Artykuł metodologiczny

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67191

⸱

6 września 2024

 , 
1Department of Chemistry and the Henry Eyring Center for Cell and Genome Science, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Streszczenie

Tlenowe bakterie utleniające metan, znane jako metanotrofy, pełnią ważną rolę w cyklach biogeochemicznych. Metanotrofy zajmują specyficzną niszę środowiskową w obrębie przeciwgradientów metanowo-tlenowych występujących w glebach i osadach, co wpływa na ich zachowanie na poziomie indywidualnym i społecznościowym. Jednak konwencjonalne metody badania fizjologii tych mikroorganizmów łagodzących gazy cieplarniane często wykorzystują jednorodne kultury planktonu, które nie odzwierciedlają dokładnie gradientów przestrzennych i chemicznych występujących w środowisku. Utrudnia to naukowcom zrozumienie, w jaki sposób te bakterie zachowują się in situ. W tym miejscu opisano prosty, niedrogi ekosystem modelowy zwany strzykawką gradientową, który wykorzystuje półstałą agarozę do odtworzenia stromych gradientów przeciwbieżności metanowo-tlenowych charakterystycznych dla naturalnych siedlisk metanotrofów. Strzykawka gradientowa pozwala na hodowlę szczepów metanotroficznych i wzbogacanie mieszanych konsorcjów utleniających metan z próbek środowiskowych, ujawniając fenotypy widoczne tylko w tym przestrzennie rozdzielczym kontekście. Protokół ten informuje również o różnych testach biochemicznych, które zostały zmodyfikowane tak, aby były kompatybilne z półstałą matrycą agarozy, co może być cenne dla naukowców hodujących mikroorganizmy w innych systemach opartych na agarozie.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy żyjące na styku anoxiczno-oksykowym często pełnią ważne role ekologiczne1. Jednym z przykładów są tlenowe bakterie utleniające metan (metanotrofy), które występują w przeciwgradientach metanu i tlenu w glebach i osadach2. Mikroorganizmy te posiadają unikalne cechy metaboliczne i fizjologiczne, które umożliwiają im wykorzystywanie gradientów gazów obecnych w ich środowisku i są przedmiotem ciągłych badań od dziesięcioleci3,4,5. Obecnie większość opublikowanych badań nad metanotrofami i zbiorowiskami utleniającymi metan opiera się na pracy z jednorodnymi kulturami planktonu, które często nie są w stanie uchwycić gradientów przestrzennych i chemicznych, które są nieodłącznie związane z ich naturalnymi siedliskami mikrobiologicznymi. To ograniczenie utrudnia nam zrozumienie fizjologii drobnoustrojów i naszą zdolność do powiązania informacji genomowych z cechami fenotypowymi.

Ten protokół informuje o prostym, laboratoryjnym ekosystemie modelowym, który stwarza powtarzalne warunki do badania zarówno konkretnych metanotrofów, takich jak Methylomonas sp. szczep LW13, jak i społeczności utleniających metan bezpośrednio z próbek gleby środowiskowej. Co ważne, hodowla w strzykawce gradientowej skutkuje fenotypami specyficznymi dla przeciw gradientowi, które nie występują w jednorodnych kulturach planktonowych6, podkreślając zdolność systemu do odkrywania nowych aspektów fizjologii metanotrofu. Zainspirowana wcześniej opublikowanymi modelami ekosystemów7,8,9, strzykawka gradientowa jest uproszczoną metodą, którą można wykorzystać do zbierania informacji chemicznych i molekularnych z mikroorganizmów hodowanych przy użyciu tego podejścia.

Zgłoszone procedury analiz genetycznych, chemicznych i molekularnych zostały zmodyfikowane, aby działały niezawodnie na kulturach mikrobiologicznych uprawianych w półstałej matrycy agarozowej. Procedury te mogą być również przydatne do analizy bakterii hodowanych w innych półstałych systemach na bazie agarozy, takich jak te używane do testów pływania z miękkim agarem bakteryjnym. Dostosowanie tych analiz do kontekstów przestrzennie rozdzielczych może otworzyć nowe możliwości badania życia mikrobiologicznego w środowiskach o bardziej istotnym znaczeniu ekologicznym.

Protokół

Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie i ekstruzja strzykawek gradientowych

UWAGA: Przygotowanie strzykawki do gradientu powinno być przeprowadzone z zachowaniem technik sterylnych.

  1. Użyj kilku świeżo wyhodowanych na płytce kolonii Methylomonas sp. LW13 do zaszczepienia 6 mL mineralnej pożywki solnej z azotanami (NMS) w szklanej probówce o wymiarach 18 mm x 150 mm. Zamknij probówkę korkiem do serum i aluminiową obręczą, a następnie za pomocą strzykawki dodaj metan, aby uzyskać końcową atmosferę składającą się w 50% (v/v) z metanu w powietrzu. Inkubuj tę planktoniczną kulturę w cieczy, wytrząsając przy 200 rpm w temperaturze pokojowej do momentu zmętnienia (około jednego dnia).
  2. Przeszczep kultury ciekłe w stosunku 1:10 do świeżej pożywki. Kontynuuj hodowlę ciekłą metanotrofów do fazy logarytmicznej wzrostu (OD600 wynosząca ok. 0,5) i dostosuj gęstość do OD600 =1,0.
  3. Przygotuj strzykawki, wyjmując z nich tłoki i przechowując je w sterylnym pojemniku. Do strzykawki przymocuj sterylną końcówkę z filtrem PTFE i umieść ją w standardowym statywie na probówki końcówką skierowaną w dół.
  4. Dla każdej strzykawki 10 mL dokładnie wymieszaj 1 mL komórek z kroku 1.2 z 5 mL pożywki NMS i 4 mL roztopionej agarozy (0,5% m/v, schłodzonej do 55 °C) w sterylnym probówce stożkowej. Objętości te można zwiększyć, aby napełnić wiele strzykawek równolegle.
  5. Powoli wlej lub za pomocą pipety serologicznej dodaj mieszaninę do każdej strzykawki, aż do oznaczenia 8 mL. Pozostaw agarozę w strzykawkach do zastygnięcia (~15 min), a następnie zamknij je sterylnym, 20 mm gumowym korkiem butylowym. Przymocuj korek do strzykawki za pomocą taśmy laboratoryjnej i opisz zawartość strzykawki.
  6. Aby dodać metan do przestrzeni nad cieczą w strzykawce, napełnij dużą strzykawkę (60 mL) 100% CH4 i przymocuj końcówkę z filtrem PTFE (0,2 µm, 25 mm) połączoną ze sterylną igłą (23 G). Przebij korek gumowy dużą strzykawką i przebij drugą sterylną igłą korek, aby stworzyć wylot gazu.
  7. Naciśnij tłok dużej strzykawki, aby przepłukać przestrzeń nad cieczą 20 mL 100% CH4, pamiętając o wyjęciu igły wylotowej, gdy w dużej strzykawce pozostanie 1-2 mL CH4, aby zapobiec cofaniu się tlenu przez igłę wylotową.
  8. Inkubuj strzykawki w temperaturze 18 °C, powtarzając codziennie kroki 1.6 i 1.7 w celu uzupełnienia metanu.
  9. Aby wydobyć agarozę, zastąp końcówkę z filtrem PTFE sterylną igłą 23 G, a korek gumowy zastąp dostarczonym tłokiem strzykawki. Powoli naciskaj tłok, aby dozować porcje po 1 mL do oddzielnych sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

2. Wyznaczanie stężeń gazów przeciwgradientowych

  1. Pomiar gradientu tlenu rozpuszczonego
    1. Za pomocą żyletki przeciąć wzdłuż szerokości strzykawkę wypełnioną agarozą (przygotowaną zgodnie z krokami 1.1-1.8) w pobliżu filtra PTFE. Przymocować otwartą strzykawkę do pompy strzykawkowej skierowanej w stronę mikroelektrody typu Clarka, tak aby otwarty koniec był skierowany w stronę końcówki elektrody.
    2. Ustawić parametry pompy strzykawkowej tak, aby strzykawka przesuwała się w kierunku mikroelektrody z prędkością 1 mL/min (0,6 cm/min); rozpocząć rejestrację pomiarów tlenu rozpuszczonego w oprogramowaniu Unisense Logger niezwłocznie po uruchomieniu pompy strzykawkowej.
  2. Pomiar gradientu metanu
    1. Bezpośrednio przed ekstruzją zastąpić końcówkę filtra strzykawki zaworem jednokierunkowym połączonym z igłą 23 G, a gumowy korek szybko zamienić na tłok strzykawki. Przenieść osiem 1 mL aliquotów agarozy do oddzielnych, ewakuowanych, gazoszczelnych fiolek 12 mL i pozostawić próbki do wyrównania temperatury w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    2. Wyrównać ciśnienie w fiolkach z próbkami do ciśnienia atmosferycznego poprzez krótkie otwarcie i natychmiastowe ponowne zamknięcie fiolek lub przebicie igłą i jej szybkie usunięcie. Za pomocą gazoszczelnej strzykawki wstrzyknąć 500 µL fazy gazowej znad próbki do chromatografu gazowego z detektorem jonizacji płomieniowej (GC-FID). Stworzyć krzywą kalibracyjną na podstawie wzorców CH4, aby przeliczyć pole powierzchni piku (pA*min) na µmol/L.

3. Zliczanie komórek w strzykawce gradientowej

  1. Cytometria przepływowa
    1. Wytłoczyć 1 mL segmentów agarozy z strzykawek gradientowych zaszczepionych szczepem LW13 typu dzikiego lub mutantem, zgodnie z opisem w kroku 1.9. Przygotować i wytłoczyć również agarozę ze sterylnej strzykawki bez komórek jako kontrolę negatywną.
    2. Do wszystkich wytłoczonych próbek agarozy dodać 0,75 mL 0,85% (m/v) NaCl w wodzie i homogenizować za pomocą wortexa. Następnie rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10, przenosząc 100 µL do nowej probówki do mikrowirówki i dodając 900 µL roztworu soli.
    3. Dodać 3 µL mieszaniny barwników SYTO9 i jodku propidyny w stosunku 1:1, a następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 min. Aby określić liczbę komórek na 1 mL agarozy, poddać zawiesinę kulek liczących mikrosfery sonikacji w kąpieli wodnej przez 5 min. Następnie, przed analizą cytometryczną, dodać 10 µL zawiesiny do każdej próbki.
    4. Próbki analizować za pomocą cytometru przepływowego10,11 przy następujących parametrach: wyzwalanie na fluorescencji zielonej, szybkość przepływu 10 µL/s oraz szybkość analizy cząstek poniżej 1000 cząstek/s.
      1. Porównać wykresy kropkowe SSC vs. FITC między próbkami kontrolnymi bez komórek a zaszczepionymi próbkami agarozy, aby wyznaczyć bramki napięciowe dla „zdarzeń bakteryjnych” wykluczające tło cząstek agarozy. Dodatkowo wyznaczyć bramki napięciowe dla kulek liczących mikrosfery, które powinny być spójne pomiędzy próbkami.
    5. Aby określić stężenie komórek w każdym segmencie agarozy w strzykawce gradientowej, należy użyć następującego równania, przyjmując, że czynnik rozcieńczenia dla powyższego protokołu wynosi 17,7275, a 10-6 mL to objętość jednej kulki mikrosferycznej.
      Wzór na stężenie bakterii, obliczanie liczby komórek/mL, laboratoryjna metoda ilościowa.
  2. Zliczanie jednostek tworzących kolonie w strzykawce gradientowej
    1. Wytłoczyć 1 mL segmentów agarozy do oddzielnych, sterylnych probówek do mikrowirówki o pojemności 2 mL, dodać 800 µL NMS i mieszać na wortexie przez 10 s, aby ułatwić pipetowanie.
    2. Przygotować sterylną płytkę 96-dołkową, dodając 180 µL NMS do każdego dołka. Dodać 20 µL rozcieńczonych próbek agarozy do każdego dołka w pierwszej kolumnie i wymieszać pipetą.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej przeprowadzić dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 20 µL z dołków w pierwszym rzędzie do dołków w drugim rzędzie i pipetując 10 razy w celu wymieszania. Kontynuować ten proces aż do ostatniego rzędu płytki.
    4. Oznakować płytki z siatką kwadratową zawierające agar NMS lub wybrane medium. Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść po 5 µL z kolumny płytki 96-dołkowej na płytkę z agarem. W zależności od wielkości płytki z agarem, na jednej płytce można nanieść kilka kolumn.
    5. Inkubować płytki w atmosferze 40% metanu w powietrzu i hodować w temperaturze 18 °C. Zliczyć kolonie bakterii po 2-3 dniach i określić liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU/mL).

4. Testy detekcji biomolekuł

  1. Oznaczanie polisacharydów
    1. Wytłoczyć 1 mL segmentów agarozy do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL i wymieszać z 1 mL 1% (m/v) roztworu Na2CO3 w wodzie. Próbki podgrzewać do 80 °C przez 30 min, mieszając w wortexie co 5-10 min, a następnie odwirować z prędkością 4,000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min.
    2. Zebrać nadsącz, połączyć z trzema objętościami 100% etanolu i inkubować w 20 °C przez co najmniej 2 h (lub przez noc).
    3. Zebrać wytrącone etanolem polisacharydy poprzez wirowanie z prędkością 16,100 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min. Usunąć nadsącz i wysuszyć osad na powietrzu. Resuspendować osad w 100 µL wody dejonizowanej.
    4. Zmierzyć względną zawartość polisacharydów w każdym segmencie agarozy, stosując kolorymetryczny test fenolowo-siarkowy12,13. W przezroczystej płytce 96-dołkowej połączyć 50 µL zresuspendowanego ekstraktu z 150 µL stężonego kwasu siarkowego i 30 µL 5% (v/v) fenolu w wodzie.
    5. Zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczyć względną zawartość polisacharydów każdego segmentu agarozy jako procent absorbancji segmentu agarozy znajdującego się najbliżej filtra PTFE.
  2. Oznaczanie białek
    1. Wytłoczyć agarozę do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przenieść 100 µL każdej porcji do szklanych probówek.
    2. Wyznaczyć całkowite stężenie białka, stosując protokół dla probówek z zestawu do oznaczania białek metodą BCA. Przygotować standardy albuminy BSA, używając agarozy wytłoczonej ze sterylnej strzykawki jako rozcieńczalnika.
  3. Oznaczanie zewnątrzkomórkowego DNA
    1. Wytłoczyć agarozę do oddzielnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i przenieść po 20 µL każdej porcji do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 0,2 mL.
    2. Zmierzyć stężenia DNA, korzystając z dostępnego komercyjnie zestawu do wysokoczułego oznaczania dsDNA 1x, zgodnie z protokołem producenta.

5. Izolacja RNA

  1. Przygotować bufor do ekstrakcji, łącząc w 800 mL wody wolnej od RNaz następujące składniki: 2,0 g CTAB, 2,0 g poliwinylopirolidonu (PVP 40), 81,8 g NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) oraz 20 mM EDTA. Dopełnić objętość do 1 L i wysterylizować w autoklawie; przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Rozdzielić przygotowany bufor do ekstrakcji na aalikwoty i tuż przed użyciem dodać beta-merkaptoetanol do końcowego stężenia 1% (v/v). Podgrzać bufor do 65 °C w łaźni wodnej lub w bloku grzejnym.
  3. Podzielić każdą strzykawkę z gradientem na sekcje o objętości 1 mL, wyciskając agarozę do oddzielnych, wolnych od RNaz probówek do mikrowirówki o pojemności 2 mL, zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.9.
  4. Próbki wirować przy 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min, a następnie odrzucić nadsącz, utrzymując próbki na lodzie.
  5. Do każdego osadu z 1 mL wyciśniętej agarozy dodać 600 µL uprzednio podgrzanego buforu do ekstrakcji. Dodać około 200 µL kulek cyrkonowo-krzemionkowych i homogenizować próbki przez 3 min przy 30 Hz/s za pomocą homogenizatora kulkowego, robiąc przerwę w połowie czasu, aby umieścić próbki na lodzie na 2 min.
  6. Próbki wirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min, aby zmniejszyć pienienie. Przeprowadzić ekstrakcję próbek, dodając do probówek 600 µL mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) i mieszając na wirówce typu vortex przez 10 s.
  7. Próbki wirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 8 min. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki, dodać do niej 600 µL mieszaniny chloroform: alkohol izoamylowy (24:1) i mieszać na vortexie przez 10 s.
  8. Próbki wirować przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 8 min i przenieść nową górną fazę wodną do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki. Do przeniesionej górnej fazy dodać równą objętość izopropanolu i inkubować próbki przez kilka godzin w temperaturze -20 °C. Opcjonalnie: próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc.
  9. Zebrać osady zawierające RNA, wirując próbki przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min.
  10. Odrzucić nadsącz i wyprać osad 300 µL zimnego 75% (v/v) etanolu przygotowanego w wodzie wolnej od RNaz, a następnie wirować przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
  11. Powtórzyć przemywanie osadów zgodnie z krokiem 5.10.
  12. Po usunięciu nadsączu z etanolu pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu przez 15 min. Rozpuścić osady w 100 µL wody wolnej od RNaz.
  13. Próbki traktować DNazą I w temperaturze 37 °C przez 30 min zgodnie z protokołem producenta.
  14. Inaktywować DNazę I, dodając 300 µL kwasowego fenolu: chloroformu: IAA (125:24:1, pH 4,5). Mieszać na vortexie przez 10 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  15. Wirować przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min i zachować górną fazę wodną, przenosząc ją do nowej, wolnej od RNaz probówki do mikrowirówki.
  16. Opcjonalnie: Połączyć RNA z tego samego segmentu ze wszystkich powtórzeń w strzykawkach, łącząc górne fazy w probówce stożkowej.
  17. Dodać objętość izopropanolu równą objętości górnej fazy zawierającej RNA oraz dodać LiCl 7,5 M do stężenia końcowego 0,8 M, odwracając probówkę kilka razy w celu wymieszania.
  18. Inkubować próbki przez kilka godzin w temperaturze -20 °C. Opcjonalnie: próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc.
  19. Próbki wirować przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min i ostrożnie odrzucić nadsącz. Przemyć osad zawierający RNA dwukrotnie, dodając zimny 70% (v/v) etanol w wodzie wolnej od RNaz, wirując przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min i usuwając nadsącz.
  20. Pozostawić osady do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 min i resuspenderować w 50 µL wody wolnej od RNaz. Próbki RNA przechowywać w temperaturze -80 °C.
  21. Opcjonalnie, w zależności od jakości RNA: Próbki można ponownie oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA w celu usunięcia małych (<200 nt) cząsteczek RNA.
  22. Aby potwierdzić, że próbki RNA nie zawierają resztkowego DNA, użyć 1 µL oczyszczonego RNA jako matrycy do amplifikacji PCR z wykorzystaniem uniwersalnych starterów genu 16S rRNA bakterii 27F/1492R. Należy uwzględnić dwie dodatkowe reakcje PCR zawierające 1 µL DNA genomowego (rozcieńczonego 1:100) lub wody wolnej od nukleaz, służące odpowiednio jako kontrola pozytywna i negatywna.
  23. Produkty rozdzielić w 1% żelu agarozowym TBE za pomocą elektroforezy żelowej14.
    UWAGA: Próbki RNA bez kontaminacji DNA nie powinny wykazywać obecności prążka w ścieżce próbki. Jeśli w próbkach RNA stwierdzono kontaminację DNA, należy ponownie przetworzyć próbki, zaczynając od kroku 5.13. RNA jest gotowe do dalszych analiz i opcjonalnie może zostać poddane analizie w celu ilościowego określenia jego integralności poprzez pomiar wskaźnika RIN (RNA Integrity Number).

Wyniki

W niniejszej pracy model ekosystemu z wykorzystaniem strzykawki gradientowej został użyty do hodowli pojedynczego szczepu (metanotrofa Methylomonas sp. szczep LW13) (Rysunek 1A)6, jednak może on służyć również do wzbogacania mikroorganizmów utleniających metan poprzez bezpośrednią inokulację glebą (Rysunek 1B). Obecność przeciwprądu gradientu metanu i tlenu potwierdzono poprzez pomiar stężeń metanu i tlenu w strzykawkach nieinokulowanych oraz inokulowanych (Rysunek 1C). W przypadku strzykawek gradientowych inokulowanych szczepem LW13, przeciwgradient uformował się w ciągu jednego dnia od przepłukania strzykawki, a następnie stawał się bardziej stromy w ciągu trzech dni inkubacji. W tym samym czasie na tej samej głębokości, na której oba substraty gazowe osiągnęły najniższe stężenia, utworzył się poziomy pas (Rysunek 1A). Stromy gradient gazowy oraz wyczerpanie metanu i tlenu poniżej głębokości poziomego pasa wykazały, że LW13 metabolizował metan tlenowo, wykazując fenotyp nieobserwowany w homogenicznej kulturze planktonicznej. Fenotyp ten jest również wytwarzany przez inne bakterie metanotroficzne wyizolowane z tej samej próbki środowiskowej co LW136. Zmienność czasu i głębokości powstawania poziomego pasa w zależności od szczepu wśród różnych szczepów metanotroficznych sugeruje, że pas ten zależał od specyficznego zachowania każdego mikroorganizmu podczas hodowli w kontekście przestrzennym6.

Liczbę komórek w całym czopie agarozowym zmierzono za pomocą cytometrii przepływowej oraz zliczeń kolonii (CFU/mL) (Rysunek 2A). Metodę tę zastosowano w celu porównania rozkładu i przeżywalności komórek szczepu dzikiego LW13 ze szczepem mutantem LW13 zawierającym delecję w genie fukozo-4-O-acetylotransferazy (OAT), o której wcześniej wykazano, że wpływa ona na powstawanie pasm poziomych6. Mutant ΔOAT szczepu LW13 wykazywał niższy ogólny wzrost w strzykawce gradientowej w ciągu 6 dni w porównaniu do typu dzikiego, czego nie zaobserwowano w homogenicznych kulturach planktonicznych tych samych szczepów6. Szczep mutant nie tworzył tak wyraźnego pasma poziomego jak typ dziki LW13 podczas hodowli w strzykawce gradientowej (Rysunek 2B). Liczba komórek oraz wygląd pasma poziomego zostały przywrócone do poziomów zbliżonych do typu dzikiego po komplementacji genu w szczepie mutant. Wyniki te pokazują, że strzykawka gradientowa może być wykorzystana do powiązania genów ze specyficznymi fenotypami występującymi wyłącznie w przeciwprądowym gradiencie metan-tlen.

Do zastosowania w przypadku bakterii hodowanych w półstałej matrycy agarozowej zaadaptowano szereg technik genetycznych, chemicznych i molekularnych. Model ekosystemu w strzykawce z gradientem może być łatwo wykorzystany do standardowych analiz ilościowych biomolekuł, z zastosowaniem niezaszczepionej agarozy jako kontroli negatywnej. Zmierzono stężenie trzech różnych biomolekuł powszechnie występujących w zewnątrzkomórkowych substancjach polimerowych i biofilmach: polisacharydów, białek oraz zewnątrzkomórkowego DNA15 (Rycina 3). W segmentach strzykawki zaszczepionych szczepem LW13, prążek poziomy zawierał znacząco więcej polisacharydów niż pozostałe segmenty, przy braku istotnego wzrostu ilości białek lub zewnątrzkomórkowego DNA.

Do pomiaru różnic transkrypcyjnych w LW13 rosnącym na różnych głębokościach strzykawki wykorzystano RNA-seq. Skuteczną ekstrakcję RNA osiągnięto przy użyciu buforu ekstrakcyjnego opartego na CTAB, a następnie konwencjonalnych etapów ekstrakcji fenol:chloroformowej oraz precypitacji. Wyniki analizy RNA-seq zostały później wykorzystane do zidentyfikowania genów zaangażowanych w produkcję poziomego pasma polisacharydowego. Wyniki te wskazują, że półstała agaroza, niezbędna do stworzenia modelu ekosystemu o rozdzielczości przestrzennej, nie uniemożliwia dalszych analiz biochemicznych, które są zazwyczaj zarezerwowane dla kultur planktonicznych i hodowli na płytkach.

Chromatografia równowagi statycznej; głębokość agarozy; stężenia O₂, CH₄; rozcieńczenie gleby; wykres danych.
Rycina 1: Model ekosystemu w strzykawce gradientowej. (A) Strzykawka gradientowa zaszczepiona metanotrofem Methylomonas sp. LW13. Wyraźny poziomy pas (grot strzałki) powstaje w ciągu dwóch dni od przepłukania strzykawki 100% metanem. (B) Zdjęcia powiększone strzykawek gradientowych zaszczepionych glebą rozcieńczoną 10-1 i 10-4 i inkubowanych przez dwa tygodnie. Strzykawki gradientowe zawierające bardziej rozcieńczoną glebę wykazały obecność kolonii sferycznych w całej agarozie, podczas gdy bardziej skoncentrowane inokula glebowe doprowadziły do powstania wyraźnego pasa. (C) Charakterystyka przeciwgradientu metan-tlen w sterylnych strzykawkach gradientowych oraz strzykawkach zaszczepionych szczepem LW13 po trzech dniach inkubacji. Szary pasek wskazuje zakres głębokości, w których znajdował się pas polisacharydowy; dane przedstawiają średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, z trzema powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. Panele (A) i (C) zostały zmodyfikowane na podstawie pracy Beals et al.6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres porównawczy wzrostu komórek i próbki z kolumny agarozowej, warunki: typ dziki vs ΔOAT oraz ΔOAT+OAT.
Rycina 2Ilościowe oznaczenie typu dzikiego i mutantów LW13 po inkubacji w strzykawce z gradientem. (A) Całkowita liczba komórek LW13 na mL wyciśniętego agarozy odzyskanej z strzykawek gradientowych w dniu 0 i dniu 7, zmierzona metodą cytometrii przepływowej. ΔOAT zawiera delecję genu fukozo-4-O-acetylotransferazy, który wykazywał wysoką ekspresję w komórkach zlokalizowanych na głębokości prążka polisacharydowego. ΔOAT+OAT zawiera gen OAT wstawiony w odległym miejscu genomu ΔOAT. *, istotnie różniące się (dwustronny test heteroskedastyczny test t-Studenta, α = 0,05); n.s., brak istotnej różnicy. Dane przedstawiają średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, z dwoma powtórzeniami technicznymi dla każdego z nich. (B) Poziomy rozwój pasma w strzykawkach gradientowych zaszczepionych dzikim typem LW13, ΔOAT lub ΔOAT+OAT po siedmiu dniach inkubacji. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Beals i wsp.6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres stężenia polisacharydów, białek i DNA; głębokość w agarozie; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 3: Ilościowe oznaczenie biomolekuł na zwiększających się głębokościach strzykawki gradientowej. Względna zawartość polisacharydów (%), stężenie białek (µg/mL) oraz stężenie DNA (ng/µL) w ośmiu sekcjach strzykawek gradientowych zaszczepionych LW13 i inkubowanych przez siedem dni (pełne kropki; puste kropki przedstawiają wartości ze sterylnych strzykawek gradientowych). Dane przedstawiają średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów z trzema powtórzeniami technicznymi w każdym. Dla względnej zawartości polisacharydów * oznacza istotną różnicę w stosunku do sterylnej kontroli na tej samej głębokości (dwustronny heteroskedastyczny t-test, α = 0.05). Dla stężeń białek i DNA * oznacza istotną różnicę w stosunku do sekcji zawierającej poziomy prążek (jednoczynnikowa ANOVA z analizą post hoc Tukey-Kramer); n.s. – brak istotności. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie Beals et al.6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Metody uprawy metanotrofu
Metanotrofy są badane od dziesięcioleci w celu zrozumienia ich fizjologii, indywidualnego i społecznego zachowania w środowisku naturalnym oraz ich potencjału w zakresie łagodzenia emisji metanu w zastosowaniach przemysłowych. W ramach tych badań wiele z przeprowadzonych badań przeprowadzono przy użyciu jednorodnych kultur planktonowych, w których utracono kontekst przestrzenny. Ekosystem gradientowego modelu strzykawki został opracowany w celu odtworzenia gradientu przeciwwagi metanowo-tlenowej charakterystycznego dla naturalnych siedlisk metanotrofów w laboratorium, co pozwoliło naukowcom na badanie metanotrofów rosnących w środowisku, które bardziej przypomina miejsce, w którym te organizmy ewoluowały.

W ciągu ostatnich 30 lat naukowcy odtworzyli w laboratorium gradient przeciwproporcji metan-tlen przy użyciu różnych metod, często mając na celu przede wszystkim wyizolowanie i sklasyfikowanie metanotrofów z mieszanych konsorcjów utleniających metan. Metody te można podzielić na dwa podejścia, oba polegające na użyciu przeciwległych komór metanu i tlenu: zawieszenie względnie nienaruszonej gleby na membranie 16,17,18 lub zaszczepienie niewielkich ilości gleby lub czystej kultury bakteryjnej do minimalnego podłoża w agarozie 7,8,19. Opisana tutaj metoda strzykawki gradientowej łączy podejście strzykawkowe Dedysha i współpracowników9 z hodowlą metanotrofów z poprzednich prac Amarala iKnowlesa 8 oraz Schinka i współpracowników7. Ostatnia z tych metod stworzyła podstawy do hodowli metanotrofów w przeciwgradiencie metanowo-tlenowym i wykorzystywała ciągły przepływ metanu i tlenu po obu stronach korka agarozowego. Chociaż zapewnia to bardziej stałe środowisko, takie podejście komplikuje konfigurację eksperymentalną i wymaga dedykowanych źródeł gazu.

W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj strzykawka gradientowa opiera się na codziennym płukaniu strzykawki w celu dostarczenia świeżego metanu, proces, który trwa mniej niż minutę na strzykawkę, zapewniając jednocześnie ciągły dostęp do tlenu atmosferycznego przez sterylną końcówkę filtra PTFE. Ta prostsza metoda może umożliwić szersze zastosowanie tego modelowego ekosystemu do badania metanotrofów w kontekście przestrzennie rozdzielczym. Opisany protokół zawiera również szczegółowe analizy chemiczne i molekularne, które można przeprowadzić bezpośrednio na bakteriach inkubowanych w półstałej agarozie. W rezultacie, bakterie nie muszą być wycinane i hodowane poza matrycą agarozy przed analizą, z zachowaniem warunków gradientu gazu w momencie pobierania próbek.

Uwagi do protokołu
Ponieważ bakterie są hodowane w polipropylenowej strzykawce wolumetrycznej, naukowcy mogą użyć dołączonego tłoka strzykawki do dokładnej i powtarzalnej segmentacji czopu agarozowego, zachowując integralność przestrzenną matrycy agarozowej, która nadal pozostaje w cylindrze strzykawki. Bez hermetycznej konstrukcji właściwej dla strzykawki, korki agarozowe musiałyby zostać wyjęte z cylindra strzykawki i pokrojone w plastry, co wprowadziłoby niepewność co do objętości segmentów agarozy i uwolniło do atmosfery niemierzalne ilości metanu i rozpuszczonego tlenu. Wytłaczanie agarozy za pomocą sterylnej igły upraszcza przygotowanie próbki i pomaga homogenizować wytłaczane segmenty bez ścinania komórek bakteryjnych. Metoda ta pozwala naukowcom podzielić każdą zaszczepioną strzykawkę gradientową na co najmniej osiem segmentów agarozy i przeprowadzić równoległe eksperymenty na metanotrofach rosnących w różnych stężeniach tlenu i metanu.

Optymalizując ekstrakcję RNA z agarozy o wysokiej zawartości polisacharydów, stwierdzono, że powszechne odczynniki, takie jak tiocyjanian guanidu i trizol, prowadziły do żelowania agarozy, co utrudniało działanie kolumn oczyszczających i opierało się granulowaniu przez wirowanie. Problemem była również niska wydajność i jakość RNA, ponieważ duże cząsteczki polisacharydów mogą zatrzymywać kwasy nukleinowe, podczas gdy małe polisacharydy mogą współstrącać się z RNA20. Zamiast tego zastosowano bufor ekstrakcyjny zawierający kationowy środek powierzchniowo czynny CTAB, który rozpuszcza błony lipidowe20; i NaCl, który zapobiega tworzeniu się kompleksów kwasów nukleinowych CTAB i umożliwia wytrącanie się kwasów nukleinowych, ale utrzymuje polisacharydy w roztworze21. RNazy uległy denaturacji przez włączenie β-merkaptoetanolu do buforu CTAB. W eksperymencie sekwencjonowania RNA uwzględniono opcjonalny etap oczyszczania oparty na kolumnach, aby wykluczyć małe (<200 nukleotydów) RNA przed przygotowaniem biblioteki.

Ograniczenia i istotne zagadnienia
Podczas gdy NMS i agaroza zapewniają minimalną matrycę pożywki do hodowli bakterii metanotroficznych, strzykawka gradientowa, jak opisano tutaj, odtwarza tylko gradienty gazów siedlisk metanotroficznych, ale nie inne gradienty obecne w tych środowiskach, takie jak metale śladowe22, zasolenie23 lub inne składniki odżywcze24. Możliwe, że te gradienty zostaną dodane do podobnego systemu w przyszłości. Dodatkowo, objętość strzykawki (8 ml agarozy) ogranicza całkowitą biomasę na strzykawkę, co wymaga łączenia wielu strzykawek do niektórych analiz (jak opisano w kroku 5.16). Chociaż ręczna strzykawka wygodnie dzieli agarozę na podwielokrotności o pojemności 1 ml, jej rozmiar ogranicza również przestrzeń nad głową do około 4 ml, ograniczając ilość metanu luzem, który może być przechowywany dla hodowanych drobnoustrojów. Ponieważ szybkość utleniania metanu jest proporcjonalna do szybkości wzrostu tlenowych metanotrofów25, zaleca się codzienne uzupełnianie metanu w przestrzeni nad powierzchnią. Chociaż może to nadal skutkować okresami ograniczenia metanu, okresy te są powtarzalne w laboratorium i prawdopodobnie naśladują sytuacje występujące w środowisku naturalnym.

Podczas korzystania ze strzykawki gradientowej obecność polisacharydów agarozy wymaga pewnych dostosowań do testów stosowanych do analizy metanotrofów hodowanych w tym systemie. Na przykład protokoły wymagające przenoszenia małych objętości ekstrudowanej agarozy wymagają wielu etapów rozcieńczania z dokładną homogenizacją między każdym rozcieńczeniem w celu dokładnego pipetowania. Dodatkowo, w przypadkach takich jak test polisacharydowy, w którym polisacharydy nieodłącznie związane z matrycą agarozy będą reagować z odczynnikiem kwas siarkowy-fenol, niezbędne jest włączenie sterylnej, bezkomórkowej kontroli ujemnej agarozy. Wczesne próby złagodzenia tych problemów poprzez włączenie enzymu hydrolizującego agarozę β-agarazy nie powiodły się i wprowadziły nieznaną zmienną do eksperymentów biologicznych. Zastosowanie wielu powtórzeń technicznych, dokładne rozcieńczenie, homogenizacja i włączenie kontroli mogą być wykorzystane do złagodzenia większości wyzwań związanych z matrycą agarozy.

Aplikacji
Oprócz badań na pojedynczym szczepie, strzykawka gradientowa może wspierać kokulturę wielu szczepów, a gleba może być używana jako inokulum zamiast czystej kultury bakteryjnej. Prosta konstrukcja ekosystemu modelu strzykawki gradientowej jest podatna na hodowlę innych typów mikroorganizmów, które istnieją na styku środowisk beztlenowych i tlenowych, poprzez zastosowanie innego substratu gazowego, takiego jakH2 lub CO, zamiast metanu. Podsumowując, zastosowanie prostego, rozdzielczego przestrzennie ekosystemu modelowego pozwala naukowcom badać unikalną fizjologię i adaptacje metaboliczne mikroorganizmów tlenowo-tlenowych i może być wykorzystane do powiązania genów z fenotypami organizmów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez fundusze start-upów z Wydziału Chemii Uniwersytetu Utah oraz nagrodę NSF CAREER Award #2339190. Dziękujemy członkom Puri Lab za pomocne dyskusje. Dziękujemy Rachel Hurrell (University of Utah) za wstępne wskazówki dotyczące eksperymentu z cytometrią przepływową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% Mieszanina gazów wzorzec analitycznySupelco225611% każdy składnik w azocie: tlenek węgla, dwutlenek węgla, wodór, metan i tlen
100% metanAirgasME CP300chemicznie czysty gatunek
15 ppm Wzorzec analityczny mieszaniny gazówSupelco23470-U15 ppm każdy składnik w azocie: metan, etan, etylen, acetylen, propan, propylen, propylen i n-butan
1x Sole mineralne azotanów patrz numery CAS poniżejRozpuść następujące substancje w wodzie Mili-Q i autoklawie: 0,2 g/L MgSO4· 7H2O, 0,2 g/L CaCl2· 6H2O, 1 g/L KNO3 oraz 30 μ M LaCl3. Przed użyciem dodać pierwiastki śladowe do 1X końcowego stężenia i bufor fosforanowy (pH 6,8) do końcowego stężenia 5,8 mM.
Igła 23 GBD Biosciences305194sterylna, Luer-Lok
500x Pierwiastki śladowepatrz numery CAS poniżejW wodzie Milli-Q rozpuścić: 1,0 g/l Na2-EDTA, 2,0 g/L FeSO4· 7H2O, 0,8 g/L ZnSO4· 7H2O, 0.03 g/L MnCl2· 4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2· 6H2O, 0,6 g/L CuCl2· 2H2O, 0,02 g/L NiCl2· 6H2O oraz 0,05 g/L Na2MoO· 2H2O.
96 Płytka studzienkowaCELLTREAT229596sterylna
Kwas fenol:chloroform:IAA (125:24:1)InvitrogenAM9720  pH 4,5
AgarozaFisher ScientificBP160klasa biologii molekularnej, CAS 9012-36-6
Aluminiowe uszczelki zaciskaneVWR30618-46020 mm
Ubijak do koralikówQiagen9003240TissueLyser III
z gumy butylowejChemglass Life Science50-143-85420 mm, niebieski
Chloroform: alkohol izoamylowy (24:1)Millipore Sigma25666BioUltra, do biologii molekularnej
Mikroelektroda Clark-type O2UnisenseOX-500
DEPC-uzdatniona wodaThermo ScientificR0601
DNase I (Ambion)InvitrogenAM2222
Cytometr przepływowyBeckman CoulterCytoFLEX
Chromatograf gazowy (jonizacja płomieniowa detekcja)Agilent6890N
Gazoszczelna strzykawka analitycznaHamilton812201750 TLL
Gazoszczelna igła do strzykawki analitycznejHamilton7729-0722 G, metalowa igła piasty, 2 cale, typ punktowy 5
Fiolki gazoszczelneLabco938WExetainer: 12 mL, okrągłe dno
Szklane probówki hodowlaneBellco Glass2048-0015018 x 150 mm
roztwór strącający LiCl (7,5 M)InvitrogenAM9480
Jednokierunkowy kranVWRMFLX30600-00port wlotowy: żeński luer, port wylotowy: męski luer lock
szalka Petriego, kwadratFisher ScientificFB0875711A100 x 100 mm
Bufor fosforanowy, 0,2 M (pH 6,8)patrz numery CAS poniżejW wodzie Milli-Q i autoklawie rozpuścić: 12,24 g/l KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA Thermo Scientific23225
Końcówka filtra strzykawkowego z PTFEThermo Scientific03-050-469hydrofobowa, wielkość porów: 0,2 i mikro; m, średnica: 4 mm
Kubit 1x zestaw do oznaczania wysokiej czułości dsDNA InvitrogenQ33230
Fluorometr Qubit 4InvitrogenQ33238
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1013
Korek do surowicyFisher Scientific03-340-302
StrzykawkaBD Biosciences302995Luer-Lock, 10 mL, jednorazowa, sterylna
pompka strzykawkowaNew Era Pump Systems Inc.1000-USNE-1000 jednokanałowy programowalny
SYTO9, jodek propydyny, mikrosferyInvitrogenL34856LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Koraliki cyrkonowe/krzemionkoweProdukty BioSpec11079101zŚrednica 0,1 mm
< silny>Odczynniki chemicznenumer CAS
CaCl2· 6H2O7774-34-7
CoCl2· 6H2O7791-13-1
Stężony kwas siarkowy7664-93-9
CTAB, bromek cetrimonium57-09-0
CuCl2· 2H2O10125-13-0
Etanol64-17-5   
FeSO4· 7H2O7782-63-0
H3BO310043-35-3
Izopropanol69-63-0
KH2PO47778-77-0
KNO37757-79-1
LaCl310099-58-8
MgSO4· 7H2O10034-99-8
MnCl2· 4H2O13446-34-9
Na2CO3, węglan sodu497-19-8
Na2-EDTA139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O7782-85-6
Na2MoO· 2H2O10102-40-6
NaCl, chlorek sodu7647-14-5
NiCl2· 6H2O7791-20-0
Fenol (90% roztwór w wodzie)108-95-2
PVP40, poliwinylopirolidon9003-39-8
Tris-HCl1185-53-1
ZnSO4· 7H2O7446-20-0
β-Merkaptoetanol60-24-2
Korek , 20 mm

Bibliografia

  1. Brune, A., Frenzel, P., Cypionka, H. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations. FEMS Microbiol Rev. 24 (5), 691-710 (2000).
  2. Auman, A. J., Stolyar, S., Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of methanotrophic isolates from freshwater lake sediment. Appl Environ Microbiol. 66 (12), 5259-5266 (2000).
  3. Whittenbury, R., Phillips, K. C., Wilkinson, J. F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol. 61 (2), 205-218 (1970).
  4. Koo, C., Rosenzweig, A. Biochemistry of aerobic biological methane oxidation. Chem Soc Rev. 50 (5), 3424-3436 (2021).
  5. Strong, P. J., Xie, S., Clarke, W. P. Methane as a resource: Can the methanotrophs add value. Environ Sci Technol. 49 (7), 4001-4018 (2015).
  6. Beals, D. G., Puri, A. W. Linking methanotroph phenotypes to genotypes using a simple spatially resolved model ecosystem. ISME J. 18 (1), wrae060(2024).
  7. Bussmann, I., Rahalkar, M., Schink, B. Cultivation of methanotrophic bacteria in opposing gradients of methane and oxygen. FEMS Microbiol. Ecol. 56 (3), 331-344 (2006).
  8. Amaral, J. A., Knowles, R. Growth of methanotrophs in methane and oxygen counter gradients. FEMS Microbiol Lett. 126 (3), 215-220 (1995).
  9. Danilova, O. V., et al. A new cell morphotype among methane oxidizers: a spiral-shaped obligately microaerophilic methanotroph from northern low-oxygen environments. ISME J. 10 (11), 2734-2743 (2016).
  10. Ou, F., McGoverin, C., Swift, S., Vanholsbeeck, F. Absolute bacterial cell enumeration using flow cytometry. J Appl Microbiol. 123 (2), 464-477 (2017).
  11. Krause, S. M. B., et al. Lanthanide-dependent cross-feeding of methane-derived carbon is linked by microbial community interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (2), 358-363 (2017).
  12. Masuko, T., et al. Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format. Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).
  13. Felz, S., Al-Zuhairy, S., Aarstad, O. A., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. M. Extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge. J Vis Exp. (115), e54534(2016).
  14. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  15. Costa, O. Y. A., Raaijmakers, J. M., Kuramae, E. E. Microbial extracellular polymeric substances: Ecological function and impact on soil aggregation. Front Microbiol. 9, 1636(2018).
  16. Sinke, A. J. C., Cottaar, F. H. M., Buis, K., Keizer, P. Methane oxidation by methanotrophs and its effects on the phosphate flux over the sediment-water interface in a eutrophic lake. Microb Ecol. 24 (3), 259-269 (1992).
  17. Murase, J., Frenzel, P. A methane-driven microbial food web in a wetland rice soil. Environ Microbiol. 9 (12), 3025-3034 (2007).
  18. Reim, A., Lüke, C., Krause, S., Pratscher, J., Frenzel, P. One millimetre makes the difference: High-resolution analysis of methane-oxidizing bacteria and their specific activity at the oxic-anoxic interface in a flooded paddy soil. ISME J. 6 (11), 2128-2139 (2012).
  19. Rahalkar, M., Bussmann, I., Schink, B. Methylosoma difficile gen. nov., sp. nov., a novel methanotroph enriched by gradient cultivation from littoral sediment of Lake Constance. Int J Syst Evol Microbiol. 57 (5), 1073-1080 (2007).
  20. Wang, L., Stegemann, J. P. Extraction of high-quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylammonium bromide. Biomaterials. 31 (7), 1612(2010).
  21. Liyanage, N. M. N., Chandrasekara, B. C. H. W. M., Bandaranayake, P. C. G. A CTAB protocol for obtaining high-quality total RNA from cinnamon (Cinnamomum zeylanicum Blume). 3 Biotech. 11 (4), 201(2021).
  22. Semrau, J. D., DiSpirito, A. A., Gu, W., Yoon, S. Metals and methanotrophy. Appl Environ Microbiol. 84 (6), e02289-e02317 (2018).
  23. Zhang, S., et al. Salinity significantly affects methane oxidation and methanotrophic community in Inner Mongolia lake sediments. Front Microbiol. 13, 1067017(2023).
  24. Fox, A. L., Trefry, J. H. Nutrient fluxes from recent deposits of fine-grained, organic-rich sediments in a Florida estuary. Front Mar Sci. , (2023).
  25. He, L., et al. A methanotrophic bacterium to enable methane removal for climate mitigation. Proc Natl Acad Sci. 120 (35), e2310046120(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultywacja metanotrofówgradient tlenu i metanumodel ekosystemu w agaroziestrzykawka gradientowabakterie utleniające metancytometria przepływowajednostki tworzące kolonieanalizy biochemicznegradienty przestrzenneMethylomonas LW13
Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.