Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek uszkodzeń siatkówki szczura wywołanych N-metylo-N-nitrozomocznikiem i wielowskaźnikowa ocena zmian patologicznych

571 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67159

⸱

13 września 2024

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę pobierania próbek siatkówki szczura i wykorzystania barwienia hematoksyliny-eozyny, testu TUNEL i Western blot do wykrywania zmian patologicznych i apoptozy w siatkówce po dootrzewnowym wstrzyknięciu N-Metylo-N-Nitrozomocznika.

Streszczenie

Retinopatię można zaobserwować w większości chorób oczu i późnych powikłań cukrzycy. Specyficzne komórki nabłonka barwnikowego oraz uszkodzenia i zwyrodnienia komórek nerwu wzrokowego to główne cechy retinopatii. Wiele tradycyjnych leków wykazało znaczną skuteczność kliniczną w leczeniu retinopatii. Jak szybko i całkowicie uzyskać siatkówkę, jest kluczowym krokiem w badaniach medycyny tradycyjnej nad leczeniem retinopatii. W tym badaniu mamy na celu zapewnienie ustandaryzowanej i wykonalnej procedury pobierania próbek uszkodzenia siatkówki szczura wywołanego N-metylo-N-nitromocznikiem (MNU) oraz wielowskaźnikowej oceny zmian patologicznych. Szczurom wstrzyknięto dootrzewnowo 60 mg/kg MNU jednorazowo w celu wywołania uszkodzenia siatkówki, a próbki siatkówki uzyskano po 7 dniach. Dodatkowo wykonano barwienie hematoksyliną-eozyną w celu oceny zmian patologicznych siatkówki. Określenie szybkości apoptozy i białka apoptozy za pomocą TUNEL i Western blot. Te ustandaryzowane protokoły pobierania próbek siatkówki i oceny zmian patologicznych są pomocne w promowaniu badania mechanizmu retinopatii oraz odkrywaniu nowych i skutecznych tradycyjnych ziół.

Wprowadzenie

Barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest dziedziczną i powodującą ślepotą chorobą siatkówki1. Częstość występowania RP wynosi od 1/3500 do 1/5000, wpływając na funkcje wzrokowe około 2,5 miliona ludzi na świecie. Jest to jedna z najbardziej znanych chorób prowadzących do upośledzenia wzroku u ludzi, stanowiąca znaczne obciążenie dla całego społeczeństwa2. Choroba charakteryzuje się stopniową utratą funkcji komórek nabłonka barwnikowego siatkówki i postępującą apoptozą fotoreceptorów. We wczesnym stadium pacjenci doświadczają ślepoty nocnej, która objawia się ubytkami w obwodowym polu widzenia i ostatecznie prowadzi do utraty widzenia centralnego3. Dlatego hamowanie apoptozy fotoreceptorów siatkówki jest kluczem do zapobiegania i leczenia RP.

Apoptoza komórek siatkówki jest powszechną cechą ludzkich RP i zwierząt modelowych4. Dootrzewnowe wstrzyknięcie 60 mg / kg N-metylo-N-Nitrozomocznika (MNU) u szczurów przez 7 dni może wywołać apoptozę i utratę komórek fotoreceptorów siatkówki i jest to powszechnie stosowany model zwierzęcy RP5,6. Analiza zmian w strukturze patologicznej, specyficznej apoptozie komórek i związanej z apoptozą ekspresji białek w tkance siatkówki u zwierząt modelowych może dostarczyć skutecznych danych eksperymentalnych i teoretycznego wsparcia w badaniu patogenezy ludzkiego RP i badaniach przesiewowych leków7,8. Dlatego jakość próbek siatkówki decyduje o wiarygodności danych doświadczalnych. Jednak ze względu na specyfikę tkanki oka, istnieje bardzo niewiele doniesień na temat tego, jak uzyskać siatkówkę szczura9.

Ten artykuł przedstawia prostą, szybką, ustandaryzowaną i operatywną procedurę pobierania próbek siatkówki u szczurów w celu przezwyciężenia powyższych niedociągnięć. Barwienie hematoksyliną-eozyną (HE), barwienie końcowym deoksynukleotydylotransferazą za pośrednictwem deoksyurydyny, trifosforanu i digoksygeniny znakowania końca (TUNEL) oraz Western blot są wykorzystywane do analizy patologicznych zmian w uszkodzeniu tkanki siatkówki i apoptozie u szczurów. Wszystkie metody wywodzą się z doświadczeń naszej grupy badawczej w zakresie konkretnych procesów operacyjnych.

Protokół

Wszystkie protokoły i procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Uniwersytetu Medycznego Ningxia (numer etyki: NR 2020-Q066). Samce szczurów SPF Sprauge-Dawley (SD) w wieku 7-8 tygodni i o wadze 200-220 g zostały zakupione z Uniwersytetu Medycznego Ningxia z numerem licencji dla zwierząt SCXK (Ning) 2020-0001. Wszystkie zwierzęta były hodowane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Ningxia. Temperatura i wilgotność były odpowiednie, cykl światła dnia i nocy był utrzymany, a jedzenie i woda były wolne i wystarczające.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Przygotuj płytki dla szczurów, urządzenia do znieczulenia wziewnego, wbudowane pudełka, zamrożone probówki do przechowywania, jednorazowe rękawiczki i maski chirurgiczne, butelki z szerokim otworem, 4% paraformaldehydu, okłady z lodu, nożyczki okulistyczne, pęsety okulistyczne, ostrza chirurgiczne i rękojeści noży, probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i wysterylizuj je wcześniej (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotowanie zwierząt
    1. Losowo podziel 20 samców szczurów SD na grupę modelową (n = 10) i grupę kontrolną (n = 10). Modelowym szczurom wstrzyknąć dootrzewnowo 60 mg/kg MNU i szczurom kontrolnym wstrzyknąć dootrzewnowo tę samą objętość soli fizjologicznej.
    2. Po 7 dniach od wstrzyknięcia należy pościć szczury i pozwolić im swobodnie pić w noc poprzedzającą pobranie próbki.
    3. Następnego dnia połóż szczura na wznak na stole operacyjnym i użyj maski do podania znieczulenia przy użyciu 4% izofluranu i 2 l/min tlenu. Zmierz głębokość znieczulenia, ściskając środek stopy, aby obserwować reakcje szczurów.

2. Pobieranie próbek siatkówki do wykrywania czynników białkowych

  1. Zamocuj oczodół szczura lewą ręką i usuń oko z umiarkowaną siłą prawą ręką za pomocą okulistycznych kleszczy do zginania. Umieść gałkę oczną w pozycji strzałkowej w zimnym szklanym naczyniu.
  2. Lewą ręką trzymając prostą pęsetę okulistyczną do mocowania gałki ocznej, a prawą ręką trzymającą ostrze chirurgiczne, wykonaj 2 mm podłużne nacięcie w pobliżu soczewki.
  3. Odetnij rogówkę nożyczkami okulistycznymi wzdłuż nacięcia i delikatnie odklej soczewkę, ciało szkliste i odsłoń muszlę oczną.
  4. Umieść dolną część muszli ocznej na końcu probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, obróć muszlę oczną nad rurką i odsłoń siatkówkę (siatkówka jest bladożółta).
  5. Usuń całą siatkówkę wzdłuż ściany twardówki gałki ocznej za pomocą pęsety do zginania okulistycznego, a następnie umieść ją w zamrożonej probówce i przechowuj w zbiorniku z ciekłym azotem do wykorzystania w przyszłości (Rysunek 1).

3. Pobieranie próbek siatkówki do badania patologicznego i barwienia komórek

  1. Lewą ręką użyj pęsety do oczu, aby unieść kącik oka szczura. Prawą ręką użyj ostrza chirurgicznego, aby wyciąć 4-milimetrowy otwór wzdłuż kącika oka szczura.
  2. Użyj pęsety do oczu, aby zacisnąć krawędź gałki ocznej przy otworze w lewej ręce. Użyj nożyczek okulistycznych, aby odciąć otaczające tkanki wzdłuż krawędzi gałki ocznej, zwracając uwagę na oczyszczenie otaczających tkanek gałki ocznej.
  3. Oddziel tkanki wokół nerwu wzrokowego na tylnym biegunie gałki ocznej za pomocą pęsety do oczu, przetnij nerw wzrokowy i zwróć uwagę na jego zachowanie. Następnie usuń gałkę oczną.
  4. Umyj usuniętą gałkę oczną solą fizjologiczną, aby usunąć pozostałą krew, zwiń ją na bibułę filtracyjną, aby wchłonąć nadmiar wody i umieść na zimnej folii aluminiowej.
  5. Napraw oko pęsetą okulistyczną. Wykonaj podłużne nacięcie o średnicy 4 mm wzdłuż połączenia rogówki i siatkówki za pomocą ostrza chirurgicznego.
  6. Usuń rogówkę nożyczkami okulistycznymi, wykonaj okrągłe nacięcie wzdłuż nacięcia i delikatnie usuń soczewkę i ciało szkliste.
  7. Umieść pozostałą muszlę oczną z nerwem wzrokowym w pudełku do zatapiania i zamocuj ją w 4% paraformaldehydzie.
  8. Zanurz próbki utrwalone paraformaldehydem w parafinie i pokrój w plastry 4 μm do barwienia HE i barwienia TUNEL7.

4. Barwienie siatkówki szczura

  1. Deparafinowanie i nawilżanie: Umieść plastry w ksylenie na 10 minut, powtarzaj proces przez kolejne 10 minut, a następnie absolutny etanol przez 5 minut, powtarzaj leczenie etanolem przez kolejne 5 minut, a następnie poddaj je działaniu 95% alkoholu przez 5 minut, następnie w 85% alkoholu przez 5 minut, a na koniec w 75% alkoholu przez 5 minut.
  2. Barwienie hematoksyliną: Plastr płukać wodą dejonizowaną przez 5 min. Użyć 100 μl roztworu barwiącego hematoksylinę i barwić przez 5 min, płukać wodą dejonizowaną przez 5-10 s. Dodawać 100 μl etanolu z 1% kwasu solnego przez 30 s, płukać wodą dejonizowaną przez 20 min i dodawać 100 μl 0,2% wody amoniakalnej przez 1 min. Płukać wodą dejonizowaną przez 5 min.
  3. Barwienie eozyną: Użyj 100 μl roztworu barwiącego eozynę do barwienia przez 5 minut i spłukuj wodą dejonizowaną przez 30 s.
  4. Odwodnienie i uszczelnienie: Zanurz plastry w 70% alkoholu na 5 minut, następnie w 85% alkoholu na 5 minut, a następnie w 90% alkoholu na 5 minut i absolutnym etanolu na 5 minut. Powtórz zabieg absolutnym etanolem przez kolejne 5 minut, następnie zanurz w ksylenie na 5 minut i powtarzaj proces przez kolejne 5 minut. Na koniec uszczelnij, dodając około 100 μl neutralnej żywicy na powierzchnię plastrów, a następnie przykryj ją szkłem nakrywkowym.
  5. Obrazowanie szkiełek: Umieść zabarwione plasterki na mikroskopie, dostosuj ostrość mikroskopu, aż obraz będzie wyraźnie widoczny, ustaw powiększenie na 400x i uchwyć obraz.
  6. Zmierz całkowitą grubość siatkówki i zewnętrzną grubość siatkówki: Zmierz całkowitą grubość siatkówki i zewnętrzną grubość siatkówki (grubość zewnętrznej warstwy jądrowej i warstwy fotoreceptorów) i oblicz procent zewnętrznej grubości siatkówki
    Zewnętrzna grubość siatkówki (%) = (zewnętrzna grubość siatkówki/ całkowita grubość siatkówki) x 100.

5. Wyznaczanie szybkości apoptozy komórek fotoreceptorów siatkówki metodą TUNEL

  1. Deparafinowanie i nawilżanie: Umieść plastry w ksylenie na 10 minut, powtarzaj proces przez kolejne 10 minut, następnie umieść w absolutnym etanolu na 5 minut i powtarzaj ten krok przez kolejne 5 minut. Wykonaj odwodnienie, umieszczając w 95% alkoholu na 5 min, 90% alkoholu na 5 minut, 80% alkoholu na 5 minut, 70% alkoholu na 5 minut, i płukać wodą dejonizowaną przez 5 min.
  2. Płukać 0,85% roztworem chlorku sodu przez 5 minut i PBS przez 5 minut. Utrwalać paraformaldehydem za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut. Płukać PBS przez 5 minut i powtarzać proces przez kolejne 5 minut.
  3. Inkubacja i równowaga7: Inkubować z 20 μg/ml roztworu proteinazy K do trawienia przez 15 min, równoważyć w buforze równowagi przez 10 min i inkubować z rekombinowanym buforem końcowej deoksynukleotydylotransferazy (rTdT) w temperaturze 37 °C przez 60 min.
  4. Zatrzymanie reakcji: Dodać 100 μl wzorcowego roztworu cytrynianu (2 x roztwór SSC) przez 15 minut. Płukać PBS przez 5 minut i powtarzać proces przez kolejne 5 minut.
  5. Barwnik jądrowy: Dodaj 100 μL 4′, odczynnika 6-diamidyno-2-fenindl (DAPI) przez 5 min. Płukać wodą dejonizowaną przez 5 min i powtarzać proces przez kolejne 5 min.
  6. Uszczelnienie: Wytrzyj nadmiar ksylenu wokół plastrów i uszczelnij, dodając około 100 μl neutralnej żywicy do powierzchni plastrów, a następnie przykryj ją szkłem nakrywkowym.
  7. Mikroskopia: Umieść poplamione plastry na mikroskopie, dostosuj ostrość mikroskopu, aby uzyskać wyraźną widoczność, ustaw powiększenie na 400x i uchwyć obraz. Obserwuj zieloną fluorescencję przy długości fali 520 ± 20 nm przy użyciu standardowego filtra fluorescencyjnego. Obserwuj niebieski DAPI przy długości fali 460 nm.
  8. Oblicz szybkość apoptozy: zmierz wartości fluorescencji zielonej i fluorescencji niebieskiej zewnętrznej warstwy jądra siatkówki. Obliczać szybkość apoptozy jako
    Szybkość komórek apoptozy = wartość zielonej fluorescencji/wartość fluorescencji niebieskiej x 100.

6. Analiza Western blot 10

  1. Leczenie buforem do lizy: Zmiel i homogenizuj jedną zamrożoną siatkówkę za pomocą 50 μl buforu do lizy na zimno (1 ml buforu do lizy zawierającego 5 μl inhibitora fosfatazy, 1 μl inhibitora proteazy i 5 μl 100 mM PMSF).
  2. Poddać działaniu sonikacji o częstotliwości 28 kHz przez 5 s w łaźni lodowej; powtórzyć 3 razy. Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 10 000 x g w celu usunięcia resztek komórkowych. Zachować supernatant.
  3. em>6.3Kwantyfikacja białka: Określ stężenie białka za pomocą zestawu odczynników do oznaczania białek BCA.
  4. em>6.4Elektroforeza: Załadować 50 μg próbki białka i rozdzielić na 12% elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE).
  5. Transfer do membrany: Elektroforetyczny transfer do membran PVDF za pomocą elektroforetycznego systemu transferowego.
  6. Podziel błony: Podziel błony i przeanalizuj każde interesujące białko, β-aktynę i GAPDH z jednego transferu.
  7. Blokowanie: Zablokuj błony na 1 godzinę w TBST zawierającym 5% mleka beztłuszczowego w temperaturze pokojowej.
  8. Inkubacja przeciwciała pierwszorzędowego: Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozszczepionej kaspazy-9 (rozcieńczenie 1:200), rozszczepionej kaspazy-3 (rozcieńczenie 1:200), rozszczepionej kaspazy-7 (rozcieńczenie 1:200) i β-aktyny (rozcieńczenie 1:1000) przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać błony TBST przez 5 minut, powtórzyć 3x.
  9. Inkubować drugie przeciwciało: Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (1:2000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Myć membrany TBST przez 5 min, powtórzyć 3x.
  10. Ekspozycja: Wizualizuj znakowane białka za pomocą substratu Western blot, a na koniec naświetlaj błony, aby uwidocznić prążki białkowe w trybie automatycznej ekspozycji.
  11. Oblicz zawartość białka7, mierząc gęstość pasma białka.

7. Analiza statystyczna

  1. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania SPSS 19.0 i przedstaw je jako średnią ± odchylenie standardowe. Wykonuj analizy statystyczne obserwowanych wartości przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji. Przyjmij p< 0,05 jako statystycznie istotne.

Wyniki

Po barwieniu HE, wszystkie warstwy siatkówki szczurów w grupie kontrolnej miały wyraźną strukturę tkankową, uporządkowany układ komórek i jednolite barwienie, podczas gdy struktura siatkówki szczurów w grupie modelowej była znacznie uszkodzona, zewnętrzna warstwa siatkówki była cieńsza, zewnętrzna warstwa jądrowa była prawie całkowicie zintegrowana z wewnętrzną warstwą rdzenia, układ komórek w warstwie był skrajnie nieuporządkowany, Liczba warstw komórek została znacznie zmniejszona, a grubość światłoczułej warstwy komórki i zewnętrznej warstwy jądrowej była znacznie cieńsza. Grubość zewnętrznej warstwy siatkówki w grupie kontrolnej i grupie modelowej wynosiła odpowiednio 48% i 23% (p < 0,01; Rysunek 2).

Metoda TUNEL wykazała, że w grupie kontrolnej nie wykryto żadnych komórek apoptotycznych, ale w zewnętrznej warstwie jądrowej szczurów w grupie modelowej znajdowały się komórki apoptotyczne (p < 0,01), a współczynnik dodatni TUNEL wynosił 9,6% (Rysunek 3).

Rodzina białek kaspazy jest jedną z głównych rodzin przeprowadzających apoptozę. Wśród nich rozszczepiona kaspaza 3, rozszczepiona kaspaza 7 i rozszczepiona kaspaza 9 są klasycznymi wskaźnikami używanymi do oceny apoptozy komórek7. Wyniki Western blot wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną, ekspresja rozszczepionej kaspazy 3, rozszczepionej kaspazy 7 i rozszczepionej kaspazy 9 w siatkówce grupy modelowej była znacznie zwiększona (p<0,01; Rysunek 4). Wskazywało to, że MNU może wyraźnie powodować apoptozę komórek w siatkówce.

figure-results-1
Rysunek 1: Eksperymentalny przepływ pracy. Po dootrzewnowym wstrzyknięciu MNU przez 7 dni (7d) uzyskano siatkówkę znieczulonych szczurów do barwienia HE i TUNEL. Skróty: MNU = N-metylo-N-nitrozomocznik; HE = hematoksylina-eozyna; TUNEL = końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylotransferazy za pośrednictwem trifosforanu deoksyurydyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne histopopatologiczne obrazy barwienia HE w 7 dniu po wstrzyknięciu MNU. (A) Barwienie HE po 7 dniach (7d) po podaniu MNU. (B) Zewnętrzny stosunek siatkówki. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n=6). Analizy statystyczne obserwowanych wartości przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. ** p < 0,01 vs kontrola. Skróty: GCL = warstwa komórek zwojowych; IPL = wewnętrzna warstwa pleksiformu; INL = warstwa jądra; OPL = zewnętrzna warstwa pleksi; ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa; PRL = warstwa fotoreceptorów; MNU = N-metylo-N-nitrozomocznik; HE = hematoksylina-eozyna. n = 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Test TUNEL pokazuje apoptozę fotoreceptorów wywołaną przez MNU u szczurów. (A) Po 7 dniach (7d) od wstrzyknięcia MNU, u szczurów leczonych MNU zaprezentowano komórki TUNEL-dodatnie (zielone). (B) Współczynnik dodatni TUNEL. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n=6). Analizy statystyczne obserwowanych wartości przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. ** p < 0,01 vs kontrola. Skróty: GCL = warstwa komórek zwojowych; IPL = wewnętrzna warstwa pleksiformu; INL = warstwa jądra; OPL = zewnętrzna warstwa pleksi; ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa; PRL = warstwa fotoreceptorów; MNU = N-metylo-N-nitrozomocznik; TUNEL = końcowe znakowanie końca deoksynukleotydylotransferazy za pośrednictwem trifosforanu deoksyurydyny. n = 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ekspresja rozszczepionej kaspazy 3, rozszczepionej kaspazy 7 i rozszczepionej kaspazy 9 w siatkówkach szczurów w 7 dniu po wstrzyknięciu MNU. (A) Dane reprezentatywne dla ekspresji rozszczepionej kaspazy. (B) Stosunek rozszczepionej kaspazy 3/β-aktyny. (C) Stosunek rozszczepionej kaspazy 7/β-aktyny. (D) Stosunek rozszczepionej kaspazy 9/β-aktyny. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n=6). Analizy statystyczne obserwowanych wartości przeprowadzono przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji. ** p < 0,01 vs kontrola. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

RP jest powszechną chorobą siatkówki w klinikach. Początek, nasilenie i progresja RP są związane z genami i modami genetycznymi i mają wpływ na środowisko 8,11. RP obejmuje RP rodzinne i okazjonalne RP, z których RP rodzinne stanowi około 60% pacjentów. Śledząc rodzinną historię genetyczną, do tej pory zidentyfikowano 83 geny związane z RP, podczas gdy sporadycznie RP stanowi około 40%, co oznacza, że ten rodzaj pacjenta nie ma historii rodzinnej i ma nieregularny wzorzec genetyczny2. Chociaż apoptoza komórek fotoreceptorów siatkówki, powodująca utratę funkcji wzrokowych u pacjentów z RP, jest powszechnie znana, mechanizm leżący u podstaw śmierci fotoreceptora w RP pozostaje niejasny 12,13,14. Ze względu na ograniczony dostęp do ludzkiej tkanki siatkówki, którą uzyskuje się głównie podczas witrektomii, ekstrakcja tkanki siatkówki od zwierząt modelowych jest nadal powszechną metodą w badaniach podstawowych RP14,15.

Siatkówka jest przezroczystą błoną umieszczoną w wewnętrznej warstwie bańki oka, z jamą ciała szklistego wewnątrz i błoną naczyniówkową blisko na zewnątrz. Siatkówka zaczyna się od ząbkowanej krawędzi z przodu, a kończy na tarczy nerwu wzrokowego z tyłu. Jest to początkowa część formowania się wizji16. Próbki siatkówki zwierząt modelowych są używane głównie do analizy PCR siatkówki, wykrywania Western blot, obserwacji patologicznej struktury tkanki, barwienia immunohistochemicznego, badania immunofluorescencyjnego, oceny gęstości mikronaczyniowej, izolacji komórek i hodowli itp.17,18. Wymagania dotyczące pobierania próbek siatkówki dla różnych wskaźników testowych są różne. Pobieranie próbek siatkówki w celu wykrywania czynników białkowych u zwierząt modelowych oraz pobieranie próbek siatkówki w przypadku skrawków zatopionych w parafinie są powszechnymi technikami operacyjnymi w badaniach przesiewowych leków w kierunku RP8. Jednak ze względu na bardzo delikatną i złożoną budowę gałki ocznej modelowego zwierzęcia, proces usuwania przeszkadzających tkanek w oku i uzyskiwania próbek siatkówki jest skomplikowany. Podczas procesu pobierania próbek może dojść do utraty tkanki siatkówki, zanieczyszczenia, degradacji białek i odwarstwienia siatkówki. Czynniki te będą miały wpływ na jakość i ilość ekstrakcji białka siatkówki, a także na efekt barwienia skrawków i wyniki wykrywania wskaźników eksperymentalnych. Dlatego potrzebna jest odpowiednia procedura pobierania próbek z siatkówki.

Niezwykle ważne jest uproszczenie złożoności i uchwycenie kluczowego ogniwa pozyskiwania siatkówki w celu ulepszenia techniki pobierania siatkówki u zwierząt modelowych. Szybkie odsłonięcie siatkówki i całkowite usunięcie siatkówki w miarę możliwości są kluczowymi etapami pobierania próbek siatkówki w celu wykrycia czynników białkowych u szczurów modelowych. W tym badaniu gałki oczne zostały pobrane bezpośrednio po znieczuleniu, aby zaoszczędzić czas pobierania próbek. Sztuczka polegająca na odsłonięciu siatkówki polega na obróceniu muszli ocznej nad rurką o pojemności 1,5 ml, co było opłacalne i praktyczne oraz mogło całkowicie oderwać siatkówkę od ściany twardówki. Ta procedura operacyjna jest prosta, szybka, oszczędna i sprzyja praktyce obsługi personelu eksperymentalnego, dzięki czemu można ją wykonać w ciągu 5 minut. W procesie pobierania próbek siatkówki do badania patologicznego i specyficznego barwienia komórek, utrzymanie świeżości i integralności strukturalnej siatkówki jest kluczowym krokiem do uzyskania wysokiej jakości barwienia. Perfuzja z formaldehydem z lewego przedsionka, a następnie uzyskanie siatkówki jest jedną z metod często stosowanych przez badaczy, ale jest czasochłonna, a formaldehyd brzydko pachnie i powoduje dyskomfort uoperatora19. W tym badaniu tkanka wokół gałki ocznej jest oddzielana w pierścień po znieczuleniu, aby zachować jej integralność. Po przecięciu i zatrzymaniu nerwu wzrokowego oddziel otaczającą go tkankę na tylnym biegunie gałki ocznej i usuń gałkę oczną. Różne części gałki ocznej były dokładnie zlokalizowane z nerwem wzrokowym. Na koniec, przy wsparciu zawartości oka, wykonano nacięcie, odcięto rogówkę w pierścieniu, odklejono soczewkę i ciało szkliste oraz uzyskano muszlę oczną łączącą nerw wzrokowy (siatkówka znajduje się na ścianie twardówki wewnątrz muszli ocznej). W tym procesie operacja powinna być delikatna, aby zachować integralność siatkówki. Procedura operacyjna nie tylko znacznie poprawia szybkość zbierania materiałów, ale może również utrzymać pełną normalną strukturę i kształt gałki ocznej i może być dokładnie zlokalizowana w różnych częściach gałki ocznej po wyjęciu gałki ocznej. Po umiejętnej operacji operację można zakończyć w 8 minut. Stosując powyższe metody pobierania próbek siatkówki, nasza grupa badawcza uzyskała stosunkowo idealne wyniki wykrywania czynników białkowych, wyników barwienia HE i wyników barwienia TUNEL.

Chociaż obecna metoda pobierania próbek siatkówki ma pewne zalety, nadal wymaga poprawy. W procesie pobierania próbek siatkówki w celu wykrycia czynnika białkowego, po odsłonięciu siatkówki, istnieje również ryzyko niepełnego rozwarstwienia siatkówki lub utraty podczas pobierania siatkówki przez zginanie pęsety ze względu na ograniczony punkt podparcia pęsety zginającej. Dlatego konieczne jest ulepszenie narzędzi do rozwarstwiania siatkówki. Z drugiej strony, w procesie ekstrakcji siatkówki do badania patologicznego i specyficznego barwienia komórek, po wyizolowaniu gałki ocznej, podczas procesu usuwania soczewki i ciała szklistego, ściana gałki ocznej zapadnie się z powodu utraty podparcia ze strony oka, co łatwo spowodować odwarstwienie siatkówki. W związku z tym operacja musi być szybka, delikatna i o odpowiedniej sile, a operator musi często ćwiczyć. W związku z tym nasze procedury pobierania próbek siatkówki nadal wymagają udoskonalenia, aby w większym stopniu promować badania nad działaniem ochronnym i mechanizmem tradycyjnej medycyny przeciwko RP.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Projekt Badań Naukowych Departamentu Szkolnictwa Wyższego Ningxia (NYG2022029).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amersham ImagerGE680
Nadsiarczan amonu  Boster Biological Technology Co., LtdA8090
Waga analitycznaBCA METTLER ToledoME104E
  Kena Gena Biotechnologia. Co. LtdKGP902
rozszczepione przeciwciało kaspazy-3Technologia sygnalizacji komórkowej9664
rozszczepione przeciwciało kaspazy-7Technologia sygnalizacji komórkowej8438
rozszczepione przeciwciało kaspazy-9Technologia sygnalizacji komórkowej9507
Ślepy zaułek fluorometryczny system TUNELPromegaG3250
Glicyna  Boster Biological Technology Co., LtdAR1200
Koza IgG Przeciw Królikom H& L (HRP)Bioss Przeciwciałabs-80295G-HRP
Surowica koziaBiosharpBL210A
Wysoka prędkość  kruszarkaThermo Fisher  NaukoweAG22331
Membrany transferowe Immobilon-P SQMerck Millipore. LtdISEQ00010
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
MetanolChengdu Kelong Chemical Co., Ltd20230108
Czytnik mikropłytekThermo Fisher  Mikroskop naukowy1510
OlympusIX73
Szkiełko mikroskopoweCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd7105P-G
Mini-PROTEAN TetraBIO-RAD1658001
N-metylo-N-Nitrosoureasigma-AldrichN4766– Piekarnik 100G
Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., LtdDHG-8145
Page Pre-solution (30%)Doublehelix Biology Science and Technology Co., LtdL3202A
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific26617
PBS BuforBiosharpG4202
SDS-PAGE Bufor ładujący białko (5& razy ;)Beyotime BiotechnologyP0015
Odtłuszczone mleko w proszkuBioFroxx1172GR500
Szczury Sprague DawleyUniwersytet Medyczny NingxiaSCXK (Ning) 2020-0001
TEMED&nbsp; Boster Biological Technology Co., LtdAR1165
Zestaw do ekstrakcji białka całkowitego  Kena Gena Biotechnologia. Co. LtdKGP2100
Moduł Trans-BlotBIO-RAD1703935
Tris base  Boster Biological Technology Co., LtdAR1162
Pęseta Changde BKMAM Biotechnology Co., Ltd130302027
β-aktynowatechnologia sygnalizacji komórkowej4970
Zestaw do kwantyzacji białek ####

Bibliografia

  1. Cehajic-Kapetanovic, J., et al. Association of a novel intronic variant in RPGR with hypomorphic phenotype of X-linked retinitis pigmentosa. JAMA Ophthalmol. 138 (11), 1151-1158 (2020).
  2. Pan, M. Y., et al. Mice deficient in UXT exhibit retinitis pigmentosa-like features via aberrant autophagy activation. Autophagy. 17 (8), 1873-1888 (2021).
  3. Xiong, Y. C., et al. 17β-Oestradiol attenuates the photoreceptor apoptosis in mice with retinitis pigmentosa by regulating N-myc downstream regulated gene 2 expression. Neuroscience. 452, 280-294 (2021).
  4. Zhang, S., et al. Müller cell regulated microglial activation and migration in rats with -Methyl--Nitrosourea-Induced retinal degeneration. Front Neurosci. 14, 606486(2020).
  5. Karine, B., et al. Transferrin non-viral gene therapy for treatment of retinal degeneration. Pharmaceutics. 12 (9), 836(2020).
  6. Yan, W. M., et al. Protection of retinal function and morphology in MNU-induced retinitis pigmentosa rats by ALDH2: an in-vivo study. BMC Ophthalmol. 20 (1), 55(2020).
  7. Zhu, Y. F., et al. Lycium barbarum polysaccharides attenuates N-methy-N-nitrosourea-induced photoreceptor cell apoptosis in rats through regulation of poly (ADP-ribose) polymerase and caspase expression. J Ethnopharmacol. 191, 125-134 (2016).
  8. He, S. Q., et al. Effects and mechanisms of water-soluble Semen cassiae polysaccharide on retinitis pigmentosa in rats. Food Sci Technol. 40 (1), 84-88 (2020).
  9. Chen, Q., Cheng, Z. H., Hu, B. J. Current situation of vitreous and retinal related tissue specimens collection and application. Chinese J Ocular Fundus Dis. 36 (5), 396-399 (2020).
  10. Zhang, Y., et al. Salidroside modulates repolarization through stimulating Kv2.1 in rats. Eur J Pharmacol. 977, 176741(2024).
  11. Deng, F. Y., Han, M. Y., Deng, T. T., Jin, M. Research progress of gene therapy for retinitis pigmentosa. Int Eye Sci. 21 (7), 1205-1208 (2021).
  12. Lin, B., Youdim, M. B. H. The protective, rescue and therapeutic potential of multi-target iron-chelators for retinitis pigmentosa. Free Radic Biol Med. 174, 1-11 (2021).
  13. Carullo, G., et al. Retinitis pigmentosa and retinal degenerations: deciphering pathways and targets for drug discovery and development. ACS Chem Neurosci. 11 (15), 2173-2191 (2020).
  14. Zhang, Z. J., et al. Quantification of microvascular change of retinal degeneration in Royal College of Surgeons rats using high-resolution spectral domain optical coherence tomography angiography. J Biomed Opt. 28 (10), 106001(2023).
  15. Loiseau, A., Raîche-Marcoux, G., Maranda, C., Bertrand, N., Boisselier, E. Animal models in eye research: focus on corneal pathologies. Int J Mol Sci. 24 (23), 16661(2023).
  16. Gregory-Evans, K. A review of diseases of the retina for neurologists. Handb Clin Neurol. 178, 1-11 (2021).
  17. Li, X. M., et al. Targeting long noncoding RNA-AQP4-AS1 for the treatment of retinal neurovascular dysfunction in diabetes mellitus. EBioMedicine. 77, 103857(2022).
  18. Lee, D., et al. Retinal degeneration induced in a mouse model of ischemia-reperfusion injury and its management by pemafibrate treatment. FASEB J. 36 (9), e22497(2022).
  19. Zhang, Q. L., Zhao, N., Li, Z. J. Effects of salidroside on retinopathy in diabetic rats based on COX-2/PGE2/VEGF pathway. J China Medical Uni. 52 (8), 731-935 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ocena retinopatiisiatk wka szczurabarwienie hematoksylin i eozynwska nik apoptozytest TUNELWestern blotretinopatia w medycynie tradycyjnej
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.