Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Podsumowanie

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Streszczenie

Tlenowe bakterie utleniające metan, znane jako metanotrofy, pełnią ważną rolę w cyklach biogeochemicznych. Metanotrofy zajmują specyficzną niszę środowiskową w obrębie przeciwgradientów metanowo-tlenowych występujących w glebach i osadach, co wpływa na ich zachowanie na poziomie indywidualnym i społecznościowym. Jednak konwencjonalne metody badania fizjologii tych mikroorganizmów łagodzących gazy cieplarniane często wykorzystują jednorodne kultury planktonu, które nie odzwierciedlają dokładnie gradientów przestrzennych i chemicznych występujących w środowisku. Utrudnia to naukowcom zrozumienie, w jaki sposób te bakterie zachowują się in situ. W tym miejscu opisano prosty, niedrogi ekosystem modelowy zwany strzykawką gradientową, który wykorzystuje półstałą agarozę do odtworzenia stromych gradientów przeciwbieżności metanowo-tlenowych charakterystycznych dla naturalnych siedlisk metanotrofów. Strzykawka gradientowa pozwala na hodowlę szczepów metanotroficznych i wzbogacanie mieszanych konsorcjów utleniających metan z próbek środowiskowych, ujawniając fenotypy widoczne tylko w tym przestrzennie rozdzielczym kontekście. Protokół ten informuje również o różnych testach biochemicznych, które zostały zmodyfikowane tak, aby były kompatybilne z półstałą matrycą agarozy, co może być cenne dla naukowców hodujących mikroorganizmy w innych systemach opartych na agarozie.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy żyjące na styku anoxiczno-oksykowym często pełnią ważne role ekologiczne¹. Jednym z przykładów są tlenowe bakterie utleniające metan (metanotrofy), które występują w przeciwgradientach metanu i tlenu w glebach i osadach². Mikroorganizmy te posiadają unikalne cechy metaboliczne i fizjologiczne, które umożliwiają im wykorzystywanie gradientów gazów obecnych w ich środowisku i są przedmiotem ciągłych badań od dziesięcioleci^3,4,5. Obecnie większość opublikowanych badań nad metanotrofami i zbiorowiskami utleniającymi metan opiera się na pracy z jednorodnymi kulturami planktonu, które często nie są w stanie uchwycić gradientów przestrzennych i chemicznych, które są nieodłącznie związane z ich naturalnymi siedliskami mikrobiologicznymi. To ograniczenie utrudnia nam zrozumienie fizjologii drobnoustrojów i naszą zdolność do powiązania informacji genomowych z cechami fenotypowymi.

Ten protokół informuje o prostym, laboratoryjnym ekosystemie modelowym, który stwarza powtarzalne warunki do badania zarówno konkretnych metanotrofów, takich jak Methylomonas sp. szczep LW13, jak i społeczności utleniających metan bezpośrednio z próbek gleby środowiskowej. Co ważne, hodowla w strzykawce gradientowej skutkuje fenotypami specyficznymi dla przeciw gradientowi, które nie występują w jednorodnych kulturach planktonowych⁶, podkreślając zdolność systemu do odkrywania nowych aspektów fizjologii metanotrofu. Zainspirowana wcześniej opublikowanymi modelami ekosystemów^7,8,9, strzykawka gradientowa jest uproszczoną metodą, którą można wykorzystać do zbierania informacji chemicznych i molekularnych z mikroorganizmów hodowanych przy użyciu tego podejścia.

Zgłoszone procedury analiz genetycznych, chemicznych i molekularnych zostały zmodyfikowane, aby działały niezawodnie na kulturach mikrobiologicznych uprawianych w półstałej matrycy agarozowej. Procedury te mogą być również przydatne do analizy bakterii hodowanych w innych półstałych systemach na bazie agarozy, takich jak te używane do testów pływania z miękkim agarem bakteryjnym. Dostosowanie tych analiz do kontekstów przestrzennie rozdzielczych może otworzyć nowe możliwości badania życia mikrobiologicznego w środowiskach o bardziej istotnym znaczeniu ekologicznym.

Protokół

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie i ekstruzja strzykawek gradientowych

UWAGA: Przygotowanie strzykawki gradientowej powinno być wykonywane przy użyciu techniki sterylnej.

1. Użyj kilku kolonii Methylomonas sp. LW13 świeżo wyhodowanych na płytce, aby zaszczepić 6 ml pożywki z azotanowymi solami mineralnymi (NMS) w szklanej probówce o wymiarach 18 mm x 150 mm. Uszczelnij rurkę korkiem do surowicy i aluminiową uszczelką zaciskaną, a następnie dodaj metan za pomocą strzykawki do końcowej atmosfery 50% (v/v) metanu w powietrzu. Potrząśnij tą płynną kulturą planktonu z prędkością 200 obr./min w temperaturze pokojowej, aż stanie się mętna (około jednego dnia).
2. Przejście płynnych kultur 1:10 do świeżej pożywki. Kontynuuj hodowlę płynnych kultur metanotrofów do wzrostu w fazie logarytmicznej (OD₆₀₀ ~0,5) i dostosuj do OD₆₀₀ = 1,0.
3. Przygotować strzykawki, wyjmując dołączony tłok i umieszczając je w sterylnym pojemniku. Przymocuj sterylną końcówkę filtra PTFE do strzykawki i umieść ją w standardowym stojaku na probówki końcówką skierowaną w dół.
4. Na każdą strzykawkę o pojemności 10 ml dokładnie wymieszaj 1 ml komórek z kroku 1.2 z 5 ml NMS i 4 ml stopionej agarozy (0,5% m/v, schłodzonej do 55 °C) w sterylnej stożkowej probówce. Objętości te można skalować w górę, aby napełniać wiele strzykawek równolegle.
5. Powoli wlewać lub używać pipety serologicznej, aby dodać mieszaninę do każdej strzykawki, aż do oznaczenia 8 ml. Pozostawić agarozę w strzykawkach do zestalenia się (~15 min), a następnie zakryć sterylnym korkiem butylowym z gumy o średnicy 20 mm. Przymocować korek do strzykawki za pomocą taśmy laboratoryjnej i oznaczyć go zawartością strzykawki.
6. Aby dodać metan do przestrzeni nad strzykawką, napełnij dużą (60 ml) strzykawkę 100% CH₄ i przymocuj końcówkę filtra PTFE (0,2 μm, 25 mm) podłączoną do sterylnej igły (23 G). Przekłuć gumowy korek dużą strzykawką i przebić drugą sterylną igłę przez korek, aby uzyskać ujście gazu.
7. Wcisnąć tłok na dużej strzykawce, aby 20 ml 100% CH₄ przepłukało się przez przestrzeń nad głową, zwracając uwagę, aby wyjąć igłę wylotową, gdy w dużej strzykawce pozostało 1-2 ml CH₄, aby zapobiec cofaniu się tlenu przez igłę wylotową.
8. Inkubować strzykawki w temperaturze 18 °C, powtarzając czynności 1.6 i 1.7 dziennie w celu uzupełnienia metanu.
9. Aby wytłoczyć agarozę, zastąp końcówkę filtra PTFE sterylną igłą 23 G i zastąp gumowy korek dostarczonym tłokiem strzykawki. Powoli wciskaj tłok, aby dozować porcje o 1 ml do oddzielnych sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.

2. Określanie stężeń gazu w przeciwnym kierunku gradientu

1. Pomiar gradientu tlenu rozpuszczonego
   1. Za pomocą żyletki przeciąć szerokość strzykawki wypełnionej agarozą (przygotowanej zgodnie z krokami 1.1-1.8) w pobliżu filtra PTFE. Przymocować otwartą strzykawkę do pompy strzykawkowej skierowanej w stronę mikroelektrody typu Clark, tak aby otwarty koniec był skierowany w stronę końcówki elektrody.
   2. Dostosuj ustawienia pompy strzykawkowej, aby przesuwać strzykawkę w kierunku mikroelektrody z prędkością 1 ml/min (0.6 cm/min); rozpocznij rejestrowanie pomiarów tlenu rozpuszczonego w oprogramowaniu Unisense Logger, gdy tylko pompa strzykawkowa zacznie się poruszać.
2. Pomiar gradientu metanu
   1. Bezpośrednio przed wytłaczaniem należy wymienić końcówkę filtra strzykawki na jednokierunkowy kran podłączony do igły 23 G i szybko wymienić gumowy korek na tłok strzykawki. Dodać osiem podwielokrotności agarozy o pojemności 1 ml do oddzielnych gazoszczelnych fiolek o pojemności 12 ml i pozostawić próbki do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
   2. Wyrównać ciśnienie w fiolkach z próbkami do ciśnienia atmosferycznego, otwierając je i natychmiast ponownie zamykając lub przekłuwając i szybko wyjmując igłę. Wstrzyknąć 500 μl przestrzeni nad fiolką do chromatografu gazowego z detekcją płomieniowo-jonizacyjną (GC-FID) za pomocą gazoszczelnej strzykawki. Utwórz krzywą kalibracyjną wyprowadzoną z wzorców CH₄, aby przeliczyć powierzchnię piku (pA*min) na μmol/L.

3. Liczenie komórek w strzykawce gradientowej

1. Cytometria przepływowa
   1. Wyciskaj 1 ml segmentów agarozy ze strzykawek gradientowych zaszczepionych LW13 typu dzikiego lub zmutowanego, jak opisano w kroku 1.9. Należy również przygotować i wycisnąć agarozę z bezkomórkowej, sterylnej strzykawki jako kontrolę negatywną.
   2. Dodaj 0,75 ml 0,85% (m/v) NaCl w wodzie do wszystkich ekstrudowanych próbek agarozy i homogenizuj przez wirowanie. Następnie rozcieńczyć próbki w stosunku 1:10, przenosząc 100 μl do nowej probówki do mikrowirówki i dodając 900 μl roztworu soli.
   3. Dodać 3 μl mieszaniny 1:1 barwienia SYTO9 i jodku propidyny, a następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby oznaczyć liczbę komórek na ml agarozy, należy poddać sonikę zawiesiny kulek zliczających mikrosfery w łaźni wodnej przez 5 minut. Następnie dodać 10 μl zawiesiny do każdej próbki przed analizą metodą cytometrii przepływowej.
   4. Analizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego^10,11 z następującymi parametrami: wyzwolenie przy zielonej fluorescencji, natężenie przepływu 10 μl/s i szybkość analizy cząstek poniżej 1 000 cząstek/s.
      1. Porównaj SSC vs. FITC wykreśla kropki między bezkomórkowymi próbkami kontrolnymi a zaszczepionymi próbkami agarozy w celu narysowania bramek napięcia "zdarzenia bakteryjnego", które wykluczają cząstki agarozy tła. Dodatkowo narysuj bramki napięciowe dla kulek zliczających mikrosfery, które powinny być spójne między próbkami.
   5. Aby określić stężenie komórek w każdym segmencie agarozy w strzykawce gradientowej, należy użyć następującego równania, zauważając, że współczynnik rozcieńczenia dla powyższego protokołu wynosi 17,7275 i że ^10-6 ml to objętość jednej kulki mikrosferycznej.
      
2. Liczenie jednostek tworzących kolonie w strzykawce gradientowej
   1. Wyciśnij 1 ml segmentów agarozy do oddzielnych, sterylnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml, dodaj 800 μl NMS i wiruj przez 10 sekund, aby ułatwić pipetowanie.
   2. Przygotuj sterylną 96-dołkową płytkę, dodając 180 μl NMS do każdej studzienki. Dodać 20 μl rozcieńczonych próbek agarozy do każdego dołka w pierwszej kolumnie i odpipetować do wymieszania.
   3. Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć próbki dziesięciokrotnie, przenosząc 20 μl z pierwszego rzędu studzienek do drugiego rzędu studzienek i pipetując 10 razy w celu wymieszania. Kontynuuj ten proces, aż do ostatniego rzędu talerza.
   4. Oznaczyć kwadratowe płytki siatkowe zawierające agar NMS lub wybrane podłoże. Za pomocą pipety wielokanałowej narysuj 5 μl z kolumny płytki 96-dołkowej na płytkę agarową. W zależności od rozmiaru płytki agarowej, na tej samej płytce można dostrzec wiele kolumn.
   5. Inkubować płytki pod 40% metanem w powietrzu i rosnąć w temperaturze 18 °C. Po 2-3 dniach policzyć kolonie bakterii i określić jednostki tworzące kolonie na mililitr (CFU/ml).

4. Testy wykrywania biomolekuł

1. Test polisacharydowy
   1. Wycisnąć 1 ml segmentów agarozy do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml i wymieszać z 1 ml 1% (m/v) roztworu Na₂CO₃ w wodzie. Podgrzewać próbki do temperatury 80 °C przez 30 minut z wirowaniem co 5-10 minut, a następnie odwirować przy 4 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   2. Zebrać sklarowany nad osadem połączony z trzema objętościami 100% etanolu i inkubować w temperaturze 20 °C przez co najmniej 2 godziny (lub przez noc).
   3. Zebrać polisacharydy wytrącone etanolem przez odwirowanie w temperaturze 16 100 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Usunąć supernatant i wysuszyć osad na powietrzu. Zawiesić osad w 100 μl wody dejonizowanej.
   4. Zmierz względną zawartość polisacharydów w każdym segmencie agarozy za pomocą testu kolorymetrycznego kwasu fenolowo-siarkowego^12,13. Połączyć 50 μl ponownie zawieszonego ekstraktu ze 150 μl stężonego kwasu siarkowego i 30 μl 5% (v/v) fenolu w wodzie w przezroczystej 96-dołkowej płytce.
   5. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm za pomocą czytnika mikropłytek i obliczyć względną zawartość polisacharydów w każdym segmencie agarozy jako procent absorbancji segmentu agarozy znajdującego się najbliżej filtra PTFE.
2. Test białka
   1. Wytłacz agarozę do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przenieś 100 μl każdej podwielokrotności do szklanych probówek.
   2. Określ całkowite stężenie białka za pomocą protokołu probówki zestawu do oznaczania białek BCA. Przygotować wzorce albuminy BSA z agarozą wytłaczaną ze sterylnej strzykawki jako rozcieńczalnikiem.
3. Test DNA zewnątrzkomórkowego
   1. Wytłacz agarozę do oddzielnych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przenieś 20 μl każdej z nich do probówek mikrowirówek o pojemności 0,2 ml.
   2. Zmierz stężenia DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu testowego 1x dsDNA o wysokiej czułości zgodnie z protokołem producenta.

5. Ekstrakcja RNA

1. Przygotować bufor ekstrakcyjny, łącząc w 800 ml wody wolnej od RNaz: 2,0 g CTAB, 2,0 g poliwinylopirolidonu (PVP 40), 81,8 g NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 20 mM EDTA. Zwiększyć objętość do 1 l i przelać w autoklawie; przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Podwielokrotnić przygotowany bufor ekstrakcyjny i dodać 1% (v/v) końcowego stężenia beta-merkaptoetanolu tuż przed użyciem. Podgrzać bufor do temperatury 65 °C za pomocą łaźni wodnej lub bloku grzewczego.
3. Podzielić każdą strzykawkę gradientową na sekcje o pojemności 1 ml, wytłaczając agarozę do oddzielnych probówek mikrowirówkowych o pojemności 2 ml bez RNaz, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.9.
4. Odwirować próbki w temperaturze 21 000 x g, 4 °C, przez 15 minut i odrzucić supernatant, pozostawiając próbki na lodzie.
5. Dodać 600 μl wstępnie podgrzanego buforu ekstrakcyjnego do każdego granulowanego 1 ml ekstrudowanej agarozy. Dodać około 200 μl kulek cyrkonu/krzemionki i homogenizować próbki przez 3 minuty z częstotliwością 30 Hz/s za pomocą ubijaka do kulek, zatrzymując się do połowy, aby umieścić próbki na lodzie na 2 minuty.
6. Odwirować próbki w temperaturze 15 000 x g, 4 °C, przez 2 minuty w celu zmniejszenia pienienia. Ekstrahować próbki, dodając 600 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) do probówek i wirować przez 10 s.
7. Odwirować próbki w temperaturze 15 000 x g, 4 °C, przez 8 minut. Ostrożnie przenieść górną fazę wodną do nowej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz i dodać 600 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1) do przeniesionej górnej fazy i wirować przez 10 s.
8. Odwirować próbki w temperaturze 15 000 x g, 4 °C, przez 8 minut i przenieść nową górną fazę wodną do nowej probówki mikrowirówkowej wolnej od RNaz. Dodać równą objętość izopropanolu do przeniesionej górnej fazy i inkubować próbki przez kilka godzin w temperaturze -20 °C. Fakultatywnie: próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc.
9. Zebrać osady zawierające RNA przez odwirowanie próbek w temperaturze 16 100 x g, 4 °C przez 30 minut.
10. Odrzucić supernatant i przemyć osad 300 μl zimnego 75% (v/v) etanolu wyprodukowanego z wody wolnej od RNaz i odwirować w temperaturze 16 100 x g, 4 °C, przez 5 min.
11. Ponownie umyj granulki zgodnie z krokiem 5.10.
12. Po usunięciu supernatantu etanolu pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Rozpuść granulki w 100 μl wody wolnej od RNaz.
13. Próbki należy traktować DNazą I w temperaturze 37 °C przez 30 minut zgodnie z protokołem producenta.
14. Dezaktywować DNazę I przez dodanie 300 μl kwaśnego fenolu: chloroform: IAA (125:24:1, pH 4,5). Wirować przez 10 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
15. Wirować w temperaturze 16 100 x g, 4 °C, przez 5 minut i utrzymywać górną fazę wodną, przenosząc ją do nowej probówki do mikrowirówek bez RNaz.
16. Opcjonalnie: Pula RNA z tego samego segmentu we wszystkich strzykawkach replikujących, łącząc górne fazy w stożkową rurkę.
17. Dodać 1 objętość izopropanolu równą objętości górnej fazy zawierającej RNA i dodać 7,5 M LiCl do końcowego stężenia 0,8 M, kilkakrotnie odwracając w celu wymieszania.
18. Inkubować próbki przez kilka godzin w temperaturze -20 °C. Opcjonalnie: próbki można pozostawić w temperaturze -20 °C na noc.
19. Odwirować próbki w temperaturze 16,100 x g, 4 °C, przez 15 minut i ostrożnie odrzucić supernatant. Przepłukać osad zawierający RNA dwukrotnie, dodając zimny 70% (v/v) etanol do wody wolnej od RNaz, odwirowując przy 16 100 x g, 4 °C, przez 5 minut i usuwając supernatant.
20. Pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut i ponownie zanurz w 50 μl wody wolnej od RNaz. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
21. Opcjonalnie, w zależności od jakości RNA: Próbki można ponownie oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania RNA w celu usunięcia małych (<200 nt) RNA.
22. Aby potwierdzić, że próbki RNA nie zawierają resztkowego DNA, należy użyć 1 μl oczyszczonego RNA jako matrycy do amplifikacji PCR przy użyciu uniwersalnych bakteryjnych starterów genów 16S rRNA 27F/1492R. Włączyć dwie dodatkowe reakcje PCR zawierające 1 μl genomowego DNA (rozcieńczonego w stosunku 1:100) lub wody wolnej od nukleaz, które służą jako kontrola pozytywna i ujemna, odpowiednio.
23. Uruchom produkty na 1% żelu do agazozy TBE za pomocą elektroforezy żelowej¹⁴.
    UWAGA: Próbki RNA bez zanieczyszczenia DNA powinny skutkować brakiem prążka na torze próbki. Jeśli próbki RNA wykazują zanieczyszczenie DNA, należy je ponownie przetworzyć, zaczynając od kroku 5.13. RNA jest gotowe do dalszej analizy i opcjonalnie może być analizowane w celu ilościowego określenia jego integralności poprzez pomiar liczby integralności RNA (RIN).

Wyniki

Tutaj ekosystem modelu strzykawki gradientowej został wykorzystany do uprawy pojedynczego szczepu (metanotrof Methylomonas sp. szczep LW13) (Rysunek 1A)⁶, ale może być również użyty do wzbogacenia społeczności mikrobiologicznej utleniającej metan poprzez bezpośrednie inokulowanie gleby (Rysunek 1B). Obecność gradientu licznika metan-tlen została potwierdzona poprzez pomiar stężenia metanu i tlenu w strzykawkach bezkomórkowych i inokulowanych (Rysunek 1C). W przypadku strzykawek gradientowych zaszczepionych LW13 w ciągu jednego dnia od przepłukania strzykawki utworzył się przeciwgradient, który uległ nasileniu w ciągu trzech dni inkubacji. W tym samym okresie czasu na tej samej głębokości utworzył się poziomy pas, na którym oba substraty gazowe osiągnęły swoje najniższe stężenia (Rysunek 1A). Stromy gradient gazu i wyczerpanie metanu i tlenu poza głębokość pasma poziomego wykazały, że LW13 metabolizował metan tlenowo i wytwarzał fenotyp, którego nie obserwowano w jednorodnej kulturze planktonowej. Ten fenotyp jest również wytwarzany przez inne bakterie metanotroficzne wyizolowane z tej samej próbki środowiskowej co LW13⁶. Zależna od szczepu zmienność czasu i głębokości rozwoju pasma poziomego wśród różnych szczepów metanotroficznych sugerowała, że na pasmo poziome miało wpływ specyficzne zachowanie każdego drobnoustroju, gdy był hodowany w przestrzennie rozwiązanym kontekście⁶.

Liczba komórek w całym czopie agarozowym została zmierzona za pomocą cytometrii przepływowej i liczby kolonii (CFU/mL) (Rysunek 2A). Metodę tę wykorzystano do porównania rozmieszczenia i przeżywalności LW13 typu dzikiego ze zmutowanym szczepem LW13 zawierającym delecję w genie fukozy 4-O-acetylotransferazy (OAT), co jak wykazano wcześniej, wpływa na rozwój pasma poziomego⁶. Mutant ΔOAT LW13 miał niższy ogólny wzrost strzykawki gradientowej w ciągu 6 dni w porównaniu z typem dzikim, efekt, którego nie zaobserwowano w jednorodnych kulturach planktonowych tych samych szczepów⁶. Zmutowany szczep nie tworzył tego samego wyraźnego poziomego pasma co dziki typ LW13, gdy był hodowany w strzykawce gradientowej (Rysunek 2B). Liczba komórek i poziomy wygląd pasm zostały przywrócone do poziomów podobnych do typu dzikiego po uzupełnieniu genów w zmutowanym szczepie. Wyniki te pokazują, że strzykawka gradientowa może być używana do łączenia genów z określonymi fenotypami obecnymi tylko w gradiencie licznika metan-tlen.

Różnorodne techniki genetyczne, chemiczne i molekularne zostały przystosowane do użycia z bakteriami hodowanymi w półstałej matrycy agarozowej. Ekosystem modelu strzykawki gradientowej może być łatwo wykorzystany do standardowych biomolekularnych testów ilościowych z włączeniem nieinokulowanej agarozy jako kontroli ujemnej. Zmierzono stężenie trzech różnych biomolekuł powszechnie występujących w zewnątrzkomórkowych substancjach polimerowych i biofilmach: polisacharydów, białka i zewnątrzkomórkowego DNA¹⁵ (Rysunek 3). W segmentach strzykawki zaszczepionych LW13 pasmo poziome miało znacznie więcej polisacharydów niż inne segmenty, bez znaczącego wzrostu białka lub zewnątrzkomórkowego DNA.

sekwencja RNA została użyta do pomiaru różnic transkrypcyjnych w LW13 rosnących na różnych głębokościach strzykawki. Solidną ekstrakcję RNA osiągnięto przy użyciu buforu ekstrakcyjnego opartego na CTAB, a następnie konwencjonalnych etapów ekstrakcji fenolem: chloroformem i wytrącania. Wyniki analizy sekwencyjnej RNA wykorzystano później do identyfikacji genów zaangażowanych w produkcję poziomego pasma polisacharydowego. Wyniki te wskazują, że półstała agaroza niezbędna do stworzenia modelowego ekosystemu o rozdzielczości przestrzennej nie stoi na przeszkodzie dalszym analizom biochemicznym, które są zazwyczaj zarezerwowane dla kultur planktonowych i płytkowych.

Rysunek 1: Ekosystem modelu strzykawki gradientowej. (A) Strzykawka gradientowa zaszczepiona metanotrofem Methylomonas sp. LW13. Wyraźny poziomy pas (grot strzały) rozwija się w ciągu dwóch dni od przepłukania strzykawki 100% metanem. (B) Zbliżenia strzykawek gradientowych zaszczepionych glebą rozcieńczoną ^10-1 i ^10-4 i inkubowanych przez dwa tygodnie. Strzykawki gradientowe zawierające bardziej rozcieńczoną glebę powodowały kuliste kolonie w całej agarozie, podczas gdy bardziej skoncentrowane inokulacje glebowe powodowały wyraźne pasmo. (C) Charakterystyka gradientu przeciwbieżności metan-tlen w strzykawkach z gradientem inokulowanym LW13 i sterylnym po trzech dniach inkubacji. Szary pasek wskazuje zakres głębokości, na których znajdowało się pasmo polisacharydowe; dane pokazują średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, z których każde miało trzy powtórzenia techniczne. Panele (A) i (C) zostały zmodyfikowane z Beals et al.⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja LW13 typu dzikiego i mutanta po inkubacji w strzykawce gradientowej. (A) Całkowita liczba komórek LW13 na ml ekstrudowanej agarozy odzyskanej ze strzykawek gradientowych w dniu 0 i dniu 7 mierzona za pomocą cytometrii przepływowej. ΔOAT zawiera delecję genu 4-O-acetylotransferazy fukozy, który okazał się silnie eksprymowany w komórkach znajdujących się na głębokości pasma polisacharydowego. ΔOAT+OAT zawiera gen OAT wstawiony w dystalnym miejscu genomu ΔOAT. *, istotnie różniący się (dwustronny heteroskedastyczny test t, α = 0,05); n.s., nie różni się znacząco. Dane pokazują średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy zawierał dwie kontrpróby techniczne. (B) Horyzontalny rozwój pasma w strzykawkach gradientowych inokulowanych LW13 typu dzikiego, ΔOAT lub ΔOAT+OAT po siedmiu dniach inkubacji. Ten rysunek został zmodyfikowany z Beals et al.⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja biomolekuł na rosnących głębokościach strzykawki gradientowej. Względna zawartość polisacharydów (%), stężenie białka (μg / ml) i stężenie DNA (ng / μl) w ośmiu sekcjach strzykawek gradientowych inokulowanych LW13 inkubowanych przez siedem dni (wypełnione koła; otwarte koła pokazują wartości ze sterylnych strzykawek gradientowych). Dane pokazują średnią ± SD z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy zawierał trzy kontrpróby techniczne. Dla względnej zawartości polisacharydów * wskazuje na istotną różnicę w stosunku do sterylnej kontroli na równoważnej głębokości (dwustronny heteroskedastyczny test t, α = 0,05). W przypadku stężeń białek i DNA * wskazuje na istotną różnicę w stosunku do odcinka zawierającego pasmo poziome (jednoczynnikowa ANOVA z analizą post hoc Tukeya-Kramera); n.s., nie znaczące. Rysunek został zmodyfikowany z Beals et al.⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Metody uprawy metanotrofu
Metanotrofy są badane od dziesięcioleci w celu zrozumienia ich fizjologii, indywidualnego i społecznego zachowania w środowisku naturalnym oraz ich potencjału w zakresie łagodzenia emisji metanu w zastosowaniach przemysłowych. W ramach tych badań wiele z przeprowadzonych badań przeprowadzono przy użyciu jednorodnych kultur planktonowych, w których utracono kontekst przestrzenny. Ekosystem gradientowego modelu strzykawki został opracowany w celu odtworzenia gradientu przeciwwagi metanowo-tlenowej charakterystycznego dla naturalnych siedlisk metanotrofów w laboratorium, co pozwoliło naukowcom na badanie metanotrofów rosnących w środowisku, które bardziej przypomina miejsce, w którym te organizmy ewoluowały.

W ciągu ostatnich 30 lat naukowcy odtworzyli w laboratorium gradient przeciwproporcji metan-tlen przy użyciu różnych metod, często mając na celu przede wszystkim wyizolowanie i sklasyfikowanie metanotrofów z mieszanych konsorcjów utleniających metan. Metody te można podzielić na dwa podejścia, oba polegające na użyciu przeciwległych komór metanu i tlenu: zawieszenie względnie nienaruszonej gleby na membranie 16,17,18 lub zaszczepienie niewielkich ilości gleby lub czystej kultury bakteryjnej do minimalnego podłoża w agarozie ^7,8,19. Opisana tutaj metoda strzykawki gradientowej łączy podejście strzykawkowe Dedysha i współpracowników⁹ z hodowlą metanotrofów z poprzednich prac Amarala i^{Knowlesa 8} oraz Schinka i współpracowników⁷. Ostatnia z tych metod stworzyła podstawy do hodowli metanotrofów w przeciwgradiencie metanowo-tlenowym i wykorzystywała ciągły przepływ metanu i tlenu po obu stronach korka agarozowego. Chociaż zapewnia to bardziej stałe środowisko, takie podejście komplikuje konfigurację eksperymentalną i wymaga dedykowanych źródeł gazu.

W przeciwieństwie do tego, opisana tutaj strzykawka gradientowa opiera się na codziennym płukaniu strzykawki w celu dostarczenia świeżego metanu, proces, który trwa mniej niż minutę na strzykawkę, zapewniając jednocześnie ciągły dostęp do tlenu atmosferycznego przez sterylną końcówkę filtra PTFE. Ta prostsza metoda może umożliwić szersze zastosowanie tego modelowego ekosystemu do badania metanotrofów w kontekście przestrzennie rozdzielczym. Opisany protokół zawiera również szczegółowe analizy chemiczne i molekularne, które można przeprowadzić bezpośrednio na bakteriach inkubowanych w półstałej agarozie. W rezultacie, bakterie nie muszą być wycinane i hodowane poza matrycą agarozy przed analizą, z zachowaniem warunków gradientu gazu w momencie pobierania próbek.

Uwagi do protokołu
Ponieważ bakterie są hodowane w polipropylenowej strzykawce wolumetrycznej, naukowcy mogą użyć dołączonego tłoka strzykawki do dokładnej i powtarzalnej segmentacji czopu agarozowego, zachowując integralność przestrzenną matrycy agarozowej, która nadal pozostaje w cylindrze strzykawki. Bez hermetycznej konstrukcji właściwej dla strzykawki, korki agarozowe musiałyby zostać wyjęte z cylindra strzykawki i pokrojone w plastry, co wprowadziłoby niepewność co do objętości segmentów agarozy i uwolniło do atmosfery niemierzalne ilości metanu i rozpuszczonego tlenu. Wytłaczanie agarozy za pomocą sterylnej igły upraszcza przygotowanie próbki i pomaga homogenizować wytłaczane segmenty bez ścinania komórek bakteryjnych. Metoda ta pozwala naukowcom podzielić każdą zaszczepioną strzykawkę gradientową na co najmniej osiem segmentów agarozy i przeprowadzić równoległe eksperymenty na metanotrofach rosnących w różnych stężeniach tlenu i metanu.

Optymalizując ekstrakcję RNA z agarozy o wysokiej zawartości polisacharydów, stwierdzono, że powszechne odczynniki, takie jak tiocyjanian guanidu i trizol, prowadziły do żelowania agarozy, co utrudniało działanie kolumn oczyszczających i opierało się granulowaniu przez wirowanie. Problemem była również niska wydajność i jakość RNA, ponieważ duże cząsteczki polisacharydów mogą zatrzymywać kwasy nukleinowe, podczas gdy małe polisacharydy mogą współstrącać się z RNA²⁰. Zamiast tego zastosowano bufor ekstrakcyjny zawierający kationowy środek powierzchniowo czynny CTAB, który rozpuszcza błony lipidowe²⁰; i NaCl, który zapobiega tworzeniu się kompleksów kwasów nukleinowych CTAB i umożliwia wytrącanie się kwasów nukleinowych, ale utrzymuje polisacharydy w roztworze²¹. RNazy uległy denaturacji przez włączenie β-merkaptoetanolu do buforu CTAB. W eksperymencie sekwencjonowania RNA uwzględniono opcjonalny etap oczyszczania oparty na kolumnach, aby wykluczyć małe (<200 nukleotydów) RNA przed przygotowaniem biblioteki.

Ograniczenia i istotne zagadnienia
Podczas gdy NMS i agaroza zapewniają minimalną matrycę pożywki do hodowli bakterii metanotroficznych, strzykawka gradientowa, jak opisano tutaj, odtwarza tylko gradienty gazów siedlisk metanotroficznych, ale nie inne gradienty obecne w tych środowiskach, takie jak metale śladowe²², zasolenie²³ lub inne składniki odżywcze²⁴. Możliwe, że te gradienty zostaną dodane do podobnego systemu w przyszłości. Dodatkowo, objętość strzykawki (8 ml agarozy) ogranicza całkowitą biomasę na strzykawkę, co wymaga łączenia wielu strzykawek do niektórych analiz (jak opisano w kroku 5.16). Chociaż ręczna strzykawka wygodnie dzieli agarozę na podwielokrotności o pojemności 1 ml, jej rozmiar ogranicza również przestrzeń nad głową do około 4 ml, ograniczając ilość metanu luzem, który może być przechowywany dla hodowanych drobnoustrojów. Ponieważ szybkość utleniania metanu jest proporcjonalna do szybkości wzrostu tlenowych metanotrofów²⁵, zaleca się codzienne uzupełnianie metanu w przestrzeni nad powierzchnią. Chociaż może to nadal skutkować okresami ograniczenia metanu, okresy te są powtarzalne w laboratorium i prawdopodobnie naśladują sytuacje występujące w środowisku naturalnym.

Podczas korzystania ze strzykawki gradientowej obecność polisacharydów agarozy wymaga pewnych dostosowań do testów stosowanych do analizy metanotrofów hodowanych w tym systemie. Na przykład protokoły wymagające przenoszenia małych objętości ekstrudowanej agarozy wymagają wielu etapów rozcieńczania z dokładną homogenizacją między każdym rozcieńczeniem w celu dokładnego pipetowania. Dodatkowo, w przypadkach takich jak test polisacharydowy, w którym polisacharydy nieodłącznie związane z matrycą agarozy będą reagować z odczynnikiem kwas siarkowy-fenol, niezbędne jest włączenie sterylnej, bezkomórkowej kontroli ujemnej agarozy. Wczesne próby złagodzenia tych problemów poprzez włączenie enzymu hydrolizującego agarozę β-agarazy nie powiodły się i wprowadziły nieznaną zmienną do eksperymentów biologicznych. Zastosowanie wielu powtórzeń technicznych, dokładne rozcieńczenie, homogenizacja i włączenie kontroli mogą być wykorzystane do złagodzenia większości wyzwań związanych z matrycą agarozy.

Aplikacji
Oprócz badań na pojedynczym szczepie, strzykawka gradientowa może wspierać kokulturę wielu szczepów, a gleba może być używana jako inokulum zamiast czystej kultury bakteryjnej. Prosta konstrukcja ekosystemu modelu strzykawki gradientowej jest podatna na hodowlę innych typów mikroorganizmów, które istnieją na styku środowisk beztlenowych i tlenowych, poprzez zastosowanie innego substratu gazowego, takiego jak_H2 lub CO, zamiast metanu. Podsumowując, zastosowanie prostego, rozdzielczego przestrzennie ekosystemu modelowego pozwala naukowcom badać unikalną fizjologię i adaptacje metaboliczne mikroorganizmów tlenowo-tlenowych i może być wykorzystane do powiązania genów z fenotypami organizmów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% Mieszanina gazów wzorzec analityczny	Supelco	22561	1% każdy składnik w azocie: tlenek węgla, dwutlenek węgla, wodór, metan i tlen
100% metan	Airgas	ME CP300	chemicznie czysty gatunek
15 ppm Wzorzec analityczny mieszaniny gazów	Supelco	23470-U	15 ppm każdy składnik w azocie: metan, etan, etylen, acetylen, propan, propylen, propylen i n-butan
1x Sole mineralne azotanów		patrz numery CAS poniżej	Rozpuść następujące substancje w wodzie Mili-Q i autoklawie: 0,2 g/L MgSO4· 7H2O, 0,2 g/L CaCl2· 6H2O, 1 g/L KNO3 oraz 30 μ M LaCl3. Przed użyciem dodać pierwiastki śladowe do 1X końcowego stężenia i bufor fosforanowy (pH 6,8) do końcowego stężenia 5,8 mM.
Igła 23 G	BD Biosciences	305194	sterylna, Luer-Lok
500x Pierwiastki śladowe		patrz numery CAS poniżej	W wodzie Milli-Q rozpuścić: 1,0 g/l Na2-EDTA, 2,0 g/L FeSO4· 7H2O, 0,8 g/L ZnSO4· 7H2O, 0.03 g/L MnCl2· 4H2O, 0.03 g/L H3BO3, 0.2 g/L CoCl2· 6H2O, 0,6 g/L CuCl2· 2H2O, 0,02 g/L NiCl2· 6H2O oraz 0,05 g/L Na2MoO· 2H2O.
96 Płytka studzienkowa	CELLTREAT	229596	sterylna
Kwas fenol:chloroform:IAA (125:24:1)	Invitrogen	AM9720	pH 4,5
Agaroza	Fisher Scientific	BP160	klasa biologii molekularnej, CAS 9012-36-6
Aluminiowe uszczelki zaciskane	VWR	30618-460	20 mm
Ubijak do koralików	Qiagen	9003240	TissueLyser III
z gumy butylowej	Chemglass Life Science	50-143-854	20 mm, niebieski
Chloroform: alkohol izoamylowy (24:1)	Millipore Sigma	25666	BioUltra, do biologii molekularnej
Mikroelektroda Clark-type O2	Unisense	OX-500
DEPC-uzdatniona woda	Thermo Scientific	R0601
DNase I (Ambion)	Invitrogen	AM2222
Cytometr przepływowy	Beckman Coulter		CytoFLEX
Chromatograf gazowy (jonizacja płomieniowa detekcja)	Agilent		6890N
Gazoszczelna strzykawka analityczna	Hamilton	81220	1750 TLL
Gazoszczelna igła do strzykawki analitycznej	Hamilton	7729-07	22 G, metalowa igła piasty, 2 cale, typ punktowy 5
Fiolki gazoszczelne	Labco	938W	Exetainer: 12 mL, okrągłe dno
Szklane probówki hodowlane	Bellco Glass	2048-00150	18 x 150 mm
roztwór strącający LiCl (7,5 M)	Invitrogen	AM9480
Jednokierunkowy kran	VWR	MFLX30600-00	port wlotowy: żeński luer, port wylotowy: męski luer lock
szalka Petriego, kwadrat	Fisher Scientific	FB0875711A	100 x 100 mm
Bufor fosforanowy, 0,2 M (pH 6,8)		patrz numery CAS poniżej	W wodzie Milli-Q i autoklawie rozpuścić: 12,24 g/l KH2PO4, 26.29 g/L Na2HPO4 · 7H2O
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Thermo Scientific	23225
Końcówka filtra strzykawkowego z PTFE	Thermo Scientific	03-050-469	hydrofobowa, wielkość porów: 0,2 i mikro; m, średnica: 4 mm
Kubit 1x zestaw do oznaczania wysokiej czułości dsDNA	Invitrogen	Q33230
Fluorometr Qubit 4	Invitrogen	Q33238
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Korek do surowicy	Fisher Scientific	03-340-302
Strzykawka	BD Biosciences	302995	Luer-Lock, 10 mL, jednorazowa, sterylna
pompka strzykawkowa	New Era Pump Systems Inc.	1000-US	NE-1000 jednokanałowy programowalny
SYTO9, jodek propydyny, mikrosfery	Invitrogen	L34856	LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit
Koraliki cyrkonowe/krzemionkowe	Produkty BioSpec	11079101z	Średnica 0,1 mm
< silny>Odczynniki chemiczne	numer CAS
CaCl2· 6H2O	7774-34-7
CoCl2· 6H2O	7791-13-1
Stężony kwas siarkowy	7664-93-9
CTAB, bromek cetrimonium	57-09-0
CuCl2· 2H2O	10125-13-0
Etanol	64-17-5
FeSO4· 7H2O	7782-63-0
H3BO3	10043-35-3
Izopropanol	69-63-0
KH2PO4	7778-77-0
KNO3	7757-79-1
LaCl3	10099-58-8
MgSO4· 7H2O	10034-99-8
MnCl2· 4H2O	13446-34-9
Na2CO3, węglan sodu	497-19-8
Na2-EDTA	139-33-3
Na2HPO4 · 7H2O	7782-85-6
Na2MoO· 2H2O	10102-40-6
NaCl, chlorek sodu	7647-14-5
NiCl2· 6H2O	7791-20-0
Fenol (90% roztwór w wodzie)	108-95-2
PVP40, poliwinylopirolidon	9003-39-8
Tris-HCl	1185-53-1
ZnSO4· 7H2O	7446-20-0
β-Merkaptoetanol	60-24-2