Artykuł metodologiczny

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67165

⸱

20 września 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Streszczenie

Biomateriały regeneracyjne są zaprojektowane tak, aby ułatwiać interakcje komórka-materiał, aby kierować naprawą uszkodzonych tkanek i organów. Materiały te mają na celu naśladowanie właściwości biofizycznych tkanki rodzimej, zapewniając komórkowe wskazówki fenotypowe i morfologiczne, które przyczyniają się do odbudowy niszy tkanki regeneracyjnej. Kolagen, rozpowszechnione białko macierzy zewnątrzkomórkowej, jest powszechnym składnikiem tych regeneracyjnych biomateriałów ze względu na swoją biokompatybilność i inne korzystne właściwości. Obecne badanie opisuje nowatorską i prostą metodę wytwarzania zmodyfikowanego kolagenu nanofibrylarnego z ukierunkowanym wzorem włókienek. Poprzez manipulację naprężeniami ścinającymi, temperaturą i pH, fibrylogeneza i wyrównanie kolagenu są precyzyjnie kontrolowane bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. Takie podejście pozwala na tworzenie nanofibrylarnych biomateriałów kolagenowych, które naśladują natywną strukturę tkanek wykazujących cechy anizotropowe lub izotropowe. Elastyczność modelowania nanowłókien kolagenowych nie tylko ułatwia badanie wzorców nanoskalowych na zachowaniu komórek, ale także oferuje różnorodne możliwości zastosowań w inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

Celem medycyny regeneracyjnej jest poprawa regeneracji i gojenia tkanek poprzez zastosowanie zaawansowanych środków terapeutycznych. Jedno z podejść polega na wytwarzaniu konstruktów biomateriałowych, które ściśle naśladują skład i strukturę tkanek natywnych. Podczas projektowania tych konstrukcji kluczową kwestią jest natywna podstawowa macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), która dostarcza wskazówek instruktażowych dotyczących proliferacji, migracji i różnicowania komórek, ostatecznie napędzając regenerację tkanek1,2. Natywny ECM składa się głównie z fibrillar collagen3,4. W wysoce zorganizowanych tkankach, takich jak mięśnie szkieletowe i ścięgna, te ECM wykazują wyrównany wzór, który jest kluczem do wspierania przenoszenia siły przez tkankę, a także funkcji motorycznych5,6.

Użyteczność kolagenu jako biomateriału do zastosowań w inżynierii tkankowej wykracza poza jego szerokie rozpowszechnienie w tkankach natywnych, ponieważ wykazuje on również dobrą biokompatybilność, biodegradowalność i powinowactwo komórkowe7,8,9. Ostatnie postępy w rozwoju biomateriałów na bazie kolagenu skupiły się na udoskonaleniu właściwości biofizycznych, aby lepiej kierować mechanicznymi i biochemicznymi sygnałami, które są niezbędne do regeneracji określonych tkanek. Tworzenie biomateriałów kolagenowych o strukturze fibrylarnej in vitro jest stosunkowo proste, ponieważ rozpuszczalne w kwasach cząsteczki kolagenu są zdolne do samoorganizacji w nanofibryle pod wpływem wysokich temperatur i neutralnego pH10,11. Jednak bez sterowanej manipulacji włókna te uformują się w losowe sieci, co sprawi, że nie będą odpowiednie do zastosowań w anizotropowej inżynierii tkankowej. Techniki zdolne do wytwarzania wyrównanych włókien obejmują elektroprzędzenie i przędzenie na mokro, wraz z innymi technikami wytłaczania roztworu12,13, liofilizacja14, produkcja elektrochemiczna lub magnetyczna15,16, osadzanie metodą ścinania17, krystalizacja wywołana przepływem18, wytłaczanie żelu19, wyrównanie wywołane odkształceniem20, oraz wyrównanie sterowane siłą poprzez manipulację przepływem płynu21,22. Jednak wiele z tych metod albo nie jest wysoce kompatybilnych z kolagenem, albo powoduje wyrównanie w mikroskali, ale nie w nanoskali, albo wymaga dodatkowych etapów przetwarzania końcowego w celu wywołania wyrównania i stabilności, albo wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu i odczynników, co sprawia, że ich powszechne zastosowanie jest wyzwaniem.

Obecne badanie przedstawia łatwą metodę wytwarzania kolagenu nanofibrylarnego opartą na ścinaniu, z wyrównanym lub losowo zorientowanym wzorem włókienek, bez potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu, takiego jak pompy strzykawkowe czy elektroprzędzarki. Technika ta wykorzystuje zależność fibrylogenezy kolagenu od pH. Zastosowanie siły ścinającej do kwaśnego kolagenu monomerycznego w buforze neutralizującym sprzyja wyrównanej fibrylogenezie wzdłuż kierunku ścinania. Podobnie kolagen może zostać nakłoniony do fibrylogenezy przy braku ścinania, które wytwarza fibryle o losowych wzorach. Powstałe w ten sposób paski kolagenu 3D, składające się z wyrównanego lub losowo wzorzystego kolagenu nanofibrylarnego, mogą służyć jako narzędzia do badania wpływu wzorców w nanoskali na zachowanie komórek. Ponadto oferują różnorodne możliwości zarówno dla anizotropowych, jak i izotropowych zastosowań inżynierii tkankowej23,24,25,26,27. Wzór można dostosować do struktury interesującej nas tkanki natywnej. Paski kolagenu mogą być również łączone w wiązki o różnych rozmiarach, aby służyć jako przeszczepiony środek terapeutyczny w różnych rozmiarach i kształtach urazów.

Protokół

1. Przygotowanie dializowanego kolagenu ( Rysunek 1)

  1. Przyciąć rurkę dializacyjną na długość około 3 cali. Używaj rurek o następujących specyfikacjach: płaska szerokość 32 mm, napompowana średnica 20 mm i rozmiar porów 4.8 nm.
  2. Nawodnij rurki dializacyjne w ultraczystej wodzie.
  3. Przymocuj jeden koniec rurki za pomocą zacisku do rurki do dializy.
  4. Przenieś 5-6 ml kolagenu typu I z ogona szczura (stężenie: 9-10 mg/ml w 0,02 N kwasu octowego) do rurki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę 18 G. Przypnij drugi koniec rurki, aby zamknąć.
  5. Umieść warstwę płatków glikolu polietylenowego (PEG) o grubości 0,5-1 cm na dnie szklanego naczynia, a następnie umieść rurkę dializacyjną wypełnioną kolagenem na wierzchu warstwy PEG.
    UWAGA: Szklane naczynie o wymiarach 13 cali x 9 cali x 2 cale może zazwyczaj pomieścić rząd 4-5 probówek wypełnionych kolagenem. Wielkość naczynia można dostosować w zależności od potrzebnej objętości kolagenu.
  6. Dodaj więcej płatków PEG, aby całkowicie przykryć rurkę i umieść tackę w lodówce o temperaturze 4 °C.
  7. Co 10-15 minut usuwaj mokre płatki PEG z powierzchni rurki do dializy i ponownie przykryj rurkę świeżą warstwą suchego PEG. Włóż naczynie do lodówki o temperaturze 4 °C.
  8. Powtórz krok 1.7 jeszcze dwa razy, a po 30-35 minutach spłucz mokre płatki PEG wodą z kranu.
  9. Jeszcze raz przepłucz rurkę ultraczystą wodą i osusz rurkę chusteczką.
  10. Odpiąć jeden koniec rurki i przenieść dializowany kolagen (końcowe stężenie: ~30 mg/ml) do probówek do mikrowirówek. Za pomocą miniwirówki (2 000 x g, ≤30 s, temperatura pokojowa [RT]) na krótko odwirować pęcherzyki powietrza w kolagenie i przechowywać w temperaturze 4°C do późniejszego wykorzystania.
  11. Dzień przed użyciem załaduj kolagen do strzykawek.
    1. Za pomocą igły o rozmiarze 16 pobrać ~1 ml dializowanego kolagenu do strzykawki o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Kolagen jest substancją lepką. Może być konieczne wstępne napełnienie główki igły kolagenem przed pobraniem większej ilości kolagenu. Zdjąć igły i w razie potrzeby usunąć duże kieszenie powietrzne
    2. Wyjąć igłę i owinąć głowicę strzykawki parafilmem.
    3. Strzykawkę wypełnioną kolagenem należy przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze 4°C przez noc, aby umożliwić pęknięcie małych pęcherzyków powietrza.

2. Przygotowanie wiórów szklanych ( Rysunek 1)

UWAGA: Korzystaj z ochrony oczu w tej części protokołu.

UWAGA: Specjalnie powlekane szkiełka hydrofobowe są używane do eksperymentów z hodowlą komórkową. Prowadnice muszą być trzymane za krawędzie, aby zapobiec usunięciu powłoki powierzchniowej. Procedurę cięcia szkła należy wykonać na odpowiedniej powierzchni do cięcia.

  1. Zmierz i zaznacz żądane wymiary wióra szklanego za pomocą markera permanentnego
    1. W przypadku tworzenia rusztowań 8-pasmowych należy zaznaczyć odstępy co około 1 cm wzdłuż dłuższej krawędzi zjeżdżalni. W razie potrzeby dostosuj wymiary w oparciu o żądany rozmiar rusztowania.
  2. Używając prostej krawędzi (tj. krawędzi płytki z 6 dołkami), przesuń nóż do szkła w dół długości pierwszego pomiaru, aby naciąć szkło.
  3. Szkiełko albo samo przełamie się wzdłuż naciętej linii, albo przewróci szkiełko na tkankę (hydrofobową stroną do dołu) i ręcznie wywrze nacisk na nacięty obszar.
  4. Zaznaczyć powlekaną stronę szkiełka hydrofobowego za pomocą markera na bazie etanolu.
  5. Opłucz szklany wiór w ultraczystej wodzie, aby usunąć resztki szklanego pyłu.
  6. Wysuszyć wióry szklane za pomocą dyszy stołowej do sprężonego powietrza lub układając je pod kątem w okapie.
  7. Powtórz w razie potrzeby dla wymaganej liczby żetonów. Przechowuj chipsy w RT. Aby uzyskać najlepsze wyniki hodowli komórkowych, użyj przygotowanych chipsów w ciągu 7 dni.

3. Przygotowanie 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)

  1. Napełnij szklaną butelkę 500 ml ultraczystej wody.
  2. Dodać 10 tabletek PBS do butelki.
    UWAGA: Ten protokół zakłada, że proporcja tabletek dla 1x PBS wynosi 1 tabletkę na 500 ml. Dostosuj liczbę tabletek zgodnie z potrzebami, jeśli używasz tabletu o innym rozmiarze lub marce.
  3. Dodaj mieszadło do butelki i umieść na talerzu mieszającym, aż tabletki się rozpuszczą.
  4. W dniu wytworzenia hydrożelu przenieś potrzebną objętość 10x PBS do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
  5. Umieść probówki wypełnione PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 15 minut przed wytwarzaniem kolagenu.

4. Wytwarzanie wyrównanych nanowłókien kolagenowych (Rysunek 2)

  1. Wyjmij strzykawkę z kolagenem z lodówki i przymocuj igłę 22 G.
  2. Umieść szklane szkiełko w pokrywce płytki 4-dołkowej.
  3. Przykryj szkiełko wystarczającą ilością podgrzanego 37 °C 10x PBS, aby je zanurzyć (30-50 ml).
  4. Trzymając strzykawkę pod kątem około 30-45°, ręcznie wytłaczaj cienkie paski kolagenu na szklany chip z prędkością ~340 mm/s i natężeniem przepływu ~3,2 ml/min.
    UWAGA: Zakończ wytłaczanie kolagenu w ciągu 30-60 s od dodania podgrzanego PBS, aby upewnić się, że PBS nie ostygnie nadmiernie.
  5. Odczekaj 1-2 minuty, aby kolagen zakończył fibrylogenezę lub do momentu, gdy kolagen zmieni kolor na nieprzezroczysty biały.
  6. Użyj kleszczy, aby przyciąć paski kolagenu na długość. Upewnij się, że paski są wystarczająco długie, aby można było złożyć 3-5 mm pod dowolnym końcem chipa.
  7. Pojedynczo delikatnie ułóż paski kolagenu wzdłuż (równolegle do naciętego obszaru) na przygotowanym chipsie szklanym. Wsuń krawędzie pod chip.
  8. Kontynuuj układanie pasków kolagenowych, aż do uzyskania pożądanych wymiarów.
  9. Umieść nowo utworzony hydrożel kolagenowy w dwóch dołkach 12-dołkowej płytki. Umożliwia to przepływ powietrza podczas procesu suszenia i zapobiega przywieraniu końców kolagenu do niepożądanych powierzchni.
  10. Pozostaw hydrożele na blacie do wyschnięcia na 1-3 godziny lub do momentu, gdy kryształki soli PBS pokryją 50%-90% powierzchni hydrożelu.
    UWAGA: Czas schnięcia będzie się różnić w zależności od wielkości hydrożelu i obecności nadmiaru płynu.
  11. Zanurz każdy hydrożel w 1x PBS na około 30-60 s lub do momentu, gdy kryształki soli się rozpuszczą.
  12. Delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką.
  13. Umieść hydrożele z powrotem na płytce studzienki i pozostaw do wyschnięcia na noc w dygestorium.
  14. Wysuszone hydrożele należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 1 tydzień.

5. Wytwarzanie losowych nanowłókien kolagenowych (Rysunek 3)

  1. Wyjmij strzykawkę z kolagenem z lodówki i przymocuj igłę 22 G.
  2. Wytłaczaj kolagen w tempie ~ 3,2 ml / min na suchy szklany wiór. Wytłacz wystarczającą ilość kolagenu, aby uzyskać podobne wymiary do wyrównanych hydrożeli kolagenowych. W razie potrzeby zapobiegaj gromadzeniu się pęcherzyków powietrza.
  3. Wyciśnij dodatkowy kolagen, aby owinąć się wokół krawędzi szklanego chipa. Minimalizuje to ryzyko przypadkowego odłączenia.
  4. Użyj kleszczy, aby zanurzyć wytłaczany kolagen w probówce o pojemności 50 ml z podgrzanym 10x PBS.
  5. Poczekaj 45-60 s, aż kolagen zakończy fibrylogenezę lub aż kolagen zmieni kolor na nieprzezroczysty biały.
  6. Delikatnie zetrzyj nadmiar PBS chusteczką.
  7. Wykonaj kroki 4.9-4.14, aby spłukać i wysuszyć hydrożele

6. Sterylizacja i ponowne nawodnienie

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Sterylizuj hydrożele kolagenowe i otaczającą płytkę studzienki w 70% etanolu przez 15 minut.
    1. Na krótko podnieś hydrożele w połowie sterylizacji za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że zarówno spód szklanego wióra, jak i hydrożel mają kontakt z etanolem.
  2. Usuń etanol i pozostaw hydrożele do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut.
  3. Umyj hydrożele 3 razy w sterylnym 1x PBS, po 10 minut każdy, aby usunąć resztki etanolu i ponownie nawodnić hydrożele. Hydrożele są teraz gotowe do użycia (hodowla komórkowa itp.). Hydrożele można na krótko pozostawić w PBS po ostatnim etapie mycia, jeśli nie są one natychmiast gotowe do użycia.

Wyniki

Niniejszy protokół opisuje prostą technikę ekstruzji opartą na ścinaniu, służącą do wytwarzania hydrożeli kolagenowych składających się z nanofibryli zorientowanych albo równolegle (Rycina 2), albo w sposób losowy (Rycina 3). Wzorowanie nanofibryli opiera się na precyzyjnej kontroli sił ścinania, co osiąga się poprzez jednoczesną modulację prędkości strzykawki i szybkości ekstruzji kolagenu. Optymalne wartości indukujące wyrównanie fibryli zostały wcześniej określone jako prędkość strzykawki 340 mm/s oraz szybkość ekstruzji kolagenu 3,2 mL/min28,29. Równowaga ta jest krytyczna nie tylko dla formowania wyrównanych nanofibryli, ale także dla zapewnienia funkcjonalności hydrożeli w skali makro. W przypadku niewłaściwego doboru tego stosunku istnieje ryzyko wytworzenia hydrożeli, które nie będą posiadały oczekiwanego wzoru, a także hydrożeli zawierających pasma kolagenu, które są zbyt cienkie (średnica <0,5 mm), zbyt grube (średnica >1,5 mm) lub pofalowane, co wyklucza ich zastosowanie. Na przykład zbyt szybki ruch strzykawki w połączeniu ze zbyt niską szybkością ekstruzji skutkuje powstaniem cienkich pasm, natomiast odwrotny stosunek prowadzi do powstania pasm grubych lub pofalowanych (Rycina 4A-D), zależnie od stopnia niezrównoważenia tego stosunku. Różnice te w właściwościach makroskopowych mogą generować na tyle dużą zmienność między poszczególnymi pasmami, aby wpływać na osadzanie komórek i lokalną adhezję.

Po ekstruzji i montażu kolagenu wytwarzanie hydrożelu przebiega poprzez wstępną fazę suszenia, trwającą zazwyczaj od 1 do 3 h, przed etapem płukania w 1x PBS (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Uzyskanie optymalnych efektów topograficznych zależy od precyzyjnej równowagi między czasem a intensywnością etapu płukania. Niewystarczające lub opóźnione płukanie prowadzi do zaburzenia topografii włókien, co objawia się odciskami kryształów soli PBS na fibrylach. Z kolei nadmierne lub przedwczesne płukanie kolagenu po wytwarzaniu skutkuje powstaniem rozpuszczonej warstwy kolagenu, która pokrywa cechy topograficzne (Rysunek 4E,F).

Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) potwierdza obecność uporządkowanej lub losowej orientacji nanowłókien wewnątrz hydrożeli kolagenowych. Zarówno w hydrożelach uporządkowanych, jak i losowych, nanowłókna wykazują średnice włókien w zakresie 30-50 nm29. Jakościowo widoczne jest, że hydrożele uporządkowane zawierają jednoosiowo zorientowane nanowłókna (Rycina 5). Uporządkowanie to zostało wcześniej ilościowo określone za pomocą analizy dwuwymiarowej szybkiej transformaty Fouriera, w której wykres orientacji dla hydrożeli uporządkowanych wykazuje dwa wyraźne piki oddalone od siebie o 180°, w przeciwieństwie do hydrożeli o losowej orientacji, które wykazują jedynie piki niskoczęstotliwościowe28.

Obrazy w jasnym polu pierwotnych mioblastów mięśni szkieletowych myszy ilustrują, że anizotropowe nanotopograficzne prowadzenie włókien kolagenowych sprzyja wyrównaniu komórek (Rysunek 6). Wykazano, że te nanostrukturalne hydrożele kolagenowe indukują wyrównanie komórek nie tylko w mioblastach26, ale także w innych typach komórek, takich jak komórki śródbłonka23,24.

Proces wytwarzania kolagenu o ultrawysokiej gęstości z użyciem membrany dializacyjnej, PEG, przechowywanie kolagenu; etapy przygotowania szkiełek przedmiotowych, nacinanie, łamanie, płukanie. Schemat.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przygotowania kolagenu o ultrawysokiej gęstości oraz cięcia szkiełek przedmiotowych. (A-F) Proces dializy kolagenu: (A) przygotowanie membrany dializacyjnej w postaci 3-calowych pasków i zamocowanie pierwszego klipsa, (B) wprowadzenie kolagenu gęstego z roztworu zapasowego do membrany i zamocowanie drugiego klipsa, (C) otoczenie załadowanej membrany dializacyjnej płatkami glikolu polietylenowego (PEG), (D) usunięcie nasyconych płatków PEG, (E) wypłukanie płatków PEG wodą oraz (F) przechowywanie kolagenu o ultrawysokiej gęstości w probówkach do mikrocentryfugi. (G-L) Proces cięcia szkiełek przedmiotowych: (G) pobranie szkiełek przedmiotowych do badania, (H,I) nacinanie szkiełka przedmiotowego diamentowym przecinakiem do szkła, (J) łamanie szkiełka przedmiotowego od strony nienaciętej, (K) płukanie przeciętego szkła wodą oraz (L) suszenie szkiełka przedmiotowego. Wykonano przy użyciu BioRender. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu ekstruzji kolagenu; tworzenie włókien, wyrównywanie pasm, etapy suszenia hydrożelu.
Rysunek 2: Proces wytwarzania wyrównanego hydrożelu kolagenowego. Krok 1: Ekstruzja kolagenu pod wpływem sił ścinających do podgrzanego buforu 10x PBS i indukcja fibrillogenezy; Krok 2: Montaż ekstrujowanego kolagenu na ciętych szkiełkach przedmiotowych; Krok 3: Montaż dodatkowego ekstrujowanego kolagenu w celu zwiększenia rozmiaru hydrożelu; oraz Krok 4: Suszenie hydrożeli kolagenowych. Wykonano przy użyciu BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat procesu tworzenia hydrożelu: od pojedynczych do wielu pasm, fibrillogeneza, efekty suszenia.
Rycina 3: Proces wytwarzania losowego hydrożelu kolagenowego. Krok 1: Ekstruzja kolagenu na cięte szkiełka przedmiotowe (pojedyncze pasmo); Krok 2: Kontynuacja ekstruzji kolagenu w celu zwiększenia rozmiaru (wiele pasm); Krok 3: Zanurzenie ekstrudowanego kolagenu w 10X buforze PBS w celu zainicjowania fibrillogenezy; oraz Krok 4: Suszenie hydrożeli. Wykonano w programie BioRender. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie grubości powłoki; wyniki SEM; warstwy optymalne/zbyt grube/zbyt cienkie; analiza powierzchni.
Rysunek 4: Możliwe błędy w procesie wytwarzania hydrożelu kolagenowego. (A-F) Przykłady (A) optymalnie grubych pasków kolagenowych, (B) nadmiernie grubych pasków kolagenowych, (C) niewystarczająco grubych pasków kolagenowych, (D) pofalowanych pasków kolagenowych oraz (E,F) nadmiernie wypłukanych powierzchni kolagenowych przedstawione za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej. Pasek skali = 1 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikrograf z Scanning Electron Micrograph, porównanie struktury materiału: nanowłókna uporządkowane kontra losowe.
Rysunek 5: Obrazy z mikroskopii elektronowej skaningowej uporządkowanych i losowych hydrożeli kolagenowych. Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu elektronowego. Parametry wiązki ustawiono na 2 keV, przy zakresie natężenia 25-100 pA i odległości roboczej 4-5 mm. Obrazy zapisano w rozdzielczości 6144 x 4096 pikseli przy czasie przebywania wiązki 1 µs. Pasek skali = 1 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy porównujący wyrównaną i losową orientację włókien w skali 100μm do analizy tkanki.
Rycina 6: Pierwotne mioblasty mysie hodowane na wyrównanych i losowych hydrożelach kolagenowych. Mioblasty były hodowane na hydrożelach przez 3 dni przed obrazowaniem. Obrazy w jasnym polu wykonano przy powiększeniu 10x przy użyciu mikroskopu odwróconego. Strzałka wskazuje wyrównaną orientację nanowłókien. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Krytyczne etapy protokołu można podzielić na trzy główne części: 1) fibrylogenezę kolagenu, 2) montaż hydrożelu i 3) mycie. Proces fibrylokenezy kolagenu zachodzi spontanicznie w warunkach neutralizujących i polega na samoorganizacji pojedynczych cząsteczek kolagenu w większe ustabilizowane struktury fibrylarne10,11. Osiąga się to poprzez zastosowanie neutralizującego buforowanego podłoża, takiego jak 10x PBS, które jest podgrzewane do 37 °C i ma kluczowe znaczenie dla kierowania oddziaływaniami elektrostatycznymi, które zapewniają pełny rozwój kolagenu w włókienka. Wyrównanie fibrylarne w nanoskali uzyskuje się poprzez zastosowanie sił ścinających jednocześnie z występowaniem fibrylogenezy. Obecność lub brak ścinania, a także szybkość ścinania, określą wzór włókienek. Po drugie, montaż hydrożelowy jest kluczowym krokiem we wzmocnieniu stabilności materiału poprzez zapewnienie fizycznych kotwic podczas procesu suszenia, podczas którego następuje skurcz i odwodnienie kolagenu. Ten krok jest szczególnie ważny, jeśli zamierzonym zastosowaniem jest wysiew komórek in vitro, ponieważ mocuje kolagen do sztywnego podłoża, które zapobiega niekontrolowanemu skurczowi. Proces montażu jest nieco inny w przypadku hydrożeli o losowym i wyrównanym wzorze. Prawidłowe przyleganie do losowych hydrożeli wymaga dodatkowego osadzania kolagenu wzdłuż krawędzi powierzchni montażowej (zwykle szkła) przed fibrylogenezą, aby przymocować go do powierzchni. Hydrożele z wyrównanym wzorem są owinięte wokół krawędzi powierzchni montażowej, aby służyć temu samemu celowi kotwienia. Ważną dodatkową kwestią w przypadku wyrównanych hydrożeli jest to, że początkowe umieszczenie paska kolagenowego decyduje o kształcie i jednorodności hydrożelu. Późniejsze umieszczanie paska jest uzależnione od napięcia powierzchniowego zdeponowanego kolagenu, przy czym należy zachować ostrożność, aby nie dotknąć hydrożelu po umieszczeniu. Wreszcie, prawidłowe suszenie hydrożelu i mycie po montażu ma zasadnicze znaczenie dla utrzymania cech topograficznych hydrożelu. Nieodpowiednie suszenie, a następnie mycie 1x PBS lub wodą może prowadzić do powstania rozpuszczonej lub przypominającej zbryloność warstwy kolagenu. Aby temu zapobiec, konieczne jest całkowite wysuszenie hydrożeli, które można wizualnie potwierdzić poprzez tworzenie się kryształów PBS i wzrost nieprzezroczystości kolagenu.

Hydrożele kolagenowe były wykorzystywane zarówno do badań in vitro, jak i do zastosowań inżynierii regeneracyjnej in vivo 23,24,25,26,27. Ważne jest, aby pamiętać, że hydrożele są wytwarzane w niesterylnych warunkach i muszą być wysterylizowane przed jakąkolwiek formą hodowli komórkowej lub przeszczepu. Zalecaną formą sterylizacji jest 70% etanolu, ponieważ inne formy sterylizacji, takie jak światło ultrafioletowe, zakłócą wzór nanowłókien poprzez sieciowanie i degradację cząsteczek kolagenu30. Jednak usuwanie etanolu poprzez etapy parowania i mycia jest ważne dla zminimalizowania resztkowego etanolu, który może być szkodliwy dla kompatybilności komórek. Zmienność kolagenu wyjściowego z partii na partię może prowadzić do zmienności stężenia roboczego dializowanego kolagenu o dużej gęstości, co może wpływać na proces fibrylogenezy. W zależności od zastosowania, losowe wzorce izotropowe mogą być preferowane w stosunku do wyrównanych wzorców anizotropowych; Dlatego w obecnym protokole uwzględniliśmy oba podejścia do modulacji organizacji fibryli.

Ograniczeniem metody wytłaczania opartej na ścinaniu opisanej w tym protokole jest to, że proces ten jest wysoce ręczny i zależny od użytkownika. Potrzebne jest znaczne szkolenie i praktyka, aby skalibrować każdego operatora w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Oznacza to, że przepustowość może być niska i czasochłonna, aby zapewnić precyzję. Niektóre z tych ograniczeń można rozwiązać za pomocą wysoce zautomatyzowanych, opartych na maszynach metod wytwarzania, takich jak druk 3D, elektroprzędzenie oraz litografia miękka i powierzchniowa. Jednak w przeciwieństwie do tych innych metod, ta całkowicie ręczna procedura wytwarzania nanowłókien nie wymaga specjalistycznego sprzętu i jest dostępna i niedroga. Wraz z postępem w metodologiach druku 3D i opłacalnością stale się poprawiają, istnieje potencjał do dostosowania i zintegrowania tego protokołu z technologią druku 3D. Taka integracja, choć jeszcze nie jest możliwa, pozwoliłaby na zwiększenie spójności i przepustowości tego protokołu.

Wytwarzanie dwóch odrębnych topografii hydrożelowych daje wyjątkową okazję do zagłębienia się w nanotopograficzne wskazówki włókien kolagenowych dotyczące morfologii, zachowania i regeneracji komórek. Obserwując reakcję na różne topografie włókienek, możemy uzyskać wgląd w to, w jaki sposób wzorce nanoskali substratu wpływają na fenotyp komórki. Na przykład wcześniejsze prace wskazują, że gdy komórki śródbłonka przyjmują wydłużoną morfologię na wyrównanych nanofibrylach, wykazują fenotyp przeciwzapalny i zwiększoną odporność na zakłócone warunki przepływu24. Odkrycia te nie tylko pogłębiają naszą wiedzę na temat rozwoju zmian miażdżycowych, ale także dają nadzieję na zaprojektowanie przyszłych pomostów miażdżycowych. Te hydrożele kolagenowe mogą być stosowane do zastosowań w inżynierii tkankowej i wzbogacane o czynniki wzrostu lub komórki przed implantacją w celu zwiększenia skuteczności terapeutycznej 25,26,27. Analiza porównawcza ujawnia, że hydrożele o wyrównanej topografii wykazują lepszą regenerację i unaczynienie mięśni w porównaniu z hydrożelami o losowej topografii26 i że te hydrożele mogą być stosowane w formie bezkomórkowej "z półki", jeśli są obciążone miogennymi czynnikami wzrostu w celu poprawy regeneracji tkanek w modelu uszkodzenia myszy27. Podczas gdy do tej pory głównym celem było wykorzystanie tych hydrożeli jako potencjalnych środków terapeutycznych w przypadku urazów mięśni, można je zastosować w szerokim spektrum zastosowań regeneracyjnych i inżynierii tkankowej.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by zadeklarować.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez fundusze Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, Oregon Health & Science University Foundation oraz Collins Medical Trust. K.M.H. był wspierany przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) oraz Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. był wspierany przez granty z NIH/NHLBI (R00HL136701) oraz NIH/NIAMS (R01AR080150).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolagen I, Wysokie stężenie, Ogon szczuraCorningCB354249
Eclipse TE-2000-Umikroskop NikonTE-2000-U Mikroskop odwrócony
Bardzo grube szkiełka mikroskopoweFisher Scientific22-267-005Działa dobrze na powierzchni wytłaczania kolagenu
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificSkaningowy mikroskop elektronowyN/A
Zestaw narzędzi do cięcia szkła 2mm-20mm Ołówek w stylu ołówka Końcówka z węglika spiekanegoAmazon / MOARMORB07Y1D243HOpcja dla noża do szkła
Hamilton Kel-F Hub Blunt Point Needles (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Igły do wytłaczania kolagenu
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819Szkiełka hydrofobowe
Tabletki PBSThermo Fisher Scientific18912014
Glikol polietylenowy 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Bezszwowe rurki do dializy celulozowej Fisher ScientificS25645G
Klipsy do dializy SnakeSkinThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Nóż do szkłaSynthware31-501-927Opcja do noża do szkła

Bibliografia

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nanow knisty kolagenwzorcowanie kolagenufibrillogeneza kolagenumacierz pozakom rkowarurka dializacyjnanapr enie cinaj cehydro el kolagenowyorientacja kom rkowabiomateria y regeneracyjne
Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.