Method Article

Wykorzystanie elastyczności i dynamiki struktury białka docelowego w obliczeniowym odkrywaniu leków przy użyciu analizy dokowania opartej na zespołach

DOI:

10.3791/67174

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Bioinformatics Programme, Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre of Research in Systems Biology, Structural Bioinformatics and Human Digital Imaging (CRYSTAL), Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody obliczeniowe obiecują przyspieszyć odkrywanie leków, jednak często pomijają dynamiczną naturę struktur białkowych. W tym miejscu omawiamy analizę dokowania opartą na zespołach, aby pośrednio uwzględnić elastyczność białek, potencjalnie poprawiając dokładność i niezawodność wysiłków związanych z odkrywaniem leków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces odkrywania leków jest rygorystyczną, czasochłonną i kosztowną operacją. Podejście obliczeniowe w odkrywaniu leków pozwala naukowcom na priorytetowe traktowanie najbardziej obiecujących związków do dalszych testów, co znacznie zmniejszyłoby wymagane zasoby, prowadząc do zwiększenia ogólnej wydajności w procesie odkrywania leków. Odkrywanie leków w oparciu o strukturę jest powszechnym podejściem, które wymaga informacji strukturalnych białka docelowego w formacie trójwymiarowym. Jednak obecnym ograniczeniem większości strategii komputerowego wspomagania odkrywania leków jest ich niezdolność do wprowadzenia elastyczności i dynamiki struktury białka docelowego podczas symulacji dokowania ligand-białko. Podczas gdy zarówno dokowanie indukowane dopasowania, jak i dokowanie oparte na zespołach mają na celu rozwiązanie problemu elastyczności białek w procedurze dokowania, to ostatnie może zapewnić bardziej kompleksowy wgląd w dynamiczne zachowanie białek poprzez włączenie wielu konformacji w całej symulacji. W tym raporcie demonstrujemy i omawiamy zastosowanie techniki zwanej analizą dokowania opartą na zespole, która pośrednio wprowadza elastyczność i dynamikę struktury białka docelowego w procesie dokowania molekularnego. Białko i ligand wybrane do badań dokowania opartych na zespole to odpowiednio lizozym i flowokawaina B (FB). Wcześniej donoszono, że FB ma działanie wiążące z lizozymem. Przeprowadzono symulację dynamiki molekularnej (MD) lizozymu w obecności wody i zbadano energię całkowitą, odchylenie średniokwadratowe (RMSD) i fluktuację średniej kwadratowej (RMSF). Grupowanie konformacji zostało wygenerowane na podstawie kilku wartości odcięcia grupowania i zostało wybrane do dodatkowej analizy dokowania za pomocą FB. Klaster nr 2 daje najniższą energię wiązania na poziomie -29,37 kJ/mol. Wygenerowano molekularne obrazy dokowania, aby przewidzieć obecność sił wiążących. Dzięki uwzględnieniu dynamiki strukturalnej białka, podejście oparte na dokowaniu zespołowym może lepiej uchwycić zakres możliwych scenariuszy wiązania, prowadząc do bardziej wiarygodnych przewidywań wyników wiązania.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obliczeniowym odkrywaniu leków (CDD) techniki z informatyki, chemii, biologii i fizyki są zintegrowane w celu eksploracji rozległej przestrzeni chemicznej, przewidywania interakcji lek-cel i optymalizacji kandydatów na leki z wyższą wydajnością i niższymi kosztami w porównaniu do tradycyjnych metod eksperymentalnych. Jest to potężne podejście, które wykorzystuje metody obliczeniowe i algorytmy w celu przyspieszenia odkrywania i optymalizacji nowych związków terapeutycznych1,2,3. CDD zrewolucjonizowało odkrywanie leków. Istnieją jednak ograniczenia związane z trójwymiarową (3D) dynamiką struktury białek, które mogą wpływać na dokładność i wiarygodność przewidywań obliczeniowych4. Struktury 3D białek służą jako szablony w CDD do projektowania lub optymalizacji kandydatów na leki w oparciu o docelowe interakcje białko-lek. Podczas gdy modele krystalografii rentgenowskiej struktur białkowych dostarczają cennych informacji strukturalnych o białku, konieczne jest rozpoznanie dynamicznej natury struktur białkowych i ograniczeń modeli statycznych5,6,7. Ponadto ostatnie postępy w mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) i przewidywaniach obliczeniowych, takich jak AlphaFold, również znacznie rozszerzyły dostępność danych strukturalnych w uchwyceniu pełnego spektrum elastyczności i dynamiki białek8,9,10,11,12.

Symulacje dynamiki molekularnej (MD) symulują ruch i interakcje atomów i cząsteczek w czasie, dostarczając wglądu w dynamiczne zachowanie i elastyczność struktury 3D białka13,14. Symulacje MD są wykorzystywane do generowania struktur 3D białek reprezentujących różne stany konformacyjne, które służą jako dane wejściowe do analizy dokowania opartej na zespołach. Poprzez próbkowanie różnych konformacji białek, analiza dokowania oparta na zespołach uwzględnia nieodłączną elastyczność i dynamikę celów biologicznych, co pozwala na bardziej wszechstronną eksplorację trybów wiązania ligandów i interakcji3.

Zrozumienie elastyczności białka jest niezbędne, ponieważ wpływa na to, jak leki wywierają swoje efekty biologiczne, określa lokalizację i orientację miejsc wiązania oraz wpływa na kinetykę wiązania, metabolizm i transport15,16. Uchwycenie tej dynamicznej natury może znacznie zwiększyć dokładność i niezawodność prognoz dokowania. W 1994 roku Kearsley i in. wprowadzili elastyczną technikę dokowania, ramę, która modeluje elastyczność zarówno ligandów, jak i białek. Takie podejście pozwala na dostosowanie konformacji białka podczas dokowania, poprawiając przewidywanie interakcji ligand-receptor poprzez uwzględnienie elastyczności strukturalnej17. Podobnie, w 1999 roku, Carlson i in. donieśli o dokowaniu zespołowym, które stosuje elastyczne modelowanie farmakoforowe zarówno do statycznych, jak i dynamicznych modeli integrazy HIV-1, dodatkowo podkreślając znaczenie uwzględniania dynamiki białek w badaniach dokowania18. Co więcej, Cavasotto i wsp. odnotowali również poprawę dokładności dokowania ligandów poprzez włączenie elastyczności receptora do procesu dokowania przy użyciu analizy w trybie normalnym19. Ostatnio techniki oparte na zespołach20,21,22,23,24,25,26,27rozszerzyły odkrywanie leków, identyfikując potencjalne nowe miejsca wiązania ligandów i dostarczając dokładniejszych szacunków wolnej energia wiązania ligand-receptor. Ulepszenia te zostały zastosowane do celów takich jak poczwórny dupleks DNA20, czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165 (VEGF-165)21, enzym docelowy SARS-CoV-222, enzymy cytochromu P450 ludzkiej wątroby23 i białka przeciwnowotworowe24.

Flavokawain B (FB), sklasyfikowana jako flawonoid, została udokumentowana jako wykazująca różne właściwości farmakologiczne28,29,30. Na podstawie analizy eksperymentalnej i obliczeniowej stwierdzono, że FB tworzy stabilny kompleks z lizozymem (LYZ)31, białkiem powszechnie znanym ze swojej aktywności przeciwdrobnoustrojowej, a także zidentyfikowanym jako transporter ligandów32,33,34. W tym raporcie dalej analizujemy charakter interakcji FB z LYZ za pomocą analizy dokowania opartej na zespołach, aby uwzględnić wpływ elastyczności białek w tworzeniu kompleksu FB-LYZ. Celem tej metody jest zapewnienie naukowcom krok po kroku, powtarzalnego procesu analizy dokowania opartej na zespołach. Ponadto zaleca się, aby badacze wybrali struktury białkowe z organizmu docelowego do badań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie struktury ligandu Flavokawaina B

  1. Otwórz witrynę internetową PubChem. Szukaj Flavokawainy B. Wybierz opcję Pobierz i wybierz opcję Zapisz dla struktury SDF 2D jako Structure2D_COMPOUND_CID_5356121.MDL SDF.
  2. Otwórz oprogramowanie Avogadro. Przenieś plik SDF w puste miejsce w oprogramowaniu. Kliknij przycisk Tak.
    UWAGA: Oprogramowanie Avogadro automatycznie zbuduje geometrię trójwymiarową (3D).
  3. Na karcie kliknij ikonę, jak pokazano w Rysunek 1. Na karcie menu po lewej stronie zmień pole siły na MMFF9435,36. Dostosuj kroki dla każdej aktualizacji do 15. Ustaw algorytm na Najbardziej strome zejście i kliknij Start.
    UWAGA: Nie przesuwaj żadnych atomów podczas obrotu. Po zakończeniu kliknij przycisk Zatrzymaj. MMFF94 nadaje się do szerokiej gamy ligandów małocząsteczkowych (w tym zarówno neutralnych, jak i naładowanych) i jest szeroko stosowany do minimalizacji energii i modelowania molekularnego37. Metoda najbardziej stromego spadku została wybrana do początkowej minimalizacji energii, ponieważ jest prosta, wydajna obliczeniowo i skuteczna w usuwaniu dużych odkształceń strukturalnych i osiąganiu podstawowego stanu minimalizacji38,39,40.
  4. Na karcie menu przejdź do Plik i kliknij Zapisz jako. Gdy pojawi się folder Zapisz cząsteczkę jako, wpisz nazwę pliku jako ligand.pdb i kliknij przycisk Zapisz.

2. Przygotowanie struktury białka lizozymu

  1. Otwórz stronę internetową banku danych o białkach RCSB. Wyszukaj lizozym, kod: 1LYZ. Kliknij Pobierz pliki i wybierz Format PDB. Zapisz jako 1lyz.pdb.
  2. Otwórz oprogramowanie Chimera. Na karcie kliknij pozycję Plik i otwórz. W folderze wybierz plik 1lyz.pdb.
    UWAGA: Struktura 3D lizozymu zostanie skonstruowana przy użyciu oprogramowania.
  3. Na karcie kliknij opcję Wybierz > pozostałości > HOH. Następnie kliknij Akcje > Atom/Bonds > Usuń. Kliknij przycisk Zaznacz i wyczyść zaznaczenie.
    UWAGA: Spowoduje to usunięcie wody z białka.
  4. Na karcie kliknij opcję Wybierz > łańcuch > A. Następnie kliknij Narzędzia > Edycja struktury > AddH. Pojawi się pole parametru i pozostawisz je jako domyślne. Kliknij przycisk OK. Kliknij Zaznacz i wyczyść zaznaczenie (Rysunek 2).
    UWAGA: Spowoduje to dodanie wodoru do białka. Reszta histydyny jest również protonowana, aby stworzyć neutralny system. Oprogramowanie może wykonywać obliczenia pKa, integrując PROPKA41,42.
  5. Na karcie, a następnie kliknij Narzędzia, Edycja struktury i Dodaj opłatę. Pojawi się pole parametrów; wybierz Gasteiger. Kliknij przycisk OK. UWAGA: Spowoduje to dodanie częściowych ładunków do białka.
  6. Aby zapisać plik, w zakładce kliknij Plik > Zapisz plik PDB. Zapisz jako białko.pdb.
    UWAGA: W tym badaniu struktura lizozymu została wybrana do porównania z wcześniej zgłoszonym wynikiem31. Zaleca się, aby czytelnicy starannie dobierali struktury białkowe z organizmu docelowego, który ich interesuje.

3. Symulacja MD lizozymu w wodzie

UWAGA: Specjalnie zbudowane komputery do symulacji dynamiki molekularnej (MD) użyte w tym badaniu to Intel CORE i7 11. generacji dla CPU, NVIDIA Geforce RTX 2060 dla GPU i DDR4 128 GB pamięci. System operacyjny to Ubuntu 22.04.4 LTS. Symulacja MD odbywa się przy użyciu oprogramowania GROMACS. Obsługa GPU to CUDA.

  1. Pobierz wszystkie wymagane dokumenty z tego linku: http://www.mdtutorials.com/gmx/lysozyme/01_pdb2gmx.html (Samouczek GROMACS, Lizozym w wodzie)43.
    UWAGA: Potrzebne dokumenty to em.mdp, ions.mdp, md.mdp. npt.mdp, nvt.mdp, charmm36 ff i protein.pdb (od kroku 2.5). Do konfiguracji systemu, em.mdp służy do minimalizacji energii, a ions.mdp służy do dodawania jonów i neutralizacji systemu. Dla równowagi, nvt.mdp służy do równoważenia temperatury, podczas gdy npt.mdp służy do równoważenia ciśnienia. W przypadku produkcji md.mdp służy do symulacji. Charmm36 ff jest przeznaczony do topologii.
  2. Kliknij prawym przyciskiem myszy puste miejsce w folderze (katalogu roboczym) i kliknij Otwórz terminal. Wpisz gmx, aby otworzyć oprogramowanie GROMACS. UWAGA: GROMACS nie posiada graficznego interfejsu użytkownika; To wszystko z polecenia napisanego w terminalu.
  3. Aby wygenerować topologię białka, wpisz gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro –ignh. Podana jest lista pól siłowych i typ 1 dla pola siłowego wszystkich atomów CHARMM44, a następnie typ 1 dla TIP3P dla modelu wodnego.
    UWAGA: Zaktualizowana wersja, CHARMM36, jest również dostępna i można ją pobrać ze strony http://mackerell.umaryland.edu/charmm_ff.shtml45.
  4. Zdefiniuj sześcienne pudełko, aby pokryć całą strukturę białka. Wpisz gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -c -d 1.0 -bt cubic. UWAGA: Białko umieszcza się w odległości co najmniej 1 nm od krawędzi pudełka. Upewnij się, że rozmiar pojemnika na wodę jest wystarczająco duży na białko, rozpuszczalnik i jony. Ponadto pojemnik na wodę powinien być odpowiedni, aby zapobiec interakcjom między okresowymi obrazami białka. Zalecana minimalna odległość między białkiem a krawędzią pudełka wynosi co najmniej 1,0–1,5 nm.
  5. Dla konfiguracji rozpuszczalnika46, wpisz gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
  6. Dodaj jony, takie jak sód i/lub chlorek, wpisując gmx solwatian -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro.
    UWAGA: Jony sodu i/lub chlorku są/są używane do neutralizacji układu.
  7. Zneutralizuj system, wpisując gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -neutral. Wybierz wartość 13 dla grupy SOL.
    UWAGA: W przypadku lizozymu 8 cząsteczek substancji rozpuszczonej zastąpiono jonami chlorkowymi (Rysunek 3).
  8. W pliku CHARMM 36 wyszukaj folder ions.itp. Skrót oznaczający jon chlorkowy to CLA.
  9. Otwórz plik topol.top, dodaj CLA i numer 8, jak pokazano na Rysunek 4.
  10. Otwórz plik solv_ions.gro i zamień wszystkie CL na CLA.
    UWAGA: Upewnij się, że pliki solv_ions.gro i topol.top mają ten sam skrót odpowiednich jonów, w przeciwnym razie pojawi się ostrzeżenie. Zmiana nazwy jonu jest zgodna z wersją pliku CHARMM 36 ff. Ponieważ skrót oznaczający chlorek to już CL, nie ma potrzeby zmiany nazw jonów w starszej wersji. Niemniej jednak zawsze sprawdzaj skrót jonów.
  11. Rozluźnij strukturę białka poprzez minimalizację energii najbardziej stromego zjazdu z maksymalną liczbą 50 000 kroków. W tym celu wpisz gmx grompp -f em.mdp -c solv_ions.gro -p topol.top -o em.tpr, a następnie gmx mdrun -v -deffnm em.
    UWAGA: Rozpuszczalnik i jony są zrównoważone wokół białka w dwóch fazach: (i) liczba cząstek (N), objętość układu (V) i temperatura (T) są stałe (NVT) oraz (ii) liczba cząstek (N), ciśnienie w układzie (P) i temperatura (T) są stałe (NPT). Sprzężenie temperaturowe (faza NVT) jest ustawione na 300 K w oparciu o zmodyfikowany termostat Berendsena, natomiast sprzężenie ciśnieniowe (faza NPT) jest ustawione na 1 bar w oparciu o Parrinello-Rahmana. Oddziaływania elektrostatyczne dalekiego zasięgu i wyszukiwanie najbliższego sąsiada są obliczane automatycznie przy użyciu odpowiednio metody Ewalda (PME) i algorytmu Verleta.
  12. Aby uzyskać równowagę NVT, wpisz gmx grompp -f nvt.mdp -c em.gro -r em.gro -p topol.top -n index.ndx -o nvt.tpr, a następnie gmx mdrun -v -deffnm nvt.
    UWAGA: Czas potrzebny na wyrównanie temperatury wynosi około 5 minut, w zależności od procesora i karty graficznej. Dla równowagi systemu czas symulacji wynosi 100 ps.
  13. Aby uzyskać równowagę NPT, wpisz gmx grompp -f npt.mdp -c nvt.gro -r nvt.gro -t nvt.cpt -p topol.top -o npt.tpr, a następnie gmx mdrun -v -deffnm npt.
    UWAGA: Czas potrzebny do wyrównania ciśnienia wynosi około 5 minut, w zależności od procesora i karty graficznej. Dla równowagi systemu czas symulacji wynosi 100 ps.
  14. Niech system przechodzi przez przebiegi równoważenia przez 1 ns, a następnie przebieg produkcyjny przy użyciu funkcji mdrun o czasie trwania 100 ns. Otwórz plik md.mdp. W n krokach zmień na 50000000; 2 ' 50000000 = 100000 ps (100 ns).
  15. Do produkcji dynamiki molekularnej wpisz gmx grompp -f md.mdp -c npt.gro -t npt.cpt -p topol.top -o md.tpr, a następnie gmx mdrun -v -deffnm md.
    UWAGA: Czas na to wynosi około ~2 dni. Ramki trajektorii wygenerowane na podstawie symulacji MD są rejestrowane w odstępach 10 ps i wykorzystywane do analizy klastrów opartej na odchyleniu średniokwadratowym (RMSD).

4. Analiza klastrów oparta na RMSD

  1. Po symulacji MD kontynuuj analizę poleceń. Białko będzie dyfundować przez komórkę elementarną i może wydawać się "zepsute" lub "przeskoczyć" na drugą stronę pudełka. Wpisz gmx trjconv -s md.tpr -f md.xtc -o md_center.xtc -center -pbc mol -ur compact. Typ 1 dla wyśrodkowania białka i 0 dla wyjścia systemu. Wpisz vmd em.gro, aby zobrazować białko.
  2. Aby przeprowadzić analizę energii całkowitej, wpisz gmx energy -f md.edr -o totalenergy.xvg i kontynuuj wpisywanie 14 dla całkowitej energii.
    UWAGA: Monitorowanie całkowitej energii ma fundamentalne znaczenie dla zapewnienia wiarygodności i poprawności symulacji MD47,48.
  3. Aby przeprowadzić analizę RMSD, wpisz gmx rms -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsd.xvg -tu ns. Kontynuuj wpisywanie 3 dla C-alfa dopasowania metodą najmniejszych kwadratów i 3 dla C-alfa w obliczeniach RMSD (Rysunek 5).
  4. W przypadku analizy RMSF wpisz gmx rmsf -s md.tpr -f md_center.xtc -o rmsf.xvg –res. Kontynuuj do typu 1 dla białka.
  5. Aby użyć łaski, wpisz to polecenie xmgrace totalenergy.xvg. Dostosuj osie, klikając dwukrotnie linię pola wykresu. Pojawi się pole Grace: Axes. Kliknij przycisk Akceptuj.
  6. W menu kart kliknij polecenie Plik i Print_setup. Pojawi się Grace: Device setup (Konfiguracja urządzenia). Zmień urządzenie z PostScript na JPEG. Kliknij przycisk Akceptuj. Teraz kliknij Drukuj w menu plików. Zapisz jako totalenergy.jpg.
  7. Powtórz kroki 4.5 i 4.6 dla xmgrace rmsd.xvg i xmgrace rmsfxvg.
  8. W przypadku analizy skupień wpisz gmx cluster –s md.tpr –f md_center.xtc –g cluster.log –sz rozmiar-klastra.xvg –clid clus-id.xvg –cl cluster.pdb –cutoff 1.0. Przejdź do typu 1 (grupa białkowa), aby obliczyć dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów oraz RMSD i typ 1 (grupa białkowa) dla wyjścia systemu.
    UWAGA: Dostosuj wartość odcięcia zgodnie z wynikiem grupowania. Polecenie -cl reprezentuje dane wyjściowe średniej dla każdego klastra.
  9. Otwórz plik cluster-size.xvg.
    1. Na podstawie podanych informacji zwiększ wartość odcięcia RMSD, jeśli liczba klastrów jest niska, lub zmniejsz wartość odcięcia RMSD, jeśli liczba klastrów jest wysoka.
  10. Powtórz krok 4.8 z różnymi wartościami odcięcia.
    UWAGA: Grupowanie z różnymi wartościami odcięcia do momentu określenia optymalnej wartości odcięcia RMSD na podstawie następujących kryteriów: (1) Całkowita liczba klastrów powinna być ograniczona do mniej niż 30. (2) Preferowane jest minimalizowanie obecności klastrów z tylko jednym elementem. (3) Pożądane jest, aby ponad 90 % trajektorii było reprezentowane w mniej niż 10 klastrach.
  11. Otwórz oprogramowanie Chimera i wyszukaj plik cluster.pdb.
    UWAGA: plik cluster.pdb zawiera średnią dla każdej grupy klastrów.
  12. Kliknij pozycję Prezenty i publikacja 1 (sylwetka, zaokrąglona wstążka).
  13. Następnie przejdź do Plik > Zapisz obraz > Zapisz.
  14. Kliknij opcję Wybierz > łańcuch > (bez identyfikatora) > cluster.pdb . Kliknij opcję Wybierz > Odwróć (wszystkie modele). Kliknij Akcje > Atomy/Wiązania > usuń.
    UWAGA: Spowoduje to usunięcie wszystkich klastrów grupowych z wyjątkiem klastra 1.
  15. Następnie przejdź do Plik > zapisz plik PDB > zapisz. Zapisz jako cluster1.pdb.
  16. Powtórz kroki 4.11–4.15 dla różnych klastrów. Zapisz jako cluster2.pdb, cluster3.pdb i cluster4.pdb.
    UWAGA: Ponieważ całkowita liczba 4 pierwszych klastrów wynosi ponad 90% całkowitych trajektorii, każdy przedstawiciel 4 pierwszych klastrów jest ekstrahowany i poddawany analizie dokowania molekularnego przy użyciu Chimery (Zobacz Rysunek 6).

5. Dokowanie oparte na zespołach

  1. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie Autodock Tools.
    UWAGA: Do dokowania w tym badaniu użyto oprogramowania AutoDock i narzędzi AutoDock13,49,50,51.
  2. Umieść pliki cluster1.pdb i ligand.pdb w nowym folderze.
  3. W menu kliknij polecenie Plik > Preferencje > Ustaw. Pojawi się okno Ustaw preferencje użytkownika. Skopiuj adres "nowego folderu" jako tekst. Wklej adres w katalogu startowym w polu Ustaw preferencje użytkownika. Kliknij przycisk Ustaw.
    UWAGA: Jest to ważny krok w przypadku korzystania z systemu operacyjnego Windows.
  4. Kliknij niebieski obraz folderu. Pojawi się folder z odczytaną cząsteczką. Wybierz cluster1.pdb.
    UWAGA: Narzędzia Autodock odczytają strukturę molekularną białka.
  5. Kliknij przycisk Edytuj opłaty > > Dodaj opłaty Kollmana. Następnie kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Edytuj > Wodory > Scal niepolarne.
    UWAGA: Do białka dodawane są ładunki Kollmana.
  6. Kliknij Siatka > Makrocząsteczki > wybierz. Pojawi się okno Wybierz makrocząsteczki. Wybierz klaster1 i kliknij Wybierz cząsteczki. Kliknij przycisk OK. Pojawi się zmodyfikowany plik makromolekuły AutoDock4. Zapisz jako cluster1.pdbqt.
  7. Opróżnij obszar roboczy, klikając Edytuj > Usuń > Usuń wszystkie cząsteczki. Kliknij Dalej.
  8. Kliknij Ligand > dane wejściowe > Otwórz. Pojawi się plik Ligand dla folderu Autodock4. Wybierz opcję Wszystkie pliki, wybierz plik ligand.pdb i kliknij przycisk Otwórz. Kliknij przycisk OK.
    UWAGA: Ligand konfiguracyjny będzie zawierał włączenie ładunków Gasteigera i połączenie wodoru niepolarnego.
  9. Kliknij Ligand > Drzewo skręcające > Wykryj pierwiastek.
  10. Kliknij Ligand > Output (Wyjście) > Save as PDBQT. Pojawi się sformatowany folder Autotors Molecules. Zapisz jako ligand.pdbqt.
  11. Opróżnij obszar roboczy, klikając Edytuj > Usuń > Usuń wszystkie cząsteczki. Kliknij przycisk Kontynuuj.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w kroku 5.6.
  12. Kliknij Siatka > Makrocząsteczki > otwórz. Wybierz cluster1.pdbqt i kliknij przycisk Otwórz. Kliknij przycisk Tak. Kliknij przycisk OK.
  13. Kliknij przycisk Siatka> Ustaw typy map > otwórz Ligand. Wybierz plik ligand.pdbqt i kliknij przycisk Otwórz.
    UWAGA: W przestrzeni roboczej znajdują się białka i ligandy.
  14. Kliknij pozycję Siatka i pole siatki. Pojawi się okno Opcje siatki. W polu Liczba punktów w wymiarze x dostosuj parametr na 120, a w polu Liczba punktów w wymiarze y ustaw wartość 120, a w polu Liczba punktów w wymiarze z ustaw wartość 120. Ustaw odstęp (angstrem) na 0,375. Pozostaw parametry środkowego pola siatki jako domyślne. Kliknij Plik i zamknij zapisywanie current.
    UWAGA: Pudełko siatki zakrywa całe białko, co oznacza, że jest to ślepe dokowanie.
  15. Kliknij Siatka > Wyjście > Zapisz GPF. Pojawi się plik wyjściowy parametrów siatki. W polu Nazwa pliku wpisz grid.gpf i kliknij przycisk Zapisz.
  16. Kliknij przycisk Uruchom i uruchom AutoGrid. Pojawi się okno Uruchom autosiatkę. Na karcie Nazwa pliku parametrów kliknij przycisk Przeglądaj. Pojawi się plik parametrów Autogrid. Wybierz grid.gpf. Kliknij przycisk Otwórz. Na ścieżce programu > przeglądaj. Pojawi się plik autogrid4. Wyszukaj autogrid4.exe i kliknij Otwórz > Launch.
    UWAGA: Upewnij się, że nazwa folderu nie zawiera żadnych spacji, ponieważ może to spowodować błąd podczas uruchamiania. Folder >autogrid4.exe można zainstalować z https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  17. Kliknij opcję Dokowanie > Makrocząsteczki> Ustaw sztywne nazwy plików. Pojawi się plik makromolekuł PDBQT. Wybierz cluster1.pdbqt i kliknij przycisk Otwórz.
  18. Kliknij Dokowanie > Ligand > wybierz. Pojawi się okno Wybierz ligandy. Wybierz ligand i kliknij przycisk Wybierz ligand. Pojawi się okno Parametr liganda AutoDpf4. Kliknij przycisk Akceptuj.
  19. Kliknij opcję Dokowanie > Parametr wyszukiwania > Algorytm genetyczny. Pojawi się okno Parametry algorytmu genetycznego. Zmień liczbę przebiegów ogólnie dostępnych na 100. Pozostaw pozostałe parametry jako domyślne. Kliknij przycisk Akceptuj.
  20. Kliknij opcję Docking > Output (Dokowanie) > Lamarckian GA(4.2). Pojawi się plik wyjściowy parametrów dokowania Autodock4.2 GALS. Jako nazwę pliku wpisz docking.dpf i kliknij przycisk Zapisz.
  21. Kliknij przycisk Uruchom > Uruchom AutoDock. Pojawi się okno Uruchom autodokowanie. W polu Nazwa pliku parametru kliknij przycisk Przeglądaj. Zostanie wyświetlony plik parametrów autodock4. Wybierz plik docking.dpf. Kliknij przycisk Otwórz. W polu Nazwa ścieżki programu kliknij przycisk Przeglądaj. Pojawi się plik autodock4. Wyszukaj autodock4.exe i kliknij przycisk Otwórz. Kliknij Launch.
    UWAGA: Upewnij się, że nazwa folderu nie zawiera spacji, ponieważ może to spowodować błąd podczas uruchamiania. Czas potrzebny na wykonanie to ~30 min. Folder autodock4.exe można zainstalować za pomocą linku: https://autodock.scripps.edu/download-autodock4/.
  22. Usuń wszystkie cząsteczki zgodnie z opisem w kroku 5.7.
  23. Powtórz kroki od 5.1 do 5.22 dla cluster2.pdb, cluster3.pdb i cluster4.pdb.
    UWAGA: Wszystkie 4 grupy dokowania zostaną użyte do analizy.

6. Analiza dokowania oparta na zespołach

  1. Użyj oprogramowania AutoDock Tools, aby kontynuować analizę. Kliknij przycisk Analizuj > dokowanie > otwórz. Pojawi się plik dziennika dokowania. Wybierz plik docking.dlg i kliknij przycisk Otwórz. Następnie kliknij przycisk OK.
  2. Kliknij przycisk Analizuj > makrocząsteczki> otwórz.
  3. Kliknij Analizuj > konformacje > Graj, uszeregowane według energii. Pojawi się pole liganda.
  4. W nowym folderze otwórz folder docking.dlg za pomocą notatnika. Wyszukaj analizę skupień konformacji. Na podstawie podanych informacji wyszukaj przebieg konformacji (określany jako Run), który ma najniższą energię wiązania.
    UWAGA: Ponieważ przeprowadza się 100 konformacji, tylko jedna ma najsilniejsze powinowactwo wiązania między ligandem a białkiem. Termin określający najniższą energię wiązania jest zdefiniowany jako posiadający silniejsze powinowactwo wiązania52,53,54.
  5. W kroku 6.3 (pole liganda) wprowadź przebieg konformacji (od kroku 6.4) i naciśnij Enter.
    UWAGA: Ligand odpowiednio ustawi się wewnątrz białka.
  6. W polu liganda kliknij przycisk otwórz panel, aby zmienić opcję odtwarzania. Pojawi się pole Ustaw opcję odtwarzania. Kliknij pozycję Write Complex (Zapis złożony). Pojawi się kompleks zapisu folderu receptora. Zapisz jako complex.pdb.
    UWAGA: Ponieważ istnieją 4 grupy klastrów, plik complex.pdb może mieć odpowiednią nazwę, na przykład complex1.pdb dla grupy klastrów 1.
  7. Otwórz oprogramowanie Chimera i wyszukaj plik complex.pdb (jak w kroku 6.6).
  8. Kliknij pozycję Ustawienia predefiniowane > Interaktywne 1 (wstążki) > Publikacja 1 (sylwetka, zaokrąglona wstążka).
  9. Następnie przejdź do Plik i kliknij Zapisz obraz.
    UWAGA: Zapisany obraz jest strukturą wstęgową kompleksu FB-LYZ.
  10. Kliknij opcję Ustawienia predefiniowane > Interaktywne 3 (powierzchnia hydrofobowa) > Publikacja 1 (sylwetka, zaokrąglona wstążka).
    UWAGA: Zapisany obraz przedstawia strukturę balonową kompleksu FB-LYZ.
  11. Otwórz oprogramowanie Discovery Studio.
  12. Przeciągnij plik complex.pdb w puste miejsce oprogramowania.
  13. Kliknij kartę Narzędzia i wybierz opcję Pokaż diagram 2D.
    UWAGA: Oprogramowanie automatycznie wygeneruje strukturę 2D złożonego (Rysunek 7).
  14. Kliknij Plik i Zapisz jako. Wpisz nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktura chemiczna i reprezentacja strukturalna 3D FB po optymalizacji są pokazane w Rysunek 8A. Rysunek 8B pokazuje strukturę 3D lizozymu z kodem pdb 1LYZ w stanie początkowym przed symulacją MD. W celu zbadania dynamiki i elastyczności struktury 3D lizozymu przeprowadzono symulację MD dla 100 ns. Całkowita energia struktury białka była stabilna podczas symulacji, jak pokazano na Rysunek 9A. Pierwsze 20 ns s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie zespołowe w obliczeniowym odkrywaniu leków obejmuje wykorzystanie licznych zespołów konformacyjnych pochodzących ze struktur krystalicznych, badań magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) lub symulacji dynamiki molekularnej26. Wykorzystanie wielu konformacji obliczeniowych pozwoliłoby na uwzględnienie w analizie dynamiki i elastyczności struktury białka, co doprowadziłoby do zwiększenia dokładności i wiarygodności w identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie są im znane żadne konkurencyjne interesy finansowe ani powiązania osobiste, które mogłyby mieć wpływ na pracę opisaną w tym artykule.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Universiti Malaya RMF Grant, numer projektu RMF1392-2021 z Universiti Malaya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AutoDockThe Scripps Research Institute, USWersja 4.2.6
AutoDock ToolsThe Scripps Research Institute, USWersja 1.5.6
AvogadroGeoffrey R Hutchison, Wydział Chemii, University of Pittsburgh, Pittsburgh, USAWersja 1.95
Discovery StudioDassault Systè mes, Massachusetts, wersjaamerykańska 2021
GROMACsUniwersytet w Groningen
Królewski Instytut Technologiczny
Uniwersytet w Uppsali, Szwecja		Wersja 2023
UCSF ChimeraResource for Biocomputing, Visualization and Informatics
Uniwersytet Kalifornijski		w wersji 1.16

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niazi, S. K., Mariam, Z. Computer-aided drug design and drug discovery: a prospective analysis. Pharmaceuticals (Basel). 17 (1), 22(2023).
  2. Sadybekov, A. V., Katritch, V. Computational approaches streamlining drug discovery. Nature. 616 (7958), 673-685 (2023).
  3. Sliwoski, G., Kothiwale, S., Meiler, J., Lowe, E. W. Jr Computational methods in drug discovery. Pharmacol Rev. 66 (1), 334-395 (2014).
  4. Adelusi, T. I., et al. Molecular modeling in drug discovery. Informatics Med Unlocked. 29, 100880(2022).
  5. Durrant, J. D., McCammon, J. A. Computer-aided drug-discovery techniques that account for receptor flexibility. Curr Opin Pharmacol. 10 (6), 770-774 (2010).
  6. Korb, O., et al. Potential and limitations of ensemble docking. J Chem Inf Model. 52 (5), 1262-1274 (2012).
  7. Strecker, C., Meyer, B. Plasticity of the binding site of renin: optimized selection of protein structures for ensemble docking. J Chem Inf Model. 58 (5), 1121-1131 (2018).
  8. Pak, M. A., et al. Using AlphaFold to predict the impact of single mutations on protein stability and function. PLoS One. 18 (3), e0282689(2023).
  9. Jumper, J. M., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  10. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  11. Nakane, T., Kimanius, D., Lindahl, E., Scheres, S. H. Characterisation of molecular motions in cryo-EM single-particle data by multi-body refinement in RELION. eLife. 8, e36861(2018).
  12. Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
  13. Zhao, H., Caflisch, A. Molecular dynamics in drug design. Eur J Med Chem. 91, 4-14 (2015).
  14. Meng, X. Y., Zhang, H. X., Mezei, M., Cui, M. Molecular docking: a powerful approach for structure-based drug discovery. Curr Comput Aided Drug Des. 7 (2), 146-157 (2011).
  15. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  16. Teague, S. J. Implications of protein flexibility for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2 (7), 527-541 (2003).
  17. Kearsley, S. K., Underwood, D. J., Sheridan, R. P., Miller, M. D. Flexibases: a way to enhance the use of molecular docking methods. J Comput Aided Mol Des. 8 (5), 565-582 (1994).
  18. Carlson, H. A., Masukawa, K. M., McCammon, J. A. Method for including the dynamic fluctuations of a protein in computer-aided drug design. J Phys Chem A. 103 (49), 10213-10219 (1999).
  19. Cavasotto, C. N., Kovacs, J. A., Abagyan, R. A. Representing receptor flexibility in ligand docking through relevant normal modes. J Am Chem Soc. 127 (26), 9632-9640 (2005).
  20. Akbari, Z., et al. HOMO-LUMO analysis and ensemble docking studies of Zn(II) complexes of bidentate and tetradentate Schiff base ligands as antileukemia agents. J Mol Struct. 1301, 137400(2024).
  21. Go, Y. J., Kalathingal, M., Rhee, Y. M. An ensemble docking approach for analyzing and designing aptamer heterodimers targeting VEGF165. Int J Mol Sci. 25 (7), 4066(2024).
  22. Ismail, C. M. K. H., et al. An ensemble docking-based virtual screening and molecular dynamics simulation of phytochemical compounds from Malaysian Kelulut Honey (KH) against SARS-CoV-2 target enzyme, human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE-2). J Biomol Struct. , (2024).
  23. Roy, P., et al. Elucidating the mechanism of metabolism of cannabichromene by human cytochrome P450s. J Nat Prod. 87 (4), 639-651 (2024).
  24. Garai, S., Thomas, J., Dey, P., Das, D. LGBM-ACp: an ensemble model for anticancer peptide prediction and in silico screening with potential drug targets. Mol Divers. 28 (4), 1965-1981 (2024).
  25. Broughton, H. B. A method for including protein flexibility in protein-ligand docking: improving tools for database mining and virtual screening. J Mol Graph Model. 18 (3), 247-257 (2000).
  26. Amaro, R. E., et al. Emerging methods for ensemble-based virtual screening. Curr Top Med Chem. 10 (1), 3-13 (2010).
  27. Amaro, R. E., et al. Ensemble docking in drug discovery. Biophys J. 114 (10), 2271-2278 (2018).
  28. Chlipała, P., et al. Multienzymatic biotransformation of flavokawain B by entomopathogenic filamentous fungi: structural modifications and pharmacological predictions. Microb Cell Fact. 23 (1), 65(2024).
  29. Kuo, Y. -F., et al. Flavokawain B, a novel chalcone from Alpinia pricei Hayata with potent apoptotic activity: involvement of ROS and GADD153 upstream of mitochondria-dependent apoptosis in HCT116 cells. Free Radic Biol Med. 49 (2), 214-226 (2010).
  30. Mohd Sakeh, N., et al. Melanogenic inhibition and toxicity assessment of flavokawain A and B on B16/F10 melanoma cells and zebrafish (Danio rerio). Molecules. 25, (2020).
  31. Feroz, S. R., et al. Interaction of flavokawain B with lysozyme: a photophysical and molecular simulation study. J Luminescence. 160, 101-109 (2015).
  32. Ding, F., et al. Potential toxicity and affinity of triphenylmethane dye malachite green to lysozyme. Ecotoxicol Environ Saf. 78, 41-49 (2012).
  33. Paramaguru, G., Kathiravan, A., Selvaraj, S., Venuvanalingam, P., Renganathan, R. Interaction of anthraquinone dyes with lysozyme: evidences from spectroscopic and docking studies. J Hazard Mater. 175 (1), 985-991 (2010).
  34. Ding, F., Zhao, G., Huang, J., Sun, Y., Zhang, L. Fluorescence spectroscopic investigation of the interaction between chloramphenicol and lysozyme. Eur J Med Chem. 44 (10), 4083-4089 (2009).
  35. Halgren, T. A. Merck molecular force field. II. MMFF94 van der Waals and electrostatic parameters for intermolecular interactions. J Comput Chem. 17 (5-6), 520-552 (1996).
  36. Sulimov, A. V., et al. Evaluation of the novel algorithm of flexible ligand docking with moveable target-protein atoms. Comput Struct Biotechnol J. 15, 275-285 (2017).
  37. Ehrman, J. N., et al. Improving small molecule force fields by identifying and characterizing small molecules with inconsistent parameters. J Comput Aided Mol Des. 35 (3), 271-284 (2021).
  38. Chaudhuri, D., Majumder, S., Giri, K. Repurposing of drugs targeting heparan sulphate binding site of dengue virus envelope protein: an in silico competitive binding study. Mol Divers. 29 (1), 87-101 (2024).
  39. Wu, N., et al. Elucidation of protein-ligand interactions by multiple trajectory analysis methods. Phys Chem Chem Phys. 26 (8), 6903-6915 (2024).
  40. Brooks, B. R., et al. CHARMM: a program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations. J Comput Chem. 4 (2), 187-217 (1983).
  41. Li, H., Robertson, A. D., Jensen, J. H. Very fast empirical prediction and rationalization of protein pKa values. Proteins. 61 (4), 704-721 (2005).
  42. Powers, N., Jensen, J. H. Chemically accurate protein structures: validation of protein NMR structures by comparison of measured and predicted pKa values. J Biomol NMR. 35 (1), 39-51 (2006).
  43. Lemkul, J. A. From proteins to perturbed Hamiltonians: a suite of tutorials for the GROMACS-2018 molecular simulation package [Article v1.0]. Living J Comput Mol Sci. 1 (1), 5068(2018).
  44. Best, R. B., et al. Optimization of the additive CHARMM all-atom protein force field targeting improved sampling of the backbone ϕ, ψ and side-chain χ1 and χ2 dihedral angles. J Chem Theory Comput. 8 (9), 3257-3273 (2012).
  45. Huang, J., et al. CHARMM36m: an improved force field for folded and intrinsically disordered proteins. Nat Methods. 14 (1), 71-73 (2017).
  46. Bondi, A. van der Waals volumes and radii. J Phys Chem. 68 (3), 441-451 (1964).
  47. Shukla, R., Tripathi, T. Computer-aided drug design. , Springer Singapore. Singapore. (2020).
  48. Vlachakis, D., Bencurova, E., Papangelopoulos, N., Kossida, S. Advances in Protein Chemistry and Structural Biology. , Elsevier, Academic Press. Swansea. (2014).
  49. Forli, S., Olson, A. J. A force field with discrete displaceable waters and desolvation entropy for hydrated ligand docking. J Med Chem. 55 (2), 623-638 (2012).
  50. Cosconati, S., et al. Virtual screening with AutoDock: theory and practice. Expert Opin Drug Discov. 5 (6), 597-607 (2010).
  51. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  52. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 3502514(2018).
  53. Ivanova, L., Karelson, M. The impact of software used and the type of target protein on molecular docking accuracy. Molecules. 27 (24), 9041(2022).
  54. Mohapatra, R. K., et al. Comparison of the binding energies of approved mpox drugs and phytochemicals through molecular docking, molecular dynamics simulation, and ADMET studies: an in silico approach. J Biosaf Biosecur. 5 (3), 118-132 (2023).
  55. Mude, L., et al. Molecular insights in repurposing selective COX-2 inhibitor celecoxib against matrix metalloproteinases in potentiating delayed wound healing: a molecular docking and MMPB/SA based analysis of molecular dynamic simulations. J Biomol Struct Dyn. 42 (5), 2437-2448 (2024).
  56. Uttarkar, A., Rao, V., Bhat, D., Niranjan, V. Disaggregation of amyloid-beta fibrils via natural metabolites using long timescale replica exchange molecular dynamics simulation studies. J Mol Model. 30 (3), 61(2024).
  57. Liang, J. J., Pitsillou, E., Hung, A., Karagiannis, T. C. A repository of COVID-19 related molecular dynamics simulations and utilisation in the context of nsp10-nsp16 antivirals. J Mol Graph Model. 126, 108666(2024).
  58. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  59. Polikar, R. Ensemble based systems in decision making. IEEE Circ Syst Mag. 6 (3), 21-45 (2006).
  60. Ballester, P. J., Mitchell, J. B. A machine learning approach to predicting protein-ligand binding affinity with applications to molecular docking. Bioinformatics. 26 (9), 1169-1175 (2010).
  61. Yang, X., Huang, K., Yang, D., Zhao, W., Zhou, X. Biomedical big data technologies, applications, and challenges for precision medicine: a review. Global Chall. 8 (1), 2300163(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ensemble Based DockingProtein Structure FlexibilityMolecular Dynamics SimulationStructure Based Drug DiscoveryProtein Conformation ClusteringLigand DockingRoot Mean Square DeviationFlavokawain B BindingElectrostatic Surface MappingComputational Drug Discovery

Related Articles