Artykuł metodologiczny

Model śpiączki niedokrwiennej mózgu wywołany zmodyfikowaną okluzją czterech naczyń

DOI:

10.3791/67161

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, 2School of Medicine, Foshan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje proces wywoływania modelu śpiączki niedokrwiennej mózgu przy użyciu zmodyfikowanej metody okluzji czterech naczyń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śpiączka spowodowana niedokrwieniem mózgu jest najpoważniejszym powikłaniem niedokrwienia mózgu. Okluzja czterech naczyń może ustanowić model śpiączki niedokrwiennej mózgu do badań nad chorobami i opracowywania leków. Jednak powszechnie stosowana metoda okluzji czterech naczyń polega głównie na wprowadzeniu pióra do elektrokoagulacji do obustronnego otworu skrzydłowego pierwszego kręgu szyjnego za szyją w celu elektrokoagulacji tętnic kręgowych. Proces ten niesie ze sobą ryzyko niepełnej elektrokoagulacji, krwawienia oraz uszkodzenia pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Dwadzieścia cztery godziny po operacji znieczulone szczury poddawane są podwiązaniu tętnicy szyjnej przed szyją. Dwie operacje narażają szczury na większe ryzyko infekcji i wydłużają okres eksperymentalny. W tym badaniu, podczas pojedynczego zabiegu chirurgicznego, zastosowano przednie nacięcie szyjki macicy w celu zlokalizowania kluczowego miejsca, w którym tętnica kręgowa przenika do pierwszego kręgu szyjnego. Obustronne tętnice kręgowe zostały wypalone, elektrokouteryzowane w warunkach wizualnych, podczas gdy obustronne tętnice szyjne wspólne zostały oddzielone w celu umieszczenia luźnych węzłów. Kiedy kończyny szczurów zaczęły drgać, obustronne tętnice szyjne wspólne zostały szybko podwiązane w celu wywołania śpiączki niedokrwiennej. Metoda ta pozwala uniknąć ryzyka infekcji spowodowanej dwiema operacjami chirurgicznymi i jest łatwa do wykonania z wysokim wskaźnikiem sukcesu, stanowiąc przydatne odniesienie dla odpowiednich lekarzy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedokrwienne uszkodzenie mózgu jest najczęstszym uszkodzeniem mózgu w praktyce klinicznej, stanowiąc około 75% przypadków chorób naczyniowo-mózgowych. Niedokrwienie może prowadzić do poważnych wtórnych urazów i chorób mózgu1,2, a śpiączka jest najpoważniejszym objawem spowodowanym niedotlenieniem niedotlenienia mózgu. Jest to również ostatnia ścieżka dla wielu krytycznych warunków3. Śpiączka jest krytyczną i ciężką chorobą w praktyce klinicznej, która jest trudna do opanowania4. Im dłużej trwa śpiączka, tym większe potencjalne niebezpieczeństwo. Szybkie przebudzenie jest głównym celem zapobiegania pogorszeniu i postępowi choroby. Chociaż wstrzykiwanie naloksonu ma szeroki zakres zastosowań klinicznych w promowaniu czuwania, nadal ma pewne skutki uboczne5. Dlatego opracowanie bezpiecznych i skutecznych leków wspomagających czuwanie jest pilnym problemem, którym należy się zająć. Stworzenie prostego i łatwego w obsłudze modelu śpiączki niedokrwiennej mózgu jest niezbędne do wyjaśnienia patogenezy śpiączki niedokrwiennej i opracowania leków6,7,8.

Celem tego badania jest wprowadzenie modelu wywoływania globalnej śpiączki niedokrwiennej poprzez elektrokoagulację obustronnych tętnic kręgowych (VA) i tymczasowe podwiązanie obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCA), co jest proste i przyjazne dla początkujących. Poprzedni protokół polegał na odsłonięciu obustronnego otworu skrzydłowego pierwszego tylnego kręgu szyjnego podczas pierwszej operacji i elektrycznym spaleniu otworu skrzydłowego w celu zablokowania obustronnych VA. Drugą operację przeprowadzono 24 godziny później w celu wywołania całkowitej śpiączki niedokrwiennej poprzez podwiązanie obustronnego CCAs9,10,11,12. Jednak ze względu na niewidzialność istnieje ryzyko niepełnej elektrokoagulacji, krwawienia, urazu pnia mózgu i rdzenia kręgowego, a także przedłużonego okresu eksperymentalnego. W związku z tym konieczne jest zajęcie się tymi kwestiami.

Tutaj prezentujemy ulepszoną metodę modelowania śpiączki niedokrwiennej. Główna procedura polega na wykonaniu środkowego nacięcia przedniej części szyi, wykonaniu resekcji elektrycznej obustronnych VA w warunkach wizualnych i krótkim podwiązaniu obustronnych CCA podczas jednej operacji w celu zablokowania dopływu krwi do całego mózgu, powodując szybkie zahamowanie elektroencefalogramu (EEG) i prowadząc do śpiączki. Metoda ta indukuje również krótką, ciągłą śpiączkę po reperfuzji. Procedura ta jest łatwa do wykonania, przyjazna dla nowicjuszy i zmniejsza ryzyko wtórnego zakażenia urazowego u zwierząt, skracając w ten sposób okres eksperymentu.

Protokół jest odpowiedni do badania globalnej śpiączki niedokrwiennej spowodowanej zatrzymaniem akcji serca. Idealnie nadaje się również do badania demencji niedokrwiennej, głównie dlatego, że obszar mózgu hipokampa jest niezwykle wrażliwy na niedokrwienie; Tak więc przemijające niedokrwienie mózgu może prowadzić do uszkodzenia lub nawet utraty neuronów hipokampa13, co skutkuje dysfunkcją funkcji poznawczych. Dlatego protokół może stanowić odniesienie dla praktyków zajmujących się niedokrwieniem mózgu, śpiączką niedokrwienną i otępieniem niedokrwiennym.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentalny został przeprowadzony zgodnie z wymaganiami Komitetu ds. Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych oraz Instytucjonalnej Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Foshan (Numer rekordu: 2023-643656). Do badania wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley (SD) (200 g ± 20 g, w wieku 6-8 tygodni). Wszystkie dane z badań na zwierzętach zostały spisane zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Implantacja elektrod EEG

  1. Wstrzyknąć 0,05 mg/kg atropiny podskórnie 15 minut przed znieczuleniem, aby zapobiec niedrożności dróg oddechowych i uduszeniu spowodowanemu wydzielinami. Podać domięśniowo wstrzyknięcie 20 mg/kg zoletilu i 5 mg/kg ksylazyny w celu znieczulenia szczurów14. Użyj pęsety, aby zacisnąć palce u nóg szczura, aby potwierdzić głębokie znieczulenie.
  2. Usuń włosy z głowy szczura za pomocą golarki do włosów. Przymocuj głowę szczura do urządzenia stereotaktycznego mózgu za pomocą niepenetrujących nauszników. Za pomocą sterylnych wacików trzykrotnie nałóż etanol i jod powidonu na miejsce operacji w celu dezynfekcji skóry.
  3. Przeciąć skórę głowy szczura wzdłuż odciętego szwu za pomocą ostrza chirurgicznego. Usuń mięsień pokrywający czaszkę i całkowicie odsłoń czaszkę. Użyj sterylnych bawełnianych wacików, aby zatrzymać krwawienie podczas całego procesu.
  4. Wysusz powierzchnię czaszki za pomocą kulki do płukania uszu, aby cement dentystyczny ściśle przylegał do czaszki. Zaznacz pozycję montażu gwoździa czaszki (średnica 1,2 mm, długość 3 mm) czarnym markerem (Rysunek 1, krok 1). Konkretne pozycje to przedni punkt ciemiączka i cztery inne miejsca.
  5. Użyj igły strzykawki o pojemności 10 ml, aby obrócić i przewiercić kolejno cztery obszary. Włóż kolejno cztery gwoździe czaszki do czaszki, zapewniając kontakt z korą mózgową (Rysunek 1, kroki 2-3).
    UWAGA: Używaj sterylnych bawełnianych wacików do wchłaniania krwi w przypadku krwawienia, aby zapobiec rdzewieniu paznokci kostnych.
  6. Owiń srebrny drut elektrody EEG wokół paznokcia czaszki. Osadź elektrodę elektromiograficzną w mięśniu i przymocuj ją szwem 6-0.
  7. Wymieszaj żywicę podstawy protezy z samoutwardzalnym proszkiem do protez i przymocuj elektrodę do czaszki. Użyj kulki do płukania uszu, aby wdmuchnąć powietrze na powierzchnię cementu dentystycznego, aby przyspieszyć utwardzanie.
  8. Wstrzyknij 10 000 jednostek penicyliny, aby zapobiec infekcji. Trzymaj każdego szczura w osobnej klatce, aby zapobiec wzajemnemu rozerwaniu i uszkodzeniu elektrod. Podskórnie wstrzykiwano 0,2 mg/kg meloksykamu przez trzy kolejne dni w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Odczekaj 3 dni na zagojenie się ran szczura i zamocowanie elektrody (Rysunek 1, krok 4).

2. Proces chirurgiczny modelu śpiączki niedokrwiennej mózgu

  1. Trzy dni później ponownie znieczul szczury i umieść je w pozycji leżącej. Użyj sterylnych wacików do dezynfekcji pola operacyjnego poprzez trzykrotne wielokrotne aplikacje jodu, a następnie płukanie/chusteczkę nasączoną alkoholem. Wykonaj nacięcie skalpelem o długości około 2-3 cm od górnego brzegu mostka wzdłuż środka szyi (Rysunek 1, krok 5).
  2. Tępo oddziel tkankę podskórną i mięsień mostkowo-gnykowy, całkowicie odsłaniając tchawicę i mięśnie długie colli po obu stronach tchawicy15.
    UWAGA: Unikaj stymulacji tchawicy przez cały czas trwania zabiegu.
  3. Tępo oddziel mięśnie longus colli od poziomu tarczycy w dół, odsłaniając pierwszy i drugi kręg szyjny. Rozszerz obszar szyi za pomocą rozszerzacza tkanek szczura, całkowicie odsłaniając pole operacyjne.
  4. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie oddzielić mięśnie i tkanki widoczne w przestrzeni międzykręgowej szyjki macicy, odsłaniając charakterystyczne miejsce, w którym tętnica kręgowa wchodzi do pierwszego kręgu szyjnego. Można zaobserwować, że tętnica kręgowa przechodzi przez pierwszy kręg szyjny (Rysunek 1, krok 6).
    UWAGA: Umieszczenie strzykawki o pojemności 1 ml pod szyją zapewnia wyraźniejszą przestrzeń do manipulacji chirurgicznej.
  5. Rozgrzej wstrzykiwacz do elektrokoagulacji i włóż go do tego obszaru na 3-5 sekund, aby upewnić się, że tętnica kręgowa jest elektrokoagulowana i przecięta. Oddziel mięśnie i powięź wzdłuż wewnętrznej krawędzi mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego, odsłoń i uwolnij obustronne CCA i zawiąż luźny węzeł.
    UWAGA: Wstrzykiwacz do elektrokoagulacji musi być wstępnie podgrzany; W przeciwnym razie nie może szybko koagulować tętnicy kręgowej, co prowadzi do krwawienia. Obie tętnice kręgowe są elektrokoagulowane, a luźne węzły są zawiązane wokół CCA.
  6. Szybko zaciśnij pierwszy luźny węzeł, aby zablokować przepływ krwi w CCA, gdy szczury odzyskają przytomność i będą wykazywać drganie kończyn, podczas gdy detektor EEG wykryje aktywne sygnały EEG i EMG. Szczury będą walczyć przez kilka sekund, a następnie stopniowo tracą przytomność (Rysunek 1, krok 7).
  7. Po zwolnieniu fiksacji obserwuj, że kończyny szczura są sztywne, odruch prostowania znika, ale oddech jest utrzymany. W tym momencie elektromiogram (EMG) przedstawia linię prostą, a EEG jest szybko tłumione, co wskazuje, że model niedokrwienia mózgu wywołanego 4-VO powiódł się16.
    UWAGA: Depresja oddechowa występuje u niektórych szczurów podczas obustronnego podwiązania CCA. Szybka stymulacja mechaniczna może przywrócić spontaniczne oddychanie u niektórych szczurów.
  8. Zgodnie z "metodą wiązania igły16], zwiąż CCA igłą strzykawkową o średnicy 0,5 mm za pomocą nylonowej nici 6-0 w odległości około 1,5 cm od rozwidlenia CCA, ICA i ECA. Ostrożnie wyciągnij igłę; ten drugi węzeł spowoduje następnie zwężenie tętnicy szyjnej (Rysunek 1, krok 8).
    UWAGA: Ligatura stosowana do zwężenia CCA musi być wykonana z materiału nylonowego, który jest stabilny. Nić nylonowa nie ma wpływu na krew i nie gęstnieje; w przeciwnym razie może spowodować skrajne zwężenie CCA u szczurów i zwiększyć śmiertelność.
  9. Po 30 minutach niedokrwienia rozwiąż pierwszy węzeł, a CCA przejdzie reperfuzję, ale drugi węzeł spowoduje zwężenie CCA, wywołując długotrwałą śpiączkę (Rysunek 1, krok 9). Zamknąć tkankę podskórną wchłanialnymi szwami monofilamentowymi, a skórę niewchłanialnymi szwami monofilamentowymi.

3. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Umieść szczury na podkładkach izolacyjnych i wstrzyknij 10 000 jednostek penicyliny, aby zapobiec infekcji. Podskórnie wstrzyknąć 0,2 mg/kg meloksykamu przez trzy kolejne dni, aby złagodzić ból pooperacyjny.
  2. Po 60 minutach reperfuzji upewnij się, że szczury stopniowo wracają do zdrowia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z powodu stanu zapalnego i innych stymulacji spowodowanych wszczepieniem elektrod, EEG może być niestabilne, więc szczury muszą dojść do siebie przez 3 dni. Szczury z prawidłowym EEG i EMG po 3 dniach mogą zostać włączone do przygotowania modelu śpiączki. Kiedy szczury zostały znieczulone, aktywność EEG i EMG była nieco stłumiona, ale przebiegała płynnie. Nie stwierdzono istotnych zmian w aktywności EEG i EMG po elektrokoagulacji blokującej obustronne VA. Po około 30 minutach lek został zmetabolizowany, szczury stopniowo odzyskiwały przytomność, a aktywność EEG i EMG wzrosła. Kiedy szczury wykazywały drganie kończyn, podczas gdy sygnały EEG i EMG były aktywne i nie były już w linii prostej, CCA zostało szybko podwiązane. W tym momencie wszystkie cztery naczynia krwionośne odpowiedzialne za dopływ krwi do mózgu zostały zablokowane, co spowodowało globalne niedokrwienie mózgu. Aktywność EEG i EMG została gwałtownie zahamowana, prawie tworząc linię prostą, a szczur już nie walczył, a gałki oczne wydawały się szare i białe (Ryc. 2A). Jeśli szczurów nie można wprowadzić w stan śpiączki, oznacza to, że model zawiódł.

Po 30 minutach, pierwsza nić ligacji CCA została zwolniona do reperfuzji, ale druga nić ligacji umieszczona przed CCA utrzymywała niski poziom perfuzji, wywołując ciągłą śpiączkę u szczurów przez około 60 minut. Wraz ze stopniową kompensacją i perfuzją krwi w organizmie, szczury stopniowo się budziły (Ryc. 2B). EEG i EMG szczurów prawie całkowicie wróciły do normy po przebudzeniu.

figure-results-1
Rysunek 1: Diagram położenia tętnicy kręgowej elektrokoagulacji. Kroki 1-3 przedstawiają protokół wszczepiania elektrod, a krok 4 sprawdza, czy elektrody działają prawidłowo. Kroki 5-6 szczegółowo opisują procedurę chirurgicznego nacięcia z przodu szyi i obustronnych tętnic kręgowych (VA) do elektrokoagulacji. Żółte strzałki i łuki wskazują kluczowe miejsca elektrokoagulacji. Nici jedwabne są używane do symulacji przejścia tętnicy kręgowej przez kręgosłup, zapewniając wyraźniejsze wskazanie charakterystycznego położenia tętnicy kręgowej poddanej elektrokoagulacji. Kroki 7-9 opisują protokoły podwiązania obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCA) w celu wywołania śpiączki. Wszystkie procedury są zgodne z wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Elektroencefalogram (EEG) i elektromiogram (EMG) zmieniają się ze śpiączki na powrót do zdrowia. (A) Przebieg EEG, EMG i poziomy aktywności u szczurów podczas śpiączki niedokrwiennej mózgu. (B) Diagram poziomów EEG, EMG i aktywności u szczurów przechodzących ze śpiączki do przebudzenia. Cały proces trwa około 90 minut. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Okluzja czterech naczyń indukuje globalne niedokrwienne i niedotlenione uszkodzenie mózgu, które może symulować ostrą śpiączkę, zatrzymanie akcji serca, uduszenie, wstrząs, ciężką arytmię i inne krytyczne stany kliniczne spowodowane niedokrwieniem mózgu w praktyce klinicznej. Tymczasem niedrożność czterech naczyń może prowadzić do uszkodzenia głównie w hipokampie17,18, który jest podstawowym funkcjonalnym obszarem mózgu odpowiedzialnym za pamięć poznawczą 19,20,21. Dlatego okluzja czterech naczyń może być również wykorzystana do symulacji modelu demencji naczyniowej22,23. Podsumowując, model globalnego niedokrwienia mózgu wywołanego okluzją czterech naczyń jest szeroko stosowany do symulacji wyżej wymienionych chorób klinicznych.

W 1979 roku Pulsinelli i wsp.10 osiągnęli globalne niedokrwienie mózgu i reperfuzję poprzez zablokowanie obustronnych tętnic szyjnych wspólnych i obustronnych tętnic kręgowych. Od tego czasu model ten stopniowo stał się uznaną na całym świecie klasyczną metodą przygotowania globalnych modeli niedokrwienia mózgu 24,25,26. Jednak ta metoda wiąże się z pewnymi problemami, takimi jak indywidualne różnice w wyrostku poprzecznym i otworze pierwszego kręgu szyjnego, w tym małe, nieregularne i zakrzywione otwory, co skutkuje niepełną elektrokoagulacją. Dodatkowo długotrwała elektrokoagulacja lub nadmierny prąd elektryczny mogą stwarzać ryzyko uszkodzenia pnia mózgu i rdzenia kręgowego. Niewystarczająca elektrokoagulacja tętnicy kręgowej może prowadzić do znacznego krwawienia i innych problemów 15,16,27.

W związku z tym uczeni nieustannie wprowadzają ulepszenia, aby zapewnić integralność elektrokoagulacji tętnicy kręgowej i zmniejszyć zmienność modelu28,29. Ze względu na niewidoczność elektrokoagulacji tętnicy kręgowej przez otwór kręgowy, Todd i wsp.30 całkowicie odsłonili tętnicę kręgową i spalili ją pod bezpośrednim widzeniem, wiercąc w otworze atlasu, zwiększając w ten sposób dokładność elektrokoagulacji. Jednak ta metoda chirurgiczna jest wysoce inwazyjna i może uszkodzić kręgosłup szyjny. Cienka ściana otworu skrzydłowego może łatwo uszkodzić tętnicę kręgową, powodując masywne krwawienie i powodując stosunkowo wysoką śmiertelność. Sugio i wsp.12 uwidocznili tętnicę kręgową i trwale ją przecięli, wprowadzając igłę elektryczną do lewego i prawego otworu międzykręgowego drugiego kręgu szyjnego. Toda i wsp.31 oraz Lu i wsp.27 odsłonili tętnicę kręgową między pierwszym a drugim wyrostkiem poprzecznym poza stawem atlasowym w oparciu o tę strukturę anatomiczną i przeprowadzili elektrokoagulację. Badacze ci rozwiązali problem niestabilności w elektrokoagulacji, gdy tętnica kręgowa nie była widoczna, odsłaniając ją za szyją i wykonując elektrokoagulację.

Jednak szczury poddawane operacji zarówno na brzuchu, jak i na plecach nadal miały zwiększone ryzyko infekcji, więc niektórzy uczeni próbowali operować z przodu szyi. Sun Wei i wsp.15 osiągnęli globalną reperfuzję niedokrwienno-reperfuzyjną mózgu poprzez oddzielenie tętnicy kręgowej od przedniej szyi, podwiązanie lub przecięcie małych tętnic oraz ciągłe lub przerywane przycinanie CCA. Ten krok wymaga skrupulatnej operacji, ponieważ tętnica kręgowa jest trudna do oddzielenia ze względu na jej subtelną naturę. Dodatkowo małe zaciski tętnicze są trudne do dokładnego zaciśnięcia tętnicy kręgowej. Jeśli separacja nie jest wystarczająco wyraźna i czysta, doprowadzi to do niepełnego zaciśnięcia lub podwiązania, co niewątpliwie zwiększa niestabilność modelu.

Badanie to zapewnia prostą i wykonalną metodę elektrokoagulacji tętnic kręgowych. Kluczowym krokiem nie jest oddzielenie tętnicy kręgowej, ale zlokalizowanie otworu poprzecznego, w którym tętnica kręgowa krzyżuje się i wchodzi do pierwszego kręgu szyjnego. Jest to wejście do tętnicy kręgowej, która ma zakrzywioną funkcję, dzięki czemu nowicjusze mogą ją szybko zlokalizować. Po wstępnym podgrzaniu wstrzykiwacza do elektrokoagulacji włóż go do pozycji zakrzywionej, aby szybko skoagulować tętnicę kręgową, trwając 3-5 sekund, aby zapewnić całkowitą okluzję. Zarówno elektrokoagulację tętnic kręgowych, jak i podwiązanie CCA wykonano w jednej operacji, co zmniejszyło ryzyko infekcji i czas trwania eksperymentu.

Stwierdziliśmy również, że śmierć zwierzęcia modelowego była spowodowana głównie zablokowaniem wszystkich czterech naczyń krwionośnych odpowiedzialnych za dopływ krwi do mózgu i nie była związana z liczbą operacji chirurgicznych. Jednak wykonanie wszystkich operacji w ramach jednej operacji rzeczywiście skróciło okres eksperymentalny. Dodatkowo, zmodyfikowana metoda może być również wykorzystana do przygotowania globalnego modelu niedokrwienia mózgu-reperfuzji. Model śpiączki niedokrwiennej mózgu wywołanej okluzją czterech naczyń może również symulować model "zespołu zamkniętego" w tradycyjnej medycynie chińskiej32. W związku z tym model przedstawiony w tym badaniu może również stanowić odniesienie dla praktyków tradycyjnej medycyny chińskiej.

W dotychczasowej literaturze 16,33,34 podwiązanie zwężenia CCA wykonywano 30 min po niedokrwieniu. Jednak po 30 minutach niedokrwienia niektóre szczury wykazywały lekką przytomność z powodu kompensacji. Stymulacja mechaniczna może spowodować, że szczury te się obudzą, co doprowadzi do awarii modelu śpiączki. Dlatego w naszym badaniu leczenie zwężenia CCA przeprowadzono natychmiast po wystąpieniu śpiączki. W tym czasie głębokość komy była ogromna, co utrudniało stymulowanie szczurów do przebudzenia, zapewniając stabilność modelu. CCA było w stanie zaciśniętym podczas tego leczenia, a leczenie zwężenia nie wpływało na przepływ krwi.

Dodatkowo w nacięciu szyi szczurów zaobserwowano, że tętnice kręgowe w trzech odstępach kręgosłupa mogą zostać zablokowane przez elektrokoagulację lub podwiązanie. Istnieje jednak charakterystyczny objaw wejścia tętnicy kręgowej w pierwszym kręgosłupie, dzięki czemu doskonale nadaje się do blokady elektrokoagulacji. Ze względu na brak charakterystycznych markerów między drugim a trzecim kręgiem, a także między trzecim a czwartym kręgiem, bardziej odpowiednie jest podwiązanie szwów. Wadą jest jednak niewystarczające podwiązanie. Dlatego w tym badaniu wybrano elektrokoagulację, aby odciąć tętnicę kręgową między pierwszym a drugim kręgiem.

Dodatkowo należy zauważyć, że sukces tego modelu jest ściśle związany z wagą szczurów. Doniesiono, że szczury o wadze od 180 do 200 g są bardziej odpowiednie do wywoływania śpiączki. W tym badaniu stwierdzono również, że szczury ważące mniej niż 180 g z trudem wytrzymują uszkodzenia czterech naczyń krwionośnych jednocześnie, co prowadzi do wysokiej śmiertelności. I odwrotnie, jeśli waga jest większa niż 220 g, szczur obudzi się szybko i nie pozostanie w śpiączce wystarczająco długo, aby spełnić normę modelu.

Co więcej, średnica otworu służącego do zwężania CCA jest kolejnym czynnikiem wpływającym na czas trwania śpiączki u szczurów. Badania wykazały, że średnica otworu wynosząca 0,6 mm może wywołać ciągłą śpiączkę u szczurów przez 6-8 godzin z wysokim wskaźnikiem przeżycia. Średnica otworu wynosząca 0,45 mm powodowała skrajne zwężenie tętnicy u szczurów, prowadząc do niemożności powrotu do zdrowia poważnie rannych szczurów, podczas gdy średnica 0,7 mm powodowała śpiączkę trwającą 1-3 godziny, ale ze znacznymi różnicami indywidualnymi16.

Jednak we wstępnym eksperymencie średnica otworka 0,6 mm nie mogła wywołać komy na dłużej niż 60 minut, podczas gdy średnica 0,5 mm mogła wywołać komę na 1-2 godziny. Różni się to od badania przeprowadzonego przez Xiaobing Jia i wsp., co może wynikać z różnic w metodach znieczulania i modelowania. W przyszłości potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić te różnice.

Podsumowując, badanie to przedstawia prostą, wykonalną i przyjazną dla początkujących metodę okluzji czterech naczyń. Służy jako cenne odniesienie dla praktyków zajmujących się śpiączką niedokrwienną mózgu lub globalnym niedokrwieniem mózgu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82173781 i 82373835), projekt badawczy podoktorancki (BKS212055), Projekt Innowacji Naukowych i Technologicznych Biura Nauki i Technologii Foshan (2320001007331), Fundację Podstawowych i Stosowanych Badań Podstawowych Guangdong (2019A1515010806), Kluczowe Projekty Terenowe (Inteligentna Produkcja) Ogólnych Uniwersytetów w Prowincji Guangdong (2020ZDZX2057) oraz Projekty Naukowo-Badawcze (Charakterystyczna innowacja) uniwersytetów ogólnych w prowincji Guangdong (2019KTSCX195).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16-kanałowa matryca fotoelektrod z mikrofibryJiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd2605
4-0 Szew chirurgicznyNantong Holycon Medical Devices Co., Ltd.B-104
6-0 Szew chirurgicznyNingbo MEDICAL Needle Co., Ltd.JM1216-742417
Elektroda EEGKedou Brain machine Technology Co., LTDKD-EEGEMG
Pióro do elektrokoagulacjiCONPUVON Company465
Lunion Stage Automatyczny system etapowania snuShanghai Lulian Intelligent Technology Co., Ltd.1336
Miniaturowa ręczna wiertarka do czaszkiRayward Life Technology Co., Ltd87001
Penicylina sodowaChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.17121709-2
SD szczurySPF ( Pekin ) Biotechnology Co., Ltd.180-220g
Gwóźdź czaszkiGLOBALEBIO,LTD/
Instrument stereotaktycznyRayward Life Technology Co., Ltd68801
Zoletil 50Vic Trading (Shanghai) Co., LTDBN 88SHA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).">Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  2. A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion. J Vis Exp. (207), e67060(2024).">Rong, M., et al. A modified model preparation for middle cerebral artery occlusion reperfusion. J Vis Exp. (207), e67060(2024).
  3. Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies. Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).">Hoesch, R. E., Koenig, M. A., Geocadin, R. G. Coma after global ischemic brain injury: Pathophysiology and emerging therapies. Crit Care Clin. 24 (1), 25-44 (2008).
  4. Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury. Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).">You, W., et al. Amplitude-integrated electroencephalography predicts outcome in patients with coma after acute brain injury. Neurosc Bull. 34 (4), 639-646 (2018).
  5. The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails. Medicine (United States). 95 (37), e4729(2016).">He, F., Jiang, Y., Li, L. The effect of naloxone treatment on opioidinduced side effects A meta-analysis of randomized and controlled trails. Medicine (United States). 95 (37), e4729(2016).
  6. Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine. Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).">Shukla, D. Description of coma and coma arousal therapy in Caraka Sahitā and its corollary in modern medicine. Neurol India. 65 (2), 250-252 (2017).
  7. Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery. Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).">Cossu, G. Therapeutic options to enhance coma arousal after traumatic brain injury: State of the art of current treatments to improve coma recovery. Brit J Neurosurg. 28 (2), 187-198 (2014).
  8. Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature. Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).">Li, J., Cheng, Q., Liu, F. K., Huang, Z., Feng, S. S. Sensory stimulation to improve arousal in comatose patients after traumatic brain injury: a systematic review of the literature. Neurol Sci. 41 (9), 2367-2376 (2020).
  9. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model. Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).">Pulsinelli, W. A., Levy, D. E., Duffy, T. E. Cerebral blood flow in the four-vessel occlusion rat model. Stroke. 14 (5), 832-834 (1983).
  10. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).">Pulsinelli, W. A., Brierley, J. B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 10 (3), 267-272 (1979).
  11. Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure. J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).">Plaschke, K., et al. Pronounced arterial collateralization was induced after permanent rat cerebral four-vessel occlusion. Relation to neuropathology and capillary ultrastructure. J Neural Transm. 110 (7), 719-732 (2003).
  12. Stroke. 19 (7), 922(1988).">Sugio, K., Horigome, N., Sakaguchi, T., Goto, M. A model of bilateral hemispheric ischemia- modified four-vessel occlusion in rats: To the editor. Stroke. 19 (7), 922(1988).
  13. Global cerebral ischemia in rats leads to amnesia due to selective neuronal death followed by astroglial scar formation in the CA1 layer. Neurobiol Learn Mem. 141, 168-178 (2017).">Sadelli, K., et al. Global cerebral ischemia in rats leads to amnesia due to selective neuronal death followed by astroglial scar formation in the CA1 layer. Neurobiol Learn Mem. 141, 168-178 (2017).
  14. 1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174(2015).">Song, B. W., et al. 1H-pyrrole-2,5-dione-based small molecule-induced generation of mesenchymal stem cell-derived functional endothelial cells that facilitate rapid endothelialization after vascular injury. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 174(2015).
  15. A modified four vessel occlusion model of global cerebral ischemia in rats. J Neurosci Methods. 352, 109090(2021).">Sun, W., et al. A modified four vessel occlusion model of global cerebral ischemia in rats. J Neurosci Methods. 352, 109090(2021).
  16. Modifying the four vessel occlusion to establish ischemic brain injury coma model in rats. Sichuan Med J. 29 (4), 384-386 (2008).">Xiaobing, J., et al. Modifying the four vessel occlusion to establish ischemic brain injury coma model in rats. Sichuan Med J. 29 (4), 384-386 (2008).
  17. Levodopa improves cognitive function and the deficits of structural synaptic plasticity in hippocampus induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Front Neurosci. 14, 586321(2020).">Wang, W., et al. Levodopa improves cognitive function and the deficits of structural synaptic plasticity in hippocampus induced by global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats. Front Neurosci. 14, 586321(2020).
  18. Inhibition of MLKL-dependent necroptosis via downregulating interleukin-1R1 contributes to neuroprotection of hypoxic preconditioning in transient global cerebral ischemic rats. J Neuroinflammation. 18 (1), 97(2021).">Zhan, L., Lu, X., Xu, W., Sun, W., Xu, E. Inhibition of MLKL-dependent necroptosis via downregulating interleukin-1R1 contributes to neuroprotection of hypoxic preconditioning in transient global cerebral ischemic rats. J Neuroinflammation. 18 (1), 97(2021).
  19. Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries. Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).">Konaka, K., Miyashita, K., Ishibashi-Ueda, H., Naritomi, H. Severe hyperthermia caused by four-vessel occlusion of main cerebral arteries. Internal Med. 48 (24), 2137-2140 (2009).
  20. Middle-aged, but not young, rats develop cognitive impairment and cortical neurodegeneration following the four-vessel occlusion/internal carotid artery model of chronic cerebral hypoperfusion. Eur J Neurosci. 34 (7), 1131-1140 (2011).">Ferreira, E. D. F., Romanini, C. V., Mori, M. A., de Oliveira, R. M. W., Milani, H. Middle-aged, but not young, rats develop cognitive impairment and cortical neurodegeneration following the four-vessel occlusion/internal carotid artery model of chronic cerebral hypoperfusion. Eur J Neurosci. 34 (7), 1131-1140 (2011).
  21. Protective effects of extract of Coeloglossum viride var. bracteatum on ischemia-induced neuronal death and cognitive impairment in rats. Behav Pharmacol. 19 (4), 325-333 (2008).">Ma, B., et al. Protective effects of extract of Coeloglossum viride var. bracteatum on ischemia-induced neuronal death and cognitive impairment in rats. Behav Pharmacol. 19 (4), 325-333 (2008).
  22. A review of animal models of vascular dementia. Chin J Comp Med. 33 (12), 75-85 (2023).">Song, Y. Y., Chen, Y. H., Li, J. F., Sun, W. A review of animal models of vascular dementia. Chin J Comp Med. 33 (12), 75-85 (2023).
  23. Autophagy activation aggravates neuronal injury in the hippocampus of vascular dementia rats. Neural Regen Res. 9 (13), 1288-1296 (2014).">Liu, B., et al. Autophagy activation aggravates neuronal injury in the hippocampus of vascular dementia rats. Neural Regen Res. 9 (13), 1288-1296 (2014).
  24. Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex. J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).">Li, J., Takeda, Y., Hirakawa, M. Threshold of ischemic depolarization for neuronal injury following four-vessel occlusion in the rat cortex. J Neurosurg Anesthesiol. 12 (3), 247-254 (2000).
  25. Ameliorative potential of thymoquinone in four vessel occlusion induced vascular dementia in rats. Alzheimer Dement. 19 (S13), e71053(2023).">Rishitha, N., Muthuraman, A. Ameliorative potential of thymoquinone in four vessel occlusion induced vascular dementia in rats. Alzheimer Dement. 19 (S13), e71053(2023).
  26. The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats. Life Sci. 154, 79-86 (2016).">Oruc, S., et al. The antioxidant and antiapoptotic effects of crocin pretreatment on global cerebral ischemia reperfusion injury induced by four vessels occlusion in rats. Life Sci. 154, 79-86 (2016).
  27. A modified method to reduce variable outcomes in a rat model of four-vessel arterial occlusion. Neurol Res. 38 (12), 1102-1110 (2016).">Lu, D., et al. A modified method to reduce variable outcomes in a rat model of four-vessel arterial occlusion. Neurol Res. 38 (12), 1102-1110 (2016).
  28. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats. Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).">Idt-Kastner, R. S., Paschen, W., Ophoff, B. G., Hossmann, K. A. A modified four-vessel occlusion model for inducing incomplete forebrain ischemia in rats. Stroke. 20 (7), 938-946 (1989).
  29. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).">McBean, D. E., Kelly, P. A. T. Rodent models of global cerebral ischemia: A comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol. 30 (4), 431-434 (1998).
  30. Reperfusion after cerebral ischemia: Influence of duration of ischemia. Stroke. 17 (3), 460-466 (1986).">Todd, N. V., Picozzi, P., Alan Crockard, H., Russell, A. R. R. Reperfusion after cerebral ischemia: Influence of duration of ischemia. Stroke. 17 (3), 460-466 (1986).
  31. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia - Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature. Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).">Toda, S., et al. Highly reproducible rat model of reversible forebrain ischemia - Modified four-vessel occlusion model and its metabolic feature. Acta Neurochir (Wien). 144 (12), 1297-1304 (2002).
  32. Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol. Biomed Pharmacother. 164, 114668(2023).">Ma, R., Lu, D., Wang, J., Xie, Q., Guo, J. Comparison of pharmacological activity and safety of different stereochemical configurations of borneol: L-borneol, D-borneol, and synthetic borneol. Biomed Pharmacother. 164, 114668(2023).
  33. Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats. Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).">Ji, X. Y., et al. Potential targets for protecting against hippocampal cell apoptosis after transient cerebral ischemia-reperfusion injury in aged rats. Neural Regen Res. 9 (11), 1122-1128 (2014).
  34. Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia. Int J Mol Sci. 22 (19), 10327(2021).">Martínez-Alonso, E., et al. Differential association of 4E-BP2-interacting proteins is related to selective delayed neuronal death after ischemia. Int J Mol Sci. 22 (19), 10327(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zaci cie t tnicy kr gowejpodwi zanie t tnicy szyjnejtechnika elektrokauteryzacjimonitorowanie EEGmodel szczuraglobalne niedokrwienie m zgupowr t funkcji neurologicznych

Powiązane artykuły