Artykuł metodologiczny

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

DOI:

10.3791/67163

⸱

9 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne techniki obrazowania na żywo są kluczowe do oceny morfologii neuronów w celu zmierzenia wzrostu neurytów w czasie rzeczywistym. Prawidłowy pomiar wzrostu neurytów od lat stanowi wyzwanie w dziedzinie badań neurobiologicznych. Parametr ten służy jako kamień węgielny w wielu konfiguracjach eksperymentalnych in vitro, począwszy od kultur zdysocjowanych i kultur organotypowych, a skończywszy na liniach komórkowych. Określając ilościowo długość neurytów, można określić, czy określone leczenie zadziałało, czy też regeneracja aksonów jest wzmocniona w różnych grupach eksperymentalnych. Celem tego badania jest wykazanie solidności i dokładności oprogramowania do analizy wzrostu neurytów Incucyte Neurotrack. To półautomatyczne oprogramowanie jest dostępne w systemie mikroskopii poklatkowej, który oferuje kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi metodologiami w zakresie ilościowego określania długości neurytów w obrazach z kontrastem fazowym. Algorytm maskuje i określa ilościowo kilka parametrów na każdym obrazie i zwraca metryki komórek neuronalnych, w tym długość neurytów, punkty rozgałęzień, klastry komórka-ciało i obszary klastrów komórka-ciało. Po pierwsze, sprawdziliśmy solidność i dokładność oprogramowania, korelując jego wartości z wartościami manualnej wtyczki NeuronJ, która została zainstalowana na Fidżi. Po drugie, zastosowaliśmy algorytm, który jest w stanie pracować zarówno na obrazach z kontrastem fazowym, jak i na obrazach immunocytochemicznych. Korzystając z określonych markerów neuronalnych, zweryfikowaliśmy wykonalność analizy wzrostu neurytów opartej na fluorescencji na neuronach czuciowych w kulturach in vitro. Dodatkowo oprogramowanie to może mierzyć długość neurytów w różnych warunkach wysiewu, od pojedynczych komórek po złożone sieci neuronowe. Podsumowując, oprogramowanie stanowi innowacyjną i efektywną czasowo platformę do oznaczania wzrostu neurytów, torując drogę do szybszych i bardziej wiarygodnych pomiarów ilościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W nerwach kulszowych można zmierzyć regenerację aksonów1. Ponadto badania in vitro wykazały możliwość monitorowania wyrostka aksonalnego2,3 w celu zrozumienia jego różnych faz, od kiełkowania aksonów po zwyrodnienie aksonów, zarówno w zdrowych, jak i uszkodzonych neuronach. Śledząc te procesy, można mierzyć takie parametry, jak polaryzacja aksonów, inicjacja, stabilność i rozgałęzienie. Ostatni parametr jest kluczowy dla zrozumienia percepcji bólu neuropatycznego4,5,6. Podobnie, zwyrodnienie aksonów może być monitorowane in vivo7 lub in vitro8,9. Podczas rozrostu neurytów sieci cytoszkieletu aktyny i mikrotubul stabilizują się lub zmieniają zgodnie z potrzebami komórki10. Cytoszkielet aktynowy reorganizuje się, aby umożliwić tworzenie aksonalnego stożka wzrostu, a mikrotubule ponownie ustawiają się w wiązki, aby ustabilizować rosnący neurite11. W celu zbadania wzrostu neurytów neuronów centralnych i obwodowych in vitro określa się ilościowo trzy wspólne parametry: całkowitą długość aksonów, maksymalną odległość i punkty rozgałęzień. Parametry te są wykorzystywane do badania odpowiedzi neuronalnej na leczenie (tj. neurotrofiny, związki, inhibitory, kwas retinowy, siRNA, shRNA) lub u zwierząt modyfikowanych genetycznie12,13,14. Aby ocenić, czy neurony mają bardziej wydłużone neuryty i/lub więcej rozgałęzień, te trzy parametry pozwalają nam ocenić morfologię neuronu. Pomiar długości neurytów jest parametrem o największym zainteresowaniu w kilku konfiguracjach eksperymentalnych in vitro. Ze zwojów korzenia grzbietowego wykonuje się głównie dwa rodzaje hodowli: zdysocjowaną hodowlę in vitro lub organotypową hodowlę całych eksplantatów DRG. W obu przypadkach długość neurytów jest złotym parametrem do oceny wyniku eksperymentu. W linii komórkowej podobnej do neuronu ruchowego (NSC-34) wzrost i rozgałęzienie aksonów są mierzone po różnicowaniu indukowanym przez kwas retinowy15,16. W rzeczywistości, mierząc przerost neurytów, można określić, czy określone leczenie zadziałało17, tempo wzrostu18, czy zdolność regeneracji po zabiegu urazu19.

Jak prawidłowo ocenić wzrost neurytów, na przestrzeni lat postawiło przed nami wiele wyzwań w dziedzinie badań. Nie ma jednak standaryzacji pomiarów długości neurytów. Niektóre z najczęściej stosowanych metod hodowli komórkowych in vitro to na przykład ręczna wtyczka NeuronJ na Fiji18,20 lub MetaMorph21,23 i półautomatyczna Neurolucida23,24. Oprócz metodologii manualnych istnieją również metody automatyczne, takie jak wtyczka NeuriteTracer na Fiji25, oprogramowanie HCA Vision26,27 lub WIS-NeuroMath2,28. Inne, mniej dokładne metodologie opierają się na pomiarze całkowitego wymiaru neuronów. Metody te obejmują pomiar odległości wektora od ciała komórki do wierzchołka najdłuższego aksonu29 lub analizę Sholla30. Jednak te metody pomiaru są odpowiednie dla kultur o bardzo niskiej gęstości lub pojedynczych neuronów. Co więcej, wszystkie te metodologie są stosowane głównie na barwionych neuronach lub neuronach, które wyrażają genetycznie kodowane fluorofory (tj. GFP, Venus, mCherry). Rodzaj neuronu i gęstość hodowli komórkowej mają duży wpływ na wybór metodologii pomiaru. Na przykład ręczna segmentacja neuronów o bardzo zawiłych i skomplikowanych morfologiach, takich jak neurony DRG, może łatwo stać się zadaniem niemożliwym. O ile splątane neurony są już wyzwaniem do segmentacji, o tyle sieci neuronowe są całkowicie poza zasięgiem metod manualnych ze względu na ich bardzo złożoną organizację.

Z jednej strony, ręczna segmentacja jest bardzo precyzyjna, ponieważ jest wykonywana przez ludzkie oko i inteligencję; z drugiej strony, jest naprawdę czasochłonna. Główną wadą jest zwiększony nakład czasu wymagany metodami ręcznymi. Z tego powodu tylko kilka neuronów jest pozyskiwanych do analizy, co czyni ją mniej dokładną i kosztowną pod względem czasu. Z drugiej strony podejścia automatyczne lub półautomatyczne częściowo zmniejszają nakład czasu. Mają jednak również pewne wady. Metody automatyczne muszą zostać przeszkolone, aby działały poprawnie, a jeśli oprogramowanie nie jest wystarczająco interaktywne z użytkownikiem, segmentacja może być błędna.

Oprócz pomiaru rozrostu neurytów, liczba punktów rozgałęzień jest również cenną informacją. Przy ręcznej segmentacji można obliczyć liczbę punktów rozgałęzienia, podczas gdy nie jest to możliwe w przypadku odległości wektorowej. W przypadku metod automatycznych zwykle podaje się liczbę punktów rozgałęzienia, podczas gdy w przypadku analizy Sholla należy ją obliczyć za pomocą wzoru matematycznego.

W tym artykule metodycznym staramy się opisać funkcjonalność i skuteczność tego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru całkowitej długości aksonów i innych parametrów. Maszyna pozwala na automatyczną akwizycję obrazów w zdefiniowanych punktach czasowych lub na prowadzenie długotrwałych badań (dni, tygodnie, miesiące), z zachowaniem fizjologicznego środowiska dla żywych komórek. Pomiar wzrostu neurytów za pomocą obrazowania poklatkowego z kontrastem fazowym ma tę zaletę, że umożliwia ciągłe monitorowanie kinetyki i wzrostu neurytów. Dodatkowo możliwe jest również monitorowanie śmierci komórki poprzez dodanie do pożywki określonych barwników, które celują w martwe komórki31,32,33. Chociaż oprogramowanie zostało wydane w 2012 roku, jesteśmy pierwszymi, którzy ustandaryzowali tę metodologię w powtarzalny i bezstronny sposób w celu dokładnej kwantyfikacji wzrostu neurytów. Należy jednak pamiętać, że oprogramowanie nie jest dołączone do zakupu maszyny. Pomimo tych dodatkowych kosztów, jego zastosowanie oferuje znaczące korzyści w pomiarze całkowitej długości aksonów i innych parametrów, przyczyniając się tym samym do badań w dziedzinie neuronauki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Skanowanie naczynia na maszynie

UWAGA: Wykrywanie odbywa się za pomocą wbudowanej kamery Basler Ace 1920-155 μm.

  1. Otwórz program, klikając Połącz z urządzeniem i wybierając Harmonogram - Do pobrania. Następnie kliknij znak +.
  2. Określ, czy statek będzie skanowany wielokrotnie, czy tylko 1 raz, wybierając odpowiednio opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem lub Skanuj raz teraz.
  3. Wybierz opcję Nowy, aby utworzyć zupełnie nowe naczynie do skanowania. Jeśli nowy statek nie zostanie dodany, utwórz nowy skan, korzystając z jednej z opcji opisanych poniżej.
    1. Wybierz opcję Kopiuj bieżący, aby utworzyć nowy statek, kopiując statek z bieżącego harmonogramu. Wybierz opcję Kopiuj poprzednio, aby utworzyć nowe naczynie, kopiując poprzednio zeskanowane naczynie.
    2. Wybierz opcję Dodaj skanowanie, aby przywrócić poprzednio zeskanowane naczynie w celu uzyskania dodatkowych skanów.
  4. Wybierz typ skanowania w zależności od testu i aplikacji. Na potrzeby analizy wybierz opcję Standardowa.
  5. Określ ustawienia skanowania. Wybierz jedną z opcji Komórka po komórce, Brak, Przylegająca komórka po komórce lub Nieprzylegająca komórka po komórce, i określ kanały obrazu w zależności od użytych cząsteczek fluorescencyjnych. Wybierz opcję Brak dla hodowli dorosłych i embrionalnych neuronów czuciowych. W przypadku linii komórkowych wybierz opcję Brak lub Przylegająca komórka po komórce.
  6. Wybierz obiektyw mikroskopu (4x, 10x, 20x). Nabywaj przy większym powiększeniu (20x) w hodowlach pierwotnych, podczas gdy w liniach komórkowych wystarczy 10x.
  7. Wybierz typ naczynia do skanowania z dostępnych opcji. Wskaż położenie naczynia w szufladzie, wybierając jego położenie na wirtualnej mapie szuflady.
  8. Określ wzorzec skanowania dla akwizycji obrazu, wybierając dołki do skanowania. Wybierz żądaną liczbę obrazów na dołek. Pojawi się szacunkowy czas trwania skanowania.
  9. Podaj informacje o statku, wpisując nazwę i określ tablicę rejestracyjną, klikając znak +.
  10. Kliknij Dalej. Wybierz Typ analizy i kliknij przycisk Dalej. Pojawi się ekran podsumowania wybranych opcji. Jeśli to prawda, kliknij Skanuj teraz, a skanowanie się rozpocznie.

2. Konfiguracja do analizy obrazu z kontrastem fazowym

UWAGA: Analiza Neurotrack może być wykonywana tylko na obrazach wcześniej pozyskanych przez maszynę.

  1. Wybierz zeskanowane naczynie do analizy. Wybierz pozycję Launch Analysis (Uruchom analizę). Wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy.
  2. Wybierz Neurotrack. Wybierz opcję Image Channels (Kanały obrazów). Wybierz reprezentatywny zestaw obrazów, na których chcesz przeprowadzić analizę. Wybierz wszystkie obrazy dla każdej studzienki, aby wytrenować algorytm.
  3. Uściślij ustawienia definicji analizy, dostosowując następujące parametry.
    UWAGA: Domyślnie neuryty są podzielone na segmenty w kolorze karmazynowym, podczas gdy ciała komórek są w kolorze żółtym. Możliwa jest dowolna modyfikacja kolorów.
    1. W przypadku segmentacji klastrów komórka-ciało dostosuj następujące elementy, jak opisano poniżej.
      1. Tryb segmentacji: Segmentacja obrazów odbywa się w celu odróżnienia ciał komórek od tła i neurytów. Wybierz pomiędzy Jasnością a Teksturą. W przypadku kultur podstawowych i linii komórkowych wybierz tryb jasności.
      2. Regulacja segmentacji: Użyj suwaka, aby dostosować czułość segmentacji w kierunku większej ilości tła lub większej liczby komórek. Mieści się w zakresie od 0 (tło) do 2 (komórki). Zwiększa lub zmniejsza rozmiar żółtej maski. Przesuń suwak w kierunku 0 (Tło), aby rozmiar żółtej maski stopniowo się zmniejszał, pozostawiając miejsce na maskę magenta. Odwrotna sytuacja ma miejsce, gdy suwak zostanie przesunięty w kierunku 2 (Komórki).
    2. W celu oczyszczenia dostosuj następujące czynności zgodnie z poniższym opisem.
      1. Wypełnienie otworu (μm2): Dostosuj to, aby usunąć wszelkie otwory w masce ciała komórki mniejsze niż obszar określony przez użytkownika.
      2. Dostosuj rozmiar (piksele): Zwiększ (jeśli jest dodatnia) lub zmniejszona (jeśli jest ujemna) żółtą maskę o określoną liczbę pikseli. Waha się od -10 do +10. Dostosuj to, aby dodać lub usunąć żółtą segmentację na obiektach o wysokim kontraście, takich jak martwe komórki i szczątki komórkowe.
      3. Minimalna szerokość komórki (μm): Wybierz wartość, aby określić rozmiar, przy którym ciała komórek będą uważane za neuryty.
    3. W przypadku filtrów klastrów ciała komórki dostosuj następujące elementy zgodnie z poniższym opisem.
      1. Obszar (μm2): Ustaw minimalną i maksymalną wartość obszaru ciała komórki. Wartości powyżej i poniżej ustawionych wartości nie będą traktowane jako obiekty komórek.
    4. W przypadku parametrów neurytów dostosuj następujące elementy, jak opisano poniżej.
      1. Filtrowanie: Zmniejsza maskowanie drobnych niedoskonałości naczyń i zanieczyszczeń. Wybierz jedną z opcji Brak, Lepsza i Lepsza. Wybierz Brak tylko dla bardzo czystych kultur i naczyń. Wybierz opcję Lepsza, aby uzyskać szybsze przetwarzanie kosztem utraty wykrywania bardzo drobnych neurytów. Może to być wystarczające dla komórek z grubymi lub wysoce kontrastowymi neurytami; Może być również przydatny w przypadku naczyń z wieloma niedoskonałościami lub zanieczyszczeniami. Wybierz opcję Najlepszy dla dłuższego czasu przetwarzania, ale jest to najbardziej czułe ustawienie filtra, aby zapewnić wykrywanie bardzo drobnych neurytów.
      2. Czułość neurytu: Służy do regulacji czułości wykrywania. Zwiększ czułość wykrywania drobniejszych neurytów. Waha się od 0,25 (mniej) do 0,75 (więcej).
        UWAGA: Zwiększa lub zmniejsza czułość oprogramowania na rozpoznawanie neurytów. Jeśli suwak zostanie przesunięty w kierunku 0,25 (mniej), oprogramowanie będzie bardziej rygorystyczne w rozpoznawaniu neurytów. Zamiast tego, jeśli suwak zostanie przesunięty w kierunku 0,75 (więcej), oprogramowanie będzie mniej rygorystyczne w tym wykrywaniu, a zatem więcej niedoskonałości (tj. Szczątki komórek, brud) zostanie uznanych za neuryty.
      3. Szerokość neurytu (μm): Użyj go, aby dostroić detekcję do rozmiaru neuronów. Może to być 1, 2 lub 4. Zwiększając go, cieńsze neuryty nie będą brane pod uwagę. Ustaw wartość 1 dla pierwotnych hodowli dorosłych neuronów czuciowych i 2 dla linii komórkowych i embrionalnych kultur neuronów czuciowych.
  4. Kliknij opcję Podgląd bieżący, aby wyświetlić obraz podzielony na segmenty. Dla każdego obrazu zostaną podane następujące pomiary: długość neurytu (mm/mm2), punkty rozgałęzień neurytów (na mm2), klastry komórka-ciało (na mm2) i obszar klastra komórka-ciało (mm2 / mm2).
  5. Powtórz kroki 2.3 i 2.4 dla wszystkich wybranych obrazów. Kliknij Dalej.
  6. Wybierz Czas skanowania i dobrze do analizy. Przypisz nazwę definicji i, w razie potrzeby, uwagi do analizy. Kliknij przycisk Dalej> zakończ.

3. Konfiguracja do analizy obrazu immunocytochemii (ICC)

  1. Wykonaj te same kroki, które zostały zilustrowane od 2.1 do 2.4. Wybierz kanały obrazu dla neurytów i jąder. Wybierz zestaw obrazów; wybierz Wszystkie obrazy dla każdej studni, aby wytrenować algorytm.
  2. Uściślij ustawienia definicji analizy, dostosowując następujące parametry zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Domyślnie neuryty są podzielone na segmenty na niebiesko, podczas gdy ciała komórek są fioletowe. Kolory można jednak dowolnie modyfikować.
    1. Segmentacja klastrów komórka-ciało: Użyj tej opcji, aby podzielić obraz na interesujące obiekty. Oszacuj jasność tła w każdym pikselu obrazu. Po znalezieniu tła wykonaj jedną z następujących opcji.
      1. Brak odejmowania tła: Użyj tej opcji, aby podzielić na segmenty bez zmieniania oryginalnego obrazu. Wybierz opcję Próg adaptacyjny lub Stały. Adaptacyjne: tło służy do znajdowania obiektów, ale nie jest jawnie odejmowane; Dzięki tej opcji możliwe jest ustawienie korekty progu (GCU). Stały próg: obiekty, które są jaśniejsze niż ten próg, są wykrywane na oryginalnym obrazie; dzięki tej opcji możliwe jest ustawienie progu (GCU).
      2. Odejmowanie tła: Użyj tej opcji, aby odjąć tło od obrazu za pomocą transformacji Top-Hat, a następnie zastosować do niego próg. Za pomocą tej opcji ustaw Promień i Próg. Promień: używany jest dysk o tym promieniu; Dysk powinien być na tyle duży, aby nie mieścił się całkowicie w żadnym obiekcie na obrazie. Próg: obiekty, które są jaśniejsze niż ten próg, są wykrywane na obrazie odejmowanym od tła.
    2. Oczyszczanie: Użyj następującej opcji, aby to zrobić.
      1. Wypełnienie otworu (μm2): Użyj tego, aby usunąć wszelkie otwory w masce ciała komórki, które są mniejsze niż określony obszar.
      2. Dostosuj rozmiar (piksele): Użyj tej opcji, aby zwiększyć (jeśli jest dodatnia) lub zmniejszyć (jeśli jest ujemna) fioletową maskę o określoną liczbę pikseli. Zakres wynosi od -10 do +10. Dodaje lub usuwa kolor fioletowy na obiektach o wysokim kontraście, takich jak martwe komórki i szczątki komórkowe.
      3. Minimalna szerokość komórki (μm): Użyj tego, aby określić rozmiar, przy którym ciała komórek będą uważane za neuryty.
    3. Filtry klastrów komórka-treść: Użyj następującej opcji, aby zastosować filtry.
      1. Obszar (μm2): Ustaw minimalną i maksymalną wartość obszaru ciała komórki. Wartości powyżej i poniżej ustawionych wartości nie będą traktowane jako obiekty komórek.
    4. Parametry neurytu: Użyj następującej opcji, aby je ustawić.
      1. Czułość zgrubna neurytu: Użyj tego, aby dostosować jasność neurytu. Czułość powinna być zwiększona, jeśli intensywność fluorescencji neurytów jest niska. Waha się od 0 (mniej) do 10 (więcej). Zwiększa lub zmniejsza czułość oprogramowania na rozpoznawanie mniej jasnych neurytów. Optymalne wartości mieszczą się w zakresie od 7 do 10; Zauważ, że jeśli jest ustawiony na 10, jest bardzo prawdopodobne, że w pomiarze neurytów zostanie uwzględnione również tło.
      2. Czułość Neurite fine: Użyj tego, aby dostosować czułość wykrywania. Należy zwiększyć czułość, aby wykryć drobniejsze neuryty. Waha się od 0,25 (mniej) do 0,75 (więcej). Zwiększa lub zmniejsza czułość oprogramowania do rozpoznawania drobnych i mniej jasnych neurytów. Jeśli suwak zostanie przesunięty w kierunku 0,25 (mniej), oprogramowanie nie uwzględni słabych neurytów. Zamiast tego, jeśli suwak zostanie przesunięty w kierunku 0,75 (więcej), oprogramowanie wykryje również bardzo słabe (prawie tło) neuryty.
      3. Szerokość neurytu (μm): Użyj tego, aby dostroić detekcję do rozmiaru neuronów. Może to być 1, 2 lub 4. Zwiększając go, cieńsze neuryty nie będą brane pod uwagę. Ustaw go na 1 dla pierwotnych hodowli dorosłych neuronów czuciowych, na 2 dla linii komórkowych i embrionalnych neuronów czuciowych.

4. Eksport danych

  1. Otwórz analizę. Kliknij Metryki wykresu.
  2. Wybierz metrykę, punkty czasowe i studnie, które Cię interesują.
  3. Wybierz opcję grupowania między kolumnami, Brak, Kolumny, wiersze i Replikaty mapy tablic
    4. .
  4. Kliknij Eksportuj dane i wybierz folder docelowy oraz, jeśli to konieczne, inne opcje. Zostanie utworzony plik .txt.
    UWAGA: Maszyna poda pojedynczą średnią wartość wybranej metryki dla każdego dołka. Podczas analizy wymagana jest ręczna adnotacja w celu pobrania pojedynczych wartości obrazu.

5. Eksport obrazu

  1. Otwórz naczynie. Kliknij Eksportuj obrazy i filmy.
  2. Wybierz typ eksportu obrazów.
    1. Wybierz opcję As Displayed (Wyświetlano), aby eksportować obrazy w takiej postaci, w jakiej są wyświetlane. Kliknij przycisk Dalej i wybierz interesujące obrazy do eksportu. Kliknij Dalej.
      1. Wybierz typ sekwencji między pojedynczym filmem lub serią obrazów a interesującymi punktami w czasie. Kliknij Dalej.
      2. Dostosuj opcje eksportu zgodnie z potrzebami i kliknij przycisk Dalej. Ustaw folder wyjściowy, format pliku i nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk Eksportuj.
    2. Wybierz opcję As Stored (Jako przechowywane), aby wyeksportować obrazy w formacie raw. Wybierz typ obrazu.
      1. Wybierz interesujące Cię punkty czasowe i studnie. Kliknij Dalej. Ustaw folder wyjściowy, format pliku i nazwę pliku, a następnie kliknij przycisk Eksportuj.
  3. Eksport obrazów z maskami segmentacji
    1. Otwórz analizę. Kliknij ikonę warstw obrazu. Wybierz żądane maski kanałów (faza neurytu i faza komórka-ciało klaster ). Wykonaj czynności opisane w kroku 5.2.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Algorytm pomiaru wzrostu neurytów jest w stanie wykryć neuryty zarówno w sieciach neuronowych, jak i pojedynczych neuronach. Generuje żółtą maskę, która segmentuje obiekty o wysokim kontraście, takie jak ciała komórek, szczątki komórkowe, martwe komórki, eksplantaty tkanek i cienie. Dodatkowo na neurytach o różnej grubości pojawia się maska magenta. Wartości długości neurytów są podawane w mm/mm2, co oznacza, że długość aksonów została podzielona przez obszar obrazu, który wynosi 0,282739 mm2 i jest stały dla każdego warunku skanowania. Dlatego, aby uzyskać czyste wartości długości neurytu w mm, liczby dostarczone przez oprogramowanie należy pomnożyć przez obszar obrazu.

Metoda półautomatyczna kontra metoda ręczna
Zastosowane oprogramowanie jest półautomatyczną metodologią pomiaru całkowitej długości aksonów. Aby ocenić dokładność oprogramowania, przeprowadziliśmy pomiary na tych samych neuronach przy użyciu metody ręcznej również za pomocą wtyczki NeuronJ. Jak pokazano w Rysunek 1, maska segmentacji neuronów jest bardzo podobna między tymi dwiema metodami (Rysunek 1A).

Dodatkowo przeprowadziliśmy analizę statystyczną uzyskanych wartości, aby zbadać ich korelację. Analiza korelacji Spearmana wykazała wysoki współczynnik r wynoszący 0,8526, dostarczając tym samym mocnych dowodów na dokładność i precyzję algorytmu (Rysunek 1B). Pomiar automatyczny wymaga wysokich standardów jakości hodowli w oparciu o jej czystość, gęstość i czystość. Wyniki uzyskane za pomocą półautomatycznej segmentacji są powtarzalne i nie mają wpływu na indywidualną ocenę. Bezstronna odtwarzalność jest problemem w przypadku metodologii ręcznych.

Czasami mogą wystąpić błędy półautomatycznej segmentacji z różnych przyczyn. Na obrazach z kontrastem fazowym brud w kulturze można było wykryć jako neuryty za pomocą półautomatycznej segmentacji. Co więcej, obecność różnych typów komórek może zakłócić proces segmentacji. Takie problemy nie pojawiają się w przypadku segmentacji ręcznej, ponieważ jest ona wykonywana przez ludzkie oczy. Niemniej jednak, jeśli pojawią się takie problemy, można je przezwyciężyć, wykorzystując obrazy immunocytochemiczne jako kontrolę.

Segmentacja neurytów
W przypadku hodowli pierwotnych dorosłych neuronów DRG optymalnym punktem wyjścia dla wiarygodnej analizy fazowej jest równomierne posiew neuronów w dobrze i czystej kulturze. Jeśli podczas wysiewu wystąpią błędy i komórki skoncentrują się w jednym miejscu, jak pokazano na rysunku Rysunek 2A-B, wartości będą bardziej szacunkowe niż dokładnie odzwierciedlone w rzeczywistości. W takich sytuacjach żółta maska pokryje większość neurytów między komórkami (Rysunek 2A-B), powodując w ten sposób utratę długości neurytów. Co więcej, oprogramowanie będzie znacznie stronnicze w rozpoznawaniu neurytów i jest bardzo prawdopodobne, że maska magenta pojawi się na obiektach, które nie są neurytami (Rysunek 2D). W optymalnym obrazie powinno znajdować się do 15 neuronów przy 20-krotnym powiększeniu.

Gdy neurony są prawidłowo posiane, a kultura jest czysta, jak pokazano na rysunku Rysunek 3A-B, zaleca się ustawienie suwaka segmentacji w kierunku tła (0,5 - 0,7; Rysunek 3C). Pomaga to zredukować żółty składnik, który pojawi się na obiektach o wysokim kontraście na obrazie, takich jak punkty rozgałęzień, które powinny być w kolorze karmazynowym. Co więcej, jeśli neuryty są pogrubione, czułość neurytów między 0,4 a 0,5 powinna wystarczyć, aby pokryć większość z nich (Rysunek 3C-D).

Inną częstą sytuacją, która może wystąpić, jest brudna kultura z wieloma resztkami komórek i martwymi komórkami, jak pokazano w Rysunek 4A-B. W takich warunkach występuje wiele obiektów o wysokim kontraście. Dlatego zaleca się zwiększenie rozmiaru żółtej maski poprzez dostosowanie suwaka segmentacji w kierunku komórki lub zwiększenie parametru dostosowania rozmiaru (+1, +2 i tak dalej; Rysunek 4C). Niemniej jednak przydatne byłoby również nieznaczne zmniejszenie czułości neurytów, aby zapobiec błędnej identyfikacji przez oprogramowanie jako obiektów neurytów, które nie są neurytami jako takimi. (Rysunek 4C-D).

Czasami neuryty mogą wydawać się bardzo cienkie i blade, jak pokazano na Rysunek 5A-B, co stanowi wyzwanie dla oprogramowania, aby je dokładnie podzielić (Rysunek 5D). W takim przypadku zaleca się zwiększenie czułości neurytów do co najmniej 0,6 (Rysunek 5C). Należy jednak pamiętać, że im wyższa czułość, tym większe prawdopodobieństwo, że oprogramowanie nieprawidłowo oznaczy obiekty, które nie są neurytami jako takimi (Rysunek 5D). Można podjąć pewne środki ostrożności, aby zapobiec nadmiernemu wzrostowi odchylenia czułości, na przykład poprzez dostosowanie suwaka segmentacji w kierunku komórek. Jeśli jednak neuryty są zbyt cienkie, aby mogły zostać wykryte przez oprogramowanie, wartości długości neurytów będą niezależnie od tego obciążone.

W przypadku obrazów immunocytochemicznych, główny problem leży w tle. Oprócz warunków wysiewu, do których mają zastosowanie powyższe zasady, głównym źródłem błędu systematycznego jest sama fluorescencja. Oprogramowanie skutecznie rozpoznaje bardzo jasne neuryty, podczas gdy cieńsze, mniej intensywne neuryty pozostają w tyle (Rysunek 6A-B). Aby zapobiec utracie długości neurytu, czułość neurytu można zwiększyć do 0,75 (Rysunek 6C). Jednak zdecydowanie zaleca się zmniejszenie czułości zgrubnej neurytów do co najmniej 8-9, aby zapobiec nadmiernemu odchyleniu wykrywania, biorąc pod uwagę neuryty w tle (Rysunek 6C-D). Jeśli ta ostatnia wartość nie zostanie zmniejszona, całe tło zostanie podzielone na segmenty, jak pokazano w Rysunek 7.

Częstym problemem związanym z akwizycją fluorescencji jest rozpraszanie światła. Często obrazy immunocytochemiczne prezentują na obrazie latarki błyskowe, które znacząco wpływają na jakość i precyzję analizy (Rysunek 8A-B). W takiej sytuacji niewiele można zrobić, aby poprawić analizę, a wartości będą miały bardziej charakter szacunkowy. Rozpraszanie światła zakłóca rozpoznawanie neurytów, tak że wykrywane są tylko bardzo jasne neuryty (Rysunek 8C-D). Kolejną kwestią w obrazach immunocytochemicznych jest jakość barwienia jako takiego. Często, z powodu błędów ludzkich, aksony mogą zostać uszkodzone (Rysunek 9A), a ciała komórek mogą zostać oderwane podczas mycia (Rysunek 9B). Błędy te stanowią krytyczny problem, ponieważ wartości długości neurytów tracą precyzję i dokładność. W konsekwencji interpretacja danych biologicznych ulega zmianie, co prowadzi do błędnych wniosków.

W przypadku kultur embrionalnych sytuacja jest inna. W tego typu hodowli dominuje obecność komórek glejowych. W związku z tym błędy znacznie się zwiększają, ponieważ oprogramowanie wykrywa również wyściółki komórek glejowych (Rysunek 10A-B). Aby zminimalizować ten problem, suwak segmentacji powinien zostać przesunięty w kierunku komórek, zwykle wokół wartości 1,7-2 ( Rysunek 10C-D). Takie podejście zapewnia, że większość komórek glejowych jest pokryta żółtą maską, a zatem nie jest brana pod uwagę w pomiarze długości neurytów. Inną przydatną wskazówką jest utrzymanie szerokości neurytów na poziomie 2, ponieważ neurony embrionalne w kulturze zazwyczaj wykazują dwubiegunowe lub jednobiegunowe kształty z grubymi neurytami (Rysunek 10C-D). Ten środek ostrożności odfiltrowuje większość wyściółki komórek glejowych, które zwykle są bardzo cienkie. Na koniec uważaj, aby nie zwiększać zbytnio wrażliwości neurytów; W przeciwnym razie to, co zostało odfiltrowane przez parametr szerokości neurytu, zostanie ponownie uwzględnione w pomiarze długości neurytu.

W przypadku kultur embrionalnych, gdzie dominuje składnik komórek glejowych, immunocytochemia może być lepszym rozwiązaniem. Dzięki specyficznemu barwieniu neuronów rozwiązano problem segmentacji gleju, ponieważ glej nie zostanie wybarwiony, co znacznie ułatwia i czyni analizę dokładniejszą (Rysunek 11).

Na koniec, oprogramowanie może być również wykorzystane do oceny programu różnicowania linii komórkowych i/lub iPSC w celu oceny ich stanu wzrostu. W związku z tym stosowanie podobnych parametrów i środków ostrożności może być wykorzystywane do różnych celów.

Jeśli chodzi o proces różnicowania, solidność oprogramowania została udowodniona w linii komórkowej NSC-34 (hybrydowa linia komórkowa składająca się z komórek nerwiaka zarodkowego myszy i motoneuronów pochodzących z rdzenia kręgowego embrionów myszy) podczas dojrzewania do komórek podobnych do motoneuronów. Jeśli chodzi o hodowle pierwotne DRG, optymalnym punktem wyjścia dla dobrej analizy jest równomierne wysiewanie komórek. Niezróżnicowane i zróżnicowane komórki, po leczeniu kwasem retinowym, można obserwować za pomocą akwizycji przez cały okres hodowli lub jak pokazano na Rysunek 12, w ostatnim punkcie czasowym.

Rzeczywiście, oprócz długości neurytu, algorytm dostarcza również parametr punktu rozgałęzienia. Należy jednak pamiętać, że parametr punktu rozgałęzienia nie reprezentuje dokładnej liczby punktów rozgałęzienia; Wskazuje raczej gęstość rozgałęzień na obrazie, wyrażoną w mm/mm2. Na pomiar ten znaczący wpływ mają zanieczyszczenia w uprawie i stężenie wysiewu. Dlatego zagęszczenie neuronów na obrazie i czystość kultury są kluczowymi czynnikami dla uzyskania wiarygodnych wartości. Jeśli hodowla przedstawia wiele szczątków komórkowych, które nie zostały odfiltrowane przez żółtą maskę, zostaną one uwzględnione w długości neurytów, a także w pomiarze punktu rozgałęzienia.

W związku z tym zaleca się normalizację tych wartości dla liczby komórek, ponieważ liczba neuronów na obrazie wpływa na pomiary długości neurytów i punktów rozgałęzień.

Segmentacja ciał komórek
Wśród wszystkich parametrów dostarczanych przez system znajdują się klaster komórka-ciało oraz obszar klastra komórka-ciało. Jednak te dwa parametry nie są wiarygodne do użycia jako wartości do zliczania komórek. Jak pokazano na rysunku Rysunek 4, oprogramowanie segmentuje obiekty o wysokim kontraście w żółtej masce, w tym cienie spowodowane średnim ruchem w studni. Dodatkowo segmentuje również martwe komórki i szczątki komórkowe (Rysunek 4). Aby uzyskać wiarygodną liczbę komórek rosnących neuronów, można zastosować metodę ręczną, taką jak narzędzie Cell Counter na Fidżi (Rysunek 13).

Podsumowanie sugerowanych parametrów analizy posortowanych według rodzaju hodowli znajduje się w Tabeli 1 dla obrazów fazowych i Tabeli 2 dla obrazów immunocytochemicznych. Ponadto w tabeli 3 przedstawiono podsumowanie sugerowanych parametrów analizy w celu rozwiązania konkretnych problemów.

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza korelacji między ręczną i półautomatyczną segmentacją neurytów. (A) Po lewej, reprezentatywny obraz fazowy neuronu podzielonego na segmenty za pomocą wtyczki NeuronJ na Fidżi. Po prawej stronie znajduje się reprezentatywny obraz fazowy neuronu, który jest podzielony na segmenty za pomocą półautomatycznego oprogramowania. (B) Prosta regresja liniowa przeprowadzona na 20 neuronach została przeanalizowana zarówno metodami ręcznymi, jak i półautomatycznymi. Współczynnik korelacji Spearmana r = 0,8526, p**** < 0,0001. Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Błąd zasiewu w hodowli dorosłych neuronów czuciowych. (A) Reprezentatywny obraz fazy błędu wysiewu. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Żółta maska segmentuje ciała komórek, maska magenta segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Górny panel: powiększ błąd segmentacji ciała komórki (żółta maska) spowodowany grupowaniem ciał komórek. Dolny panel: powiększ błąd segmentacji neurytów (maska magenta) spowodowany szczątkami komórkowymi. Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Idealna hodowla dorosłych neuronów czuciowych do analizy wzrostu neurytów. (A) Reprezentatywny obraz fazy idealnych warunków wysiewu do analizy przerostu neurytów. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Żółta maska segmentuje ciała komórek, maska magenta segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Zbliżenie na segmentację ciała komórki (żółta maska) i na segmentację neurytów (maska magenta). Obrazy zostały uzyskane 48 godzin po wysianiu. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza niepokojących elementów w analizie wzrostu neurytów w hodowli dorosłych neuronów czuciowych. (A) Reprezentatywny obraz fazowy szczątków komórkowych i cieni spowodowanych ruchami ośrodka. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Żółta maska segmentuje ciała komórek, maska magenta segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Powiększenie błędu segmentacji ciała komórki (żółta maska) i segmentacji neurytów (maska magenta) spowodowanego szczątkami komórek i cieniami poruszającego się ośrodka. Obrazy uzyskano 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Analiza cienkich neurytów w analizie wzrostu neuronów czuciowych u dorosłych. (A) Reprezentatywny obraz fazowy neuronów charakteryzujących się bardzo cienkimi neurytami. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Żółta maska segmentuje ciała komórek, maska magenta segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Panel górny: zbliżenie na utratę długości neurytów z powodu granic wykrywalności segmentacji neurytów (maska magenta). Dolny panel: zbliżenie na błąd segmentacji neurytów (maska magenta) na ciałach obcych. Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Analiza jasności neurytów w hodowli neuronów czuciowych dorosłych. (A) Reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) neuronów charakteryzujących się bardzo jasnymi i grubymi neurytami. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Fioletowa maska segmentuje ciała komórek, niebieska maska segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Panel górny: powiększenie błędu segmentacji ciała komórki (fioletowa maska) ze względu na grubość neurytów. Dolny panel: zbliżenie na utratę długości neurytów z powodu intensywnej jasności fluorescencyjnej grubych neurytów. Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Fluorescencja tła w analizie wzrostu neurytów w hodowli dorosłych neuronów czuciowych. (A) Reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) o wysokim szumie fluorescencji tła. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Fioletowa maska segmentuje ciała komórek, niebieska maska segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Powiększenie błędu segmentacji neurytów (niebieska maska) spowodowanego interferencją fluorescencji tła. Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Rozpraszanie światła w analizie wzrostu neurytów w kulturze dorosłych neuronów czuciowych. (A) Reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) rozpraszania światła. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Fioletowa maska segmentuje ciała komórek, niebieska maska segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Panel górny: zbliżenie na utratę długości neurytu z powodu interferencji rozpraszania światła. Dolny panel: powiększenie błędu segmentacji ciała komórki (fioletowa maska). Obrazy zostały pozyskane 48 godzin po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Wpływające na jakość błędy procedury barwienia zakłócające analizę wzrostu neurytów w hodowli dorosłych neuronów czuciowych. (A) Po lewej stronie reprezentatywny obraz fazowy dorosłych neuronów czuciowych. Po prawej reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) uszkodzonych neurytów w wyniku mycia w procedurze barwienia. (B) Po lewej stronie reprezentatywny obraz fazowy dorosłych neuronów czuciowych. Po prawej stronie reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) przedstawiający usunięcie ciała komórki w wyniku przemycia procedury barwienia. Obrazy uzyskano 48 godzin po wysianiu. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10: Idealna embrionalna (E13.5) hodowla neuronów czuciowych do analizy wzrostu neurytów. (A) Reprezentatywny obraz fazowy idealnych warunków wysiewu do analizy wzrostu neurytów w embrionalnej hodowli neuronów czuciowych. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Żółta maska segmentuje ciała komórek, maska magenta segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Zbliżenie na segmentację ciała komórki (żółta maska) i na segmentację neurytów (maska magenta). Obrazy zostały pozyskane 24 godziny po wysianiu. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11: Idealna embrionalna (E13.5) hodowla neuronów czuciowych do analizy wzrostu neurytów. (A) Reprezentatywny obraz immunocytochemiczny (marker neuronalny Tuj1) idealnej hodowli embrionalnych neuronów czuciowych do analizy wzrostu neurytów. (B) Reprezentatywny obraz automatycznie segmentowany. Fioletowa maska segmentuje ciała komórek, niebieska maska segmentuje neuryty. (C) Przykładowe parametry definicji analizy wzrostu neurytów. (D) Zbliżenie na segmentację ciała komórki (fioletowa maska) i na segmentację neurytów (niebieska maska). Obrazy zostały uzyskane 24 godziny po wysiewie. Powiększenie 20x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Zróżnicowane komórki NSC-34 mają zwiększone neuryty i rozgałęzienia w porównaniu do niezróżnicowanych kontrol.Reprezentatywne obrazy komórek NSC-34. Górny panel: niezróżnicowane komórki NSC-34 (kontrola). Dolny panel: zróżnicowane komórki NSC-34 po 96 godzinach leczenia kwasem retinowym. Po lewej stronie obu paneli znajdują się obrazy kontrastu fazowego, natomiast po prawej stronie obu paneli obrazy są automatycznie segmentowane (soma w kolorze żółtym, neuryty w kolorze magenta). Obrazy zostały uzyskane 96 godzin po zasiewie. Powiększenie 10x. Podziałka, 50 μm. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-13
Rysunek 13: Narzędzie do liczenia komórek na Fidżi. Ręczne zliczanie komórek przeprowadzone na obrazie fazowym idealnych warunków wysiewu do analizy przerostu neurytów. Powiększenie 20x. Figura została stworzona za pomocą BioRenderu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

wzrost wzrost
Rodzaj kulturyPosiew DRG dla dorosłych (faza)Hodowla zarodków DRG (faza)NSC-34 (Faza)
Powiększenie20-krotny20-krotny10x
Tryb segmentacjijasnośćjasnośćjasność
Korekta segmentacji 0,5 - 0,71,7 - 21
Dostosuj rozmiar (piksele)0, +1, +20, +10
Filtrowanienajlepszynajlepszynajlepszy
Wrażliwość na neuryty 0,4 - 0,50,25 - 0,40,3 - 0,5
Szerokość neurytu1cyfra arabskacyfra arabska

Tabela 1: Podsumowanie sugerowanych parametrów definicji analizy dla kultur dorosłych neuronów czuciowych, embrionalnych (E13.5) kultur neuronów czuciowych i kultur NSC-34 na obrazach kontrastu fazowego.

wzrost wzrost
Rodzaj kulturyHodowla DRG dla dorosłych (ICC)Hodowla zarodków DRG (ICC)
Powiększenie20-krotny20-krotny
Tryb segmentacjijasnośćjasność
Korekta segmentacji 0,5 - 0,71,7 - 2
Dostosuj rozmiar (piksele)0, +1, +20, +1
Filtrowanienajlepszynajlepszy
Neuryt Czułość zgrubna 8 - 98 - 9
Delikatna wrażliwość neurytu aż do 0,750,5 - 0,75
Szerokość neurytu1cyfra arabska

Tabela 2: Podsumowanie sugerowanych parametrów definicji analizy dla kultur dorosłych neuronów czuciowych, embrionalnych (E13.5) kultur neuronów czuciowych i kultur NSC-34 w obrazach immunocytochemicznych.

problemSugestie
Brudna kulturaDopasowywanie suwaka segmentacji w kierunku komórek
Zwiększ parametr regulacji rozmiaru (+1,+2...)
Nieznacznie zmniejszyć wrażliwość neurytów
Blade/cienkie neurytyZwiększ wrażliwość neurytów (co najmniej 0,6)
Dostosuj suwak segmentacji w kierunku komórek.
Cienkie neuryty w ICCZwiększ wrażliwość drobnych neurytów (do 0,75)
Zmniejsz wrażliwość zgrubną neurytu (co najmniej do 8-9)
Komórki glejoweDopasowywanie suwaka segmentacji w kierunku komórek (1,7-2)
Szerokość neurytu przy 2

Tabela 3: Podsumowanie sugerowanych parametrów definicji analizy w celu rozwiązania konkretnych problemów w różnych typach kultur.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładny pomiar wzrostu neuronów w zdrowych, uszkodzonych i chorych warunkach jest krytycznym parametrem w wielu konfiguracjach eksperymentalnych w dziedzinie neuronauki. Niezależnie od tego, czy pracujemy z organotypowymi kulturami całych eksplantatów DRG, czy z kulturami zdysocjowanymi, właściwy pomiar wzrostu aksonów był poważnym wyzwaniem w ciągu ostatnich 20 lat. Bez wiarygodnego i dokładnego określenia ilościowego wzrostu neurytów niemożliwe jest ocena, czy określone leczenie, takie jak kwas retinowy (przez 4 dni) dla komórek NSC-3434 lub neurotrofiny (przez 1-2 dni) dla embrionalnych neuronów DRG 14,35, było skuteczne. Neurony zazwyczaj wykazują ciągły wzrost, gdy są zdrowe; Jednak po urazie tempo wzrostu aksonów wzrastao 12,13. Czas ma kluczowe znaczenie przy pomiarze wzrostu aksonów; Dlatego przed rozpoczęciem eksperymentu konieczne jest przeprowadzenie testu próbnego w celu określenia optymalnego czasu na utrwalenie komórek na podstawie ich krzywej plateau szybkości wzrostu.

Wybór metody, ręcznej lub automatycznej, stanowi punkt zwrotny pod względem nakładu czasu i dokładności. Niektóre z najczęstszych metod ręcznych to NeuronJ18,20 i Metamorph (Visitron)2,22,28. Metody ręczne wymagają od użytkowników ręcznego śledzenia neurytów, co jest niezwykle czasochłonne i wymaga obrazów pojedynczych komórek. Przy ręcznej segmentacji neurytów sieci neuronowe są całkowicie poza zasięgiem. Zazwyczaj metodologie te mierzą tylko najdłuższy akson lub wykorzystują pomiar odległości wektorowej, tracąc w ten sposób ważne informacje, takie jak liczba punktów rozgałęzień i całkowita długość aksonu. Pewną poprawę zapewnia analiza Sholla30, która i tak ogranicza się do warunków jednokomórkowych. Analiza pojedynczych komórek wiąże się z kilkoma wyzwaniami, począwszy od wysiewu komórek. Neurony muszą być posiane w bardzo niskim stężeniu, co może nie być najbardziej odpowiednim warunkiem wzrostu dla każdego typu komórek. Kolejna kwestia wynika z pozyskiwania obrazu. Zazwyczaj mikroskop konfokalny jest wykorzystywany do obrazowania, co wymaga przeszkolonych użytkowników i neuronów fluorescencyjnych i nie jest ani efektywne czasowo, ani kosztowo. Za pomocą mikroskopu konfokalnego uzyskuje się obrazy o wysokiej rozdzielczości, ale bardzo niewiele neuronów jest obrazowanych w każdym eksperymencie. Stanowi to ograniczenie, ponieważ do osiągnięcia odpowiedniej liczby neuronów potrzeba więcej powtórzeń biologicznych.

Niektóre metodyki automatyczne, takie jak NeuroMath 2,28, rozwiązują problem czasochłonnej segmentacji neurytów, która jest wykonywana w sposób automatyczny.

Jednak ze względu na ograniczenia czasowe, ten moduł pomiaru wzrostu neurytów zapewnia szybsze wyniki podczas pozyskiwania obrazów za pomocą mikroskopii poklatkowej. To ostatnie, wraz z tym oprogramowaniem, znacznie poprawia efektywność czasową i kosztową zarówno dla studentów, jak i głównych badaczy.

Maszyna akwizycyjna pozwala na stworzenie dość kompletnej mapy studni, uzyskując zmienną liczbę obrazów w oparciu o średnicę studni. Stanowi to istotną zaletę, ponieważ wiele neuronów jest obrazowanych w tym samym czasie. Jednak osiągnięcie tylko 20-krotnego powiększenia jest wystarczające i odpowiednie do analizy obrazów za pomocą oprogramowania. Jego moc polega na zdolności do trenowania na zestawie obrazów i wykonywania półautomatycznego pomiaru całkowitej długości aksonów. Dodatkowo oprogramowanie może działać zarówno na pojedynczych neuronach, jak i sieciach neuronowych. Oprogramowanie jest w stanie segmentować neuryty i ciała komórkowe za pomocą dwóch różnych masek. Żółta maska dzieli na segmenty wszystkie obiekty obrazu o wysokim kontraście, takie jak obiekty komórek, szczątki komórek i cienie. Zamiast tego maska magenta dzieli neuryty. Precyzja i dokładność oprogramowania została udowodniona przez segmentację tych samych neuronów zarówno za pomocą oprogramowania, jak i NeuronJ. Z punktu widzenia analizy statystycznej wartości długości neurytów ładnie korelowały z wysokim współczynnikiem korelacji Spearmana.

Po ocenie wiarygodności metody przeszliśmy do analizy różnych warunków testowych. Aby uzyskać optymalną analizę, wymagane są pewne środki ostrożności. Po pierwsze, neurony muszą być równomiernie rozmieszczone w studni, unikając miejsc o wysokim stężeniu komórek. Grupowanie neuronów powoduje, że oprogramowanie traci precyzję w wykrywaniu neurytów. Kolejną zmienną, która wpływa na dokładność i precyzję analizy, jest czystość hodowli. Preferowana jest czysta kultura z niewielką ilością resztek komórkowych i martwych komórek. Jednak oprogramowanie jest w stanie skompensować takie problemy poprzez modulację wrażliwości neurytów i maski segmentacji ciała komórki. Jak wspomniano powyżej, żółta maska segmentuje obiekty o wysokim kontraście, wśród których znajdują się również cienie spowodowane ruchem medium w studni. Cienie mogą zakrywać neuryty, powodując w ten sposób utratę długości neurytów. Jednak taki problem można łatwo rozwiązać, pozwalając nośnikowi ustabilizować się przed pozyskaniem obrazu.

Algorytm jest w stanie przeprowadzić kwantyfikację długości neurytów zarówno na obrazach kontrastu fazowego, jak i na obrazach immunocytochemicznych. W przypadku fluorescencji należy podjąć inne środki ostrożności w celu uzyskania wiarygodnej analizy. Po pierwsze, jakość barwienia ma ogromny wpływ na wynik analizy. Jeśli neuryty są uszkodzone lub podzielone na segmenty, a ciała komórkowe są odrywane podczas mycia, analiza traci wytrzymałość i wiarygodność. Dodatkowo, sama fluorescencja stanowi potencjalnie niepokojący element dla analizy. Ponieważ ustawianie ostrości jest wykonywane automatycznie przez maszynę, obiektyw ustawia ostrość na bardzo jasnych obiektach, takich jak artefakty, ciała komórek lub grube neuryty. W rezultacie cieńsze i mniej jasne neuryty pozostają w tyle, co utrudnia użytkownikowi prawidłowy pomiar długości neurytu.

W związku z tym analiza obrazów fazowych może być bardziej uzasadniona w porównaniu z analizą obrazów immunocytochemicznych. Oprogramowanie jest w stanie pracować nad wieloma różnymi morfologiami neuronów, od najbardziej skomplikowanych i wyszukanych po najprostsze, zarówno jako pojedyncze komórki, jak i w sieciach neuronowych. Dlatego można go wykorzystać w wielu różnych dziedzinach badawczych, począwszy od pierwotnych kultur neuronów pochodzących z ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego na różnych etapach rozwoju, a skończywszy na neuronach i liniach komórkowych pochodzących z iPSC, takich jak NSC-34.

Pomimo znacznego potencjału oprogramowania, można zauważyć pewne ograniczenia. Po pierwsze, precyzja segmentacji ciała komórki jest nieoptymalna. W związku z tym parametry takie jak klaster ciała komórki i obszar klastra ciała komórki nie mogą być niezawodnie wykorzystywane do zliczania komórek. Po drugie, oprócz niezbędnych środków ostrożności dla optymalnej segmentacji neurytów, niewystarczająco grube aksony mogą zostać wyłączone z pomiaru długości neurytów, co spowoduje utratę danych.

Parametr punktu rozgałęzienia napotyka problemy związane z obydwoma typami segmentacji. Cienie, martwe komórki lub szczątki w kulturze, które lokalizują się w punktach rozgałęzień, zasłaniają je, gdy są pokrywane przez segmentację ciała komórki. Co więcej, w przypadku cienkich neurytów niezawodność parametru punktu rozgałęzienia jest ponownie poważnie zagrożona.

Co więcej, automatyczne ustawianie ostrości podczas akwizycji obrazu może czasami nie być optymalne. Maksymalne powiększenie urządzenia jest ograniczone do 20x, co może być niewystarczające do obserwacji drobniejszych szczegółów lub fluorescencji w smukłych strukturach, takich jak neuryty. Dodatkowo maszyna najlepiej radzi sobie z jednorodnymi podłożami z tworzyw sztucznych. Jeśli szklane szkiełko nakrywkowe zostanie włożone do studzienki, ostrość na szkle może się nie powieść, co spowoduje częściowo rozmyte obrazy. Jednak to oprogramowanie ma zastosowanie nie tylko do neuronów, ale także do zupełnie innych dziedzin badań, takich jak wzrost grzybów36.

Biorąc wszystko pod uwagę, uważamy, że ten moduł pomiaru wzrostu neurytów jest niezawodnym narzędziem do szybkiego, bezstronnego i skutecznego pomiaru neurytów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone bez jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby potencjalnie powodować konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcemy podziękować Alessandro Vercelli za krytyczne uwagi i wsparcie techniczne Sartoriusa za pomoc. Nasze badania na te tematy zostały hojnie wsparte grantem Rita-Levi Montalcini Grant 2021 (MIUR, Włochy). Badania te zostały sfinansowane przez Ministero dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027 dla Departamentu Neuronauki Rity Levi Montalcini. Badania D.M.R. były prowadzone w trakcie i przy wsparciu włoskiego narodowego międzyuniwersyteckiego studia doktoranckiego w zakresie zrównoważonego rozwoju i zmian klimatycznych (link: www.phd-sdc.it).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagenaza AMerck / Roche 10103586001
Dispase II (neutralna proteaza, stopień II)Merck / Roche4942078001
Zmodyfikowana pożywka orła DulbeccoMerck / SigmaD5796
Surowica płodowa bovin Merck / SigmaF7524
Mieszanka odżywcza F-12 szynki (1X)ThermoFisher Scientific21765029
Ham's F12 z L-glutaminąEuroklonECM0135L
Zbilansowany roztwór soli HanksaEuroklonECM0507L
HBSS (10X), bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejThermoFisher Scientific14185045
HyClone charakteryzuje płodową surowicę bydlęcą (USA)CytivaSH30071.03
Incucyte, oprogramowanie do analizy Neurotrack Sartorius9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)Millipore/SigmaL5520
Białko myszy Laminin, naturalneThermoFisher Scientific23017015
L-cysteinaMerck / SigmaC7352
Leibovitz's L-15 bez L-glutaminyEurocloneECB0020L
myszy NGF 2.5S (>95%)Alomone LabsN-100
Podłoże neurobazalne [-] GlutaminaThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Kanada)CLU140
Papaina z lateksu papaiSigmaP4762
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
Percoll ( Gęstość 1,130 g / ml)Cytiva17089101
Roztwór poli-D-lizyny (1 mg / ml)EMD Milipore / MerckA-003-E
Roztwór poli-L-lizyny (0-01%)SigmaP4832
Rekombinowany człowiek NT-3PeproTech450-03
Kwas retinowyMerck / SigmaR2625
Roztwór trypsyny-EDTASigmaPrzeciwciało T3924
β-tubulina III (Tuj1)Merck / SigmaT8660

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359, 1416-1421 (2018).
  2. Marvaldi, L., et al. Enhanced axon outgrowth and improved long-distance axon regeneration in sprouty2 deficient mice. Dev Neurobiol. 75, 217-231 (2015).
  3. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. J Cell Biol. 218, 1871-1890 (2019).
  4. Marvaldi, L., et al. Importin α3 regulates chronic pain pathways in peripheral sensory neurons. Science. 369, 842-846 (2020).
  5. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606, 137-145 (2022).
  6. Testa, L., Dotta, S., Vercelli, A., Marvaldi, L. Communicating pain: emerging axonal signaling in peripheral neuropathic pain. Front Neuroanat. 18, (2024).
  7. Thongrong, S., et al. Sprouty2 and -4 hypomorphism promotes neuronal survival and astrocytosis in a mouse model of kainic acid induced neuronal damage. Hippocampus. 26, 658-667 (2016).
  8. Yaron, A., Schuldiner, O. Common and divergent mechanisms in developmental neuronal remodeling and dying back neurodegeneration. Curr Biol. 26, R628-R639 (2016).
  9. Maor-Nof, M., et al. Axonal degeneration is regulated by a transcriptional program that coordinates expression of pro- and anti-degenerative factors. Neuron. 92, 991-1006 (2016).
  10. Bromberg, K. D. Regulation of neurite outgrowth by Gi/o signaling pathways. Front Biosci. 13, 4544-4557 (2008).
  11. Girouard, M. P., et al. Collapsin response mediator protein 4 (CRMP4) facilitates wallerian degeneration and axon regeneration following Sciatic nerve injury. eNeuro. 7, (2020).
  12. van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  13. Wang, X., et al. Driving axon regeneration by orchestrating neuronal and non-neuronal innate immune responses via the IFNγ-cGAS-STING axis. Neuron. 111, 236-255 (2023).
  14. Kaselis, A., Treinys, R., Vosyliūtė, R., Šatkauskas, S. DRG axon elongation and growth cone collapse rate induced by Sema3A are differently dependent on NGF concentration. Cell Mol Neurobiol. 34, 289-296 (2014).
  15. Maier, O., et al. Differentiated NSC-34 motoneuron-like cells as experimental model for cholinergic neurodegeneration. Neurochem Int. 62, 1029-1038 (2013).
  16. Nango, H., et al. Highly efficient conversion of motor neuron-like NSC-34 cells into functional motor neurons by Prostaglandin E2. Cells. 9, 1741(2020).
  17. Kim, H., Caspar, W. T., Shah, S. B., Hsieh, A. H. Effects of proinflammatory cytokines on axonal outgrowth from adult rat lumbar dorsal root ganglia using a novel three-dimensional culture system. Spine J. 15, 1823-1831 (2015).
  18. Frey, E., et al. An in vitro assay to study induction of the regenerative state in sensory neurons. Exp Neurol. 263, 350-363 (2015).
  19. Zhang, Z., et al. Cerebellar injury and impaired function in a rabbit model of maternal inflammation induced neonatal brain injury. Neurobiol Learn Mem. 165, 106901(2019).
  20. Pemberton, K., Mersman, B., Xu, F. Using ImageJ to assess neurite outgrowth in mammalian cell cultures: Research data quantification exercises in undergraduate neuroscience lab. J Undergrad Neurosci Educ. 16, A186-A194 (2018).
  21. Marvaldi, L., Hausott, B., Auer, M., Leban, J., Klimaschewski, L. A Novel DRAK inhibitor, SC82510, promotes axon branching of adult sensory neurons in vitro. Neurochem Res. 39, 403-407 (2014).
  22. Quarta, S., et al. Peripheral nerve regeneration and NGF-dependent neurite outgrowth of adult sensory neurons converge on STAT3 phosphorylation downstream of neuropoietic cytokine receptor gp130. J Neurosci. 34, 13222-13233 (2014).
  23. Woitke, F., et al. Adult hippocampal neurogenesis poststroke: More new granule cells but aberrant morphology and impaired spatial memory. PLoS One. 12, e0183463(2017).
  24. Xiao, X., et al. Automated dendritic spine detection using convolutional neural networks on maximum intensity projected microscopic volumes. J Neurosci Meth. 309, 25-34 (2018).
  25. Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: A novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Meth. 168, 134-139 (2008).
  26. Wang, D., et al. HCA-Vision: Automated neurite outgrowth analysis. SLAS Disc. 15, 1165-1170 (2010).
  27. Whitlon, D. S., et al. Novel high content screen detects compounds that promote neurite regeneration from cochlear spiral ganglion neurons. Sci Rep. 5, 15960(2015).
  28. Rishal, I., et al. WIS-neuromath enables versatile high throughput analyses of neuronal processes. Dev Neurobiol. 73, 247-256 (2013).
  29. Smith, D. S., Pate Skene, J. H. A Transcription-dependent switch controls competence of adult neurons for distinct modes of axon growth. J Neurosci. 17, 646-658 (1997).
  30. Gardiner, N. J., et al. Preconditioning injury-induced neurite outgrowth of adult rat sensory neurons on fibronectin is mediated by mobilisation of axonal α5 integrin. Mol Cell Neurosci. 35, 249-260 (2007).
  31. Hauck, J. S., et al. Heat shock factor 1 directly regulates transsulfuration pathway to promote prostate cancer proliferation and survival. Commun Biol. 7, 9(2024).
  32. Zhu, Y., et al. Loss of WIPI4 in neurodegeneration causes autophagy-independent ferroptosis. Nat Cell Biol. 26, 542-551 (2024).
  33. Reggiani, F., et al. BET inhibitors drive Natural Killer activation in non-small cell lung cancer via BRD4 and SMAD3. Nat Commun. 15, 2567(2024).
  34. Ackerman, H. D., Gerhard, G. S. Bile acids induce neurite outgrowth in NSC-34 cells via TGR5 and a distinct transcriptional profile. Pharmaceuticals. 16, 174(2023).
  35. Tuttle, R., Matthew, W. D. Neurotrophins affect the pattern of DRG neurite growth in a bioassay that presents a choice of CNS and PNS substrates. Development. 121, 1301-1309 (1995).
  36. Wurster, S., et al. Live monitoring and analysis of fungal growth, viability, and mycelial morphology using the IncuCyte NeuroTrack processing module. mBio. 10 (3), e00673-e00719 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozga zianie neuryt wmorfologia neuron wmikroskopia poklatkowaobrazowanie w kontra cie fazowymobrazy immunocytochemicznekultury neuron w sensorycznychregeneracja aksonalnab l neuropatyczny

Powiązane artykuły