Polaryzacja i charakterystyka makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów M1 i M2 na powierzchniach implantów

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół oceny potencjału immunomodulacyjnego powierzchni implantów in vitro, mający na celu poprawę wiarygodności i odtwarzalności obecnych protokołów oraz promowanie dalszych badań. Profile cytokin wydzielniczych, ekspresję mRNA i markery powierzchni komórek monitorowano za pomocą makrofagów pochodzących z monocytów krwi w celu zbadania polaryzacji makrofagów hodowanych na tytanie.

Streszczenie

Reakcja ciała obcego (FBR), złożony proces gojenia za pośrednictwem układu immunologicznego, odgrywa kluczową rolę w integracji implantów z ciałem. Makrofagi, jako pierwsza linia interakcji układu odpornościowego z powierzchniami implantów, odgrywają dwukierunkową rolę w modulowaniu równowagi między stanem zapalnym a regeneracją. Dla dogłębnego zrozumienia i oceny reakcji między materiałami implantów a odpowiedzią immunologiczną kluczowe znaczenie mają wiarygodne metody i protokoły in vitro. Wśród różnych modeli in vitro, pierwotne makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) stanowią doskonały model do badania interakcji makrofag-implant. Wdrożyliśmy eksperymentalny protokół oceny polaryzacji MDM na makrofagi M1 (aktywowane klasycznie aktywowane) i M2 (aktywowane alternatywnie) na powierzchniach implantów. Wyizolowaliśmy monocyty krwi od zdrowych dawców i zróżnicowaliśmy je w makrofagi za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Zróżnicowane makrofagi wyhodowano na powierzchniach implantów i spolaryzowano na podtypy M1 i M2. Polaryzację M1 uzyskano w obecności interferonu (IFN)-γ i lipopolisacharydu (LPS), natomiast polaryzację M2 przeprowadzono w pożywce zawierającej interleukinę (IL)-4 i IL-13. Oceniliśmy fenotypy makrofagów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA), konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM) i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) w oparciu o panele wydzielanych cytokin, markery powierzchni komórek i ekspresję genów. Wyekstrahowany RNA przekształcono w komplementarne DNA (cDNA), a qRT-PCR użyto do ilościowego określenia mRNA związanego z makrofagami M1 i M2. W związku z tym makrofagi M1 charakteryzowały się wyższą ekspresją cytokin prozapalnego czynnika martwicy nowotworu (TNF-α) i markera powierzchniowego CCR7 w porównaniu z makrofagami M2, które wykazywały wyższe poziomy CD209 i CCL13. W związku z tym CCR7 i CD209 zostały zidentyfikowane jako specyficzne i wiarygodne markery podtypów makrofagów M1 i M2 poprzez barwienie immunologiczne i wizualizację za pomocą CLSM. Dalsze potwierdzenie uzyskano za pomocą testu ELISA, który wykrył podwyższony poziom TNF-ɑ w M1 i zwiększony CCL13 w komórkach M2. Proponowane markery i konfiguracja eksperymentalna mogą być skutecznie wykorzystane do oceny potencjału immunomodulacyjnego implantów.

Wprowadzenie

Wszczepialne biomateriały stały się konwencjonalnym rozwiązaniem dla różnych chorób ludzkich i odgrywają wielką rolę w badaniach biomedycznych, w tym inżynierii tkankowej, systemach dostarczania leków i implantach^1,2. Istnieje szeroka gama implantów wykonanych z różnych materiałów o różnej budowie i funkcjonalnościach, takich jak protezy stawu biodrowego, stenty, siatki, zastawki serca czy implanty dentystyczne. Po implantacji kontakt tkanka-implant wywołuje odpowiedź immunologiczną, po której następuje ustąpienie, przebudowa tkanki i homeostaza. Na procesy te mają wpływ właściwości fizyczne, chemiczne i bioaktywne zastosowanych biomateriałów. Cechy te mogą wpływać na intensywność i spektrum reakcji pro- i przeciwzapalnych, tworzenie się torebki zwłóknieniowej, degradację tkanek i fazę gojenia^3,4. W celu wsparcia i optymalizacji procesu gojenia i długoterminowej integracji implantów, jednym z pojawiających się aspektów obecnych badań jest badanie i pośredniczenie w interakcji między powierzchniami implantów a komórkami odpornościowymi.

Wśród innych komórek odpornościowych, makrofagi, które znajdują się w całym ciele, odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i obronie przeciwpatogennej, a także w procesach gojenia i utrzymaniu homeostazy tkanek5^,6. Opierając się na swojej plastyczności i lokalnych bodźcach mikrośrodowiskowych tkanek, makrofagi są w stanie polaryzować się w odrębne funkcjonalne fenotypy, które wykazują duże różnice w metabolizmie komórkowym, funkcjach komórkowych i profilach wydzielania cytokin. Klasycznie aktywowany fenotyp M1 można odróżnić po wydzielaniu cytokin prozapalnych, takich jak IL-1β, IL-6 i TNF-α, i bierze udział w początkowej i przewlekłej odpowiedzi zapalnej na uraz i obce biomateriały. W przeciwieństwie do tego, alternatywnie, aktywowane makrofagi M2, które są wyzwalane przez cytokiny, takie jak IL-4 i IL-13, mają charakterystyczne cechy, takie jak ustąpienie stanu zapalnego i promowanie gojenia się tkanek. Makrofagi spolaryzowane M2 można zidentyfikować na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych komórek, takich jak CD206, oraz produkcji cytokin, takich jak IL-10 i IL-4⁷. Podobnie makrofagi, które zostały już spolaryzowane, mogą przeprogramować się w nowym mikrośrodowisku.

Wiele badań nad interakcjami komórka-biomateriał wykazało znaczenie makrofagów w kaskadzie odpowiedzi immunologicznych na wszczepialne biomateriały oraz w organizowaniu procesów związanych z gojeniem się powikłań związanych z implantami^8,9^,10. Mimo że inżynieria biomedyczna poczyniła znaczne postępy w ostatnich latach, potrzebne są dalsze badania, aby zrozumieć, w jaki sposób implanty modulują zachowanie i polaryzację makrofagów^11,12,13.

W hodowli komórkowej, monojądrzaste komórki krwi obwodowej pochodzące z monocytów (PBMCs) mogą być różnicowane na przylegające makrofagi M0, a następnie indukowana polaryzacja w kierunku fenotypów M1 lub M2 za pomocą odpowiednio LPS i IFN-γ lub IL-4. Po inkubacji in vitro z nowymi próbkami biomateriałów, możliwe jest wykorzystanie różnych receptorów powierzchniowych komórek i profili cytokin makrofagów M1 i M2 do wykrycia potencjału immunomodulacyjnego biomateriałów in vitro^14,15. Badanie to miało na celu opracowanie protokołu in vitro, który można zastosować do zbadania polaryzacji MDM w odpowiedzi na różne powierzchnie implantów. Analizy ekspresji genów, techniki mikroskopowe i ELISA mogą być wykorzystywane do określania markerów fenotypowych i specyficznych profili cytokin makrofagów M1 i M2 modulowanych przez biomateriał. W związku z tym można wyjaśnić złożone interakcje między makrofagami a powierzchniami biomateriałów i uzyskać cenne informacje, aby lepiej zrozumieć interakcje makrofagów z biomateriałami. Wreszcie, ustandaryzowany protokół in vitro zapewnia odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych poprzez minimalizację zmienności w konfiguracji eksperymentalnej.

Protokół

Ludzka krew obwodowa została pobrana od zdrowych dawców krwi zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komisję Etyki wydziału medycznego Uniwersytetu w Tybindze (aprobata etyczna: 286/2021 BO). Ludzkie PBMC zostały wyizolowane za pomocą wirowania w gradimencie gęstości, jak opisano wcześniej¹⁶. Przedstawiono następujący protokół dla PBMC wyizolowanych z 24 ml krwi. Schematyczne przedstawienie protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

UWAGA: Objętość krwi powinna być dostosowana w zależności od liczby użytych makrofagów M0.

Z 24 ml krwi uzyskano łącznie 35,46 ± 9,1 miliona PBMC, co dało 1,97 ± 0,46 miliona makrofagów M0 (n = 5). Wszystkie odczynniki, materiały eksploatacyjne i urządzenia są wymienione w Tabeli materiałów. są wymienione w tabeli 1.

1. Różnicowanie monocytów krwi ludzkiej do makrofagów

1. Ponownie zawiesić wyizolowane PBMC w 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki przyłączowej monocytów i przenieść je do jednej kolby do hodowli komórkowych T75.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 90 minut, aby umożliwić adhezję.
3. Wyrzucić supernatant i raz umyć komórki wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożem z delikatnym przechyleniem w celu usunięcia nieprzylegających lub luźno przylegających komórek.
   UWAGA: Przyłączone komórki są monocytami, które stanowią około 10% wszystkich PBMC pierwotnie dodanych do kolby.
4. Dodać 15 ml kompletnej pożywki zawierającej 10 ng/ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) do przylegających komórek i inkubować przez 6 dni w celu pobudzenia różnicowania.
5. Pożywkę należy wymieniać na świeżą, kompletną pożywkę zawierającą 10 ng/mL M-CSF co 2 dni.

2. Uprawa i polaryzacja MDM na powierzchni implantu tytanowego

UWAGA: W 6 dniu różnicowania, makrofagi M0 zostały wysiane na powierzchni biomateriału za pomocą różnych bodźców przez 48 godzin, aby uzyskać w pełni spolaryzowane makrofagi M1 lub M2. Dla każdej badanej powierzchni użyto trzech dysków do wysiewu makrofagów M0, M1 i M2. Jako powierzchnie kontrolne użyto plastikowych szkiełek nakrywkowych poddanych hodowlom komórkowym.

1. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolb T75 i przemywać komórki 10 ml PBS przez 5 minut.
2. Odłączyć przylegające komórki, inkubując je z 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu do odrywania komórek przez 30 minut.
3. Delikatnie postukaj w komórki i przenieś je do probówki o pojemności 50 ml. Odłącz pozostałe komórki, delikatnie zeskrobując je w 10 ml PBS.
4. Przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 50 ml i odwirować je w stężeniu 300 x g przez 10 minut.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża.
6. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym i hemocytometru, aby określić liczbę komórek i żywotność.
7. Przygotować zawiesinę komórek, dostosowując liczbę komórek do 160 000 komórek na 1 ml kompletnej pożywki.
8. Oczyść krążki biomateriału ultradźwiękowo w 70% etanolu przez 5 minut, a następnie sterylizuj w 70% etanolu przez 30 minut.
9. Suszyć tytanowe krążki przez 1-2 godziny, a następnie umieścić je w niepoddanych działaniu substancji 24-dołkowych płytkach i dodać 1 ml przygotowanej zawiesiny komórek do każdej studzienki.
10. Aby uzyskać makrofagi spolaryzowane M1, dodaj IFN-γ i LPS w stężeniu odpowiednio 50 ng/ml i 10 ng/ml. W przypadku polaryzacji M2 dodaj IL-4 i IL-13 w stężeniu 20 ng/ml każdy. Upewnij się, że komórki M0 są hodowane bez żadnych środków polaryzacyjnych. Inkubować komórki przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 w} celu wywołania polaryzacji.

3. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą testu ELISA

UWAGA: W drugim dniu polaryzacji próbki zostały przygotowane do analiz charakteryzacyjnych. Cytokina TNF-ɑ i chemokina CCL13 zostały zmierzone w celu scharakteryzowania odpowiednio makrofagów spolaryzowanych M1 i M2. Stężenie wydzielanych białek znormalizowano do całkowitego stężenia wydzielanych białek w odpowiednim supernatancie.

1. Zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki.
2. Przenieś krążki do nowej płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Celem jest wyeliminowanie martwych lub luźno przyczepionych komórek w niepoddanych działaniu substancji płytkach 24-dołkowych.
   UWAGA: Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy należy sprawdzić żywotność komórek na powierzchniach. Żywotność komórek można określić za pomocą testów żywotności żywych/martwych komórek lub pośrednio za pomocą testów proliferacji komórek i cytotoksyczności.
3. Zmierz cytokiny i chemokiny zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostarczonymi przez producenta. Zmierz cytokiny natychmiast lub przechowuj próbki w temperaturze -80 °C do przyszłego pomiaru.
   UWAGA: Dla każdego typu zestawu (biorąc pod uwagę czułość i granice wykrywalności zestawu ELISA) należy określić odpowiednie rozcieńczenie próbki. W teście kwasu bicinchoninowego (BCA) próbki rozcieńczono w stosunku 1:5. Próbki M1 dla TNF-ɑ rozcieńczono w stosunku 1:10, a próbki M2 dla CCL13 rozcieńczono w stosunku 1:12.
4. Obliczyć stężenie wydzielanych cytokin/chemokin za pomocą krzywej wzorcowej zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Zmierz całkowitą ilość białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
6. Normalizuj stężenie wydzielanych białek do mg białka całkowitego.

4. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą CLSM

UWAGA: Spolaryzowane makrofagi zostały dodatkowo scharakteryzowane poprzez barwienie ich przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórek CD209 i CCR7. Jądra zostały podbarwione przeciwstawnie za pomocą DRAQ5. CD68 lub inne markery mogą być używane jako markery panmakrofagów.

1. Umyj komórki 2x w 800 μL PBS. Inkubować krążki przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w 400 μl buforu utrwalającego.
2. Po usunięciu buforu utrwalającego przemyć trzykrotnie w 400 μl PBS. Próbki należy natychmiast zabarwić lub przechowywać w temperaturze 4 °C w 1 ml buforu do przechowywania.
   UWAGA: Dzięki temu protokołowi utrwalania i przechowywania próbki zostały pomyślnie wybarwione i zobrazowane w ciągu 1-6 tygodni od utrwalenia.
3. Przed kolejnym krokiem po przechowywaniu umyj krążki dwukrotnie 800 μl PBS.
4. Inkubować krążki z 400 μl buforu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania.
5. Odrzucić bufor blokujący i inkubować krążki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w 400 μl buforu barwiącym.
   1. Wykonaj procedurę immunofluorescencji przy użyciu podwójnego barwienia, aby zbadać ekspresję CCR7 i CD209 w jednej próbce. W tym celu należy połączyć przeciwciała pierwszorzędowe wyhodowane od różnych gatunków (myszy i królika) na tym samym etapie barwienia.
      UWAGA: Aby uzyskać silny sygnał z minimalnym tłem, zoptymalizuj stężenie przeciwciał. Przeciwciało CCR7 zastosowano w końcowym stężeniu 10 μg/ml, a przeciwciało CD209 rozcieńczono w stosunku 1/400.
6. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 3x 400 μl buforu do przemywania wodą.
7. Dodać przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem rozcieńczone w buforze barwiącym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
   UWAGA: Stężenie przeciwciał drugorzędowych powinno być zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnych specyficznych sygnałów przy minimalnym tle. W tym badaniu zastosowano przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 5 μg/ml do barwienia.
8. Po usunięciu supernatantu próbki należy przemyć trzykrotnie w buforze do przemywania przez 3 minuty każda.
9. Dodać 10 μM DRAQ5 do PBS i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
10. Usunąć supernatant i raz umyć krążki w PBS.
11. Usuń pozostały PBS i dodaj 1 kroplę podłoża montażowego.
12. Po 5 minutach nałożyć okulary nakrywkowe i pozostawić próbki do wyschnięcia na 1 godzinę.
13. Po wysuszeniu próbek uszczelnić krawędzie przezroczystym lakierem do paznokci i przechowywać je w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu wykonania obrazowania.
14. Aby uzyskać przegląd komórek, zobrazuj próbki w 25-krotnym powiększeniu. Aby dokładniej określić strukturę i lokalizację znaczników powierzchniowych, uzyskaj obrazy o 63-krotnym powiększeniu.
15. Określ ilościowo intensywność fluorescencji CCR7 i CD209 za pomocą oprogramowania ImageJ.
    UWAGA: Akwizycja obrazu została wykonana za pomocą fotopowielacza (PMT) z wykorzystaniem systemu CLSM, który został wyposażony w laser argonowy (488 nm), laser DPSS (561 nm) oraz laser HeNe (633 nm).

5. Charakterystyka spolaryzowanych makrofagów za pomocą qRT-PCR

UWAGA: Do izolacji RNA użyto dwóch krążków na próbkę, aby uzyskać wystarczającą ilość RNA do syntezy cDNA.

1. Umyj krążki 2x 800 μl PBS.
2. Dodać 350 μl buforu do lizy do pierwszego krążka i poddać komórki lizie, pipetując w górę i w dół.
3. Przenieś lizat na drugi krążek i powtórz proces lizy.
4. Dodać 350 μl 70% etanolu do lizatu i pipetować w górę iw dół, aż do uzyskania jednorodności.
5. Przenieś lizat do kolumny wirowej i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji RNA.
6. Określ ilościowo ilość RNA za pomocą nanokropli lub innego urządzenia.
7. Znormalizuj stężenia RNA dla różnych próbek i zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą systemu RT-PCR do syntezy pierwszej nici cDNA.
8. Zsyntetyzować cDNA przy użyciu 350 ng RNA zgodnie z protokołem producenta i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy qRT-PCR.
   UWAGA: W tym przypadku 350 ng oczyszczonego RNA użyto do syntezy cDNA przy użyciu 4 μL RT Mix (5x) w 20 μL.
9. Wykonaj qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym na 96-dołkowych płytkach i indywidualnych reakcjach 15 μl (1x Syber green master mix, 0,2 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 4,5 μl rozcieńczonego cDNA w stosunku 1:10).
   UWAGA: Program PCR rozpoczyna się od podgrzanej pokrywki (105 °C), po której następują trzy etapy: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, następnie 15 s w temperaturze 95 °C i 30 s w temperaturze 55 °C przez 40 cykli.
10. Normalizuj poziomy ekspresji różnych genów do genu porządkowego GAPDH (lub innych genów porządkowych, takich jak β-aktyna).
11. Obliczyć względną ekspresję genów przy użyciu metody 2^−ΔΔCt, przyjmując jako odniesienie komórki M0 hodowane na szkiełkach nakrywkowych do hodowli tkankowych. W tabeli 2 wymieniono wszystkie startery użyte w tym badaniu.

6. Analiza statystyczna

1. Przedstaw wszystkie dane jako średnią ± SEM. Powtórz wszystkie testy (w tym badaniu testy powtórzono pięć razy), aby zapewnić odtwarzalność. Oceń statystycznie istotne różnice między danymi o rozkładzie normalnym za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnego Tukeya.
2. Użyj testu Friedmana i testu wielokrotnego porównania Dunna, aby przeanalizować nieparametryczne zestawy danych. Użyj odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, aby przeanalizować dane i zdefiniować istotność statystyczną jako wartość p mniejszą niż 0,05.

Wyniki

Wyniki tego badania pokazują udane różnicowanie i polaryzację MDM na powierzchniach tytanu, a następnie charakteryzację makrofagów spolaryzowanych M1 lub M2. W pierwszym kroku scharakteryzowaliśmy spolaryzowane MDM za pomocą CLSM. Na podstawie naszych wstępnych badań, CD209 i CCR7 zostały użyte jako specyficzne markery do odróżnienia M1 od spolaryzowanych M2 MDM. Jak pokazano w Rysunek 2A,B, MDM pomyślnie spolaryzowały się na makrofagi M1 i M2. Na powierzchni tytanu CCR7 ulegał silniejszej ekspresji w makrofagach spolaryzowanych M1 niż CD209, wyrażonych specyficznie w makrofagach spolaryzowanych M2. Co więcej, ilościowe określenie względnej intensywności fluorescencji ułatwiło przypisanie markerów do podtypów M1 lub M2 (Rysunek 2C).

Rysunek 3 pokazuje reprezentatywną analizę qRT-PCR MDM na powierzchniach tytanu i szkiełek nakrywkowych. Wyniki wykazały, że MDM na obu powierzchniach były skutecznie spolaryzowane, o czym świadczy wysoka ekspresja markerów polaryzacji M1 (CCR7 i TNF-ɑ) i M2 (CD209 i CCL13). Zostało to dodatkowo potwierdzone na poziomie białka, obserwując wysokie poziomy zapalnych cytokin TNF-α (Figura 4A) i chemokin IL-13 (Figura 4B) odpowiednio w spolaryzowanych komórkach M1 i M2.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka spolaryzowanych MDM za pomocą CLSM. Wzbogacenie spolaryzowanych makrofagów M1 i M2 potwierdzono przez barwienie swoistych przeciwciał i analizę CLSM przy użyciu przeciwciał CCR7 i CD209 w 2 dniu po wysiewie. Zgodnie z barwieniem fluorescencyjnym i analizą CLSM, (A) 25-krotne powiększenie i (B) 63-krotne powiększenie, komórki M1 wyrażały wyższy CCR7 (na zielono) niż M0 lub M2. Komórki M2 wykazują znaczący wzorzec ekspresji CD209 (na zielono). (C) Analiza ilościowa względnej intensywności fluorescencji CCR7 i CD209. Jądra wybarwiono DRAQ5 (na fioletowo). Wyniki są reprezentatywne dla 5 podobnych eksperymentów przeprowadzonych niezależnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Charakterystyka spolaryzowanych MDM za pomocą profili ekspresji genów. Ilościową polimerazę odwrotnej transkrypcji wykorzystano do zbadania poziomów mRNA różnych genów związanych z polaryzacją M1 (CCR7 i TNF-ɑ) i M2 (CD209 i CCL13). GAPDH był używany jako gen do sprzątania. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM (n = 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Produkcja cytokin przez makrofagi M0, M1 i M2 hodowane na tytanowych i plastikowych szkiełkach nakrywkowych. (A) poziom cytokin TNF-ɑ i (B) poziom CCL13 w supernatantach hodowli komórkowych mierzono za pomocą testu ELISA. Wydzielanie cytokin znormalizowano do całkowitego wydzielania białka mierzonego za pomocą testu BCA. Wykresy słupkowe reprezentują średnią ± SEM (n = 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Bufor / Roztwór	zawartość
Bufor barwiący/blokujący	PBS + 1% BSA + 0,1% Animacja 20
Bufor do płukania	PBS + 0,1% Animacja 20
Bufor utrwalający	3% zawartości paraformaldehydu (PFA) w PBS
Bufor pamięci masowej	1% penicyliny i streptomycyny w PBS

Tabela 1: Lista.

)

Nazwa podkładu	Sekwencje starterów do przodu	Odwrotne sekwencje starterów
GAPDH	5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'	5'-TTGATTTTGGAGGAGGGATCTCG-3'
CCR7 (Klasa przemysłowa	5'- TGGTGATCGGCTCTCTCTTC-3'	5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'
Płyta CD209	5'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'	5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3'
Zobacz materiał CCL13	5'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'	5'-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3'
Format TNF-ɑ	5'- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'	5'- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'

Tabela 2. Sekwencje starterów stosowanych w qRT-PCR.

Dyskusja

Dokładne zrozumienie zachowania makrofagów jest niezbędne do zrozumienia właściwości immunomodulacyjnych materiałów do implantacji. W kilku badaniach opisano heterogeniczne markery, różnorodne modele komórkowe i protokoły charakteryzujące polaryzację makrofagów in vitro 17,18,19,20. Aby poprawić odtwarzalność, wiarygodność i porównywalność wyników eksperymentalnych, niezbędne są standaryzowane i zweryfikowane protokoły, wraz z odpowiednim modelem komórkowym i markerami charakterystyki konsensusu. W związku z tym dokładna symulacja właściwości immunomodulacyjnych materiałów implantologicznych wymaga najpierw odpowiedniego modelu komórkowego. W różnych badaniach wykorzystano szeroką gamę modeli komórkowych, takich jak izolowane makrofagi tkankowe, zróżnicowane makrofagi pochodzące z monocytów krwi i unieśmiertelnione linie komórek monocytowych. Chociaż makrofagi izolowane tkankowo można uznać za bardziej reprezentatywne dla warunków in vivo, stanowią one wyzwanie techniczne i etyczne^21,22. Makrofagi są również często pozyskiwane z uznanych unieśmiertelnionych linii komórek monocytowych, takich jak komórki THP1 23,24,25,26. Chociaż komórki te mogą oferować większą jednorodność odpowiedzi komórkowej jako nieograniczone źródło komórek niestarzejących się, zwykle uzyskuje się je od pacjentów z nowotworami hematologicznymi, a ich odpowiedzi mogą się znacznie różnić od normalnych komórek. Na przykład doniesiono, że monocytowe komórki THP1 są bardziej wrażliwe na symulatory M1 i częściej wykazują cechy M1²². Wyniki tego badania są zgodne z wynikami naszego badania wstępnego (dane nie są tutaj przedstawione).

Ponadto, ponieważ monocyty pochodzące z krwi są uważane za prekursory makrofagów rezydujących w tkankach i można je łatwo uzyskać z większą wydajnością, mogą one stanowić realną alternatywę dla makrofagów 27,28,29. Na podstawie naszego badania z użyciem makrofagów pochodzących z monocytów krwi stwierdziliśmy, że komórki te w równym stopniu reagowały na stymulatory M1 i M2 zarówno na szkiełkach nakrywkowych podawanych tytanowi, jak i hodowlom komórkowym. Ponadto wykazywali wiele markerów konsensusu M1 i M2, z których niektóre są pokazane w reprezentatywnych wynikach. Wyniki pokazały, że MDM mogą być wykorzystywane jako wykonalny model in vitro do symulacji interakcji implant-makrofag.

Dla dalszych postępów w badaniach nad immunomodulacją niezbędne są stałe i swoiste markery charakteryzujące. Badania wprowadziły różnorodne markery do charakterystyki makrofagów, które różnią się nie tylko między makrofagami z różnych źródeł, ale także między makrofagami z tego samego źródła 17,18,19,24. Panel markerów M1 i M2 charakterystycznych dla MDM został określony i zweryfikowany poprzez ocenę różnych zgłoszonych markerów. W tym artykule przedstawiono niektóre z najważniejszych kluczowych markerów.

Określenie najodpowiedniejszych metod wykrywania jest również kluczową częścią procesu oceny. Techniki analityczne powszechnie stosowane do oceny markerów powierzchni komórek zazwyczaj wymagają usunięcia komórek z biomateriałów. Zaobserwowano jednak, że proces ten negatywnie wpływa na komórki, uszkadzając ich markery powierzchniowe i powodując małą liczbę oderwanych komórek³⁰. W związku z tym cytometria przepływowa, która wymaga oderwania komórek, nie jest odpowiednia do oceny makrofagów, które są ściśle przymocowane do implantów. W tym badaniu wykrywanie markerów powierzchniowych komórek przeprowadzono za pomocą CLSM. Dzięki zastosowaniu odpowiednich markerów i optymalizacji procesu barwienia, udało nam się z powodzeniem scharakteryzować podtypy M1 i M2 w porównaniu do siebie i do komórek M0. Należy zauważyć, że barwienie fluorescencyjne jest półilościowe, co jest jednym z jego ograniczeń. Może to skomplikować ocenę komórek przy użyciu markerów wyrażonych we wszystkich podtypach bez znaczących różnic. CCR7 i CD209 zostały wybrane po przetestowaniu różnych markerów w celu scharakteryzowania MDM za pomocą CLSM. CCR7 i CD209 były konsekwentnie wyższe w podtypach M1 i M2, odpowiednio.

W ramach ograniczeń tego badania, wyniki podkreślają użyteczność i skuteczność wdrożonych protokołów w polaryzacji makrofagów na powierzchniach implantów i dokładnym ich charakteryzowaniu pod względem ekspresji genów, wydzielanych białek i markerów powierzchni komórek. Ponadto analiza opisanych markerów ujawniła spójne i specyficzne wzorce ekspresji, które można wykorzystać do rozróżnienia różnych podtypów MDM. Ten model in vitro nie odzwierciedla jednak w pełni różnorodności fenotypowej i plastyczności ludzkich makrofagów. Obecnie identyfikowanych jest kilka podtypów makrofagów (M2a, M2b, M2c, M2d), co wskazuje na potrzebę bardziej zróżnicowanych modeli in vitro w celu zbadania, w jaki sposób różne biomateriały i ich cechy (np. właściwości fizykochemiczne) wpływają na plastyczność i polaryzację makrofagów^31,32. Chociaż nie jest możliwe odzwierciedlenie złożonej sytuacji in vivo za pomocą modeli in vitro, wiele wyników można uzyskać przy użyciu przedstawionego protokołu in vitro, aby skutecznie opisać potencjał immunomodulacyjny nowych biomateriałów do implantacji⁹. Wreszcie, co nie mniej ważne, konieczne jest dalsze ustalenie, aby scharakteryzować makrofagi w bardziej złożonych modelach in vitro lub in vivo, obejmujących rolę innych graczy w złożonych kontekstach fizjologicznych. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przyczyni się do rozwoju i projektowania biomateriałów immunomodulujących w celu poprawy i promowania korzystnych procesów regeneracji tkanek i skutecznej integracji implantów, a także zapobiegania przewlekłym stanom zapalnym związanym z implantami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytka 24-dołkowa, niepoddawana obróbce	Corning Incorporated (Kennebunk, USA)	144530
Czytnik absorbancji Infinite F50	TECAN Austria GmbH (Grö dig, Austria)	TCAT91000001
Accutase w DPBS, 0,5 mM EDTA	EMD Millipore Corp. (Burlington, USA)	SCR005
Anti-Fade Fluorescencyjny środek montażowy -wodny, Fluoroshield	abcam (Cambridge, Wielka Brytania)	ab104135
Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler	Bio-Rad / MJ Research	7212
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	VWR International bvba (Leuven, Belgia)	Wirówka 422361V
5804 R	Eppendorf SE (Hamburg, Niemcy)	5804 R
DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13193
Dimetylosulfotlenek	Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA)	D2438-5X10ML
DRAQ5 Roztwór barwiący	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)	130-117-344
Alkohol etylowy ≥ 99,8% dla biologii molekularnej	Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Niemcy)	1HPH.1
Kozia IgG Anty-Mysia (H& L) Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej , Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723TR
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo, cyjanina3	Invitrogen	A10520
GraphPad Prism	Wersja GraphPad	9.4.1
Ludzkie przeciwciało CCR7	R& D Systems	MAB197
Human IFN-gamma Recombinant	Invitrogen (Rockford, USA)	RIFNG100
Human IL-13	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)	5230901032
Human IL-4	Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Niemcy)	130-095-373
Human M-CSF	Peprotech (Cranbury, USA)	300-25
Leica TCS SP5	Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Niemcy)	https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/
Lipopolisacharydy firmy Escherichia	Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA)	L4391-1MG
Luna Universal qPCR Master Mix	New England Biolabs	NEB #M3003
LunaScript RT SuperMix Kit	New England Biolabs	E3010L
Pożywka do separacji limfocytów 1077	PromoCell (Heidelberg, Niemcy)	C-44010
MCP-4/CCL13 Zestaw ELISA dla ludzi	Invitrogen	EHCCL13
MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml	)Applied Biosystems (Waltham, USA)	4346907
MicroAmp Optical Adhesive Film	Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA)	4311971
MicroAmp Splash Free 96-well Base	Applied Biosystems (Waltham, USA)	4312063
Wirówka mikrolitrowa CD-3124R	Phoenix Instrument (Niemcy)	9013111121
Okulary nakrywkowe do mikroskopu, 10 mm	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Niemcy	4HX4.1
Monocyte Attachment Medium	PromoCell (Heidelberg, Niemcy)	C-28051
Multiply-Pro Gefä ß 0,5 ml, PP	Sarstedt AG & Eco (Nü mbrecht, Niemcy)	7,27,35,100
Nanodrop One	Thermo Scientific (USA)	ND-ONE-W
QuantStudio  3 System	Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Niemcy)	A28567
RNeasy Micro Kit	Qiagen	74007
RPMI 1640, 1x, z L-glutaminą	Mediatech, Inc. (Manassas, USA)	10-040-CV
Sterylna ławka, LaminarAir HB 2472	Instrumenty Heraeus (Hanau, Niemcy)	51012197
Szkiełka nakrywkowe do hodowli tkankowych 13 mm (tworzywo sztuczne)	Sarstedt Inc. (Newton, USA)	83,18,40,002
Tarcze obrabiane tytanem 12 cm	Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Niemcy)	N/A
TNF alfa Human ELISA Kit	Invitrogen	KHC3011
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%	Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Niemcy)	1680.1