Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67180

⸱

6 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Materials Science & Technology, Institute for Biomedical Engineering, University Hospital Tübingen, 2Department of Conservative Dentistry and Periodontology, University Hospital Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Streszczenie

Reakcja ciała obcego (FBR), złożony proces gojenia za pośrednictwem układu immunologicznego, odgrywa kluczową rolę w integracji implantów z ciałem. Makrofagi, jako pierwsza linia interakcji układu odpornościowego z powierzchniami implantów, odgrywają dwukierunkową rolę w modulowaniu równowagi między stanem zapalnym a regeneracją. Dla dogłębnego zrozumienia i oceny reakcji między materiałami implantów a odpowiedzią immunologiczną kluczowe znaczenie mają wiarygodne metody i protokoły in vitro. Wśród różnych modeli in vitro, pierwotne makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) stanowią doskonały model do badania interakcji makrofag-implant. Wdrożyliśmy eksperymentalny protokół oceny polaryzacji MDM na makrofagi M1 (aktywowane klasycznie aktywowane) i M2 (aktywowane alternatywnie) na powierzchniach implantów. Wyizolowaliśmy monocyty krwi od zdrowych dawców i zróżnicowaliśmy je w makrofagi za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Zróżnicowane makrofagi wyhodowano na powierzchniach implantów i spolaryzowano na podtypy M1 i M2. Polaryzację M1 uzyskano w obecności interferonu (IFN)-γ i lipopolisacharydu (LPS), natomiast polaryzację M2 przeprowadzono w pożywce zawierającej interleukinę (IL)-4 i IL-13. Oceniliśmy fenotypy makrofagów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w oparciu o panele wydzielanych cytokin, markery powierzchni komórek i ekspresję genów. Wyekstrahowany RNA przekształcono w komplementarne DNA (cDNA), a qRT-PCR użyto do ilościowego określenia mRNA związanego z makrofagami M1 i M2. W związku z tym makrofagi M1 charakteryzowały się wyższą ekspresją cytokin prozapalnego czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) i markera powierzchniowego CCR7 w porównaniu z makrofagami M2, które wykazywały wyższe poziomy CD209 i CCL13. W związku z tym CCR7 i CD209 zostały zidentyfikowane jako specyficzne i wiarygodne markery podtypów makrofagów M1 i M2 poprzez barwienie immunologiczne i wizualizację za pomocą CLSM. Dalsze potwierdzenie uzyskano za pomocą testu ELISA, który wykrył podwyższony poziom TNF-ɑ w M1 i zwiększony CCL13 w komórkach M2. Proponowane markery i konfiguracja eksperymentalna mogą być skutecznie wykorzystane do oceny potencjału immunomodulacyjnego implantów.

Wprowadzenie

Wszczepialne biomateriały stały się konwencjonalnym rozwiązaniem dla różnych chorób ludzkich i odgrywają wielką rolę w badaniach biomedycznych, w tym inżynierii tkankowej, systemach dostarczania leków i implantach1,2. Istnieje szeroka gama implantów wykonanych z różnych materiałów o różnej budowie i funkcjonalnościach, takich jak protezy stawu biodrowego, stenty, siatki, zastawki serca czy implanty dentystyczne. Po implantacji kontakt tkanka-implant wywołuje odpowiedź immunologiczną, po której następuje ustąpienie, przebudowa tkanki i homeostaza. Na procesy te mają wpływ właściwości fizyczne, chemiczne i bioaktywne zastosowanych biomateriałów. Cechy te mogą wpływać na intensywność i spektrum reakcji pro- i przeciwzapalnych, tworzenie się torebki zwłóknieniowej, degradację tkanek i fazę gojenia3,4. W celu wsparcia i optymalizacji procesu gojenia i długoterminowej integracji implantów, jednym z pojawiających się aspektów obecnych badań jest badanie i pośredniczenie w interakcji między powierzchniami implantów a komórkami odpornościowymi.

Wśród innych komórek odpornościowych, makrofagi, które znajdują się w całym ciele, odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i obronie przeciwpatogennej, a także w procesach gojenia i utrzymaniu homeostazy tkanek5,6. Opierając się na swojej plastyczności i lokalnych bodźcach mikrośrodowiskowych tkanek, makrofagi są w stanie polaryzować się w odrębne funkcjonalne fenotypy, które wykazują duże różnice w metabolizmie komórkowym, funkcjach komórkowych i profilach wydzielania cytokin. Klasycznie aktywowany fenotyp M1 można odróżnić po wydzielaniu cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-6 i TNF-α, i bierze udział w początkowej i przewlekłej odpowiedzi zapalnej na uraz i obce biomateriały. W przeciwieństwie do tego, alternatywnie, aktywowane makrofagi M2, które są wyzwalane przez cytokiny, takie jak IL-4 i IL-13, mają charakterystyczne cechy, takie jak ustąpienie stanu zapalnego i promowanie gojenia się tkanek. Makrofagi spolaryzowane M2 można zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych komórek, takich jak CD206, oraz produkcji cytokin, takich jak IL-10 i IL-47. Podobnie makrofagi, które zostały już spolaryzowane, mogą przeprogramować się w nowym mikrośrodowisku.

Wiele badań nad interakcjami komórka-biomateriał wykazało znaczenie makrofagów w kaskadzie odpowiedzi immunologicznych na wszczepialne biomateriały oraz w organizowaniu procesów związanych z gojeniem się powikłań związanych z implantami8,9,10. Mimo że inżynieria biomedyczna poczyniła znaczne postępy w ostatnich latach, potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć, w jaki sposób implanty modulują zachowanie i polaryzację makrofagów11,12,13.

W hodowli komórkowej, monojądrzaste komórki krwi obwodowej pochodzące z monocytów (PBMCs) mogą być różnicowane na przylegające makrofagi M0, a następnie indukowana polaryzacja w kierunku fenotypów M1 lub M2 za pomocą odpowiednio LPS i IFN-γ lub IL-4. Po inkubacji in vitro z nowymi próbkami biomateriałów, możliwe jest wykorzystanie różnych receptorów powierzchniowych komórek i profili cytokin makrofagów M1 i M2 do wykrycia potencjału immunomodulacyjnego biomateriałów in vitro14,15. Badanie to miało na celu opracowanie protokołu in vitro, który można zastosować do zbadania polaryzacji MDM w odpowiedzi na różne powierzchnie implantów. Analizy ekspresji genów, techniki mikroskopowe i ELISA mogą być wykorzystywane do określania markerów fenotypowych i specyficznych profili cytokin makrofagów M1 i M2 modulowanych przez biomateriał. W związku z tym można wyjaśnić złożone interakcje między makrofagami a powierzchniami biomateriałów i uzyskać cenne informacje, aby lepiej zrozumieć interakcje makrofagów z biomateriałami. Wreszcie, ustandaryzowany protokół in vitro zapewnia odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych poprzez minimalizację zmienności w konfiguracji eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzka krew obwodowa została pobrana od zdrowych dawców krwi zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki wydziału medycznego Uniwersytetu w Tybindze (aprobata etyczna: 286/2021 BO). Ludzkie PBMC zostały wyizolowane za pomocą wirowania w gradimencie gęstości, jak opisano wcześniej16. Przedstawiono następujący protokół dla PBMC wyizolowanych z 24 ml krwi. Schematyczne przedstawienie protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

UWAGA: Objętość krwi powinna być dostosowana w zależności od liczby użytych makrofagów M0.

Z 24 ml krwi uzyskano łącznie 35,46 ± 9,1 miliona PBMC, co dało 1,97 ± 0,46 miliona makrofagów M0 (n = 5). Wszystkie odczynniki, materiały eksploatacyjne i urządzenia są wymienione w Tabeli materiałów. są wymienione w tabeli 1.

1. Różnicowanie monocytów krwi ludzkiej do makrofagów

  1. Ponownie zawiesić wyizolowane PBMC w 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki przyłączowej monocytów i przenieść je do jednej kolby do hodowli komórkowych T75.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 90 minut, aby umożliwić adhezję.
  3. Wyrzucić supernatant i raz umyć komórki wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożem z delikatnym przechyleniem w celu usunięcia nieprzylegających lub luźno przylegających komórek.
    UWAGA: Przyłączone komórki są monocytami, które stanowią około 10% wszystkich PBMC pierwotnie dodanych do kolby.
  4. Dodać 15 ml kompletnej pożywki zawierającej 10 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) do przylegających komórek i inkubować przez 6 dni w celu pobudzenia różnicowania.
  5. Pożywkę należy wymieniać na świeżą, kompletną pożywkę zawierającą 10 ng/mL M-CSF co 2 dni.

2. Uprawa i polaryzacja MDM na powierzchni implantu tytanowego

UWAGA: W 6 dniu różnicowania, makrofagi M0 zostały wysiane na powierzchni biomateriału za pomocą różnych bodźców przez 48 godzin, aby uzyskać w pełni spolaryzowane makrofagi M1 lub M2. Dla każdej badanej powierzchni użyto trzech dysków do wysiewu makrofagów M0, M1 i M2. Jako powierzchnie kontrolne użyto plastikowych szkiełek nakrywkowych poddanych hodowlom komórkowym.

  1. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolb T75 i przemywać komórki 10 ml PBS przez 5 minut.
  2. Odłączyć przylegające komórki, inkubując je z 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek przez 30 minut.
  3. Delikatnie postukaj w komórki i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml. Odłącz pozostałe komórki, delikatnie zeskrobując je w 10 ml PBS.
  4. Przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować je w stężeniu 300 x g przez 10 minut.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża.
  6. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru, aby określić liczbę komórek i żywotność.
  7. Przygotować zawiesinę komórek, dostosowując liczbę komórek do 160 000 komórek na 1 ml kompletnej pożywki.
  8. Oczyść krążki biomateriału ultradźwiękowo w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie sterylizuj w 70% etanolu przez 30 minut.
  9. Suszyć tytanowe krążki przez 1-2 godziny, a następnie umieścić je w niepoddanych działaniu substancji 24-dołkowych płytkach i dodać 1 ml przygotowanej zawiesiny komórek do każdej studzienki.
  10. Aby uzyskać makrofagi spolaryzowane M1, dodaj IFN-γ i LPS w stężeniu odpowiednio 50 ng/ml i 10 ng/ml. W przypadku polaryzacji M2 dodaj IL-4 i IL-13 w stężeniu 20 ng/ml każdy. Upewnij się, że komórki M0 są hodowane bez żadnych środków polaryzacyjnych. Inkubować komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu wywołania polaryzacji.

3. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą testu ELISA

UWAGA: W drugim dniu polaryzacji próbki zostały przygotowane do analiz charakteryzacyjnych. Cytokina TNF-ɑ i chemokina CCL13 zostały zmierzone w celu scharakteryzowania odpowiednio makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Stężenie wydzielanych białek znormalizowano do całkowitego stężenia wydzielanych białek w odpowiednim supernatancie.

  1. Zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  2. Przenieś krążki do nowej płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Celem jest wyeliminowanie martwych lub luźno przyczepionych komórek w niepoddanych działaniu substancji płytkach 24-dołkowych.
    UWAGA: Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy należy sprawdzić żywotność komórek na powierzchniach. Żywotność komórek można określić za pomocą testów żywotności żywych/martwych komórek lub pośrednio za pomocą testów proliferacji komórek i cytotoksyczności.
  3. Zmierz cytokiny i chemokiny zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Zmierz cytokiny natychmiast lub przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do przyszłego pomiaru.
    UWAGA: Dla każdego typu zestawu (biorąc pod uwagę czułość i granice wykrywalności zestawu ELISA) należy określić odpowiednie rozcieńczenie próbki. W teście kwasu bicinchoninowego (BCA) próbki rozcieńczono w stosunku 1:5. Próbki M1 dla TNF-ɑ rozcieńczono w stosunku 1:10, a próbki M2 dla CCL13 rozcieńczono w stosunku 1:12.
  4. Obliczyć stężenie wydzielanych cytokin/chemokin za pomocą krzywej wzorcowej zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Zmierz całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
  6. Normalizuj stężenie wydzielanych białek do mg białka całkowitego.

4. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą CLSM

UWAGA: Spolaryzowane makrofagi zostały dodatkowo scharakteryzowane poprzez barwienie ich przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórek CD209 i CCR7. Jądra zostały podbarwione przeciwstawnie za pomocą DRAQ5. CD68 lub inne markery mogą być używane jako markery panmakrofagów.

  1. Umyj komórki 2x w 800 μL PBS. Inkubować krążki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w 400 μl buforu utrwalającego.
  2. Po usunięciu buforu utrwalającego przemyć trzykrotnie w 400 μl PBS. Próbki należy natychmiast zabarwić lub przechowywać w temperaturze 4 °C w 1 ml buforu do przechowywania.
    UWAGA: Dzięki temu protokołowi utrwalania i przechowywania próbki zostały pomyślnie wybarwione i zobrazowane w ciągu 1-6 tygodni od utrwalenia.
  3. Przed kolejnym krokiem po przechowywaniu umyj krążki dwukrotnie 800 μl PBS.
  4. Inkubować krążki z 400 μl buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
  5. Odrzucić bufor blokujący i inkubować krążki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 400 μl buforu barwiącym.
    1. Wykonaj procedurę immunofluorescencji przy użyciu podwójnego barwienia, aby zbadać ekspresję CCR7 i CD209 w jednej próbce. W tym celu należy połączyć przeciwciała pierwszorzędowe wyhodowane od różnych gatunków (myszy i królika) na tym samym etapie barwienia.
      UWAGA: Aby uzyskać silny sygnał z minimalnym tłem, zoptymalizuj stężenie przeciwciał. Przeciwciało CCR7 zastosowano w końcowym stężeniu 10 μg/ml, a przeciwciało CD209 rozcieńczono w stosunku 1/400.
  6. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 3x 400 μl buforu do przemywania wodą.
  7. Dodać przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem rozcieńczone w buforze barwiącym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Stężenie przeciwciał drugorzędowych powinno być zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnych specyficznych sygnałów przy minimalnym tle. W tym badaniu zastosowano przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 5 μg/ml do barwienia.
  8. Po usunięciu supernatantu próbki należy przemyć trzykrotnie w buforze do przemywania przez 3 minuty każda.
  9. Dodać 10 μM DRAQ5 do PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  10. Usunąć supernatant i raz umyć krążki w PBS.
  11. Usuń pozostały PBS i dodaj 1 kroplę podłoża montażowego.
  12. Po 5 minutach nałożyć okulary nakrywkowe i pozostawić próbki do wyschnięcia na 1 godzinę.
  13. Po wysuszeniu próbek uszczelnić krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać je w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazowania.
  14. Aby uzyskać przegląd komórek, zobrazuj próbki w 25-krotnym powiększeniu. Aby dokładniej określić strukturę i lokalizację znaczników powierzchniowych, uzyskaj obrazy o 63-krotnym powiększeniu.
  15. Określ ilościowo intensywność fluorescencji CCR7 i CD209 za pomocą oprogramowania ImageJ.
    UWAGA: Akwizycja obrazu została wykonana za pomocą fotopowielacza (PMT) z wykorzystaniem systemu CLSM, który został wyposażony w laser argonowy (488 nm), laser DPSS (561 nm) oraz laser HeNe (633 nm).

5. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą qRT-PCR

UWAGA: Do izolacji RNA użyto dwóch krążków na próbkę, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do syntezy cDNA.

  1. Umyj krążki 2x 800 μl PBS.
  2. Dodać 350 μl buforu do lizy do pierwszego krążka i poddać komórki lizie, pipetując w górę i w dół.
  3. Przenieś lizat na drugi krążek i powtórz proces lizy.
  4. Dodać 350 μl 70% etanolu do lizatu i pipetować w górę iw dół, aż do uzyskania jednorodności.
  5. Przenieś lizat do kolumny wirowej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji RNA.
  6. Określ ilościowo ilość RNA za pomocą nanokropli lub innego urządzenia.
  7. Znormalizuj stężenia RNA dla różnych próbek i zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą systemu RT-PCR do syntezy pierwszej nici cDNA.
  8. Zsyntetyzować cDNA przy użyciu 350 ng RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy qRT-PCR.
    UWAGA: W tym przypadku 350 ng oczyszczonego RNA użyto do syntezy cDNA przy użyciu 4 μL RT Mix (5x) w 20 μL.
  9. Wykonaj qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym na 96-dołkowych płytkach i indywidualnych reakcjach 15 μl (1x Syber green master mix, 0,2 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 4,5 μl rozcieńczonego cDNA w stosunku 1:10).
    UWAGA: Program PCR rozpoczyna się od podgrzanej pokrywki (105 °C), po której następują trzy etapy: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 15 s w temperaturze 95 °C i 30 s w temperaturze 55 °C przez 40 cykli.
  10. Normalizuj poziomy ekspresji różnych genów do genu porządkowego GAPDH (lub innych genów porządkowych, takich jak β-aktyna).
  11. Obliczyć względną ekspresję genów przy użyciu metody 2−ΔΔCt, przyjmując jako odniesienie komórki M0 hodowane na szkiełkach nakrywkowych do hodowli tkankowych. W tabeli 2 wymieniono wszystkie startery użyte w tym badaniu.

6. Analiza statystyczna

  1. Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± SEM. Powtórz wszystkie testy (w tym badaniu testy powtórzono pięć razy), aby zapewnić odtwarzalność. Oceń statystycznie istotne różnice między danymi o rozkładzie normalnym za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego Tukeya.
  2. Użyj testu Friedmana i testu wielokrotnego porównania Dunna, aby przeanalizować nieparametryczne zestawy danych. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby przeanalizować dane i zdefiniować istotność statystyczną jako wartość p mniejszą niż 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki niniejszego badania wykazują pomyślną różnicowanie i polaryzację MDM na powierzchniach tytanowych, a następnie charakterystykę makrofagów spolaryzowanych do fenotypu M1 lub M2. W pierwszym kroku scharakteryzowano spolaryzowane MDM przy użyciu CLSM. W oparciu o nasze wstępne badania, jako specyficzne markery do odróżnienia spolaryzowanych MDM typu M1 od M2 wykorzystano CD209 oraz CCR7. Jak pokazano na Rysunku 2A,B, MDM uległy pomyślnej polaryzacji do makrofagów M1 i M2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładne zrozumienie zachowania makrofagów jest niezbędne do zrozumienia właściwości immunomodulacyjnych materiałów do implantacji. W kilku badaniach opisano heterogeniczne markery, różnorodne modele komórkowe i protokoły charakteryzujące polaryzację makrofagów in vitro 17,18,19,20. Aby poprawić odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych, niezbędne są standa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dyski zostały uprzejmie dostarczone przez Medentis Medical, Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Niemcy. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Kliniki Chirurgii Jamy Ustnej i Szczękowo-Twarzowej (Szpital Uniwersytecki w Tybindze).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowa, niepoddawana obróbceCorning Incorporated (Kennebunk, USA) 144530
Czytnik absorbancji Infinite F50 TECAN Austria GmbH (Grö dig, Austria)TCAT91000001
Accutase w DPBS, 0,5 mM EDTAEMD Millipore Corp. (Burlington, USA)SCR005
Anti-Fade Fluorescencyjny środek montażowy -wodny, Fluoroshieldabcam (Cambridge, Wielka Brytania)ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal CyclerBio-Rad / MJ Research7212
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR International bvba (Leuven, Belgia)Wirówka 422361V
5804 REppendorf SE (Hamburg, Niemcy)5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology13193
DimetylosulfotlenekSigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)D2438-5X10ML
DRAQ5 Roztwór barwiącyMilteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)130-117-344
Alkohol etylowy ≥ 99,8% dla biologii molekularnejCarl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Niemcy)1HPH.1
Kozia IgG Anty-Mysia (H& L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej
, Alexa Fluor Plus 488		InvitrogenA32723TR
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, cyjanina3InvitrogenA10520
GraphPad PrismWersja GraphPad  9.4.1
Ludzkie przeciwciało CCR7R& D SystemsMAB197
Human IFN-gamma RecombinantInvitrogen (Rockford, USA)RIFNG100
Human IL-13Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)5230901032
Human IL-4Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)130-095-373
Human M-CSFPeprotech (Cranbury, USA)300-25
Leica TCS SP5Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Niemcy)https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolisacharydy firmy EscherichiaSigma Aldrich Co. (Missouri, USA)L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix New England BiolabsNEB #M3003
LunaScript RT SuperMix KitNew England BiolabsE3010L
Pożywka do separacji limfocytów 1077PromoCell (Heidelberg, Niemcy)C-44010
MCP-4/CCL13 Zestaw ELISA dla ludziInvitrogenEHCCL13
MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml)Applied Biosystems (Waltham, USA)4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmLife Technologies Corporation (Carlsbad, USA)4311971
MicroAmp Splash Free 96-well BaseApplied Biosystems (Waltham, USA)4312063
Wirówka mikrolitrowa CD-3124RPhoenix Instrument (Niemcy)9013111121
Okulary nakrywkowe do mikroskopu, 10 mmCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy4HX4.1
Monocyte Attachment MediumPromoCell (Heidelberg, Niemcy)C-28051
Multiply-Pro Gefä ß 0,5 ml, PPSarstedt AG & Eco (Nü mbrecht, Niemcy)7,27,35,100
Nanodrop OneThermo Scientific (USA)ND-ONE-W
QuantStudio  3 SystemLife Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Niemcy)A28567
RNeasy Micro KitQiagen74007
RPMI 1640, 1x, z L-glutaminąMediatech, Inc. (Manassas, USA)10-040-CV
Sterylna ławka, LaminarAir HB 2472 Instrumenty Heraeus (Hanau, Niemcy)51012197
Szkiełka nakrywkowe do hodowli tkankowych 13 mm (tworzywo sztuczne)Sarstedt Inc. (Newton, USA)83,18,40,002
Tarcze obrabiane tytanem 12 cm Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Niemcy)N/A
TNF alfa Human ELISA KitInvitrogenKHC3011
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Niemcy)1680.1

Bibliografia

  1. Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
  2. Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).
  3. Aamodt, J. M., Grainger, D. W. Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response. Biomaterials. 86, 68-82 (2016).
  4. Batool, F., et al. Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration. J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).
  5. Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling. J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).
  6. Shrivastava, R., Shukla, N. Attributes of alternatively activated (M2) macrophages. Life Sci. 224, 222-231 (2019).
  7. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).
  8. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  9. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  10. Kzhyshkowska, J., et al. Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine. J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).
  11. Browne, S., Pandit, A. Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment. Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).
  12. Piatnitskaia, S., et al. Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement. Front Immunol. 15, 1349461(2024).
  13. Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. Activation of macrophages in response to biomaterials. Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).
  14. Murray, P. J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  15. Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biol. 15 (1), 53(2017).
  16. Salma Iqbal, A. K. Characterization of in vitro generated human polarized macrophages. J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).
  17. Hotchkiss, K. M., et al. Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation. Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).
  18. Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants. Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).
  19. Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo. Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).
  20. Lu, W., et al. Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization. Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).
  21. Murray, P. J., Wynn, T. A. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).
  22. Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies. Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).
  23. Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).
  24. Zhang, Y., et al. Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs. Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).
  25. Cerqueira, A., et al. Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels. J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).
  26. Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).
  27. Nobs, S. P., Kopf, M. Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis. Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).
  28. Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. Origins and diversity of macrophages in health and disease. Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).
  29. Parisi, L., et al. Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro. J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).
  30. Feuerer, N., et al. Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods. J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).
  31. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  32. Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles. Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Polaryzacja makrofagów M1polaryzacja makrofagów M2charakterystyka makrofagówanaliza qRT-PCRmikroskopia konfokalnatest ELISAmarker CCR7marker CD209
Polaryzacja i charakterystyka ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów typu M1 i M2 na powierzchniach implantów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.