Badanie przesiewowe fragmentów kowalencyjnych przy użyciu ilościowego testu nieodwracalnego wiązania

Summary

Ilościowy test nieodwracalnego wiązania (qIT) jest opartą na fluorescencji metodą identyfikacji kowalencyjnych fragmentów, które selektywnie łączą się z docelowym białkiem. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół opisujący test qIT, wraz z przykładowymi wynikami.

Abstract

Związki, które tworzą wiązania kowalencyjne z określonymi białkami docelowymi, oferują wiele zalet jako sondy chemiczne i środki terapeutyczne. Najczęściej umiarkowanie reaktywne, elektrofilowe małe cząsteczki są wykorzystywane do tworzenia wiązań kowalencyjnych z wybranymi łańcuchami bocznymi cysteiny w określonych białkach. Elektrofilowe podejścia do odkrywania ligandów, w ramach których biblioteka elektrofilowych małych cząsteczek jest przesiewana pod kątem celu białkowego, stały się popularne, ponieważ pozwalają uniknąć czasochłonnej instalacji elektrofilowej głowicy bojowej. Takie badanie przesiewowe jest jednak skomplikowane, ponieważ ligandy elektrofilowe mogą wykazywać szeroki zakres różnych szybkości spontanicznej reakcji z cysteinami. Ilościowo-nieodwracalne tethering (qIT) oferuje opartą na fluorescencji metodę identyfikacji i rozwoju trafień, która normalizuje dane dotyczące tych różnic w wewnętrznej reaktywności związków. Określa się szybkość reakcji poszczególnych związków z białkiem docelowym i porównuje je z reaktywnością związku z nieustrukturyzowanym tripeptydem glutationem (jest to wskaźnik zastępczy dla spontanicznej reakcji związku), co umożliwia identyfikację związków, które preferencyjnie reagują z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Metodologia ta została z powodzeniem zastosowana do identyfikacji selektywnych fragmentów kowalencyjnych przeciwko kilku celom leków, w tym głównej proteazie SARS-CoV-2, kinazie zależnej od cykliny 2 i RAP27A. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie qIT do białka docelowego w celu wygenerowania ilościowego i solidnego zestawu danych, co pozwala na priorytetyzację ligandów trafień dla przyszłego rozwoju.

Introduction

Reagujące na cysteinę ligandy kowalencyjne (cząsteczki, które wywierają efekt biologiczny poprzez reakcję z wybraną resztą cysteiny na określone białko) stały się coraz bardziej popularne jako narzędzia chemiczne i terapeutyczne w ciągu ostatnich dziesięcioleci¹. Zazwyczaj składają się one z umiarkowanie reaktywnego elektrofilu (takiego jak akrylamid, chloroacetamid lub sulfonu winylu) dołączonego do ugrupowania ligandowego o wysokim powinowactwie do białka docelowego². W idealnej sytuacji interakcja ligand-białko przebiega poprzez dwuetapowy mechanizm obejmujący początkowe niekowalencyjne wiązanie liganda, po którym następuje nieodwracalne tworzenie wiązania kowalencyjnego między docelową cysteiną a electrophile³.

Kilka wczesnych ukierunkowanych ligandów kowalencyjnych, w tym inhibitor kinazy tyrozynowej Brutona, Ibrutynib, zostało opracowanych poprzez dostarczenie wcześniej zidentyfikowanego odwracalnego liganda z uchwytem elektrofilowym⁴. Jednak takie podejście nie zawsze jest skuteczne, a inne próby wykazały, że instalacja elektrofilu wymaga znacznej optymalizacji⁵. Zamiast tego w ostatnich latach coraz popularniejsze stały się podejścia elektrofilowe, szczególnie wykorzystujące fragmenty elektrofilowe. Zazwyczaj obejmują one inkubację biblioteki elektrofilów z białkiem, a następnie wybór związków o zwiększonej szybkości reakcji w kierunku cysteiny, która, jak zakłada się, jest indukowana przez produktywne niekowalencyjne interakcje między ligandem a kieszenią wiążącą⁶. Warto zauważyć, że metody te zostały z powodzeniem zastosowane podczas opracowywania inhibitora KRAS (G12C) Sotorasib¹.

Pierwsze badanie przesiewowe elektrofilu stwarza kilka unikalnych wyzwań w porównaniu z tradycyjnym przesiewowym ligandem niekowalencyjnym, głównie ze względu na dużą zmienność reaktywności w obrębie i pomiędzy klasami głowic bojowych⁷. Większość elektrofili reagujących z cysteiną z czasem reaguje ze wszystkimi resztami cysteiny wystawionymi na działanie rozpuszczalnika, niezależnie od jakiejkolwiek selektywnej interakcji dla białka docelowego. Zajętość ligandów będzie zatem wzrastać z czasem dla prawie wszystkich elektrofilów, a bez kontrolowania reaktywności, wybór trafień będzie często stronniczy w kierunku bardziej reaktywnych fragmentów, które szybciej atakują cel⁸.

Ponadto, metody przesiewowe oparte na elektrofilach często wykorzystują spektrometrię mas do wykrywania powstawania adduktów białkowo-ligandowych, co jest ograniczone pod względem przepustowości⁹. Regularne próbkowanie reakcji jest wymagane przez dłuższy okres czasu (od godzin do dni), aby prawidłowo scharakteryzować kinetykę reakcji dla biblioteki związków o zróżnicowanej elektrofilowości¹⁰. Badanie przesiewowe 300 fragmentów pobranych w 10 punktach czasowych będzie zatem wymagało wykonania 3000 widm masowych, co przekracza przepustowość większości systemów spektrometrii mas białek. W związku z tym pożądane są bardziej przepustowe metody monitorowania tworzenia adduktów białko-ligand

.

Opisane tutaj podejście, ilościowy test nieodwracalnego wiązania (qIT), to metoda przesiewowa oparta na elektrofilu, która kontroluje wewnętrzną reaktywność i wykorzystuje prosty odczyt fluorescencji⁷. Białko lub glutation (nieustrukturyzowany, zawierający tiol tripeptyd stosowany jako kontrola wewnętrznej reaktywności) inkubuje się z biblioteką fragmentów elektrofilowych i regularnie pobiera się próbki do hartowania w roztworze CPM (7-dietyloamino-3-(4'-maleimidylofenylo)-4-metylokoumaryny, fluorogenny środek do oznaczania ilościowego tiolu). Tworzenie adduktów między cysteiną a fragmentem elektrofilowym zmniejsza ilość tiolu dostępnego do reakcji z CPM, zmniejszając powstałą fluorescencję podczas hartowania. Fluorescencja CPM działa zatem jako wskaźnik zastępczy dla nieprzereagowanego tiolu, umożliwiając określenie kinetyki reakcji tiolu z każdym fragmentem elektrofilowym. Fragmenty elektrofilowe o znacznie zwiększonej reaktywności białka w stosunku do glutationu są wybierane jako trafienia i traktowane priorytetowo do dalszego rozwoju (Rysunek 1).

Rysunek 1: Schemat qIT. Schematyczny przegląd testu qIT. (utworzony przy użyciu BioRender). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wybór trafień za pomocą wartości REF kontroluje wewnętrzną reaktywność i zapewnia, że fragmenty są wybierane jako trafienia tylko wtedy, gdy tworzą produktywne niekowalencyjne interakcje z celem białkowym. Prosty odczyt fluorescencji oznacza również, że test qIT jest wysoce skalowalny i nie wymaga metod monitorowania reakcji opartych na spektrometrii mas.

Tutaj przedstawiono kompleksową procedurę testu qIT, z przykładowymi wynikami ilustrującymi wydajność testu i wybór trafienia.

Protocol

1. Budowa biblioteki fragmentów

1. Zaprojektuj bibliotekę fragmentów elektrofilowych i zsyntetyzuj je lub kup. Biblioteki fragmentów elektrofilowych zazwyczaj składają się z umiarkowanie reaktywnych elektrofilów (takich jak akrylamidy, chloroacetamidy i sulfonamidy winylu) dołączonych do różnorodnych rusztowań chemicznych. Biblioteki fragmentów elektrofilowych są powszechnie dostępne u dostawców komercyjnych, a więcej szczegółów na temat ich projektowania i budowy można znaleźć gdzie indziej^5,11.
2. Rozpuść każdy związek w DMSO do stężenia 50 mM, a następnie dozuj inny związek do każdej studzienki kolumn od 3 do 22 384-dołkowej płytki zbiornikowej, zwanej płytką biblioteki fragmentów.
   1. Dozować DMSO do każdej studzienki w kolumnach 1, 2, 23 i 24 dla kontroli dodatniej i ujemnej. Układ płytek może być różny w zależności od liczby przesiewanych związków (Rysunek 2). Objętość dodana do płytki bibliotecznej będzie zależeć od liczby badań przesiewowych, które mają zostać wykonane, biorąc pod uwagę, że wymagane jest około 1,8 μl z każdej studzienki na ekran qIT. Przygotuj tę płytę biblioteki fragmentów z wyprzedzeniem i przechowuj ją w temperaturze 4 °C.

Rysunek 2: Układ płyt. Przegląd układu płytek 384-dołkowych testu qIT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Konfiguracja testu (Rysunek 3)

1. Przygotować następujące roztwory: rekombinowany roztwór białka (białko docelowe w dowolnym buforze), bufor do oznaczania qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), bufor do wygaszania testu qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7,5)) i złożone roztwory podstawowe (fragment elektrofilowy (50 mM) w DMSO).
   UWAGA: W buforze reakcyjnym stosuje się pH 8 w celu przyspieszenia reakcji między docelową resztą cysteiny a fragmentami, co pozwala na pomiar szybkości reakcji nawet w przypadku skrajnie łagodnie reaktywnych fragmentów. Nieco niższe pH 7,5 jest stosowane w buforze wygaszającym, ponieważ wiązanie tioeterowe utworzone między maleimidem CPM a tiolem cysteiny jest podatne na hydrolizę przy bardziej podstawowych pH (na przykład poprzednie prace wykazały, że koniugaty cysteina-maleimid są znacznie bardziej stabilne przy pH 7,3 niż pH 8¹²).
2. Wyjmij roztwory podstawowe fragmentów DMSO z magazynu i pozostaw je w temperaturze pokojowej na co najmniej 2 godziny, aby umożliwić rozmrożenie mieszanek.
3. Bufor testowy Degas qIT przez bulgotanie argonem przez około 30 minut.
4. Dokładnie wymień docelowy roztwór białkowy na odgazowany bufor testowy qIT. Co najważniejsze, środki redukujące, takie jak DTT i TCEP, muszą zostać dokładnie usunięte do stężeń < 100 nM, ponieważ będą zakłócać kwantyfikację tiolu. Ten krok można wykonać za pomocą powtarzającej się serii wymian, jak opisano poniżej.
   1. Rozcieńczyć roztwór białkowy w ilości przekraczającej odgazowany bufor do oznaczania qIT w wirowym filtrze, zagęścić za pomocą wirowania (4000 x g, 4 °C, 15 min) i powtórzyć. Zazwyczaj wymagane są 4 rundy rozcieńczeń 1 na 15, aby w wystarczającym stopniu usunąć DTT (1 mM) z 1 ml rekombinowanego roztworu podstawowego białka, chociaż ten krok można dostosować w zależności od stężenia środka redukującego w oryginalnym roztworze białka rekombinowanego.
      UWAGA: Alternatywnie, dializowanie docelowego roztworu białkowego w stosunku do dużego nadmiaru odgazowanego buforu testowego qIT może osiągnąć ten sam wynik.
5. Rozcieńczyć docelowy roztwór białkowy (otrzymany w kroku 2.1) do stężenia białka 15 μM w odgazowanym buforze do oznaczania qIT. Około 9 ml docelowego roztworu białka jest potrzebne do napełnienia płytki 384-dołkowej wystarczającą objętością martwą.
6. Przygotować 1,5% (v/v) zawiesinę agarozy TCEP w odgazowanym buforze testowym qIT. Wymagane jest około 9 ml zawiesiny TCEP-agarozy na płytkę przesiewową.
7. Dozować 20 μl roztworu agarozy TCEP do każdego dołka z dwiema płytkami 384-dołkowymi.
8. Przygotować zapas glutationu o stężeniu 15 μM w odgazowanym buforze testowym qIT. Należy to przygotować bezpośrednio przed posiewem, ponieważ glutation szybko utlenia się w roztworze bez środka redukującego.
9. Dozować 20 μl buforu do oznaczania qIT do kolumn 1 i 2 obu płytek 384-dołkowych.
10. Dozować 20 μl 15 μM roztworu białka lub glutationu (zgodnie z przeznaczoną płytką) do kolumn 3-24 płytki 384-dołkowej. Są one nazywane płytką reakcyjną białka i płytką reakcyjną glutationu. Pozostawić do zredukowania w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
11. Dozować 58,2 μl odgazowanego buforu testowego qIT do każdej studzienki płytki 384-dołkowej, a następnie przenieść 1,8 μl z każdej odpowiedniej studzienki płytki biblioteki fragmentów, aby utworzyć płytkę do rozcieńczania związków, gdzie każdy związek rozcieńcza się do stężenia 1,5 mM w buforze testowym qIT plus 3% DMSO.
    UWAGA: Ten etap jest łatwiejszy dzięki stacji pipetującej 384, która umożliwia przenoszenie mieszanek do każdego dołka w jednej operacji.
12. Po 1 godzinnej inkubacji białka i glutationu z TCEP-agarozą, przenieś 20 μl roztworu złożonego z każdej studzienki płytki rozcieńczającej związek do płytki reakcyjnej białka i glutationu, aby rozpocząć test. Ten krok jest również łatwiejszy dzięki stacji pipetującej 384. Etapy testu są podsumowane w Rysunek 3.
    UWAGA: Stężenie fragmentów można zmieniać w zależności od potrzeb, a testy qIT można powtórzyć dla trafień przy niższych stężeniach, jeśli jest to pożądane, aby potwierdzić, że powinowactwo do białek nie jest artefaktem wysokiego stężenia fragmentu. Stosunkowo wysokie stężenie fragmentów służy do podniesienia k_pro i k_GSH, aby zapewnić możliwość określenia dokładnych szybkości dla związków umiarkowanie reaktywnych (które mogą wykazywać t_1/2 (GSH) > 24 godzin w warunkach testu). Ponadto, chociaż stężenie fragmentów wynoszące 500 μM jest wysokie, w badaniach przesiewowych fragmentów zastosowano wysokie stężenia μM do niskich mM, na przykład ¹³.
13. Uruchom timer - test się rozpoczął, a hartowanie powinno być wykonywane w regularnych punktach czasowych zgodnie z poniższą sekcją.

Rysunek 3: podsumowanie testu qIT. Podsumowanie ilustrujące kluczowe etapy przygotowania dołka reakcyjnego testu qIT. (utworzony przy użyciu BioRender). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. CPM wygasza

UWAGA: Gaszenie CPM jest wykonywane w celu ilościowego określenia ilości nieprzereagowanego tiolu pozostałego na płytkach reakcyjnych białka i glutationu. Powinny one być wykonywane w dyskretnych punktach czasowych (na przykład zwykle stosuje się następujące punkty czasowe: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 i 1440 min), aby umożliwić monitorowanie kinetyki reakcji.

1. Przygotować roztwory podstawowe CPM (500 μM) w DMSO, rozlać je do 111,2 μl porcji w probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Te zapasy CPM można przygotować z wyprzedzeniem, a na punkt czasowy hartowania wymagana będzie 1 porcja.
2. Przygotować roztwór wygaszający CPM (1,4 μM), rozmrażając zamrożony roztwór podstawowy CPM (500 μM) i dodając go do 40 ml buforu do oznaczania prób qIT.
3. Dozuj 27 μl roztworu hartującego CPM do każdej studzienki z dwóch płytek 384-dołkowych - dwie są wymagane do wygaszania zarówno płytek reakcyjnych białka, jak i glutationu. Są to tak zwane płyty hartownicze CPM, przygotuj je maksymalnie 30 minut przed użyciem.
4. Odwirować płytkę reakcyjną białka o masie 200 x g przez 3 minuty, aby zapewnić granulowanie agarozy TCEP.
5. W określonych wcześniej punktach czasowych przenieś 3 μl próbki z każdej studzienki płytki reakcyjnej białka na wstępnie napełnioną płytkę gaszącą CPM. Ten etap jest również uproszczony dzięki stacji pipetującej 384.
6. Wymieszaj płytkę gaszącą CPM, zasysając i dozując 3 x 25 μL. Ważne jest, aby usunąć próbkę z górnej części studzienki, aby uniknąć zasysania agarozy TCEP na dole, co będzie zakłócać hartowanie CPM.
7. Powtórz kroki 3.4-3.6 z płytką reakcyjną glutationu.
8. Inkubować płytki hartownicze CPM (przygotowane w 3.4-3.6) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
9. Zmierzyć intensywność fluorescencji płytki wygaszającej CPM (wzbudzenie przy 384 nm i emisja przy 470 nm).

4. Analiza danych i wybór trafień

1. Dla każdego hartowania należy obliczyć Z' jako miarę jakości testu. Wszelkie wygaszenia CPM z Z' < 0,5 powinny być ignorowane.
   Z' = 1 - (((3σ_{kontrola dodatnia} + 3σ_{kontrola ujemna}) / (μ_{kontrola dodatnia} -_{μ kontrola ujemna}))
   Gdzie σ = odchylenie standardowe intensywności fluorescencji, a μ = średnia intensywność fluorescencji
2. Obliczyć średnie wartości fluorescencji dla studzienek kontroli ujemnej i dodatniej (odpowiednio kolumny 1 i 2 oraz 23 i 24).
3. Dobrze znormalizować każdą reakcję do średnich wartości fluorescencji kontroli dodatniej i ujemnej:
   % zmodyfikowany = 100 x (fluorescencja studzienki złożonej - fluorescencja kontroli ujemnej) / (fluorescencja kontroli dodatniej - fluorescencja kontroli ujemnej)
4. Oddzielnie wykreślić % zmodyfikowany w funkcji czasu dla każdego związku reagującego z glutationem i białkiem docelowym.
5. Dopasuj znormalizowane dane % zmodyfikowane w funkcji czasu do jednofazowego modelu rozkładu wykładniczego zarówno dla reakcji z białkiem, jak i z glutationem, korzystając z równania:
   % Zmodyfikowany = ae ^{- kt + c}
   Gdzie a = zakres % wartości zmodyfikowanych, k = szybkość reakcji, t = czas, c = % wartości zmodyfikowanej w nieskończonym czasie. Dopasowywanie krzywych i określanie parametrów można wykonać za pomocą komercyjnego oprogramowania (takiego jak Graphpad).
6. Użyj szybkości, z jaką fragmenty reagują z białkiem (k_pro) i glutationem (k_GSH), aby obliczyć wartość współczynnika wzmocnienia szybkości (REF) dla każdego fragmentu:
   REF = k_pro / k_GSH
7. Użyj wartości REF, aby wybrać fragmenty trafienia. Można to zrobić, ustawiając próg REF (np. REF > 3), dowolny współczynnik trafień (np. górne 2%) lub wybierając fragmenty, których odchylenia standardowe REF 3 są większe niż średnia geometryczna.

Results

Test qIT jest tutaj używany do identyfikacji uderzeń w fragmenty kowalencyjne dla nienazwanego, pojedynczego białka cysteiny. MgCl₂ (10 mM) dodano do reakcyjnych, ponieważ wiadomo, że białko docelowe wiąże się z jonami Mg²⁺. Badanie przesiewowe przeprowadzono w trzech egzemplarzach i określono szybkość, z jaką każdy fragment reagował zarówno z białkiem docelowym (k_pro), jak i glutationem (k_GSH). Wartości Z' były większe niż 0,5 dla wszystkich płytek hartowniczych i średnio 0,75 dla hartowania białka i 0,79 dla hartowania glutationu, co wskazuje na doskonałą wydajność testu. Następnie obliczono wartości REF dla każdego fragmentu i wybrano trafienia, w których REF > 3.

Reprezentatywne wyniki (Rysunek 4), stanowią przykład wyboru trafienia za pomocą testu qIT. Związek 1 reagował 6,0-krotnie szybciej z resztą cysteiny na białku docelowym niż z glutationem i, stosując kryterium REF > 3, został wybrany jako trafienie (Figura 4B). To przyspieszenie szybkości wskazuje na obecność efektu szablonowego, w wyniku którego oddziaływania niekowalencyjne ustawiają 1 we właściwej orientacji, aby cysteina na białku docelowym reagowała z głowicą chloroacetamidową. Natomiast 2 jest przykładem fragmentu nietrafionego, ponieważ reakcja między 2 a docelową resztą cysteiny nie jest przyspieszona w stosunku do reakcji między 2 a glutationem. Brak przyspieszenia szybkości wskazuje, że nie ma produktywnych oddziaływań niekowalencyjnych, które ustawiają 2 we właściwej orientacji, aby reagować z docelową resztą cysteiny.

Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki. Wyniki pokazują monitorowanie reakcji białka i glutationu za pomocą qIT pod kątem (A) wysokiej reaktywności wewnętrznej, możliwego fałszywie dodatniego fragmentu trafienia i (B) fragmentu trafienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Test qIT stanowi skuteczną i wygodną platformę do badań przesiewowych fragmentów elektrofilowych reagujących na cysteinę w stosunku do białka docelowego. Istnieją jednak krytyczne względy, które mogą utrudnić wykonanie testu, jeśli nie zostaną odpowiednio uwzględnione. Przede wszystkim białka docelowe muszą zawierać tylko jedną cysteinę wystawioną na działanie powierzchni, aby nadawały się do badań przesiewowych qIT, ponieważ inne reszty cysteiny będą reagować z CPM i zakłócać pomiary fluorescencji. W poprzednich przypadkach, w których białka docelowe zawierają wiele cystein wystawionych na działanie powierzchni (takich jak główna proteaza SARS-CoV-2, mała GTPaza RAP27A i kinaza zależna od cykliny 2), wcześniej z powodzeniem stosowano konstrukty przesiewowe z usuniętymi pozostałościami zakłócającymi. Jednak skuteczność tej strategii będzie się różnić w zależności od białka 10,14,15.

Ponadto, ponieważ test qIT mierzy spadek tiolu dostępnego do reakcji z CPM w czasie, każdy czynnik zmniejszający proporcję dostępnych tioli, taki jak utlenianie tiolu lub agregacja białek, może utrudniać wydajność testu. Odgazowanie buforowe i zastosowanie unieruchomionego środka redukującego (TCEP-agaroza) zapewnia, że utlenianie tiolu jest powolne, a wszelkie pozostałe utlenianie powinno być złagodzone poprzez normalizację pomiarów fluorescencji do pomiarów fluorescencji w studzienkach kontroli dodatniej. Jednak problemy mogą się pojawić, gdy nierównomierny rozkład agarozy TCEP między studzienkami powoduje nierównomierne utlenianie tiolu. Spójne powlekanie TCEP-agarozy ma zatem zasadnicze znaczenie dla wydajności testu, co może być trudne, ponieważ cząsteczki agarozy TCEP toną w zbiornikach pipetowania.

Problemem może być również agregacja białek, ponieważ warunki badania (24-godzinna inkubacja w temperaturze pokojowej) są stosunkowo surowe. Strategie rozwiązywania problemów, takie jak łączenie białek docelowych z solubilizacją znaczników, zmiana reakcyjnych lub wykonywanie testu w niższych temperaturach, mogą zmniejszyć agregację i rozwiązać problemy ze stabilnością białek. Niektóre fragmenty mogą również indukować agregację białek, co ponownie zmniejsza proporcję tiolu dostępnego do reakcji z CPM i powoduje fałszywie dodatnie trafienia. Ortogonalna walidacja trafień przy użyciu spektrometrii mas z nienaruszonymi białkami jest skuteczną metodą wykrywania tych przypadków, ponieważ fałszywie dodatnie trafienia stworzą małą lub żadną populację znakowanych gatunków podczas inkubacji z docelowym białkiem.

Gdy te względy są kontrolowane, test qIT ma pewne wyraźne zalety w porównaniu z innymi metodami przesiewowych fragmentów kowalencyjnych. Selekcja trafień przy użyciu REF zapewnia, że trafienia są wybierane tylko wtedy, gdy tworzą produktywne niekowalencyjne interakcje z białkiem docelowym. Elektrofilowość odłamków różni się w dużych zakresach, zarówno między różnymi głowicami, jak i w obrębie klas głowic; Na przykład, poprzednie prace wykazały kilkasetkrotne różnice w szybkości reaktywności glutationu między akrylamidami¹⁰. Ten szeroki zakres elektrofilowości może utrudniać odróżnienie fragmentów o wysokich wartościach _{k pro} ze względu na efekt szablonu od tych, które są po prostu wysoce reaktywne, co może prowadzić do wyboru wysoce reaktywnych fragmentów jako wyników fałszywie dodatnich. Na przykład 2 reagował z docelową resztą cysteiny szybciej niż 1 i, bez uwzględnienia wewnętrznej reaktywności, może być wybrany jako trafienie. Jednak 2 nie reaguje z docelową resztą cysteiny szybciej niż z glutationem, co wskazuje, że większy k_pro 2 w stosunku do 1 jest spowodowany większą wewnętrzną reaktywnością fragmentu, a nie efektem szablonowym.

Prosty odczyt fluorescencji stosowany w teście qIT do ilościowego oznaczania pozostałego tiolu jest również bardzo korzystny. Inne metody badań przesiewowych fragmentów kowalencyjnych wykorzystują spektrometrię mas nienaruszonych białek do określenia szybkości, z jaką fragmenty reagują z białkiem docelowym i LC-MS do określenia szybkości, z jaką glutation reaguje z fragmentami - obie wymagają specjalistycznego sprzętu i nie mają przepustowości ^8,16. Wygodny odczyt fluorescencji sprawia, że test qIT jest wysoce skalowalny i wymaga tylko powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego.

W połączeniu te innowacje tworzą solidną i skalowalną metodę badań przesiewowych fragmentów kowalencyjnych, która eliminuje potrzebę stosowania sprzętu do spektrometrii mas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Argon Gas	BOC	I1149
Corning 384-dołkowe, niskokołnierzowe, płaskodenne płytki testowe	Corning	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Unieruchomiony TCEP-agaroza	Pierce	77712
Czytnik mikropłytek	CLARIOstar
Uszczelki płytkowe PCR	BioRad	MSA5001
Zredukowany L-glutation	Sigma-Aldrich	G4251
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium Hepes	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7