Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67186

⸱

8 listopada 2024

 ,  ,  , 
1School of Chemistry, Universidad Autónoma de Querétaro, 2Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Morelia, 3Department of Biochemical Engineering, Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico Superior de Ciudad Hidalgo

W tym artykule

Podsumowanie

Oddychanie mitochondrialne w całych komórkach drożdży jest cennym wskaźnikiem bioenergetyki komórki. W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określenia tego fenotypu mający zastosowanie do różnych gatunków drożdży.

Streszczenie

Metabolizm jest głównie koordynowany przez dostępność energii komórkowej i warunki środowiskowe. Testy pozwalające dowiedzieć się, w jaki sposób komórki dostosowują metabolizm energetyczny do różnych warunków żywieniowych i środowiskowych, dostarczają cennych informacji w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych. Fosforylacja oksydacyjna jest głównym źródłem ATP w większości komórek, a aktywność oddychania mitochondrialnego jest kluczowym składnikiem fosforylacji oksydacyjnej, utrzymując potencjał błony mitochondrialnej do syntezy ATP. Oddychanie mitochondrialne jest często badane w izolowanych mitochondriach, w których brakuje kontekstu komórkowego. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania oddychania mitochondrialnego w komórkach nienaruszonych przez drożdże. Metoda ta ma zastosowanie do wszystkich gatunków drożdży, chociaż jest zwykle stosowana do komórek Saccharomyces cerevisiae. W pierwszej kolejności badany jest wzrost drożdży w określonych warunkach. Następnie komórki są myte i ponownie zawieszane w wodzie dejonizowanej w stosunku 1:1 (w/v). Komórki są następnie umieszczane w komorze pulsoksymetru z ciągłym mieszaniem, a elektroda Clarka służy do ilościowego określenia zużycia tlenu. Niektóre cząsteczki są sekwencyjnie umieszczane w komorze i selekcjonowane zgodnie z tym wpływem na łańcuch transportu elektronów lub syntezę ATP. Inhibitor ATPazy oligomycyna jest najpierw dodawany w celu pomiaru oddychania sprzężonego z syntezą ATP. Następnie za pomocą rozłącznika mierzy się maksymalną wydolność oddechową. Na koniec dodaje się mieszaninę inhibitorów łańcucha transportu elektronów, aby wyeliminować zużycie tlenu niezwiązane z oddychaniem mitochondrialnym. Dane są analizowane przy użyciu regresji liniowej w celu uzyskania nachylenia reprezentującego wskaźnik zużycia tlenu. Zaletą tej metody jest to, że jest ona specyficzna dla oddychania mitochondrialnego drożdży, zachowując kontekst komórkowy. Należy podkreślić, że inhibitory stosowane w ilościowym określaniu oddechu mitochondrialnego mogą się różnić w zależności od gatunku drożdży.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają fundamentalną rolę w bioenergetyce komórkowej, ponieważ są głównym źródłem ATP dla większości komórek, a kilka szlaków zbiega się i zależy od aktywności szlaków mitochondrialnych1. Fosforylacja oksydacyjna jest potrzebna do syntezy ATP, która łączy transport elektronów przez łańcuch transportu elektronów w celu zmniejszenia aktywności tlenu i F1F0- ATPazy, syntetyzując ATP przy użyciu potencjału błony mitochondrialnej wytwarzanego w wyniku strumienia elektronów2. Tak więc oddychanie mitochondrialne jest częścią fosforylacji oksydacyjnej3.

Łańcuch oddychania mitochondrialnego składa się z czterech kompleksów lub, w niektórych przypadkach, kompleksu drożdżowego z niedoborem I (np. Saccharomyces cerevisiae), trzech kompleksów i trzech białek dehydrogenazy4. Kompleksy oddechowe są zlokalizowane w wewnętrznej błonie mitochondrialnej; niektóre drożdże prezentują kanoniczny łańcuch transportu elektronów z kompleksem I (dehydrogenaza NADH) lub dehydrogenazą trzech NADH, ubichinonem (Co Q), kompleksem II (oksydoreduktaza ubichinonianu bursztynianu), kompleksem III (oksydoreduktaza ubichinonu), cytochromem c (Cyt c) i kompleksem IV (oksydaza cytochromu c)5,6. Transport elektronów przez kompleksy umożliwia pompowanie protonów z macierzy mitochondriów do przestrzeni międzybłonowej, tworząc potencjał błony mitochondrialnej7. Protony znajdujące się w przestrzeni międzybłonowej są pompowane w odwrotnej kolejności, w kierunku macierzy mitochondriów przez F1F0 -ATPazę w celu syntezy jednej cząsteczki ATP na cztery pompowane protony8.

Pomiary oddychania mitochondrialnego dostarczają cennych informacji na temat integralności mitochondriów, bioenergetyki komórek i zdolności oddechowej mitochondriów9. Funkcja oddychania mitochondrialnego może być analizowana in vitro lub in situ przy użyciu różnych technik. Jednak analiza oddychania mitochondrialnego w nienaruszonych komórkach może przynieść szereg korzyści, ponieważ obejmuje cały metabolizm komórkowy, ponieważ interakcje komórek z ich środowiskiem i metabolizm wewnątrzkomórkowy są brane pod uwagę przy zastosowaniu całych komórek10. Co więcej, użycie nienaruszonych komórek pozwala na łatwą ocenę różnych warunków eksperymentalnych i wykrywa minimalne zmiany, których nie można było zaobserwować w izolowanych mitochondriach10,11. Kolejną zaletą kwantyfikacji oddychania mitochondrialnego w nienaruszonych komórkach jest to, że efekty proliferacji i lokalizacji mitochondriów są zachowane12.

Oddychanie mitochondriów ssaków w nienaruszonych komórkach zostało opisane bardzo szczegółowo12, pomijając badania nad innymi organizmami eukariotycznymi, takimi jak drożdże. W tym miejscu proponujemy technikę ilościowego określania oddychania mitochondrialnego dostosowaną do drożdży na podstawie protokołów ssaków. W związku z tym w tej technice wykorzystano koncepcje z kwantyfikacji oddychania mitochondrialnego u ssaków. Na przykład technika ta jest podzielona na różne etapy jako protokół ssaków: 1) oddychanie podstawowe (zależne od substratu), 2) oddychanie sprzężone z ATP (poprzez hamowanie syntazy ATP), 3) maksymalna zdolność oddychania (zastosowanie rozłącznika, który umożliwia przepuszczalność protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną), 4) hamowanie oddychania mitochondrialnego (wykorzystujące mieszankę inhibitorów łańcucha oddechowego w celu odrzucenia zużycia tlenu na rzecz innych źródeł niż Oddychanie mitochondrialne)11,13. W związku z tym niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie protokołu ilościowego oznaczania oddychania mitochondrialnego u drożdży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pożywki hodowlane i przygotowanie inokulum

  1. Przygotuj 100 ml pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem i dekstrozą (YPD), dodając 1 g ekstraktu drożdżowego, 2 g peptonu kazeinowego i 2 g glukozy w 95 ml wody destylowanej. Rozprowadzić 3 ml do szklanych probówek o pojemności 10 ml, sterylizować w temperaturze 121 °C i 1,5 psi przez 15 min.
    UWAGA: Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 - 8 °C przez okres do 1 miesiąca.
  2. Zaszczepić szklaną probówkę o pojemności 10 ml zawierającą 3 ml pożywki YPD 250 μl komórek drożdży konserwowanych glicerolem w temperaturze -20 °C. Inkubować przez noc ze stałym mieszaniem przy 200 obr./min i temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Inkubacja w temperaturze może się różnić w przypadku niektórych gatunków drożdży (np. Kluyveromyces marxianus ma optymalną temperaturę wzrostu 37 °C).
  3. Napełnić szalkę Petriego (60 x 15 mm2) sterylnym 2% agarem YPD (dodać 10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu kazeinowego, 20 g glukozy i 20 g agaru bakteriologicznego do 950 ml wody destylowanej) i przetrzeć szalkę Petriego komórkami drożdży wyhodowanymi w szklanej probówce o pojemności 10 ml za pomocą sterylnej pętli. Inkubować szalkę Petriego w temperaturze 30 °C aż do pojawienia się odizolowanych kolonii.
  4. Przygotować inokulum wstępne, zaszczepiając sterylną szklaną probówkę o pojemności 10 ml zawierającą 3 ml pożywki YPD o stężeniu 2% glukozy dwiema lub trzema koloniami izolowanymi od drożdży z szalki Petriego. Inkubować przez noc przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 30 °C.

2. Warunki wzrostu i projekt eksperymentu

  1. Zaszczepić 500 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 100 ml sterylnej syntetycznej kompletnej pożywki (pożywka SC; 0,18 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów, 0,5 g siarczanu amonu, 0,2 g fosforanu dipotasowego, 1 g syntetycznych suplementów drożdżowych i glukozy zgodnie z planem doświadczalnym, w 98,02 ml wody destylowanej) kulturą drożdży przy początkowym OD600 ~ 0,1, to jest około 3 ml nocnego pre-inokulum (OD600 ~ 3). Ustaw warunki środowiskowe lub suplement za pomocą wyzwania chemicznego, które ma być testowane w oddychaniu mitochondrialnym (np. dodanie 100 μM resweratrolu). Przygotować kontrolę nośnika w oddzielnej kolbie na wyzwanie chemiczne. Przeprowadzić co najmniej trzy kontrpróby biologiczne.
    UWAGA: Zaleca się użycie minimalnej pożywki w celu odrzucenia szumu odżywczego w teście, a minimalna pożywka proponowana w tym momencie jest stosowana w przypadku S. cerevisiae i może się różnić w przypadku innych gatunków drożdży. Wreszcie, stężenie glukozy uzupełnione w pożywce hodowlanej ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia represji glukozy lub efektu Crabtree, który hamuje oddychanie mitochondrialne; stężenia poniżej 0,5% (w/v) dawały dobre odpowiedzi w oddychaniu mitochondrialnym, czemu towarzyszyło wysokie tempo wzrostu S. cerevisiae. U drożdży Crabtree-ujemnych wysokie stężenia glukozy nie wpływały na oddychanie mitochondrialne (np. K. marxianus).
  2. Zważyć pustą probówkę stożkową o pojemności 50 ml i użyć jej do zebrania komórek w środkowej fazie logarytmu (OD600 ~ 0,5) przez odwirowanie przy 4000 x g przez 5 min.
    UWAGA: Faza mid-log jest zalecana do testowania oddychania mitochondrialnego, ponieważ jest to faza wzrostu, w której metabolizm energetyczny jest bardziej aktywny.
  3. Wyrzuć supernatant i przemyj osad 3x 25 ml wody dejonizowanej. Zważyć probówkę stożkową z komórkami osadu (masa mokra) i odjąć masę rurki stożkowej, aby uzyskać mokrą masę komórkową.
  4. Zawiesić osad w 2 ml wody dejonizowanej.
  5. Zapisać stężenie w komórkach, dzieląc mokrą masę przez 2, aby uzyskać mg komórek/ml. Wartość ta jest niezbędna do określenia, ile objętości należy dodać, aby uzyskać 50 mg komórek do testu.

3. Test zużycia tlenu (polarografia)

  1. Do pozyskiwania danych należy użyć elektrody tlenowej typu Clark podłączonej do monitora YSI5300A i komputera.
    1. Umieścić 5 ml kwasu sulfonowego morfoetanolu dostosowanego do pH 6 z trietanoloaminą (bufor MES-TEA; 10 mM) i 50 mg komórek (mokra masa) w komorze polarografu. Delikatnie umieść elektrodę, uważając, aby nie było pęcherzyków.
    2. Włącz monitor YSI5300A, komputer do zbierania danych i komorę do mieszania. Ustaw monitor YSI5300A, wybierając pokrętło ustawień kanału 1 w środowisku AIR. Dostosuj kanał 1 do 100% za pomocą pokrętła kalibracyjnego kanału 1 i ustabilizuj sygnał na 5 minut na 100%.
    3. Rozpocznij rejestrowanie danych w komputerze i mierzenie czasu za pomocą chronometru.
      UWAGA: Monitor YSI5300A nie jest wyposażony w komputer ani program do akwizycji danych; Może to być zaimplementowane zewnętrznie przez użytkownika.
    4. Użyj bocznego kanału elektrody w komorze pulsoksymetru, aby kolejno dodać utleniający się substrat, oligomycynę, rozprzęgacz i mieszaninę inhibitorów łańcucha oddechowego.
  2. Dodać substrat ulegający utlenieniu (glukozę, glicerol, L-mleczan lub inne źródło węgla zgodnie z projektem doświadczalnym) do końcowego stężenia 10 mM za pomocą strzykawki chromatograficznej. Utrzymuj komorę zamkniętą przez cały czas i z ciągłym mieszaniem. Rejestruj procentowe zużycie powietrza przez 2-3 minuty, aby określić oddychanie podstawowe.
    UWAGA: Glukoza, glicerol i L-mleczan są używane do analizy łańcucha transportu elektronów w różnych miejscach łańcucha oddechowego: metabolizm glukozy zmniejsza NAD + do NADH i jest wykorzystywany do analizy całego łańcucha oddechowego; glicerol przenosi elektrony do ubichinonu i jest używany do oceny łańcucha oddechowego ubichinonu; na koniec L-mleczan oddaje swoje elektrony cytochromowi c i jest stosowany do określenia efektu z cytochromu C14. Substraty te mogą się różnić w zależności od zdolności enzymatycznych gatunków drożdży.
  3. Dodać oligomycynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,01 mM w komorze pulsoksymetru za pomocą strzykawki chromatograficznej w celu oceny oddychania sprzężonego z ATP i zarejestrowania procentowego zużycia powietrza przez 2-3 minuty.
  4. Uzupełnić rozprzęgacz, cyjanek karbonylu 3-chlorofenylohydrazonu (CCCP) w celu uzyskania końcowego stężenia 0,015 mM w komorze pulsoksymetru za pomocą strzykawki chromatograficznej w celu określenia maksymalnej zdolności oddychania i zarejestrowania procentowego zużycia powietrza przez 2-3 minuty.
  5. Za pomocą strzykawki chromatograficznej dodać inhibitory łańcucha transportu elektronów: najpierw 2-tenoiltrifluoroaceton (TTFA), a następnie antymycynę A (AA) w końcowych stężeniach odpowiednio 1 mM i 1 mg/ml. Odmierzaj każdy inhibitor przez 2-3 min.
    UWAGA: Inhibitory łańcucha transportu elektronów mogą się różnić w zależności od gatunku drożdży; Należy to wziąć pod uwagę na tym etapie.
  6. Przesiewaj każde źródło węgla niezależnie (tj. glukozę, glicerol lub L-mleczan). Powtórz kroki od 3.3 do 3.5 dla każdego źródła węgla. Po każdym użyciu umyj komorę 3x 70% etanolem i 3x wodą dejonizowaną.

4. Przetwarzanie danych

  1. Użyj krzywych zużycia tlenu (wykreślając procent powietrza w funkcji czasu), aby obliczyć nachylenia ulegającego utlenieniu substratu (oddychanie podstawowe), oligomycyny (oddychanie sprzężone z ATP), CCCP (oddychanie maksymalne), AA i TTFA (nie oddychanie mitochondrialne; Rysunek 1). Oblicz indywidualne nachylenia dla każdego uzupełnionego związku za pomocą regresji liniowej, jak opisano poniżej.
    1. Utwórz nowy plik projektu w oprogramowaniu statystycznym. Wybierz XY w sekcji Utwórz. Wybierz opcję Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli w sekcji Tabela danych.
    2. Wybierz pozycję Liczby w podsekcji X w sekcji Opcje. Kliknij Wprowadź 3 replikowane wartości w podkolumnach obok siebie w podsekcji Y w sekcji Opcje.
      UWAGA: Format tabeli zawiera jedną kolumnę X i kilka kolumn Y, z których każda zawiera 3 podkolumny o nazwach A: Y1 i A: Y2.
    3. Wprowadź dane czasowe w kolumnach X (np. 0, 2, 4, 6, 8 s lub 0, 1, 2, 3 min). Zapisz procentową zawartość powietrza w kolumnach Y.
    4. Wykonaj dopasowanie regresji liniowej. Kliknij Analizuj na pasku menu. W opcji Analiza wybierz Prosta regresja liniowa w analizach XY i kliknij OK.
    5. Uzyskaj wartość nachylenia z tabel Wyniki w danych po lewej stronie ekranu.
  2. Zapisz wartości nachylenia w arkuszu danych i odejmij wartość nachylenia uzyskaną z mieszaniny inhibitorów oddechowych (AA i TTFA) od nachyleń uzyskanych z utleniającego się substratu, oligomycyny i CCCP w celu odrzucenia zużycia tlenu ze źródeł innych niż oddychanie mitochondrialne.
  3. Pomnóż uzyskane wartości przez 237 μM z O2 . Za wartość tę uważa się rozpuszczalnośćO2 w buforowanym podłożu mitochondrialnym zrównoważonym powietrzem (20,9 %O2) w temperaturze 25 °C; Wartość ta zmienia się w zależności od temperatury, wysokości i zastosowanego bufora.
  4. Przelicz na minuty; uzyskane wartości to μM z O2 na czas, w zależności od tego, jak czas jest wykreślony, aby uzyskać μM O2 / min.
  5. Podziel przez 50, czyli mg użytych komórek; mg komórki może się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. Wreszcie zużycie tlenu wyraża się jako μM z O2 / mg komórek x min

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tę technikę badania oddychania mitochondrialnego można zastosować dla gatunków drożdży innych niż S. cerevisiae, takich jak Scheffersomyces stipitis15 oraz K. marxianus16. Jednakże w celach reprezentacyjnych przedstawiamy wyniki wyłącznie dla S. cerevisiae. Powszechnie wiadomo, że S. cerevisiae wykazuje dominujący metabolizm oddechowy przy niskich stężeniach glukozy (poniżej 0.8 mM)17,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Fosforylacja oddychania mitochondrialnego odgrywa fundamentalną rolę w kilku szlakach, które zależą od potencjału błony mitochondrialnej i utrzymują poziom ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Zrozumienie, w jaki sposób warunki środowiskowe i żywieniowe wpływają na oddychanie mitochondrialne drożdży, służy jako narzędzie do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych.

Aby uzyskać wiarygodne wyniki tej metody, należy wziąć pod uwagę następujące kluczowe kroki. Mieszanie >200 obr./min ma kluczowe zna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Tecnológico Nacional de México (Grant 20026.24-PD) przyznany LAMP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-thenoilotrifluoroaceton (TTFA)MerckT27006Inhibitor kompleksu II
3-chlorofenylohydrazon cyjanek karbonylu (CCCP)MerckC2759Rozprzęgacz oddychania mitochondrialnego   
Absolut etanolMerck107017Do rozpuszczania kwercetyny 
AgarMerckA1296YPD preparat agarowy
Siarczan amonu granulowany (NH4)2SO4J.T. Baker0792-05SC preparat bulionowy
Antymycyna A (AA)MerckA8674Inhibitor kompleks III
aYSI5300A--------Monitor 
WirówkaHermleZ 206 ADo wirowania komórek
Elektroda tlenowa--------typu Clarka 
Komputer--------Do akwizycji danych 
Fosforan dipotasowy K2HPO4J.T. Baker3252-05SC preparat bulionowy
GlukozaMerckG7021Preparat bulionu YPD
GlicerolMerckG5516Podłoże substratowe suplementacja 
MleczanMerckL1250Podłoże substratowe suplementacja 
Oligomycyna z Streptomyces diastatochromogenesMerckO4876Hamowanie mitochondrialnej syntazy ATP
Wytrząsarka orbitalnaThermo FisherSHKE6000Inokulum inkubacja szklane probówki i kolba 
Pepton z kazeiny, trawienie enzymatyczneMerck82303YPD preparat bulionowy
Kwercetyna Merck337951Na zmniejszenie oddychania mitochondrialnego
Uracil Preparat bulionowyMerckU0750
Ekstrakt drożdżowy PreparatMerckY1625YPD
Drożdżowa baza azotowa bez aminokwasów i siarczanu amonuPreparat bulionowyMerckY1251
Syntetyczne podłoże Syntetyczne suplementy bez uracyluPrzygotowanie bulionuMerckY1501
SC bulionowy SC SC

Bibliografia

  1. Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes. Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).
  2. Duvezin-Caubet, S., Caron, M., Giraud, M. F., Velours, J., di Rago, J. P. The two rotor components of yeast mitochondrial ATP synthase are mechanically coupled by subunit delta. Proc Natl Acad Sci. 100 (23), 13235-13240 (2003).
  3. Vakifahmetoglu-Norberg, H., Ouchida, A. T., Norberg, E. The role of mitochondria in metabolism and cell death. Biochem Biophys Res Comm. 482 (3), 426-431 (2017).
  4. Matus-Ortega, M. G., et al. New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).
  5. Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis. Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).
  6. Schägger, H. Respiratory chain supercomplexes. IUBMB Life. 52 (3-5), 119-128 (2001).
  7. Lasserre, J. P., et al. Yeast as a system for modeling mitochondrial disease mechanisms and discovering therapies. Dis Model Mech. 8 (6), 509-526 (2015).
  8. Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes. EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).
  9. Zhang, J., et al. Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells. Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).
  10. Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles. Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).
  11. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).
  12. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
  13. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  14. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  15. Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation. FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).
  16. Carrillo-Garmendia, A., et al. Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae. Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).
  17. Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis. Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).
  18. Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).
  19. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).
  20. Carrillo-Garmendia, A., et al. Cytotoxicity of quercetin is related to mitochondrial respiration impairment in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 39 (11-12), 617-628 (2022).
  21. Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. FEBS J. 281 (21), 4805-4814 (2014).
  22. Gancedo, J. M. Yeast carbon catabolite repression. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (2), 334-361 (1998).
  23. Katzmann, D. J., et al. Expression of an ATP-binding cassette transporter-encoding gene (YOR1) is required for oligomycin resistance in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 15 (12), 6875-6883 (1995).
  24. Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism. J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).
  25. Gueguen, N., et al. Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice. PloS One. 10 (12), e0144290(2015).
  26. Lagoa, R., Graziani, I., Lopez-Sanchez, C., Garcia-Martinez, V., Gutierrez-Merino, C. Complex I and cytochrome c are molecular targets of flavonoids that inhibit hydrogen peroxide production by mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1807 (12), 1562-1572 (2011).
  27. de Oliveira, M. R., et al. Quercetin and the mitochondria: A mechanistic view. Biotechnol Adv. 34 (5), 532-549 (2016).
  28. Carrillo-Garmendia, A., Madrigal-Perez, L. A., Regalado-Gonzalez, C. The multifaceted role of quercetin derived from its mitochondrial mechanism. Mol Cell Biochem. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zużycie tlenuelektroda Clarkafosforylacja oksydacyjnałańcuch transportu elektronówsynteza ATPregresja liniowakomora oksymetruSaccharomyces cerevisiae
Kwantyfikacja oddychania mitochondrialnego w całych komórkach drożdży
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.