Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model napędzanych mechanotransdukcją, podobnych do ludzkich blizn przerostowych

3.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67156

⸱

29 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Arizona, 2Department of Biomedical Engineering, University of Arizona

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wyjaśni, jak ustanowić model myszy z bliznami przerostowymi, który zwiększa sygnalizację mechanotransdukcji, aby symulować blizny podobne do ludzkich. Metoda ta polega na zwiększeniu napięcia mechanicznego w poprzek gojącego się nacięcia u myszy i użyciu specjalistycznego urządzenia do stworzenia powtarzalnej, nadmiernej tkanki bliznowatej do szczegółowych analiz histologicznych i bioinformatycznych.

Streszczenie

Bliznowacenie przerostowe (HTS) to nieprawidłowy proces gojenia się ran, który powoduje nadmierne tworzenie się tkanki bliznowatej. W ciągu ostatniej dekady wykazaliśmy, że mechanotransdukcja - przekształcanie bodźców mechanicznych w odpowiedzi komórkowe - napędza nadmierne gojenie się blizn zwłóknieniowych. Mysi model do oceny blizn przerostowych podobnych do ludzkich byłby niezbędnym narzędziem do badania różnych terapii i ich zdolności do zmniejszania blizn i poprawy gojenia. W szczególności nasze laboratorium opracowało mysi model rany, który zwiększa obciążenie mechaniczne, aby promować HTS podobny do ludzkiego. Protokół ten wykorzystuje biomechaniczne urządzenia ładujące, wykonane ze zmodyfikowanych 13-milimetrowych ekspanderów podniebiennych, których ramiona są umieszczone po obu stronach nacięcia i stopniowo rozpraszane od siebie w celu wywierania ciągłego napięcia na łożysko rany podczas gojenia. W ciągu prawie dwóch dekad użytkowania model ten został znacznie zaawansowany w celu poprawy skuteczności i odtwarzalności. Korzystając z mysiego modelu HTS, można indukować znaczne blizny zwłóknieniowe skóry, aby były histologicznie porównywalne z ludzkimi bliznami przerostowymi. Ten mysi model zapewnia środowisko do opracowywania leków biologicznych zaangażowanych w leczenie HTS i stanów związanych z mechanotransdukcją, takich jak reakcja na ciało obce.

Wprowadzenie

Gojenie się ran, proces, w którym organizm próbuje naprawić uszkodzoną tkankę i odbudować barierę skórną, może prowadzić do nietypowego gojenia, jeśli jego procesy hemostazy, zapalenia, proliferacji i przebudowy są nieregularne1. Bliznowacenie przerostowe (HTS) jest przykładem nieregularnego gojenia się ran, charakteryzującego się nadmiernym odkładaniem się macierzy zewnątrzkomórkowej i tkanki łącznej w miejscu urazu, co skutkuje powstawaniem powiększonego obszaru tkanki bliznowatej1,2,3. Obszary na ciele, które poddawane są powtarzającym się mechanicznym stymulacjom rozciągającym, takie jak okolice stawów lub twarz, są bardziej podatne na rozwój HTS i zwłóknienia4,5,6,7,8,9,10. My i inni wykazaliśmy, że mechaniczne rozciąganie w poprzek łożyska rany sprzyja tworzeniu HTS poprzez aktywację szlaków mechanotransdukcji - konwersji bodźców mechanicznych na odpowiedzi komórkowe9,11.

HTS nie tylko wiąże się ze złożonymi procesami biologicznymi, ale także niesie ze sobą poważne wyzwania społeczne, medyczne i ekonomiczne dla osób dotkniętych tym problemem. Osoby dotknięte chorobą mogą zmagać się z poczuciem własnej wartości i depresją, zwłaszcza gdy blizny znajdują się w widocznych obszarach, takich jak twarz i dłonie1,9,10,12. Artykuły naukowe wskazują, że częstość występowania HTS waha się od 32% do 72% w Stanach Zjednoczonych10,13. Dotkliwość tych problemów estetycznych, zwłaszcza w przypadku poważnych oparzeń w okolicy twarzy, jest podkreślona przez rosnącą liczbę przypadków pełnego przeszczepu twarzy w celu poprawy wyglądu10. Blizny te mogą również powodować upośledzenie funkcjonalne poprzez ograniczanie ruchu6,14, a interwencja chirurgiczna jest często wymagana w celu usunięcia blizn i przywrócenia mobilności10. Koszt leczenia HTS może być znaczny, w tym wydatki na operację, zabiegi, fizjoterapię, a nawet opiekę długoterminową1,10. W samych Stanach Zjednoczonych roczny koszt leczenia HTS przekracza 4 miliardy dolarów10.

Biorąc pod uwagę powszechność HTS i ekstremalne środki podjęte w celu rozwiązania jego powikłań, konwencjonalne terapie (np. chirurgiczne wycięcie, zastrzyki z kortykosteroidów i terapia laserowa) pozostają wysoce zmienne1,2,15,16,17. Chociaż zabiegi te mogą przynieść ulgę w niektórych przypadkach, mogą być niewystarczające ze względu na złożony charakter patologii blizn. Czynniki takie jak różnice genetyczne między osobami i niepełne zrozumienie mechanizmów napędzających HTS powodują, że strategie terapeutyczne pozostają klinicznie niezadowalające18,19,20. Przyszłość terapii HTS wydaje się leżeć w nowych innowacyjnych podejściach, które są ukierunkowane na mechanistyczne czynniki HTS w komórkach, takie jak mechanotransdukcja11,21, które, jak obszernie wykazaliśmy, napędzają nadmierne gojenie się blizn zwłóknieniowych5,6,7,8,11,21,22,23,24,25. W szczególności wcześniej opracowaliśmy model mysim, który zwiększa obciążenie mechaniczne rany, aby promować podobny do ludzkiego HTS9. Jednak po prawie dwóch dekadach użytkowania model został znacznie zaawansowany w celu poprawy skuteczności i odtwarzalności. Protokół ten pozwoli naukowcom jak najlepiej wykorzystać zaktualizowany i zoptymalizowany model myszy HTS do zbadania populacji komórek i czynników odpowiedzialnych za nadmierne bliznowacenie. Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie naukowcom protokołu zaprojektowanego do wytwarzania podobnych do ludzkich blizn przerostowych u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uzyskano zgodę od University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dla wszystkich eksperymentów (numer kontrolny: 2021-0828). Ten protokół wykorzystuje 15-tygodniowe samce myszy C57BL/6J, chociaż może być stosowany do innych grup wiekowych i szczepów9,26.

1. Tworzenie biomechanicznego urządzenia ładującego HTS

UWAGA: Modyfikacja ekspanderów podniebiennych do urządzenia HTS może nastąpić w dowolnym momencie przed eksperymentem.

  1. Weź niezmodyfikowany ekspander podniebienny i przedstaw mu rdzeń makerspace lub rdzeń produkcyjny ze specyfikacjami zgodnie z Rysunek 1A, B.
    UWAGA: Jeśli nie jest dostępna żadna przestrzeń twórcza lub rdzeń produkcyjny, przejdź do następujących kroków.
  2. Użyj narzędzia do gięcia drutu Mini Universal Bender (MUB), aby zmienić ekspander podniebienny, aby był zgodny ze specyfikacjami Rysunek 1A,B.
  3. Umieść urządzenie płasko na powierzchni, jak pokazano na Rysunek 1A1.
  4. Zegnij ramiona pod kątem 90° w górę dla górnych ramion i 90° w dół dla dolnych ramion, gdy urządzenie leży płasko z MUB, jak pokazano na Rysunek 1A2. Zobacz Rysunek 1A3, aby zobaczyć wygląd urządzenia, gdy spoczywa płasko na powierzchni, gdzie ramiona są teraz idealnie równoległe do korpusu urządzenia.
  5. Zegnij każde ramię z powrotem na stronie pod kątem 90° wzdłuż osi przerywanej linii, jak pokazano na Rysunek 1A4. Zobacz Rysunek 1A5 dla urządzenia po zgięciu.

2. Depilacja i pierwsze nacięcie w dniu pooperacyjnym 0 (POD 0)

UWAGA: Oczyść i autoklawuj kilka zestawów narzędzi chirurgicznych przed operacją (np. nożyczki do preparacji, skalpel, kleszcze Adson, sterownik do igieł). Przygotuj wysterylizowane szwy 5-0 do użycia i miej pod ręką marker chirurgiczny.

  1. Oczyść przestrzeń roboczą za pomocą sprayu 70% etanolu.
  2. Umieść poduszkę grzewczą ustawioną w temperaturze 35 °C na stole do przygotowania przedoperacyjnego. Przyklej chłonną wkładkę do poduszki grzewczej. Umieść kolejny chłonny wkład na poprzednim podkładzie (aby zebrać ogolone włosy). Przyklej stożek (lub stożki) anestezjologiczne do wkładu chłonnego.
    UWAGA: [Opcjonalnie] Jeśli dostępny jest stołowy odciąg oparów, umieść stożek w pobliżu miejsca pracy i włącz ssanie.
  3. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia z 1-3% izofluranem i przepływem tlenu 2 l/min, aż myszy zaczną spokojnie oddychać (2-3 min).
  4. Włóż nos każdej myszy do otworu stożka nosowego, co pozwala na inhalację środka znieczulającego składającego się z 1-3% izofluranu z 2 l/min tlenu. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż okulistyczną maść nawilżającą na oczy myszy.
  5. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić włosy na grzbiecie w obszarze, jak pokazano na Rysunek 1C.
  6. Nałóż pastę do depilacji palcem w rękawiczce lub wacikiem na skórę, zakrywając ogolony obszar. Po 45 s zetrzyj pastę gazą, a następnie wacikiem nasączonym alkoholem. Przetrzyj grzbiet innym wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć pastę do depilacji, pozostawiając bezwłosą plamę (Rysunek 1C).
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby użyć umiarkowanej ilości pasty, natychmiast usunąć pastę i wytrzeć mysz po usunięciu pasty, aby zapobiec poparzeniom skóry przez pastę do depilacji. Mysia skóra jest cienka, co czyni ją podatną na szybkie oparzenia chemiczne, które mogą mieć szkodliwy wpływ zarówno na zdrowie myszy, jak i na jakość eksperymentów.
  7. Załóż kolczyk na ucho myszy w celu identyfikacji.
  8. Po usunięciu włosów umieść mysz z powrotem w klatce, aby zapobiec nadmiernemu narażeniu na izofluran. Monitoruj mysz.
  9. Zdejmij górną wkładkę chłonną pokrytą włosami, aby uzyskać czystą przedoperacyjną powierzchnię roboczą.
  10. Stwórz oddzielny obszar roboczy chirurgiczny. Umieść na stole operacyjnym poduszkę grzewczą ustawioną w temperaturze 35 °C. Przyklej chłonną wkładkę do poduszki grzewczej. Przyklej stożek (lub stożki) anestezjologiczne do wkładu chłonnego.
  11. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia z 2-4% izofluranem i przepływem tlenu 2 l/min, aż mysz zacznie spokojnie oddychać (2-3 min).
  12. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją na powierzchni roboczej. Włóż nos każdej myszy do otworu stożka nosowego, co pozwala na inhalację środka znieczulającego składającego się z 1-3% izofluranu z 2 l/min tlenu. Potwierdź odpowiednie znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Nałóż okulistyczną maść nawilżającą na oczy myszy.
  13. Wstrzyknąć podskórnie w ramię 0,05 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu za pomocą igły 21 G w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
  14. Zdezynfekuj grzbiet myszy za pomocą trzech naprzemiennych rund peelingu na bazie jodu/chlorheksydyny i wacika nasączonego alkoholem. Za pomocą pisaka chirurgicznego i linijki zaznacz 2-centymetrową linię na grzbietowej linii środkowej, w której zostanie wykonane nacięcie na całej grubości, jak pokazano na Rysunek 1D.
  15. Użyj skalpela lub nożyczek preparacyjnych (preferencje chirurgiczne), aby wykonać nacięcie grzbietowej linii środkowej na całej grubości przez zaznaczony obszar.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć leżącej pod spodem tkanki (np. mięśni), jak widać na Rysunek 1D.
  16. Używając szwów 5-0 w prostym, przerywanym wzorze, zamknij nacięcie, przecinając ranę na pół, jak pokazano na Rysunek 1D. Użyj co najmniej 5 równomiernie rozmieszczonych szwów.
  17. Pokrój gazę Telfa na kawałek o wymiarach 3 cm x 1 cm. Umieść go w środku opatrunku z kleju piankowego i umieść opatrunek samoprzylepny na grzbiecie myszy tak, aby gaza zakrywała nacięcie, jak pokazano na Rysunek 1D. Umieść przepołowiony opatrunek na brzuchu i zawiń obwodowo, aż zetknie się z opatrunkiem grzbietowym.
  18. Po zakończeniu opatrunku umieść mysz w oddzielnej sterylnej klatce i monitoruj ją, aż w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu.
  19. Powtórz procedurę ze wszystkimi myszami, niezależnie od grupy eksperymentalnej. Pozwól nacięciu zagoić się w ciągu następnych 4 dni przed następnym krokiem.

3. Umieszczenie biomechanicznego urządzenia ładującego HTS (POD 4)

UWAGA: Oczyść i autoklawuj urządzenia HTS oraz kilka zestawów narzędzi chirurgicznych przed operacją (np. nożyczki do preparacji, skalpel, kleszcze Adsona, sterownik igieł, zszywacz do skóry, zszywki do skóry). Przygotuj wysterylizowane szwy 5-0 do użycia. [Opcjonalnie] Jeśli dostępny jest laboratoryjny pochłaniacz oparów, umieść stożek w pobliżu miejsca pracy i włącz ssanie.

  1. Przygotować obszar operacji zgodnie z opisem w krokach 2.1 i 2.2.
  2. Znieczulij mysz i zapewnij środek przeciwbólowy, wykonując czynności 2.11-2.13.
  3. Użyj kleszczyków lub wkrętaka do igieł, aby oddzielić opatrunek od brzucha myszy, przesuwając narzędzie na boki po stronie brzusznej. Pozostawiając narzędzie między okładem a skórą, aby podnieść opatrunek ze skóry, użyj nożyczek, aby odciąć opatrunek.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przeciąć skóry myszy, nie zerwać opatrunku ani nie naruszyć gojącego się nacięcia.
  4. Oczyść grzbiet wacikiem nasączonym alkoholem. Zbadaj nacięcie pod kątem rozejścia się rany lub oznak infekcji.
  5. Upewnij się, że urządzenie HTS nie jest wysunięte/rozszerzone i jest w swojej najbardziej zredukowanej formie, jak pokazano na Rysunek 1B. Lekko pokryj ramiona urządzenia klejem medycznym.
  6. Jedną ręką spraw, aby skóra na grzbiecie myszy była lekko napięta w kierunku poprzecznym. Drugą ręką umieść urządzenie HTS na grzbiecie myszy tak, aby nacięcie znajdowało się w równej odległości od każdego ramienia urządzenia HTS, centrując w ten sposób urządzenie nad nacięciem. Upewnij się, że skóra między ramionami urządzenia HTS jest równomiernie napięta. Przytrzymaj urządzenie w miejscu, aż klej wyschnie (~30 s), jak widać na Rysunek 2A.
    UWAGA: Utrzymanie równomiernego napięcia skóry jest ważne, aby zapewnić równe napięcie nacięcia za pomocą urządzenia. Podczas tego procesu pozostaw szwy nienaruszone, ponieważ proces umieszczania urządzenia zwiększa napięcie mechaniczne skóry, które może ponownie otworzyć gojące się nacięcie. Szwy pozostają na miejscu do pierwszego dnia rozciągania, aby zapewnić, że rana pozostanie zamknięta.
  7. Zabezpiecz cztery szwy wokół każdego ramienia i przez skórę, jak pokazano na Rysunek 2B. Podczas szycia upewnij się, że igła wychodzi ze skóry w kierunku nacięcia.
    UWAGA: Wkłucie igły od strony nacięcia urządzenia może czasami rozerwać nacięcie z powodu siły niezbędnej do przebicia skóry.
  8. Teraz umieść trzy zszywki skóry wokół ramion i przez skórę, mocując urządzenie HTS do skóry, jak pokazano na Rysunek 2B.
  9. Zabandażuj mysz, wykonując kroki 2.17 i 2.18.
  10. Powtórz procedurę ze wszystkimi myszami, niezależnie od grupy eksperymentalnej.
    UWAGA: Wszystkie myszy otrzymują ten sam preparat; Są one jednak losowo przydzielane do każdej grupy eksperymentalnej (np. kontrola, rozciąganie), aby zapewnić bezstronny rozkład myszy w projekcie eksperymentalnym. W szczególności zarówno myszy kontrolne, jak i rozciągające będą miały urządzenie przymocowane do grzbietu. Urządzenia myszy kontrolnych pozostaną nietknięte, podczas gdy myszy rozciągające przejdą kolejne kroki.

4. Początkowy rozciąg biomechanicznego urządzenia ładującego HTS (POD 5)

UWAGA: Oczyść i autoklaw kilka zestawów narzędzi chirurgicznych (np. nożyczki do preparacji, skalpel, kleszcze Adsona, wkrętak do igieł) przed operacją. [Opcjonalnie] Jeśli dostępny jest stołowy odciąg oparów, umieść stożek w pobliżu miejsca pracy i włącz ssanie.

  1. Losowo przypisz każdą mysz za pomocą kolczyka do żądanej grupy. W przypadku myszy kontrolnych wystarczy usunąć szwy z nacięcia i zmienić opatrunki ran (kroki 1-6, a następnie 8-9). W razie potrzeby zdejmij urządzenie w czasie rozciągania i zrób zdjęcie za pomocą narzędzia pomiarowego, aby uzyskać skalę do śledzenia rozmiaru blizny.
  2. Przygotuj obszar operacyjny, znieczul mysz i zdejmij opatrunek, wykonując czynności 3.1-3.4.
    UWAGA: Uważaj, aby nie oderwać opatrunku ani nie naruszyć gojącego się nacięcia. Jeśli ramię urządzenia HTS oderwało się od skóry, delikatnie przyklej je z powrotem na miejsce i dodaj zszywkę lub szew do skóry, w zależności od rozmiaru odklejenia.
  3. Usuń szwy z rany za pomocą nożyczek preparacyjnych lub innej wybranej metody.
  4. Włóż klucz urządzenia HTS do urządzenia i obróć, aby rozszerzyć urządzenie, aż skóra będzie napięta, ale nie istnieje ryzyko rozerwania skóry, jak pokazano na Rysunek 2C.
    UWAGA: To początkowe rozproszenie uwagi może zająć około 4-8 pełnych obrotów, ponieważ skóra może być luźna między ramionami urządzenia.
  5. Zabandażuj mysz, wykonując kroki 2.17 i 2.18.

5. Kolejne rozciągnięcie biomechanicznego urządzenia ładującego HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

UWAGA: Oczyść i autoklaw kilka zestawów narzędzi chirurgicznych (np. nożyczki do preparacji, skalpel, kleszcze Adsona, wkrętak do igieł) przed operacją. [Opcjonalnie] Jeśli dostępny jest laboratoryjny odciąg oparów, umieść stożek w pobliżu miejsca pracy i włącz ssanie.

  1. W przypadku myszy kontrolnych po prostu zmień opatrunki ran (kroki 1-5, a następnie kroki 13-14). W razie potrzeby zdejmij urządzenie w czasie rozciągania i zrób zdjęcie blizny za pomocą narzędzia pomiarowego, aby uzyskać skalę do śledzenia rozmiaru blizny.
  2. Przygotować obszar operacyjny, znieczulić mysz i zdjąć opatrunek, wykonując czynności 3.1-3.4.
    UWAGA: Jeśli ramię urządzenia HTS oderwało się od skóry, przyklej je na miejscu i dodaj zszywkę lub szew do skóry w zależności od rozmiaru odklejenia.
  3. Włóż klucz urządzenia HTS do urządzenia i obróć, aby rozszerzyć urządzenie, aż skóra będzie napięta, ale nie istnieje ryzyko rozerwania skóry.
    UWAGA: Może to zająć około 4 obrotów lub ~2 mm całkowitego rozproszenia. Jeśli urządzenie osiągnęło maksymalne wysunięcie i nie można go dalej wysunąć, wykonaj kroki 5.4-5.7, aby zdjąć i ponownie podłączyć nowe urządzenie. W przeciwnym razie zabandażuj mysz, wykonując kroki 2.17 i 2.18.
  4. Jeśli urządzenie osiągnęło maksymalne rozciągnięcie, wyjmij je z grzbietu myszy, usuwając zszywki za pomocą ściągacza do zszywek lub nożyczek, podważając zęby zszywek. Następnie zdejmij szwy i ostrożnie wyjmij urządzenie.
  5. Wyczyść urządzenie skalpelem, wacikami nasączonymi alkoholem i ręcznikami papierowymi. Namocz urządzenie w 70% etanolu na ~20 minut, aby ułatwić czyszczenie. Następnie użyj klucza, aby skurczyć urządzenie do najcieńszej formy.
  6. Podłącz ponownie urządzenie HTS, wykonując czynności 3.5-3.8.
  7. Zabandażuj mysz, wykonując kroki 2.17 i 2.18.

6. Pobieranie tkanki HTS (POD 19)

UWAGA: Pobieranie tkanek może odbywać się w dowolnym momencie procesu. Pobraliśmy tkankę już po 4 dniach rozciągania, aby zbadać wczesne punkty czasowe; jednak tkanka jest najbardziej konsekwentnie pobierana w POD 19 (2 tygodnie po rozpoczęciu szczepu). Przed zabiegiem należy oczyścić i autoklawować kilka zestawów narzędzi chirurgicznych (np. nożyczki do preparacji, skalpel, kleszcze Adsona). Aby uzyskać zdjęcia blizny w czasie, urządzenie można zdjąć przed każdym krokiem rozciągania, aby zrobić zdjęcie blizny przed ponownym nałożeniem urządzenia i ponownym zainicjowaniem obciążenia mechanicznego. [Opcjonalnie] Jeśli dostępny jest stołowy odciąg oparów, umieść stożek w pobliżu miejsca pracy i włącz ssanie. Stołowy pochłaniacz oparów może zostać wyłączony, gdy izofluran nie jest już używany.

  1. Przygotować obszar operacyjny, znieczulić mysz i zdjąć opatrunek, wykonując czynności 3.1-3.4.
  2. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
    UWAGA: Uważaj, aby nie ciągnąć skóry i nie rozerwać grzbietu myszy.
  3. Użyj nożyczek preparacyjnych lub środka do usuwania zszywek do skóry, aby usunąć zszywki skóry. Odetnij szwy. Delikatnie wyjmij urządzenie HTS, uważając, aby nie rozerwać skóry.
  4. Za pomocą skalpela lub nożyczek przetnij skórę otaczającą bliznę HTS. Zachowaj skórę do analizy histologicznej w pożądany sposób.
    UWAGA: Jeśli skóra ma być używana do analizy transkryptomicznej lub białkowej (np. qPCR, western blot, analiza jednokomórkowa), należy wyciąć tylko tkankę bliznowatą HTS, aby zminimalizować ilość otaczającej zdrowej tkanki. Zapewni to, że analiza uchwyci tylko tkankę bliznowatą.
  5. Zeskrob urządzenia HTS do czysta skalpelem. Umieść urządzenia w zlewce z 70% etanolem, aby zmiękczyć pozostały klej lub chusteczkę.
    UWAGA: Po namoczeniu w 70% etanolu urządzenia mogą wymagać dalszego wycierania, skrobania i czyszczenia przed autoklawowaniem.

7. Pomiar średniej szerokości blizny

UWAGA: Zostało to osiągnięte za pomocą oprogramowania do analizy obrazów ImageJ, a informacje zostały zapisane w arkuszu kalkulacyjnym.

  1. Otwórz obrazy w ImageJ. Obrysuj krawędzie blizny za pomocą narzędzia wielokąta. Kliknij przycisk analizuj | zmierz, aby zmierzyć ten obszar.
    UWAGA: Bliznę można rozpoznać po przebarwieniach i braku mieszków włosowych.
  2. Zmierz długość blizny od końca do końca za pomocą narzędzia do segmentowania. Kliknij przycisk Analizuj | Zmierz, aby zmierzyć tę długość.
  3. Zmierz długość 1 cm lub dowolną inną znormalizowaną jednostkę długości na rysunku za pomocą narzędzia do segmentowania. Kliknij przycisk Analizuj | Zmierz, aby zmierzyć tę długość.
  4. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, weź obszar blizny (w pikselach; px) i podziel go przez długość blizny (długość px). Ten wynik daje średnią szerokość blizny w pikselach.
  5. Podziel ten wynik przez zmierzoną standardową jednostkę długości (długość w pikselach). Wynikiem będzie średnia szerokość blizny w jednostce standardowej jednostki długości (np. cm) użytej w eksperymencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby wyraźnie zademonstrować skuteczne zastosowanie protokołu HTS i zidentyfikować pomyślne wyniki „pozytywne”, model ustanowiono zgodnie z Rysunkiem 3A. W reprezentatywnym badaniu wyróżniono dwie grupy: grupę kontrolną bez rozciągania (n = 6) oraz grupę HTS z rozciąganiem mechanicznym (n = 6), w której wywołano poziom odkształcenia mechanicznego odpowiadający warunkom ludzkim w obrębie nacięcia w celu wygenerowania HTS, co przedstawiono na Rysunku 3B,C

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mysi model HTS jest opłacalną i wysoce powtarzalną metodą indukcji HTS poprzez mechanotransdukcję i opracowywanie potencjalnych terapii. Chociaż istnieje początkowa krzywa uczenia się, aby skutecznie korzystać z modelu, protokół może, przy odrobinie praktyki, być wykonywany przez każdego badacza bez przeszkolenia chirurgicznego. Wykorzystanie tego modelu pozwala naukowcom lepiej zrozumieć powstawanie HTS i rolę mechanotransdukcji w gojeniu się ran, co może prowadzić do wymiernej poprawy leczenia ran u pacjentów. Demonstr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów ani innych konfliktów związanych z treścią tego artykułu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Centrum Stomatologicznej, Oralnej i Twarzoczaszkowej Regeneracji Tkanek i Narządów Interdyscyplinarne Nagrody za Projekty Translacyjne wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (U24 DE026914) (G.C.G) oraz Plastic Surgery Foundation Translational Research Grant (837107) (K.C.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 ml zlewka PYREX GriffinMilipore SignmaCLS1000100
Aesculap Exacta mini trymerAesculap
AutoClip SystemPrecyzyjne narzędzia chirurgiczne12020-00
Waciki na bazie alkoholu izopropylowego marki BDFisher Scientific13-680-63
Buprenorfina SR (0,5 mg / ml)Buprenex, Indivior Inc.12496-0757-1
C57/BL6 suki (6– 8 tygodni)The Jackson Laboratory000664
Sterylna gaza CovidienFisher Scientific2187
Covidien TelfaTM nieprzywierające podpaskiFisher Scientific, Covidien1961
Linijka do chirurgii stomatologicznejDoWell Dental ProductsS1070
Krem do depilacji (balsam do usuwania włosów Nair)Church& Dwight, CVS339823
Etanol 70% roztwórFisher Scientific64-17-5
ExcelOprogramowanie do współpracy Microsoft.com firmy Microsoft 
ImageJImageJ, Wayne Rasbandimagej.netoprogramowanie 
System znieczulenia wziewnegoVetEquip922130
Nożyczki do przysłony 4½ in. nierdzewnyMcKesson43-2-104
Isoflurane, USPDechra Veterinary Products17033-094-25
Kaka industrial MUB-1Kaka Industrial 173207Konieczne tylko wtedy, gdy nie ma dostępnej przestrzeni produkcyjnej lub warsztatu produkcyjnego 
Leone Rapid Podniebienny ekspander - 13 mmGreat Lakes Dental Technologies125-004Klucz niezbędny do rozbudowy i kotnract urządzenia będzie dostarczany z tym produktem w pudełku
Serweta odporna na płyny 75 x 90 cm z otworem samoprzylepnym 6 x 9 cmOmnia S.p.A.12.T4362
Medequip Depot Jedwabny pleciony Sutr 6-0 RxMedequip Depot D707N, Fisher ScientificNCO835822
Uchwyt igły 5 cali z ząbkowanymi szczękamiMcKesson43-2-842
Prism 9GraphPad Holdings, LLCgraphpad.comoprogramowanie 
Maść okulistyczna PuralubeDechra, NDC17033-211-38
R studio DesktopRStudio PBCrstudio.comoprogramowanie 
Chirurgiczny marker do skóryMcKesson19-1451_BX
Tegaderm, 3 MVWR56222-191opatrunek piankowy samoprzylepny 
Poduszka grzewcza Thermo-peepK& H, Amazonka
Kleszczyki do tkanek 4¾ in. nierdzewne 1 x 2 zębyMckesson43-2-775
Vetbond (3 M)Saint Paul, MN1469SB

Bibliografia

  1. Mony, M. P., Harmon, K. A., Hess, R., Dorafshar, A. H., Shafikhani, S. H. An updated review of hypertrophic scarring. Cells. 12 (5), 678(2023).
  2. Limandjaja, G. C., Niessen, F. B., Scheper, R. J., Gibbs, S. Hypertrophic scars and keloids: Overview of the evidence and practical guide for differentiating between these abnormal scars. Exp Dermatol. 30 (1), 146-161 (2021).
  3. Cao, X., Sun, L., Luo, Z., Lin, X., Zhao, Y. Aquaculture derived hybrid skin patches for wound healing. Engineered Regeneration. 4 (1), 28-35 (2023).
  4. Ishise, H., et al. Hypertrophic scar contracture is mediated by the trpc3 mechanical force transducer via nfkb activation. Sci Rep. 5 (1), 11620(2015).
  5. Padmanabhan, J., et al. Allometrically scaling tissue forces drive pathological foreign-body responses to implants via rac2-activated myeloid cells. Nat Biomed Eng. 7 (11), 1419-1436 (2023).
  6. Kussie, H. C., et al. Avenanthramide and β-glucan therapeutics accelerate wound healing via distinct and nonoverlapping mechanisms. Adv Wound Care (New Rochelle). 13 (4), 155-166 (2024).
  7. Chen, K., et al. Disrupting biological sensors of force promotes tissue regeneration in large organisms. Nat Commun. 12 (1), 5256(2021).
  8. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (5), 986-991 (2018).
  9. Aarabi, S., et al. Mechanical load initiates hypertrophic scar formation through decreased cellular apoptosis. FASEB J. 21 (12), 3250-3261 (2007).
  10. Aarabi, S., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Hypertrophic scar formation following burns and trauma: New approaches to treatment. PLoS Med. 4 (9), e234(2007).
  11. He, J., et al. Mechanical stretch promotes hypertrophic scar formation through mechanically activated cation channel piezo1. Cell Death Dis. 12 (3), 226(2021).
  12. Weng, W., et al. Ellipsoidal porous patch with anisotropic cell inducing ability for inhibiting skin scar formation. Engineered Regeneration. 3 (3), 262-269 (2022).
  13. Lawrence, J. W., Mason, S. T., Schomer, K., Klein, M. B. Epidemiology and impact of scarring after burn injury: A systematic review of the literature. J Burn Care Res. 33 (1), 136-146 (2012).
  14. Ziolkowski, N., et al. Psychosocial and quality of life impact of scars in the surgical, traumatic and burn populations: A scoping review protocol. BMJ Open. 9 (6), e021289(2019).
  15. Gauglitz, G. G., Korting, H. C., Pavicic, T., Ruzicka, T., Jeschke, M. G. Hypertrophic scarring and keloids: Pathomechanisms and current and emerging treatment strategies. Mol Med. 17 (1-2), 113-125 (2011).
  16. Fu, X., et al. Oxygen atom-concentrating short fibrous sponge regulates cellular respiration for wound healing. Advanced Fiber Materials. 5 (5), (2023).
  17. Fu, X., et al. Living electrospun short fibrous sponge via engineered nanofat for wound healing. Advanced Fiber Materials. , (2022).
  18. Fomovsky, G. M., Holmes, J. W. Evolution of scar structure, mechanics, and ventricular function after myocardial infarction in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (1), H221-H228 (2010).
  19. Macintyre, L., Baird, M. Pressure garments for use in the treatment of hypertrophic scars--a review of the problems associated with their use. Burns. 32 (1), 10-15 (2006).
  20. Brissett, A. E., Sherris, D. A. Scar contractures, hypertrophic scars, and keloids. Facial Plast Surg. 17 (4), 263-272 (2001).
  21. Chen, K., et al. Disrupting mechanotransduction decreases fibrosis and contracture in split-thickness skin grafting. Sci Transl Med. 14 (645), eabj9152(2022).
  22. Ogawa, R., et al. Clinical applications of basic research that shows reducing skin tension could prevent and treat abnormal scarring: The importance of fascial/subcutaneous tensile reduction sutures and flap surgery for keloid and hypertrophic scar reconstruction. J Nippon Med Sch. 78 (2), 68-76 (2011).
  23. Chen, K., Henn, D., Gurtner, G. C. Holy grail of tissue regeneration: Size. Bioessays. 44 (9), e2200047(2022).
  24. Sivaraj, D., et al. Nitric oxide-releasing gel accelerates healing in a diabetic murine splinted excisional wound model. Front Med (Lausanne). 10, 1060758(2023).
  25. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodelling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).
  26. Mascharak, S., et al. Preventing engrailed-1 activation in fibroblasts yields wound regeneration without scarring. Science. 372 (6540), eaba2374(2021).
  27. Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio Protoc. 13 (3), e4606(2023).
  28. Wang, P. H., Huang, B. S., Horng, H. C., Yeh, C. C., Chen, Y. J. Wound healing. J Chin Med Assoc. 81 (2), 94-101 (2018).
  29. Azmat, C. E. Martha Council. Wound closure techniques. Statpearls. , StatPearls Publishing LLC. Treasure Island (FL). (2024).
  30. Tunca, M., et al. Cryosurgery to remove perichondrium for the rabbit ear hypertrophic scar model: A simplified method. Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat. 28 (2), 57-59 (2019).
  31. Sun, Q., et al. The effects of timing of postoperative radiotherapy on hypertrophic scar in a rabbit model. Med Sci Monit. 26, e921263(2020).
  32. Zu, W., Jiang, B., Liu, H. Establishment of a long-term hypertrophic scar model by injection of anhydrous alcohol: A rabbit model. Int J Exp Pathol. 102 (2), 105-112 (2021).
  33. Molina, E. A., et al. Angiogenic gene characterization and vessel permeability of dermal microvascular endothelial cells isolated from burn hypertrophic scar. Sci Rep. 12 (1), 12222(2022).
  34. Li, Z., et al. A highly simulated scar model developed by grafting human thin split-thickness skin on back of nude mouse: The remodeling process, histological characteristics of scars. Biochem Biophys Res Commun. 526 (3), 744-750 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Gojenie ranodkształcenie mechaniczneblizna włóknistaobciążenie biomechaniczneregeneracja tkanekreakcja na ciało obceredukcja blizn
Mysi model napędzanych mechanotransdukcją, podobnych do ludzkich blizn przerostowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.