Badanie przesiewowe fragmentów kowalencyjnych przy użyciu ilościowego testu nieodwracalnego wiązania

Podsumowanie

Ilościowy test nieodwracalnego wiązania (qIT) jest opartą na fluorescencji metodą identyfikacji kowalencyjnych fragmentów, które selektywnie łączą się z docelowym białkiem. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół opisujący test qIT, wraz z przykładowymi wynikami.

Streszczenie

Związki, które tworzą wiązania kowalencyjne z określonymi białkami docelowymi, oferują wiele zalet jako sondy chemiczne i środki terapeutyczne. Najczęściej umiarkowanie reaktywne, elektrofilowe małe cząsteczki są wykorzystywane do tworzenia wiązań kowalencyjnych z wybranymi łańcuchami bocznymi cysteiny w określonych białkach. Elektrofilowe podejścia do odkrywania ligandów, w ramach których biblioteka elektrofilowych małych cząsteczek jest przesiewana pod kątem celu białkowego, stały się popularne, ponieważ pozwalają uniknąć czasochłonnej instalacji elektrofilowej głowicy bojowej. Takie badanie przesiewowe jest jednak skomplikowane, ponieważ ligandy elektrofilowe mogą wykazywać szeroki zakres różnych szybkości spontanicznej reakcji z cysteinami. Ilościowo-nieodwracalne tethering (qIT) oferuje opartą na fluorescencji metodę identyfikacji i rozwoju trafień, która normalizuje dane dotyczące tych różnic w wewnętrznej reaktywności związków. Określa się szybkość reakcji poszczególnych związków z białkiem docelowym i porównuje je z reaktywnością związku z nieustrukturyzowanym tripeptydem glutationem (jest to wskaźnik zastępczy dla spontanicznej reakcji związku), co umożliwia identyfikację związków, które preferencyjnie reagują z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Metodologia ta została z powodzeniem zastosowana do identyfikacji selektywnych fragmentów kowalencyjnych przeciwko kilku celom leków, w tym głównej proteazie SARS-CoV-2, kinazie zależnej od cykliny 2 i RAP27A. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie qIT do białka docelowego w celu wygenerowania ilościowego i solidnego zestawu danych, co pozwala na priorytetyzację ligandów trafień dla przyszłego rozwoju.

Wprowadzenie

Ligandy kowalencyjne ukierunkowane na cysteinę (cząsteczki wywierające efekt biologiczny poprzez reakcję z wybranym resztą cysteiny w konkretnym białku) stały się coraz popularniejsze jako narzędzia chemiczne i środki terapeutyczne w ostatnich dziesięcioleciach¹. Zazwyczaj składają się one z lekko reaktywnego elektrofila (takiego jak akrylamid, chloroacetamid lub winylosulfon) przyłączonego do fragmentu liganda o wysokim powinowactwie do białka docelowego². W idealnych warunkach oddziaływanie ligand-białko przebiega według dwuetapowego mechanizmu, obejmującego początkowe niekowalencyjne wiązanie liganda, a następnie nieodwracalne utworzenie wiązania kowalencyjnego między cysteiną docelową a elektrofilem³.

Kilka wczesnych celowanych ligandów kowalencyjnych, w tym inhibitor kinazy tyrozynowej Brutona – Ibrutynib, zostało opracowanych poprzez wyposażenie wcześniej zidentyfikowanego ligandu odwracalnego w grupę elektrofiliową⁴. Jednak podejście to nie zawsze okazuje się skuteczne, a w innych próbach stwierdzono, że wprowadzenie elektrofila wymaga znacznej optymalizacji⁵. Zamiast tego, w ostatnich latach większą popularność zyskały podejścia typu „najpierw elektrofil”, w szczególności z wykorzystaniem fragmentów elektrofiliowych. Typowo polegają one na inkubowaniu biblioteki elektrofilów z białkiem, a następnie wyborze związków o zwiększonej szybkości reakcji z cysteiną, co zakłada indukowanie tego procesu przez produktywne oddziaływania niewalencyjne pomiędzy ligandem a kieszenią wiążącą⁶. Warto zaznaczyć, że metody te zostały z sukcesem zastosowane podczas opracowywania inhibitora KRAS (G12C) – Sotorasibu¹.

Przesiewy z pierwszeństwem dla elektrofilów stawiają kilka unikalnych wyzwań w porównaniu do tradycyjnych przesiewów ligandów niewalencyjnych, głównie ze względu na wysoką zmienność reaktywności w obrębie i pomiędzy klasami grup reaktywnych (warheads)⁷. Większość elektrofilów reagujących z cysteiną będzie z czasem reagować ze wszystkimi dostępnymi w rozpuszczalniku resztami cysteiny, niezależnie od jakiejkolwiek selektywnej interakcji z białkiem docelowym. Zatem stopień zajęcia ligandem będzie rósł w czasie dla prawie wszystkich elektrofilów, a bez kontrolowania reaktywności wybór trafień (hits) będzie często stronniczy na korzyść bardziej reaktywnych fragmentów, które szybciej wiążą się z celem⁸.

Ponadto metody przesiewowe oparte na uprzednim zastosowaniu elektrofila często wykorzystują spektrometrię mas do wykrywania tworzenia adduktów białko-ligand, co ogranicza ich wydajność⁹. Aby prawidłowo scharakteryzować kinetykę reakcji dla biblioteki związków o zróżnicowanej elektrofilowości, wymagane jest regularne pobieranie próbek reakcyjnych w dłuższym przedziale czasowym (od godzin do dni)¹⁰. W związku z tym przesiewanie 300 fragmentów pobieranych w 10 punktach czasowych wymagałoby wykonania 3000 widm masowych, co przekracza przepustowość większości systemów spektrometrii mas białek. Pożądalne są zatem wydajniejsze metody monitorowania tworzenia adduktów białko-ligand.

Opisane tutaj podejście, test ilościowego nieodwracalnego wiązania (qIT), jest metodą przesiewową typu „pierwsze elektrofil”, która kontroluje reaktywność wewnętrzną i wykorzystuje prosty odczyt fluorescencyjny⁷. Białko lub glutation (nieustrukturalny tripeptyd zawierający grupę tiolową, stosowany jako kontrola reaktywności wewnętrznej) inkubuje się z biblioteką fragmentów elektrofilowych, a regularnie pobierane próbki poddaje się gaszeniu w roztworze CPM (7-dietylamino-3-(4'-maleimidylofenylo)-4-metylokumaryny, fluorogennego czynnika do ilościowego oznaczania grup tiolowych). Powstanie adduktu pomiędzy cysteiną a fragmentem elektrofilowym zmniejsza ilość grup tiolowych dostępnych do reakcji z CPM, co redukuje końcową fluorescencję podczas gaszenia. Fluorescencja CPM służy zatem jako wskaźnik niereagujących grup tiolowych, co pozwala na określenie kinetyki reakcji tiolu z każdym z fragmentów elektrofilowych. Fragmenty elektrofilowe wykazujące znacznie zwiększoną reaktywność z białkiem w porównaniu z glutationem są wybierane jako trafienia i priorytetyzowane do dalszego rozwoju (Rysunek 1).

Rysunek 1: Schemat qIT. Schematyczny przegląd testu qIT (stworzony przy użyciu BioRender). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wybór hitów w oparciu o wartości REF pozwala na kontrolę wewnętrznej reaktywności i zapewnia, że fragmenty są wybierane jako hity tylko wtedy, gdy tworzą produktywne oddziaływania niekowalencyjne z białkiem docelowym. Prosty odczyt fluorescencyjny sprawia również, że test qIT jest wysoce skalowalny i nie wymaga metod monitorowania reakcji opartych na spektrometrii mas.

Poniżej przedstawiono szczegółową procedurę przeprowadzania testu qIT, wraz z przykładowymi wynikami ilustrującymi wydajność analizy oraz proces wyboru hitów.

Protokół

1. Konstrukcja biblioteki fragmentów

1. Zaprojektować bibliotekę fragmentów elektrofilnych, a następnie je zsyntezyzować lub zakupić. Biblioteki fragmentów elektrofilnych zazwyczaj składają się z lekko reaktywnych elektrofilów (takich jak akrylamidy, chloroacetamidy i winylosulfonamidy) przyłączonych do różnorodnego zestawu rusztowań chemicznych. Biblioteki fragmentów elektrofilnych są szeroko dostępne u dostawców komercyjnych, a szczegółowe informacje na temat ich projektowania i konstrukcji zostały omówione w innych opracowaniach^5,11.
2. Rozpuścić każdy związek w DMSO do stężenia 50 mM, a następnie nanieść każdy związek do oddzielnych studzienek w kolumnach od 3 do 22 płyty rezerwuarowej z 384 studzienkami, nazwanej Płytą Biblioteki Fragmentów.
   1. Nanieść DMSO do każdej studzienki w kolumnach 1, 2, 23 i 24 jako kontrole dodatnie i ujemne. Układ płyty może być zmienny w zależności od liczby badanych związków (Rysunek 2). Objętość dodana do płyty bibliotecznej będzie zależeć od liczby przeprowadzonych przesiewów, przyjmując, że na jeden przesiew qIT wymagane jest około 1,8 μL z każdej studzienki. Przygotować tę Płytę Biblioteki Fragmentów z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C.

Rysunek 2: Układ płytki. Przegląd układu płytki 384-dołkowej dla analizy qIT. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie analizy (Rysunek 3)

1. Przygotować następujące roztwory: roztwór białka rekombinowanego (białko docelowe w dowolnym buforze), bufor do testu qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), bufor do przerywania testu qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) oraz roztwory zapasowe związków (fragment elektrofilowy (50 mM) w DMSO).
   UWAGA: W buforze reakcyjnym stosuje się pH 8, aby przyspieszyć reakcję między docelowymi resztami cysteiny a fragmentami, co umożliwia pomiar szybkości reakcji nawet dla fragmentów o bardzo niskiej reaktywności. W buforze do przerywania stosuje się nieco niższe pH 7,5, ponieważ wiązanie tioeterowe utworzone między maleimidem CPM a tiolem cysteiny jest podatne na hydrolizę przy bardziej zasadowych pH (na przykład wcześniejsze prace wykazały, że konjugaty cysteina-maleimid są znacznie stabilniejsze przy pH 7,3 niż przy pH 8¹²).
2. Wyjąć roztwory zapasowe fragmentów w DMSO z przechowywania i pozostawić je w temperaturze pokojowej przez minimum 2 h, aby umożliwić rozmrożenie zapasów związków.
3. Odgazować bufor do testu qIT poprzez przedmuchiwanie gazem argonem przez około 30 min.
4. Dokładnie wymienić bufor roztworu białka docelowego na odgazowany bufor do testu qIT. Kluczowe jest całkowite usunięcie czynników redukujących, takich jak DTT i TCEP, do stężeń < 100 nM, ponieważ będą one zakłócać kwantyfikację tioli. Krok ten można przeprowadzić poprzez powtarzającą się serię wymian buforów, zgodnie z opisem poniżej.
   1. Rozcieńczyć roztwór białka nadmiarem odgazowanego bufora do testu qIT w jednostce z filtrem wirowym, skoncentrować za pomocą wirówki (4000 x g, 4 °C, 15 min) i powtórzyć czynność. Zazwyczaj wymagane jest 4 cykle rozcieńczeń 1:15, aby dostatecznie usunąć DTT (1 mM) z 1 mL roztworu zapasowego białka rekombinowanego, choć krok ten można dostosować w zależności od stężenia czynnika redukującego w pierwotnym roztworze białka rekombinowanego.
      UWAGA: Alternatywnie, ten sam efekt można osiągnąć poprzez dializę roztworu białka docelowego przeciwko dużemu nadmiarowi odgazowanego bufora do testu qIT.
5. Rozcieńczyć roztwór białka docelowego (przygotowany w kroku 2.1) do stężenia białka 15 μM w odgazowanym buforze do testu qIT. Do wypełnienia płytki 384-dołkowej z odpowiednią objętością martwą wymagane jest około 9 mL roztworu białka docelowego.
6. Przygotować 1,5% (v/v) zawiesinę TCEP-agarozy w odgazowanym buforze do testu qIT. Na jedną płytkę przesiewową wymagane jest około 9 mL zawiesiny TCEP-agarozy.
7. Rozdać 20 μL roztworu TCEP-agarozy do każdego dołka dwóch płytek 384-dołkowych.
8. Przygotować roztwór zapasowy glutationu 15 μM w odgazowanym buforze do testu qIT. Należy go przygotować bezpośrednio przed aplikacją na płytkę, ponieważ glutation szybko utlenia się w roztworze bez obecności czynnika redukującego.
9. Rozdać 20 μL buforu do testu qIT do kolumn 1 i 2 obu płytek 384-dołkowych.
10. Rozdać 20 μL roztworu białka lub glutationu o stężeniu 15 μM (zależnie od przeznaczenia płytki) do kolumn 3-24 płytki 384-dołkowej. Płytki te określa się mianem Płytki Reakcyjnej Białka oraz Płytki Reakcyjnej Glutationu. Pozostawić do redukcji w temperaturze pokojowej przez 1 h.
11. Rozdać 58,2 μL odgazowanego buforu do testu qIT do każdego dołka płytki 384-dołkowej, a następnie przenieść 1,8 μL z każdego odpowiadającego dołka Płytki Biblioteki Fragmentów, aby stworzyć Płytkę Rozcieńczeń Związków, w której każdy związek jest rozcieńczony do stężenia 1,5 mM w buforze do testu qIT z dodatkiem 3% DMSO.
    UWAGA: Krok ten jest ułatwiony dzięki zastosowaniu stacji pipetującej 384, która pozwala na przeniesienie zapasów związków do wszystkich dołków w jednej operacji.
12. Po 1-godzinnej inkubacji białka i glutationu z TCEP-agarozą, przenieść 20 μL roztworu związku z każdego dołka Płytki Rozcieńczeń Związków do obu płytek reakcyjnych (białkowej i glutationowej), aby rozpocząć test. Krok ten jest również ułatwiony dzięki zastosowaniu stacji pipetującej 384. Etapy testu przedstawiono w Rysunku 3.
    UWAGA: Stężenie fragmentu można zmieniać według potrzeb, a testy qIT można powtarzać dla hitów przy niższych stężeniach, jeśli jest to pożądane, aby potwierdzić, że powinowactwo do białka nie jest artefaktem wysokiego stężenia fragmentu. Stosuje się stosunkowo wysokie stężenie fragmentu, aby zwiększyć k_pro oraz k_GSH, co zapewnia możliwość wyznaczenia dokładnych szybkości dla związków o niskiej reaktywności (które w warunkach testu mogą wykazywać t_1/2(GSH) > 24 h). Ponadto, choć stężenie fragmentu 500 µM jest wysokie, w przesiewaniu fragmentów stosowano stężenia od wysokich wartości μM do niskich wartości mM, na przykład¹³.
13. Uruchomić stoper – test się rozpoczął, a przerywanie reakcji powinno być wykonywane w regularnych odstępach czasu zgodnie z poniższą sekcją.

Rycina 3: Podsumowanie testu qIT. Podsumowanie przedstawiające kluczowe etapy przygotowania studzienek reakcyjnych w teście qIT. (stworzone za pomocą BioRender). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Gaszenie CPM

UWAGA: Wygaszanie CPM przeprowadza się w celu ilościowego oznaczenia pozostałej ilości niezereagowanych grup tiolowych w płytkach reakcyjnych z białkiem i glutationem. Powinno być ono wykonywane w określonych punktach czasowych (na przykład zazwyczaj stosuje się następujące punkty czasowe: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 i 1440 min), aby umożliwić monitorowanie kinetyki reakcji.

1. Przygotować roztwory zapasowe CPM (500 μM) w DMSO, rozdzielić je w aliquotach po 111,2 µL do probówek do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -20 °C. Roztwory zapasowe CPM można przygotować z wyprzedzeniem; jedna aliquota będzie potrzebna na każdy punkt czasowy wygaszania.
2. Przygotować roztwór wygaszający CPM (1,4 μM), rozmrażając zamrożony roztwór zapasowy CPM (500 μM) i dodając go do 40 mL buforu wygaszającego do testu qIT.
3. Rozdzielić 27 µL roztworu wygaszającego CPM do każdego dołka dwóch płytek 384-dołkowych — dwie płytki są wymagane do wygaszenia reakcji zarówno na płytkach z białkiem, jak i z glutationem. Są one określane jako płytki wygaszające CPM (CPM-Quench Plates); należy je przygotować maksymalnie 30 min przed użyciem.
4. Odwirować płytkę z reakcją białek przy 200 x g przez 3 min, aby upewnić się, że TCEP-agaroza została osadzona w formie pelletu.
5. W określonych punktach czasowych przenieść 3 µL próbki z każdego dołka płytki z reakcją białek do uprzednio napełnionej płytki wygaszającej CPM. Ten krok można ułatwić, korzystając ze stacji pipetującej 384-kanałowej.
6. Wymieszać zawartość płytki wygaszającej CPM poprzez aspirację i dozowanie 3 x 25 µL. Ważne jest, aby pobierać próbkę z górnej części dołka, aby uniknąć zasysania TCEP-agarozy z dna, co zakłóciłoby wygaszanie CPM.
7. Powtórzyć kroki 3.4-3.6 dla płytki z reakcją glutationu.
8. Inkubować płytki wygaszające CPM (przygotowane w punktach 3.4-3.6) w temperaturze pokojowej przez 1 h.
9. Zmierzyć intensywność fluorescencji płytki wygaszającej CPM (wzbudzenie przy 384 nm i emisja przy 470 nm).

4. Analiza danych i wybór trafień

1. Dla każdego wygaszenia oblicz wartość Z' jako miarę jakości testu. Należy odrzucić wszystkie wygaszenia CPM, dla których Z' < 0,5.
   Z' = 1 - ((3σ_{positive control} + 3σ_{negative control}) / (µ_{positive control} - µ_{negative control}))
   Gdzie σ = odchylenie standardowe intensywności fluorescencji, a µ = średnia intensywność fluorescencji
2. Oblicz średnie wartości fluorescencji dla dołków kontroli negatywnej i pozytywnej (odpowiednio kolumny 1 i 2 oraz 23 i 24).
3. Znormalizuj każdy dołek reakcyjny do średnich wartości fluorescencji kontroli pozytywnej i negatywnej:
   % modified = 100 x (compound well fluorescence - negative control fluorescence) / (positive control fluorescence - negative control fluorescence)
4. Wykreśl oddzielnie zależność % modified od czasu dla każdego związku reagującego z glutationem oraz z białkiem docelowym.
5. Dopasuj znormalizowane dane % modified w funkcji czasu do modelu jednofazowego zaniku wykładniczego zarówno dla reakcji z białkiem, jak i z glutationem, korzystając z równania:
   % Modified = ae ^{- kt + c}
   Gdzie a = zakres wartości % modified, k = szybkość reakcji, t = czas, c = wartość % modified w czasie nieskończonym. Dopasowanie krzywej i wyznaczanie parametrów można przeprowadzić za pomocą komercyjnego oprogramowania (takiego jak Graphpad).
6. Wykorzystaj szybkość reakcji fragmentów z białkiem (k_pro) oraz z glutationem (k_GSH) do obliczenia wartości współczynnika przyspieszenia szybkości (REF) dla każdego fragmentu:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Użyj wartości REF do wyboru fragmentów będących trafieniami (hit fragments). Można to zrobić poprzez ustalenie progu REF (np. REF > 3), arbitralnej częstości trafień (np. górne 2%) lub poprzez wybranie fragmentów, których REF jest o 3 odchylenia standardowe większy od średniej geometrycznej.

Wyniki

Analizę qIT zastosowano tutaj w celu zidentyfikowania kowalencyjnych fragmentów dla nienazwanego białka zawierającego jedną cysteinę. Do buforów reakcyjnych dodano MgCl₂ (10 mM), ponieważ wiadomo, że białko docelowe wiąże jony Mg²⁺. Przesiewanie przeprowadzono w trzech powtórzeniach, określając szybkość reakcji każdego fragmentu zarówno z białkiem docelowym (k_pro), jak i z glutationem (k_GSH). Wartości Z' dla wszystkich płytek wygaszających były większe niż 0,5 i wynosiły średnio 0,75 dla wygaszeń białkowych oraz 0,79 dla wygaszeń glutationowych, co wskazuje na doskonałą wydajność analizy. Następnie obliczono wartości REF dla każdego fragmentu, a jako trafienia wybrano te, dla których REF > 3.

Reprezentatywne wyniki (Rycina 4) przedstawiają przykład wyboru hitu przy użyciu testu qIT. Związek 1 reagował z resztą cysteiny w białku docelowym 6,0 razy szybciej niż z glutationem i, przyjmując kryterium REF > 3, został wybrany jako hit (Rycina 4B). Takie przyspieszenie szybkości reakcji wskazuje na występowanie efektu matrycowego, w wyniku którego oddziaływania niekowalencyjne pozycjonują związek 1 w odpowiedniej orientacji, umożliwiając reakcję cysteiny w białku docelowym z grupą chloroacetamidową. W przeciwieństwie do niego, związek 2 jest przykładem fragmentu, który nie jest hitem, ponieważ reakcja między związkiem 2 a docelową resztą cysteiny nie jest przyspieszona w stosunku do reakcji między związkiem 2 a glutationem. Brak przyspieszenia szybkości reakcji wskazuje, że nie występują produktywne oddziaływania niekowalencyjne, które pozycjonowałyby związek 2 w odpowiedniej orientacji do reakcji z docelową resztą cysteiny.

Rysunek 4Reprezentatywne wyniki. Wyniki przedstawiają monitorowanie reakcji białka i glutationu za pomocą qIT dla (A) wysoka reaktywność wewnętrzna, możliwy fałszywie dodatni fragment hitowy oraz (B) fragment hitowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Test qIT stanowi skuteczną i wygodną platformę do badań przesiewowych fragmentów elektrofilowych reagujących na cysteinę w stosunku do białka docelowego. Istnieją jednak krytyczne względy, które mogą utrudnić wykonanie testu, jeśli nie zostaną odpowiednio uwzględnione. Przede wszystkim białka docelowe muszą zawierać tylko jedną cysteinę wystawioną na działanie powierzchni, aby nadawały się do badań przesiewowych qIT, ponieważ inne reszty cysteiny będą reagować z CPM i zakłócać pomiary fluorescencji. W poprzednich przypadkach, w których białka docelowe zawierają wiele cystein wystawionych na działanie powierzchni (takich jak główna proteaza SARS-CoV-2, mała GTPaza RAP27A i kinaza zależna od cykliny 2), wcześniej z powodzeniem stosowano konstrukty przesiewowe z usuniętymi pozostałościami zakłócającymi. Jednak skuteczność tej strategii będzie się różnić w zależności od białka 10,14,15.

Ponadto, ponieważ test qIT mierzy spadek tiolu dostępnego do reakcji z CPM w czasie, każdy czynnik zmniejszający proporcję dostępnych tioli, taki jak utlenianie tiolu lub agregacja białek, może utrudniać wydajność testu. Odgazowanie buforowe i zastosowanie unieruchomionego środka redukującego (TCEP-agaroza) zapewnia, że utlenianie tiolu jest powolne, a wszelkie pozostałe utlenianie powinno być złagodzone poprzez normalizację pomiarów fluorescencji do pomiarów fluorescencji w studzienkach kontroli dodatniej. Jednak problemy mogą się pojawić, gdy nierównomierny rozkład agarozy TCEP między studzienkami powoduje nierównomierne utlenianie tiolu. Spójne powlekanie TCEP-agarozy ma zatem zasadnicze znaczenie dla wydajności testu, co może być trudne, ponieważ cząsteczki agarozy TCEP toną w zbiornikach pipetowania.

Problemem może być również agregacja białek, ponieważ warunki badania (24-godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej) są stosunkowo surowe. Strategie rozwiązywania problemów, takie jak łączenie białek docelowych z solubilizacją znaczników, zmiana reakcyjnych lub wykonywanie testu w niższych temperaturach, mogą zmniejszyć agregację i rozwiązać problemy ze stabilnością białek. Niektóre fragmenty mogą również indukować agregację białek, co ponownie zmniejsza proporcję tiolu dostępnego do reakcji z CPM i powoduje fałszywie dodatnie trafienia. Ortogonalna walidacja trafień przy użyciu spektrometrii mas z nienaruszonymi białkami jest skuteczną metodą wykrywania tych przypadków, ponieważ fałszywie dodatnie trafienia stworzą małą lub żadną populację znakowanych gatunków podczas inkubacji z docelowym białkiem.

Gdy te względy są kontrolowane, test qIT ma pewne wyraźne zalety w porównaniu z innymi metodami przesiewowych fragmentów kowalencyjnych. Selekcja trafień przy użyciu REF zapewnia, że trafienia są wybierane tylko wtedy, gdy tworzą produktywne niekowalencyjne interakcje z białkiem docelowym. Elektrofilowość odłamków różni się w dużych zakresach, zarówno między różnymi głowicami, jak i w obrębie klas głowic; Na przykład, poprzednie prace wykazały kilkasetkrotne różnice w szybkości reaktywności glutationu między akrylamidami¹⁰. Ten szeroki zakres elektrofilowości może utrudniać odróżnienie fragmentów o wysokich wartościach _{k pro} ze względu na efekt szablonu od tych, które są po prostu wysoce reaktywne, co może prowadzić do wyboru wysoce reaktywnych fragmentów jako wyników fałszywie dodatnich. Na przykład 2 reagował z docelową resztą cysteiny szybciej niż 1 i, bez uwzględnienia wewnętrznej reaktywności, może być wybrany jako trafienie. Jednak 2 nie reaguje z docelową resztą cysteiny szybciej niż z glutationem, co wskazuje, że większy k_pro 2 w stosunku do 1 jest spowodowany większą wewnętrzną reaktywnością fragmentu, a nie efektem szablonowym.

Prosty odczyt fluorescencji stosowany w teście qIT do ilościowego oznaczania pozostałego tiolu jest również bardzo korzystny. Inne metody badań przesiewowych fragmentów kowalencyjnych wykorzystują spektrometrię mas nienaruszonych białek do określenia szybkości, z jaką fragmenty reagują z białkiem docelowym i LC-MS do określenia szybkości, z jaką glutation reaguje z fragmentami - obie wymagają specjalistycznego sprzętu i nie mają przepustowości ^8,16. Wygodny odczyt fluorescencji sprawia, że test qIT jest wysoce skalowalny i wymaga tylko powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego.

W połączeniu te innowacje tworzą solidną i skalowalną metodę badań przesiewowych fragmentów kowalencyjnych, która eliminuje potrzebę stosowania sprzętu do spektrometrii mas.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Argon Gas	BOC	I1149
Corning 384-dołkowe, niskokołnierzowe, płaskodenne płytki testowe	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Unieruchomiony TCEP-agaroza	Pierce	77712
Czytnik mikropłytek	CLARIOstar
Uszczelki płytkowe PCR	BioRad	MSA5001
Zredukowany L-glutation	Sigma-Aldrich	G4251
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7