturze 95 °C na 1 minutę w celu denaturacji enzymu i nici cDNA/RNA, a następnie dodaj 95 μl H2O wolnego od RNaz, przesuń probówkę do wymieszania i umieść ją na lodzie na 2 minuty. Ta probówka zawiera cDNA wygenerowane z 16 próbek RNA, z których każda jest oddzielnie oznaczona kodem kreskowym w 3'.

7. Przeprowadź test PCR i amplifikację na dużą skalę

  1. Przygotuj świeży bufor 10x PCR, łącząc 304 μl H2O bez nukleaz, 125 μl 2 M KCl, 50 μL 1 M Tris pH 8,0, 10 μL 1 M MgCl2, 5 μL 1% Triton X-100 i 6 μL 1 M 2-merkaptoetanolu w probówce, która może być przechowywana na lodzie.
  2. Złóż pilotażową/testową reakcję PCR dla cDNA wytworzonego w kroku 6.8 (powyżej), łącząc 67 μl H2Owolnego od nukleaz z 10 μl 10x buforu PCR, 10 μL 10x dNTPs, 0,5 μL 100 μM 5' startera PCR, 0,5 μL 100 μM 3' startera PCR, 10 μL biblioteki cDNA i 2 μL 50x polimerazy Taq do świeżej probówki PCR.
    UWAGA: Przed przeprowadzeniem amplifikacji PCR należy skonfigurować urządzenie, ustanawiając dwa różne pliki w następujący sposób: Dla Pliku #1: 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 85 s i 72 °C przez 60 s przez 12 cykli i 4 °C; oraz dla Pliku #2: 94 °C przez 45 s, 50 °C przez 85 s i 72 °C przez 60 s przez 2 cykle i 4 °C.
  3. W przypadku pilotażowej/testowej reakcji PCR umieść probówkę PCR zawierającą 100 μL reakcji PCR w termocyklerze i uruchom plik#1.
  4. Po zakończeniu Pliku#1 otwórz probówkę PCR i przenieś 12 μl reakcji do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 3 μl 5x barwnika ładującego żel. Zamknij tubkę i napisz "12 cykli" na nasadce.
  5. Weź probówkę do PCR, umieść ją w termocyklerze i uruchom plik #2.
  6. Po zakończeniu Pliku#2 przenieś 12 μL reakcji PCR do 1,5 ml probówki zawierającej 3 μL 5x barwnika ładującego żel i napisz "14 cykli" na jej nakrętce.
  7. Powtórz amplifikacje PCR jeszcze cztery razy (tj. po dwa cykle PCR), przenosząc 12 μl produktu PCR na końcu każdej amplifikacji, a następnie uzyskaj cztery różne probówki, oznaczone 16, 18, 20 i 22 cyklami.
  8. Załaduj drabinę o rozmiarze 20 nt i każdy z produktów amplifikowanych PCR na 2,5% agarozę i uruchom żel w 0,5x TBE przez 30 minut przy 120 V.
  9. Zidentyfikuj optymalny cykl amplifikacji PCR (Figura 8A), w oparciu o stosunek i obecność dimerów starterów (dolne pasmo) i amplifikowane cDNA (górne pasmo).
    UWAGA Biorąc pod uwagę, że całkowity wkład RNA z 16 próbkami może być niższy niż 1 ng, oczekuje się, że dimery starterów będą generować produkt szybciej i w większych ilościach niż oczyszczone cDNA. W związku z tym odpowiedni cykl PCR jest zwykle wybierany między 18 a 22 cyklami. W Rysunek 8A, odpowiedni cykl PCR dla tej biblioteki to 20. W Rysunek 8B, rozmiar konstruktu PCR jest szczegółowy.
  10. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego cyklu amplifikacji PCR należy ustawić ujemny wynik PCR (brak cDNA) i cztery dodatnie reakcje PCR po 100 μl (tj. każda zawierająca 12 μl cDNA).
      Aby uprościć przygotowanie reakcji PCR, ustaw PCR Master Mix (tj. dla 4,5 reakcji) w probówce o pojemności 1,5 ml, łącząc 292,5 μl H2O bez nukleaz, 45 μl 10 x buforu PCR, 45 μl 10 x dNTP, 3,25 μl startera 3' RT/PCR (Rysunek 1B) i 2,25 μl startera 5' PCR (Figura 1B).
    1. Odwróć tę rurkę, aby wymieszać i obrócić, aby zebrać się na dnie probówki.
    2. Przenieś 86 μl PCR Master Mix do każdej z czterech probówek PCR o pojemności 0,5 ml.
    3. Dodaj 12 μl biblioteki cDNA (przechowywanej na lodzie), a następnie 2 μl 50x tytanowej polimerazy Taq do każdej z 4 probówek PCR i mieszaj, pipetując w górę iw dół.
    4. Przygotuj probówkę reakcyjną PCR bez matrycy, dodając 77 μl H2O bez nukleaz, 10 μl 10 x buforu PCR, 10 μl 10 x dNTP, 0,5 μl startera 5' PCR, 0,5 μl startera 3' PCR i 2 μl 50x polimerazy Taq do oddzielnej probówki PCR i pipetując w górę iw dół w celu wymieszania.
    5. Ustaw probówki PCR w termocyklerze, korzystając z cyklu PCR określonego w kroku 7.9 i ustaw nowy program w termocyklerze, aby w razie potrzeby wzmocnić.
  11. Przygotuj 2,5% żel agarozowy z 0,5x TBE i bromkiem etydyny i przenieś 12 μl z każdej probówki PCR do pojedynczych probówek zawierających 3 μl 5x barwnika ładującego żel.
  12. Przygotować drabinkę o masie 20 nt, łącząc 3 μl drabinki z 9 μl H2O bez nukleaz i 3 μl barwnika ładującego żelem.
  13. Załaduj żel, uruchom go na 30 minut przy napięciu 120 V i sprawdź, czy amplifikacja PCR jest podobna między czterema różnymi reakcjami i czy kontrola bez matrycy jest pusta (Rysunek 8C).
  14. Połącz cztery reakcje PCR między dwiema silikonowanymi probówkami mikrowirówkowymi o pojemności 1,5 ml (tj. dwiema probówkami zawierającymi 90 μl produktu) i dodaj 18 μl 5 M NaCl i 800 μl 100% etanolu do każdej z dwóch probówek.
    1. Odwróć probówki, aby je wymieszać i przechowywać w temperaturze -20 °C do wytrącenia przez noc.

8. Oczyszczanie biblioteki wzmocnionej PCR

  1. Odwirować dwie probówki zawierające zmieszane dodatnie reakcje PCR w temperaturze 16 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Po 60 minutach usunąć supernatant, wysuszyć próżniowo granulki DNA i ponownie je zawiesić w 19,5 μl 1x buforu, a następnie dodać 0,5 μl enzymu PmeI.
  3. Ustawić trawienie PmeI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, aby usunąć wszelkie markery wielkości DNA, które biegły w sąsiednich studzienkach (tj. adapter 19 nt-3', adapter 24 nt-3') lub nośniki RNA (tj. nośnik ekstrakcji RNA, nośnik ligacji RNA po 3') potencjalne zanieczyszczenia (tj. patrz miejsca PmeI zawarte w starterach RNA i DNA w pliku uzupełniającym 1)
  4. Uruchom dwa roztwory w trzech różnych dołkach 2,5% żelu agarozowego, używając 0,5 x TBE, aby uniknąć gromadzenia się nadmiaru dimerów starterów w jednym dołku i tworzenia rozmazu.
    1. Dodaj 3 μl 5x barwnika ładującego żel do każdego z trawień, połącz dwa roztwory, a następnie załaduj 16,5 μl do trzech oddzielnych sąsiednich studzienek.
    2. Załaduj drabinkę o rozmiarze DNA 20 nt w końcowych dołkach żelu i uruchom żel przez 90 minut pod napięciem 150 V (Rysunek 8D).
  5. Aby oczyścić biblioteki DNA, należy wyciąć górne prążki PCR z trzech sąsiednich pasów żelu i przenieść je do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Oczyść bibliotekę amplifikowaną PCR za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta, i oznacz ilościowo oczyszczony produkt DNA za pomocą fluorometru, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

9. Końcowa amplifikacja PCR w celu dodania kodów kreskowych kompatybilnych z sekwencerem

  1. Przygotuj świeżą mieszaninę buforową 10x PCR, jak opisano w kroku 7.1.
  2. Skonfigurować reakcje PCR, włączając jedną kontrolę ujemną (bez amplikonów) i trzy reakcje PCR przy użyciu 0,75 ng produktu PCR oczyszczonego z pierwszej amplifikacji PCR w każdej z trzech probówek w następujący sposób:
      Przygotuj trzy indywidualne reakcje PCR, mieszając 75 μl ddH2O, 10 μl 10 x buforu PCR, 10 μl 10 x dNTP, 1 μl 5' 2 nd PCR starter (tj. starter i503 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B)), 1 μL 3' PCR 2 nd starter (tj. starter i702 (Rysunek 1B)),
    1. 1 μl produktu PCR (tj. 0,75 ng z oczyszczonego żelem 1. produktu PCR) i 2 μl polimerazy tytanowej Taq.
    2. Ustaw negatywną kontrolę PCR (tj. brak matrycy DNA), mieszając 76 μL ddH2O, 10 μL 10x buforu PCR, 10 μL 10x dNTP, 1 μL 5' 2 nd PCR starter (tj. starter i503 (Figura 1B)), 1 μL 3' PCR 2nd starter (tj. starter i702 (Rysunek 1B)), oraz 2 μL polimerazy Taq.
    3. Ustawić cztery reakcje PCR (tj. jedną kontrolę ujemną, trzy dodatnie) na termocyklerze zaprogramowanym w następujący sposób: 72 °C przez 3 min, 95 °C przez 30 s i 95 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s przez 9 cykli, a następnie 72 °C przez 5 min, i końcowe zatrzymanie w temperaturze 10 °C.
  3. Po zakończeniu cykli PCR weź 10 μl mieszaniny reakcyjnej i dodaj 3 μl barwnika ładującego, a następnie oceń produkty na 2,5% żelu agarozowym, jak pokazano w Rysunek 9A, wraz z drabinką 20 nt.
  4. Po walidacji rozmiaru produktu PCR (tj. górnego pasma PCR biegnącego w temperaturze 164 pz, jak pokazano w Rysunek 9B i Rysunek 6 dla rozmiaru i szczegółów dotyczących ostatecznej konstrukcji) i rozkładu prążków, połącz produkty PCR w dwóch probówkach, dodając do każdego 135 μl produktu PCR (tj. 90 μL + 45 μL), 13,5 μl 5 M NaCl i 650 μl 100% etanolu i wytrącić w temperaturze -20 °C przez noc.
  5. Następnego dnia odwirować dwie probówki do PCR o stężeniu 16 000 × g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Wysuszyć każdą osadkę, ponownie zawiesić 19,5 μl 1x buforu PmeI i dodać 0,5 μl PmeI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C na wytrząsarce, aby jeszcze bardziej wyeliminować wszelkie znaczniki wielkości, które biegły w sąsiednich studzienkach (tj. adapter 19 nt-3', adapter 24 nt-3') lub nośniki RNA (tj. Nośnik ekstrakcji RNA, nośnik ligacji RNA post-3'
    7. ).
  7. Strawione produkty umieścić w trzech dołkach z 2,5% żelem agarozowym i oddzielić pod napięciem 150 V na 90 minut.
  8. Wyciąć górne pasmo, które biegnie przy 164 pz (Rysunek 9C) i oczyścić produkt DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA i określić ilościowo za pomocą fluorometru.
  9. Uruchom końcowy produkt PCR na chipie DNA, aby zweryfikować rozmiar, stężenie i czystość biblioteki przed rozcieńczeniem i analizą przy użyciu sekwencera.
  10. Przenieś plik danych FASTQ do potoku RNAworld w celu przycięcia adaptera, demultipleksacji, dopasowania do ludzkiego genomu, przed analizami miRNA, jak opisano wcześniej41. Alternatywnie, korzystając ze skryptu przedstawionego w pliku uzupełniającym 3, należy zdemultipleksować odczyty z pliku FASTQ i kontynuować przetwarzanie przy użyciu wybranego potoku analitycznego small-RNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano w powyższym protokole, opisujemy jednoczesne przetwarzanie do 16 pojedynczych próbek RNA małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV) (tj. do analizy małych niekodujących RNA i miRNA), które są analizowane razem w ramach jednej biblioteki, po przejściu 3' kodowania kreskowego. SEVs, które zostały wybrane do naszych analiz, zostały wyizolowane przez ultrawirowanie, jak opisano wcześniej37,40, z 45 ml osocza pobranego od kobiet, u których zdiagnozowano ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokół przygotowania biblioteki cDNA do powtarzalnego i czułego sekwencjonowania nowej generacji (NGS) niekodujących RNA, w tym mikroRNA (miRNA) skutecznie izolowanych z małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEV). Biorąc pod uwagę, że ograniczona ilość małych niekodujących RNA i miRNA może zostać odzyskana z globalnie lub selektywnie izolowanych sEV, staraliśmy się zoptymalizować naszą procedurę przygotowania biblioteki cDNA, która umożliwia powtarzalną i czułą analizę ładunków miRNA sEV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O.L. jest bezrobotnym założycielem EValuate Diagnostics, Inc z niewielkim procentem udziałów w spółce. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pragniemy podziękować laboratorium dr Thomasa Tuschla za wsparcie i za udostępnienie oryginalnej technologii opracowanej w ich laboratorium, a także za udzielenie nam dostępu do potoku RNAworld.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Triton X-100 InvitrogenHFH10
10 mM ATP AmbionAM8110G
10x dNTPs AmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14 M MerkaptoetanolSigmaO3445I-100 
Drabina 20 nt Jena BioscienceM-232S
surowicy bydlęcejSigmaB8894-5ML 
50x Tytanowy Taq Laboratoria Clontech 
Nadsiarczan amonuFisher Scientific 7727-54-0
Oświetlacz światła niebieskiego - Safe Imager 2.0 ThermofisherG6600
BRL Pionowy system elektroforezy żelowej ze szklanymi płytkami i grzebieniamiGIBCOV16
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD9170-5VL
Mikrowirówka Eppendorf 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppendorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Rurka filtracyjna z Filtr 5mmIST Engineering Inc.5388-50
Fisherbrand Silikonowane probówki wirówkowe o niskiej retencji 1,5 mlFisher Scientific02-681-320
Rurka do łamania żelu 0,5 mlIST Engineering Inc.3388-100
Aparat do elektroforezy żelowej 7 cm x 10 cm- Mini-sub Cell GT z nakładkami żelowymi i grzebieniamiBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Illumina NextSeq 1000/2000 sekwencer Illumina20047256
Jersey-Cote (roztwór na bazie krzemu)LabScientific, Inc 1188
KCl 2 MAmbionAM9640G
MgCl2 1 MAmbionAM9530G
Minifuge Wirówka osobista dwuwirnikowaUSA scientific2641-0016
Model V16 aparatura do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, okulary, grzebienie i przekładkiCiore Nauki przyrodnicze21070010
OligonukleotydyIDTZdefiniowany podczas zamówienia
Mini system do elektroforezy Owl EasyCast B2 - z tackami na żel i grzebieniamiThermofisher ScientificB2
Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick Qiagen28704
Fluorometr kubitowyThermofisher ScientificQ33238
Enzym restrykcyjny PmeI i 10x Cut Smart BufferNEBR0560S
Odwrotna transkryptaza - indeks górny IIIThermoFisher12574026
Woda wolna od RNaz AmbionAM9932
Shaker- Eppendorf ThermomixerEppendorf5385000024
SeaKem LE agaroza Lonza50002
Indeks górny III zestaw do odwrotnej transkrypcji Invitrogen18080-044
SYBR GoldLife Technologies S11494
Polimeraza tytanowa TaqTakara639208
Ligaza RNA T4 1 NEBM0204S
T4 Ligaza RNA 2 obcięta K227Q NEB0351L
TEMEDFisher Naukowy O3446I-100
Themocycler z podgrzewaną pokrywąApplied Biosystem4359659
Tris 1 M pH 7,5 Invitrogen15567027
Tris 1 M pH 8,0AmbionAM9855G
System UltraPure Sequagel koncentrat, rozcieńczalnik i buforNational DiagnosticsEC-833
20 mg / ml Albumina 639208

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat Rev Immunol. 2 (8), 569-579 (2002).
  2. Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  4. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  5. Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. J Clin Invest. 126 (4), 1139-1143 (2016).
  6. Raposo, G., Stahl, P. D. Extracellular vesicles: a new communication paradigm. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (9), 509-510 (2019).
  7. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  8. Berumen Sánchez, G., Bunn, K. E., Pua, H. H., Rafat, M. Extracellular vesicles: mediators of intercellular communication in tissue injury and disease. Cell Commun Signal. 19 (1), 104(2021).
  9. Shami-Shah, A., Travis, B. G., Walt, D. R. Advances in extracellular vesicle isolation methods: a path towards cell-type specific EV isolation. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 4, 447-460 (2023).
  10. Jiang, C., Fu, Y., Liu, G., Shu, B., Davis, J., Tofaris, G. K. Multiplexed profiling of extracellular vesicles for biomarker development. Nanomicro Lett. 14 (1), 3(2021).
  11. O'Brien, K., Breyne, K., Ughetto, S., Laurent, L. C., Breakefield, X. O. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 585-606 (2020).
  12. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandão, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: from biomarkers to mediators of physiology and disease. Cell Metab. 30 (4), 656-673 (2019).
  13. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  14. Ha, M., Kim, V. N. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 509-524 (2014).
  15. O'Brien, J., Hayder, H., Zayed, Y., Peng, C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 9, 402(2018).
  16. Ardekani, A. M., Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J Med Biotechnol. 2 (4), 161-179 (2010).
  17. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am J Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  18. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  19. Dellar, E. R., Hill, C., Melling, G. E., Carter, D. R. F., Baena-Lopez, L. A. Unpacking extracellular vesicles: RNA cargo loading and function. J Extracell Biol. 1 (5), e40(2022).
  20. Lee, Y. J., Shin, K. J., Chae, Y. C. Regulation of cargo selection in exosome biogenesis and its biomedical applications in cancer. Exp Mol Med. 56 (4), 877-889 (2024).
  21. Barman, B., et al. VAP-A and its binding partner CERT drive biogenesis of RNA-containing extracellular vesicles at ER membrane contact sites. Dev Cell. 57 (8), 974-994.e8 (2022).
  22. Oka, Y., Tanaka, K., Kawasaki, Y. A novel sorting signal for RNA packaging into small extracellular vesicles. Sci Rep. 13 (1), 17436(2023).
  23. Wang, X., Tian, L., Lu, J., Ng, I. O. Exosomes and cancer - diagnostic and prognostic biomarkers and therapeutic vehicle. Oncogenesis. 11 (1), 54(2022).
  24. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  25. Chatterjee, M., et al. Circulating extracellular vesicles: an effective biomarker for cancer progression. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (11), 375(2024).
  26. Asleh, K., et al. Extracellular vesicle-based liquid biopsy biomarkers and their application in precision immuno-oncology. Biomark Res. 11 (1), 99(2023).
  27. Wang, J., et al. Systematic assessment of small RNA profiling in human extracellular vesicles. Cancers (Basel). 15 (13), 3446(2023).
  28. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int J Biochem Cell Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  29. Avendaño-Vázquez, S. E., Flores-Jasso, C. F. Stumbling on elusive cargo: how isomiRs challenge microRNA detection and quantification, the case of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1784617(2020).
  30. Goh, T. X., Tan, S. L., Roebuck, M. M., Teo, S. H., Kamarul, T. A systematic review of extracellular vesicle-derived Piwi-interacting RNA in human body fluid and its role in disease progression. Tissue Eng Part C Methods. 28 (10), 511-528 (2022).
  31. Liu, D. S. K., Yang, Q. Z. C., Asim, M., Krell, J., Frampton, A. E. The clinical significance of transfer RNAs present in extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (7), 3692(2022).
  32. Teng, M., Liu, L. Y., Hua, J. T., Chen, S., He, H. H. Orphan noncoding RNAs: novel regulators and cancer biomarkers. Ann Transl Med. 7 (Suppl 1), S21(2021).
  33. von Felden, J., et al. Unannotated small RNA clusters associated with circulating extracellular vesicles detect early stage liver cancer. Gut. , (2021).
  34. Dogra, N., et al. Extracellular vesicles carry transcriptional 'dark matter' revealing tissue-specific information. J Extracell Vesicles. 13 (8), 12481(2024).
  35. Loudig, O., et al. Evaluation and adaptation of a laboratory-based cDNA library preparation protocol for retrospective sequencing of archived microRNAs from up to 35-year-old clinical FFPE specimens. Int J Mol Sci. 18 (3), 627(2017).
  36. Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective microRNA sequencing: complementary DNA library preparation protocol using formalin-fixed paraffin-embedded RNA specimens. J Vis Exp. (135), e57471(2018).
  37. Mitchell, M. I., et al. Extracellular vesicle capture by antibody of choice and enzymatic release (EV-CATCHER): a customizable purification assay designed for small-RNA biomarker identification and evaluation of circulating small-EVs. J Extracell Vesicles. 10 (8), e12110(2021).
  38. Mitchell, M. I., et al. Customizing EV-CATCHER to purify placental extracellular vesicles from maternal plasma to detect placental pathologies. Int J Mol Sci. 25 (10), 5102(2024).
  39. Mitchell, M. I., et al. Non-invasive detection of orthotopic human lung tumors by microRNA expression profiling of mouse exhaled breath condensates and exhaled extracellular vesicles. Extracell Vesicles Circ Nucleic Acids. 5 (1), 138-164 (2024).
  40. Mitchell, M. I., et al. Exhaled breath condensate contains extracellular vesicles (EVs) that carry miRNA cargos of lung tissue origin that can be selectively purified and analyzed. J Extracell Vesicles. 13 (4), e12440(2024).
  41. Farazi, T. A., et al. Bioinformatic analysis of barcoded cDNA libraries for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 171-187 (2012).
  42. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): from basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  43. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  44. Llorens-Revull, M., et al. Comparison of extracellular vesicle isolation methods for miRNA sequencing. Int J Mol Sci. 24 (15), 12183(2023).
  45. Crossland, R. E., et al. MicroRNA profiling of low concentration extracellular vesicle RNA utilizing NanoString nCounter technology. J Extracell Biol. 2 (1), e72(2023).
  46. Miceli, R. T., et al. Extracellular vesicles, RNA sequencing, and bioinformatic analyses: challenges, solutions, and recommendations. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70005(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie mikroRNAprofilowanie miRNA sEVkodowanie kreskowe RNAsekwencjonowanie z podw jnym indeksemRNA o niskiej ilo ci wej ciowejkr ce biomarkerykomunikacja mi dzykom rkowa
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły