Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowana i uproszczona technika produkcji i hodowli precyzyjnie krojonych plastrów wątroby

DOI:

10.3791/67202

⸱

22 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust, 3National Institute of Health Research Great Ormond Street Biomedical Research Centre

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół produkcji i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS) do badania wątroby myszy. W artykule skupiono się na kluczowych aspektach protokołu, który wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego z dostępem do wibratomu i pozwala na przeżycie PCLS przez minimum 4 dni.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia prosty system do tworzenia i hodowli precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS). PCLS zawiera wszystkie komórki w nienaruszonym środowisku i dlatego przypomina mini model całego narządu. Umożliwiają one badanie żywych tkanek przy jednoczesnej replikacji ich złożonych fenotypów. Protokół ten umożliwia przygotowanie plastrów z wątroby myszy przy użyciu wibratomu i standardowego sprzętu laboratoryjnego. Protokoły produkcji i hodowli PCLS nie są ustandaryzowane i mogą się dość drastycznie różnić w zależności od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, rodzaju użytego wibratomu i zapotrzebowania na tlen. Mogą one być trudne do odtworzenia w niektórych laboratoriach, które mają dostęp tylko do podstawowego wibratomu i powszechnych urządzeń do hodowli tkankowych. Opracowaliśmy protokół, w którym skupiliśmy się na znaczeniu niektórych kluczowych kroków w ramach różnych już dostępnych protokołów. Protokół ten podkreśla zatem znaczenie metody osadzania, orientacji cięcia, systemu dynamicznego i statycznego oraz znaczenia minimalnej objętości hodowli. Protokół ten można ustalić i odtworzyć w prosty sposób w większości laboratoriów, które mają dostęp do podstawowego krajalnika do tkanek. Podsumowując i zgodnie z tym protokołem, PCLS mogą pozostać przy życiu przez co najmniej 4 dni. PCLS jest prostym, ekonomicznym i powtarzalnym modelem do badania patofizjologicznych i terapeutycznych badań przesiewowych narządów, takich jak wątroba.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Precyzyjnie wycięte plastry tkanek (PCTS) to cienkie fragmenty narządów. Pozwalają one na zachowanie architektury narządu, replikując mini-narząd, przy jednoczesnym zachowaniu trójwymiarowego aspektu sąsiednich komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej. Jest to atrakcyjny model ze względu na łatwy dostęp, oszczędność kosztów i mniej pracochłonne cechy przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej.

PCTS wypełnia lukę między badaniami na komórkach in vitro a badaniami na zwierzętach in vivo, pokonując większość wad obu modeli. PCTS został wygenerowany z różnych narządów, takich jak wątroba1, intestines2,3, colon2, brain4,5, lung6,7,8, kidney9,10, spleen11,12, heart13,14 ale także tumors15,16. Mogą również pochodzić od różnych zwierząt, takich jak mouse1, rat17,18, ale także pig19 i ludzkie odpady chirurgiczne15,20,21. Chociaż PCTS wymaga wykorzystania zwierząt, co sugeruje kwestie etyczne, narząd od jednego zwierzęcia może generować wiele PCTS, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt zgodnie z wytycznymi NC3Rs (Reduction, Replacement, Refinement)22 przy jednoczesnym ograniczeniu różnic międzyosobniczych.

Rozwój ulepszonych krajalnic do tkanek, np. vibratomes23, umożliwił przejście od ręcznie ciętych plastrów charakteryzujących się niejednorodną grubością i słabym wskaźnikiem przeżycia do powtarzalnych, cieńszych plastrów z lepiej zachowaną integralnością strukturalną.

Jednak protokoły przygotowania i hodowli PCTS, a dokładniej precyzyjnie ciętych plastrów wątroby (PCLS), różnią się znacznie w literaturze i nie mają standaryzacji, zwłaszcza dla podstawowych parametrów, takich jak sprzęt do krojenia, zawartość podłoża i warunki hodowli. Protokoły mogą się również zauważalnie różnić w zależności od tkanki, z której pochodzą. Niektóre z protokołów będą wymagały natlenienia buforu lub kultury za pomocą skomplikowanych systemów bioreaktorów24. Zazwyczaj koncentrują się one indywidualnie na różnych aspektach technicznych lub są przeznaczone dla różnych tkanek i często mogą być kosztowne i trudniejsze do odtworzenia w przeciętnym laboratorium w opłacalny sposób.

Tutaj ten protokół łączy kilka kluczowych punktów, takich jak metoda osadzania, kierunek cięcia, użycie transwells25, dynamiczny system hodowli26 oraz znaczenie minimalnej ilości kultury. Niektóre z tych kroków zostały wcześniej zoptymalizowane niezależnie lub w innym kontekście, np. zwłóknienie27 lub tumor response28. Protokół ten podkreśla również znaczenie osadzania przy użyciu niektórych typów krajalnic i orientacji cięcia, które są parametrami trudnymi do opanowania i często zaniedbywanymi w literaturze. Ta prosta metoda generuje PCLS utrzymywane w hodowli przez co najmniej 4 dni przy łatwej konfiguracji i użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego z dostępem do podstawowego krajalnika do tkanek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy CD57Bl/6J typu dzikiego zostały zakupione w Charles River Laboratories. Myszy miały swobodny dostęp do pożywienia i wody, trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach z kontrolowanymi warunkami temperatury i wilgotności oraz z 12-godzinnym cyklem świetlnym. Zwierzęta w wieku 3 tygodni były uśmiercane, a wątroby były natychmiast zbierane bez perfuzji. Wszystkie prace na zwierzętach zostały zatwierdzone po lokalnej ocenie etycznej przeprowadzonej przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Uniwersytetu College London i wykonane na podstawie licencji projektowej Ministerstwa Spraw Wewnętrznych PP9223137 oraz zgodnie z ustawą o procedurach naukowych Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Zwierzęta) (1986) i wytycznymi ARRIVE. Dołożono wszelkich starań, aby ograniczyć krzywdę wyrządzaną zwierzętom zgodnie ze standardową praktyką w Zakładzie Usług Biologicznych na University College London.

1. Przygotuj się do eksperymentu

  1. Dzień przed zbiorami wykonaj następujące czynności.
    1. Przygotować 1 l buforu Krebs-Henseleit (KREBS), rozpuszczając jedną fiolkę z proszkiem Krebs w 1 litrze jałowej wody. Schłodzić do 4 °C i przechowywać na mokrym lodzie.
    2. Zdezynfekuj tackę 70% etanolem i spłucz sterylnym PBS. Przechowuj tacę zawiniętą w folię aluminiową w lodówce przez noc, aby utrzymać zimne środowisko podczas krojenia.
    3. Spryskaj wszystkie inne zdejmowane części etanolem, spłucz sterylnym PBS, pozostaw do wyschnięcia i utrzymuj je w sterylności. Autoklaw ostrzy i utrzymuj je w sterylności do momentu użycia.
    4. Przygotuj 4% w/v niskotopliwej agarozy w sterylnej wodzie. Po ponownym zawieszeniu i stopieniu agarozę przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.
  2. W dniu zbioru i przed zbiorem wątroby wykonaj następujące czynności.
    1. Rozpuść 4% niskotopliwą agarozę i przechowuj ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do czasu użycia. Przed użyciem upewnij się, że agaroza ostygła do 37 °C i że wszystkie pęcherzyki rozproszyły się.
    2. Przygotuj płytki hodowlane, dodając odpowiednio 2,6 ml, 1,5 ml i 0,7 ml na studzienkę do płytek 6-, 12- i 24-dołkowych. Dodaj 8 μm porowatych wkładek do każdego dołka. Umieść płytki w nawilżonym inkubatorze ustawionym na 37 °C, 5% poziom CO2 i 21% O2 . Pomoże to dostosować pH podczas podgrzewania podłoża, aby było gotowe do hodowli.
    3. Hoduj plastry za pomocą porowatych wkładek o grubości 8 μm, aby umożliwić dostęp do obu stron plasterka. Przygotuj pożywkę w następujący sposób: Dodaj do William's Medium E (WME), 2 mM suplementu L-glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, 10 μg/ml genttamycyny, 25 mM roztworu D-glukozy i 15 mM roztworu HEPES.

2. Pobranie wątroby i przygotowanie (15 min)

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zbiorem.
  2. Znieczulić mysz zgodnie z lokalnymi procedurami opieki nad zwierzętami do celów naukowych za pomocą maski izofluranowej. Przed otwarciem jamy brzusznej ściśnij między palcami, aby upewnić się, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone. Jeśli wątroba może zostać szybko usunięta, mysz może zostać uśpiona przez uduszenie CO2 lub zwichnięcie szyjki macicy. Ponieważ zabieg jest zabiegiem terminalnym, nie należy stosować maści do oczu, ponieważ nie wpłynie to na zwierzę.
  3. Spryskaj brzuch 70% etanolem. Opcjonalnie: Ogol mysz, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów.
  4. Otwórz jamę brzuszną sterylnymi kleszczami i nożyczkami, przecinając skórę i otrzewną od środka brzucha. Delikatnie odetnij wątrobę od innych narządów lub naczyń i unikaj uszkodzenia płatów.
  5. Całą wątrobę należy natychmiast przechowywać w lodowatym buforze Krebsa. Wykonać wszystkie dalsze czynności na lodzie w temperaturze 4 °C i przystąpić do przygotowania wątroby tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec dalszej śmierci komórek.

3. Osadzanie płatów wątroby (25 minut dla każdego płata wątroby)

  1. Przenieś wątrobę na szalkę Petriego na lodzie zawierającą lodowaty bufor Krebsa, upewniając się, że cała wątroba jest całkowicie zanurzona.
  2. Oddziel każdy płat osobno za pomocą kleszczy i ostrego, sterylnego noża, aby uniknąć uszkodzenia płatów.
  3. Wybierz pierwszy płat do przekrojenia i trzymaj pozostałe płaty w lodowatym buforze Krebsa, aż będą gotowe do osadzenia i pokrojenia.
  4. Wytnij wszystkie krawędzie, aby uzyskać łatwiejszy w obsłudze płat z prostymi krawędziami gotowymi do osadzenia. Pomoże to również usunąć część włóknistej torebki Glissona, aby jeszcze bardziej ułatwić cięcie. Zrób to, utrzymując mokre powierzchnie wątroby w lodowatym buforze Krebsa.
  5. Umieścić szalkę Petriego o średnicy 3 cm (lub podobną) na mokrym lodzie i wlać do niej 4% niskotopliwej agarozy (znajdującej się już w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C). Trzymaj dobrze na lodzie, aby agaroza ostygła w kierunku do góry, jednocześnie zapobiegając opadaniu płata na dno i równomiernemu osadzaniu go.
  6. Pozostaw agarozę do dalszego ostygnięcia na 30 s i umieść w niej przycięty płat. Płat osiądzie pośrodku bloku agarozy. Proces osadzania wymaga praktyki i optymalizacji, aby dopasować się do każdych warunków laboratoryjnych i osobistego doświadczenia.
  7. Osadzony płatek, jeszcze na lodzie, wstawiamy do lodówki na 5 minut. Agaroza powinna być wtedy wyraźnie zastygła.
  8. Odetnij zewnętrzną stronę bloku agarozy. Usuń blok agarozy z naczynia.
  9. Pokrój agarozę do łatwiejszego do opanowania rozmiaru, upewniając się, że górna strona i strona przyklejona do platformy wibratomu są równoległe do górnej krawędzi płata.
  10. Rozpocznij proces krojenia tak szybko, jak to możliwe, ale upewnij się, że blok agarozy jest przechowywany w lodowatym buforze Krebsa i na lodzie.

4. Produkcja plastrów wątroby (40 min na płat)

  1. Ustaw wibratom do cięcia na grubość 250 μm, z prędkością 5 i częstotliwością 7 Hz. Są to parametry przewodnie; W zależności od rodzaju użytego wibratomu może to wymagać optymalizacji.
  2. Przed cięciem spryskaj wibratom i obszary stołu 70% etanolem, aby środowisko było jak najbardziej sterylne.
  3. Umieść tackę na wibratomie i wlej wokół niej lód. Umieść ostrza na wibratomie pod kątem 10° w dół i poniżej poziomu.
  4. Napełnij zbiornik wibratomu lodowatym buforem Krebsa. Umieść cienką warstwę kleju cyjanoakrylowego na platformie.
  5. Osusz krawędź bloku agarozy, który zostanie przyklejony do platformy, za pomocą sterylnej chusteczki chłonnej.
  6. Umieść blok agarozy na zdejmowanej platformie. Ustaw płat pionowo, aby umożliwić jego poprzeczne przecięcie. Chociaż rozmiar plastrów jest zmniejszony, drastycznie ułatwia to proces cięcia, ograniczając nacisk na płat podczas cięcia.
  7. Odczekaj 1 minutę, aż klej stwardnieje i zanurz zdejmowaną platformę w zbiorniku i upewnij się, że blok agarozy jest całkowicie pokryty buforem Krebsa.
  8. Zaprogramuj wibratom do cięcia, ustawiając pozycje start i stop. Zacznij początkowo kroić grubsze plastry, aż dojdziesz do płata wątroby.
  9. Wyrzuć pierwszy plasterek, ponieważ może nie zostać przycięty do odpowiedniej grubości. Aby uniknąć uszkodzenia plastrów, użyj szpatułki do zebrania plastrów wątroby zamiast kleszczy lub szczotek.
    UWAGA: Mała szczoteczka zdezynfekowana 70% etanolem i spłukana sterylnym PBS może być również używana do delikatnego prowadzenia tkanki podczas procesu cięcia.
  10. Powtarzaj proces, aż zostanie osiągnięta wymagana liczba plasterków. Płat może od czasu do czasu odsunąć się od agarozy, uniemożliwiając dalsze użycie. Zbierz plastry do lodowatego bufora Krebsa, aż do uzyskania kultury.

5. Inkubacja plastrów wątroby

  1. Przenieś plastry za pomocą szpatułki do przygotowanych dołków zawierających podłoże i wkładki.
  2. Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej, ustawić prędkość na 130 obr./min i inkubować w konwencjonalnym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C. Ostateczna objętość kultury wynosi 2,6 ml, 1,5 ml i 0,7 ml na dołek odpowiednio na płytkach 6-, 12- i 24-dołkowych.
  3. Umieścić jedną pustą płytkę poniżej płytki hodowlanej zawierającej plastry w kulturze, aby umożliwić rozproszenie nadmiaru ciepła pochodzącego z platformy wytrząsarki. Zmieniaj podłoże co 48 godzin.

6. Test przeżycia komórek

  1. Przenieść plastry do 48-dołkowej płytki zawierającej 400 μl wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki Williamsa Medium E i dodać 80 μl odczynnika MTS (3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium) odczynnika tetrazolowego.
  2. Po inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na wytrząsarce, przenieść 200 μl pożywki na płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję przy 490 nm za pomocą czytnika płytek wielodołkowych. Plastry pozostawione na stole w PBS i w temperaturze pokojowej przez 24 godziny należy wykorzystać jako kontrole ujemne.

7. Barwienie histologiczne

  1. Odparafinować i ponownie uwodnić skrawki za pomocą ksylenu i etanolu, a następnie wody dejonizowanej. Skrawki barwić roztworem Hematoxyliny przez 3 min.
  2. Płukać wodą dejonizowaną przez 5 min. Szybko zanurzyć 10x w kwaśnym etanolu (1 ml stężonego HCL i 400 ml 70% etanolu).
  3. Spłucz 2x do wody dejonizowanej i osusz nadmiar wody. Zanurz sekcje w Eozynie na 30 sekund.
  4. Odwodnić do 95% etanolu, a następnie 100% etanolu przez 5 minut, po 3 razy. Zanurz sekcje w ksylenie 3x na 15 minut każda. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas zbiorów, perfuzja zwierzęcia jest celowo pomijana, aby zapewnić szybkie przetwarzanie narządu i zapobiec jego uszkodzeniu. Wątroba jest pobierana szybko po nacięciu i natychmiast umieszczana w lodowatym buforze chroniącym narządy, np. Krebs buffer24,29. Chociaż krojenie świeżej tkanki wątroby bez osadzania zostało już wcześniej opisane1, osadzanie wątroby w niskotopliwej agarozie 30 (Rysunek 1) w połączeniu z buforem ochronnym narządów umożliwi optymalne warunki cięcia wibratomu, zmniejszając uszkodzenia tkanek i zwiększając odtwarzalność grubości przekroju. Grubość tkanki ma kluczowe znaczenie, ponieważ cienkie sekcje umożliwiają większej liczbie warstw komórek dostęp do składników odżywczych i tlenu31 i zmniejszają śmierć komórki. Jednak zbyt cienkie odcinki stają się trudne do jednorodnego cięcia. I odwrotnie, plastry grubsze niż 400 μm będą wykazywać niższą szybkość penetracji składników odżywczych. Sekcje inkubowano na granicy faz ciecz-powietrze za pomocą wkładki (Rysunek 1) i inkubowano z 5% CO2 i 21% O2 w temperaturze 37 °C na wytrząsarce. Sekcje należy inkubować w pożywce hodowlanej w ciągu 3 godzin po zbiorze, po czym następuje szybka śmierć komórki32.

Aby określić żywotność PCLS, żywotność komórek została oceniona za pomocą testu 4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium (MTS), który wymaga dehydrogenaz zależnych od NAD(P)H, tj. metabolicznie aktywnych komórek, w celu zmniejszenia MTS. Wartości MTS zostały znormalizowane do odpowiedniej masy warstwy. Aby zoptymalizować żywotność PCLS, minimalna objętość pożywki hodowlanej była niezbędna do utrzymania żywotności po 24 godzinach inkubacji. Objętość 0,7 ml w płytkach 24-dołkowych wykazała znaczne zmniejszenie żywotności za pomocą testu TMS (p = 0,02) w porównaniu z 1,5 ml w płytkach 12-dołkowych i 2,6 ml w płytkach 6-dołkowych (Rysunek 2A). Objętości te zostały dobrane tak, aby umożliwić lekkie zakrycie sekcji, ale mogą wymagać regulacji w zależności od rodzaju zastosowanych wkładek i płyt. Jak to jest w przypadku innych33, płytki 12-dołkowe są używane jako najlepszy kompromis dla optymalnego przeżycia w mniejszej objętości pożywki hodowlanej.

Wytrząsanie jest niezbędne i zwiększa żywotność PCLS o 50% w ciągu 24 godzin po inkubacji w porównaniu do hodowli statycznej (Rysunek 2B). Wytrząsanie tworzy krytyczną granicę faz powietrze-ciecz, zoptymalizowaną za pomocą transwelli, umożliwiając dostęp do składników odżywczych i tlenu do obu stron sekcji. Pobór tlenu i składników odżywczych jest również zwiększony przez stały przepływ wytwarzany przez ruch wytrząsania, który również przechodzi przez membranę transwell.

Test MTS był oceniany od 1 godziny inkubacji do 6 dnia inkubacji. Żywotność komórek pozostawała stała od dnia 0 do dnia 4 po inkubacji, zanim zaobserwowano znaczny spadek (p = 0,05) w dniu 6 (Rysunek 2C). Morfologia PCLS oceniana za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) nie wykazała zmian w drogach żółciowych i architekturze do 5 dni po inkubacji (Ryc. 3A-D). W porównaniu z dniem 0 (Ryc. 3A), PCLS nie wykazał różnicy histologicznej w dniu 1 (Ryc. 3B) i dniu 2 (Rycina 3C) po inkubacji, z hiperchromazją jądrową, łagodnym naciekiem zapalnym, wakuolizacją na korzyść umiarkowanego procesu śmierci komórki w 5. dniu po inkubacji (Rysunek 3D). Podsumowując, ten protokół hodowli PCLS umożliwia żywotność przez co najmniej 4 dni, co jest zgodne z badaniami wykorzystującymi wycinki w podobnych warunkach31.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat podsumowujący protokół generowania PCLS. Ten rysunek został zmodyfikowany z34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Zoptymalizowany protokół hodowli PCLS wykazuje zadowalającą żywotność przez 5 dni. (A) Wpływ wielkości studni na proliferację komórek (n=3). (B) Wpływ wstrząsania na proliferację komórek (n = 6 na warunek). (C) Test proliferacji komórek MTS z odcinków wątroby od d0 do d6 dni inkubacji (n = 5 na punkt czasowy). Dowolna jednostka OD, znormalizowana w celu pokrojenia świeżej masy. Wykres przedstawia średnią ± SD. Niesparowany 2-stronny test t-Studenta, ns=nieistotne, *p<0,05, **p<0,01. Ten rysunek został zmodyfikowany z34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki badań histologicznych. (A-D) Reprezentatywne obrazy histologiczne PCLS wątroby po barwieniu H&E. Podziałka = 100 μM. Ten rysunek został zmodyfikowany z34. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy, że wytwarzanie i hodowla PCLS może być łatwo osiągnięta przy jednoczesnym zapewnieniu okresu półtrwania wynoszącego co najmniej 4 dni. Protokół ten podsumowuje pięć krytycznych kroków: metodę osadzania, jeśli używany jest ten rodzaj wibratomu, orientację cięcia, dynamiczny system hodowli, minimalną objętość kultury i użycie wkładek.

Protokoły dotyczące produkcji i hodowli PCLS są powszechnie dostępne. Brakuje im jednak standaryzacji; Mogą koncentrować się na podobnych i konkretnych punktach protokołu, ale mogą być trudne do odtworzenia w prosty sposób lub w większości laboratoriów, które mają dostęp do podstawowego wibratomu. Rodzaje wibratomii lub krajalnic do tkanek są szerokie. Będą się różnić kosztem i specyfiką techniczną, taką jak zintegrowany system chłodzenia lub nie, ale ich wspólną cechą jest system cięcia za pomocą oscylującej żyletki. Główną różnicą w odniesieniu do krojenia tkanek jest wymóg zatapiania. Z oczywistych względów i wpływu osadzania na rentowność, najlepiej byłoby tego unikać. Jednym z przykładów fragmentatora referencyjnego, który nie wymaga osadzania, jest fragmentator Krumdieck35. Ten typ krajalnicy umożliwia cięcie tkanki w schłodzonym buforze przy użyciu rdzenia, tworząc równomierne plastry bez zatapiania. Jednak takie urządzenie jest zwykle droższe niż bardziej podstawowe wibratory i rzadziej używane lub dostępne w większości laboratoriów. Wibratomy, takie jak ten stosowany w tym protokole, są zwykle dostępne do cięcia chemicznie utrwalonych tkanek, ale będą wymagały osadzenia płatów wątroby. Niektórzy wykazali, że krojenie plastrów wątroby można osiągnąć bez osadzania i używania podobnego wibratomu1; Jednak z naszego doświadczenia wynika, że jest to trudne do odtworzenia. Ponadto, podczas stosowania tego rodzaju wibratomu, krojenie wątroby bez podtrzymującego 3D żelu agarozowego powoduje uszkodzenie plastrów i nierówną grubość, a tym samym zwiększa śmierć komórek. Protokół ten polega na przecięciu płata wątroby poprzecznie, a nie strzałkowo. Etap cięcia jest trudną techniką do opanowania, a według naszej wiedzy orientacja cięcia jest ważnym szczegółem, na którym nigdy się nie skupiamy. Orientacja płata podczas cięcia może drastycznie ułatwić proces cięcia, jednocześnie zmniejszając nacisk na wątrobę. Stosowanie hydrożelu można również uznać za poprawę korzyści36.

Kolejnym ważnym kryterium jest potrzeba większych ilości upraw w celu zwiększenia żywotności. Już zasugerowano, że większe ilości dostarczają więcej składników odżywczych i rozcieńczają bardziej toksyczne produkty zawierające kwasy żółciowe37. Dodanie dynamicznego systemu z wytrząsaniem i w połączeniu z użyciem Transwells poprawia dostęp do składników odżywczych i potencjalnie tlenu do obu powierzchni sekcji, tworząc stały przepływ 18,38,39. Zastosowanie transwella i zaleta systemu dynamicznego zostały już udowodnione w różnych kontekstach, takich jak reakcje na wycinki wątroby u człowieka28 oraz w modelowaniu zwłóknienia26,27. Protokół ten potwierdza ich przewagę w szerszym aspekcie fizjologicznym.

Pożywka E Williamsa jest powszechnie wybierana jako standardowa pożywka do hodowli komórkowych dla PCLS40,41. Opisano pożywki z glukozą i surowicą, które mogą przynieść korzyści w zachowaniu żywotności i funkcjonalności plastrów42. Stężenie glukozy w pożywkach zwykle waha się od 4 nM do 36 nM 43,44, ale nie znaleziono konsensusu co do wpływu wyższego stężenia glukozy na żywotność lub odpowiedź oksydacyjną. Twierdzi się, że dodanie insuliny lub deksametazonu35 poprawia długoterminową żywotność, ale nie osiągnięto konsensusu, ponieważ dodanie takich suplementów może potencjalnie wywołać wtórną insulinooporność, co miałoby dalszy wpływ na żywotność45 .

Poprzednie dane pokazują, że skrawki cieńsze niż 200 μm stają się trudne do jednorodnego cięcia i mogą wykazywać stres oksydacyjny, podczas gdy plastry grubsze niż 400 μm wykazują niski współczynnik penetracji składników odżywczych 18,19,46. Ponadto, w oparciu o wygląd PCLS, wpływ na teksturę i łatwość cięcia, preferowana jest grubość 250 μm. Przenikanie składników odżywczych lub środka terapeutycznego do wewnętrznych warstw komórkowych PCLS jest również znacznie ulepszone dzięki transwellom jako części systemu dynamicznego 18,32. W przeciwieństwie do korzystania z krajalnicy Krumdieck, która ma tę zaletę, że dzięki integracji systemu cięcia rdzeniowego wytwarza się plastry o równych rozmiarach, protokół można dostosować poprzez zmianę rozmiaru plastrów w równych wymiarach po pokrojeniu. Jednak w doświadczeniu należy wziąć pod uwagę zmienność wielkości, masy lub zawartości białka i jej wpływ na środowisko hodowli, a tym samym na żywotność i biomarkery. Z tego powodu odczyty testu MTA, podczas korzystania z tego protokołu, są znormalizowane do świeżej masy każdego plasterka. Można również zaobserwować niejednorodność grubości, ale niestety prawdopodobnie będzie ona obserwowana przy użyciu wszystkich typów krajalnic. Użytkownik może rozważyć odrzucenie najmniej jednorodnych plastrów, oceniając ich aspekt, ale nadal jest to uważane za niewiarygodną opcję i pozostaje wadą PCTS. Głównym ograniczeniem związanym z tym modelem pozostaje względna krótkoterminowa rentowność, ale mieści się ona w opublikowanych jużramach czasowych 24,31. Dostępność tlenu można zwiększyć, aby zwiększyć taką żywotność. Niektóre wcześniej opublikowane protokoły wymagały złożonych pożywek hodowlanych i stężenia tlenu wyższego niż 80%, zwiększając metabolizm i zapewniając dłuższą żywotność 1,24,35,38. Trudno jest również bezpośrednio porównać poziomy tlenu używane do natleniania PCLS i poziomy tlenu używane do hodowli linii komórkowych. Dane dotyczące wpływu tlenu na fizjologię PCLS są bardzo ograniczone 18,47, a wyższe stężenie tlenu prawdopodobnie znacznie zmieni patofizjologię i fenotyp poprzez generowanie toksycznych reaktywnych form tlenu48.

Podsumowując, krótkotrwałe PCLS mogą być wytwarzane przy użyciu ograniczonego sprzętu i wykorzystywane jako niezawodny model ex vivo . Architektura tkankowa ma kluczowe znaczenie w fizjologii wątroby, a PCLS pozwalający na jej zachowanie jest kolejnym przykładem na to, dlaczego model ten powinien być rozważany w bardziej dominujący sposób. Precyzyjnie pokrojone plastry powinny zatem stać się bardziej rozpoznawalnym narzędziem w badaniach naukowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie ma żadnego konkurencyjnego interesu, który mógłby zostać ujawniony.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Mirabeli Bandol, Samancie Richards, Louise Fisher, Rebecce Towns i personelowi UCL Biological Services za pomoc w hodowli i utrzymaniu kolonii zwierząt. Prace te były finansowane przez United Kingdom Medical Research Council Clinician Scientist Fellowship MR/T008024/1 (JB) oraz NIHR Great Ormond Street Hospital Biomedical Research Centre (JB). Wyrażone poglądy są poglądami autora (autorów), a niekoniecznie poglądami NHS lub NIHR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalka Petriego 3 cmDowolnaOdpowiednia do hodowli komórkowych
Płytka hodowlana 6, 12, 24 dołkowaDowolnadowolna odpowiednia do hodowli komórkowych
Super klej cyjanoakrylowyDowolna
D-glukozaGibcoA24940
EozynaMerckHT110316
EtanolDowolna
Płodowa surowica bydlęcaThermoFisher26400044
Gentamycyna Gibco15750060
HematoxylinMerck51275
HEPESGibcoH0887
wkładki 8um, do płytek 12-dołkowychStrastedt83.3931.800
wkładki 8um, do płytek 24-dołkowychStrastedt83.3932.800
wkładki 8um, do płytek 6-dołkowychStrastedt83.3930.800
KREBSMerckK3753
z przepływem laminarnymFiltracja powietrza Hepa
Agaroza o niskiej temperaturze topnienia ThermoFisher16520050
Odczynnik tetrazolowy MTS wielodołkowych Abcamab197010
 Dowolne
tabletki PBSThermoFisherP4417
Penicylina/StreptomycynaGibco15140-122
Ostrze skalpelaDowolne
Kleszcze chirurgiczneDowolnaz płaską kwadratową końcówką 
Nożyczki chirurgiczneDowolny
VibratomeLeicaVT1000 S
William' s Medium E z GlutaMAX (WME)ThermoFisherW4125
Okap Czytnik płytek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
  2. De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of drugs through the combined use of slices from rat liver, lung, kidney, small intestine and colon. Xenobiotica. 34 (3), 229-241 (2004).
  3. van de Kerkhof, E. G., de Graaf, I. A., Ungell, A. L., Groothuis, G. M. Induction of metabolism and transport in human intestine: validation of precision-cut slices as a tool to study induction of drug metabolism in human intestine in vitro. Drug Metab Dispos. 36 (3), 604-613 (2008).
  4. Nogueira, G. O., Garcez, P. P., Bardy, C., Cunningham, M. O., Sebollela, A. Modeling the human brain with ex vivo slices and in vitro organoids for translational neuroscience. Front Neurosci. 16, 838594(2022).
  5. Ucar, B., Stefanova, N., Humpel, C. Spreading of aggregated alpha-Synuclein in sagittal organotypic mouse brain slices. Biomolecules. 12 (2), 163(2022).
  6. Liu, G., et al. Precision cut lung slices: an ex vivo model for assessing the impact of immunomodulatory therapeutics on lung immune responses. Arch Toxicol. 95 (8), 2871-2877 (2021).
  7. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. J Vis Exp. (171), e62392(2021).
  8. Viana, F., O'Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Mol Microbiol. 117 (3), 578-588 (2022).
  9. De Kanter, R., et al. Drug-metabolizing activity of human and rat liver, lung, kidney and intestine slices. Xenobiotica. 32 (5), 349-362 (2002).
  10. Stribos, E. G. D., Seelen, M. A., van Goor, H., Olinga, P., Mutsaers, H. A. M. Murine precision-cut kidney slices as an ex vivo model to evaluate the role of transforming growth factor-beta1 signaling in the onset of renal fibrosis. Front Physiol. 8, 1026(2017).
  11. James, K., Skibinski, G., Hoffman, P. A comparison of the performance in vitro of precision cut tissue slices and suspensions of human spleen with special reference to immunoglobulin and cytokine production. Hum Antibodies Hybridomas. 7 (4), 138-150 (1996).
  12. Tatibana, M., Kita, K., Asai, T. Stimulation by 6-azauridine of carbamoyl phosphate synthesis for pyrimidine biosynthesis in mouse spleen slices. Eur J Biochem. 128 (2-3), 625-629 (1982).
  13. Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 390-398 (2011).
  14. Liu, Z., et al. Comparative analysis of adeno-associated virus serotypes for gene transfer in organotypic heart slices. J Transl Med. 18 (1), 437(2020).
  15. Zimmermann, M., et al. Human precision-cut liver tumor slices as a tumor patient-individual predictive test system for oncolytic measles vaccine viruses. Int J Oncol. 34 (5), 1247-1256 (2009).
  16. Philouze, P., et al. CD44, gamma-H2AX, and p-ATM expressions in short-term ex vivo culture of tumour slices predict the treatment response in patients with oral squamous cell carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (2), 877(2022).
  17. Tigges, J., et al. Optimization of long-term cold storage of rat precision-cut lung slices with a tissue preservation solution. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (6), L1023-L1035 (2021).
  18. Olinga, P., et al. Comparison of five incubation systems for rat liver slices using functional and viability parameters. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 59-69 (1997).
  19. Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circ Res. 125 (6), 628-642 (2019).
  20. Martin, C. Human lung slices: New uses for an old model. Am J Respir Cell Mol Biol. 65 (5), 471-472 (2021).
  21. Sewald, K., Danov, O. Infection of human precision-cut lung slices with the Influenza virus. Methods Mol Biol. 2506, 119-134 (2022).
  22. , Accessed 08/02/2023 https://www.nc3rs.org.uk (2023).
  23. Iulianella, A. Cutting thick sections using a vibratome. Cold Spring Harb Protoc. 2017 (6), (2017).
  24. Szalowska, E., et al. Effect of oxygen concentration and selected protocol factors on viability and gene expression of mouse liver slices. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1513-1524 (2013).
  25. Kenerson, H. L., Sullivan, K. M., Labadie, K. P., Pillarisetty, V. G., Yeung, R. S. Protocol for tissue slice cultures from human solid tumors to study therapeutic response. STAR Protoc. 2 (2), 100574(2021).
  26. Paish, H. L., et al. A bioreactor technology for modeling fibrosis in human and rodent precision-cut liver slices. Hepatology. 70 (4), 1377-1391 (2019).
  27. Dewyse, L., et al. Improved precision-cut liver slice cultures for testing drug-induced liver fibrosis. Front Med (Lausanne). 9, 862185(2022).
  28. Jagatia, R., et al. Patient-derived precision cut tissue slices from primary liver cancer as a potential platform for preclinical drug testing. EBioMedicine. 97, 104826(2023).
  29. Koch, A., et al. Murine precision-cut liver slices (PCLS): a new tool for studying tumor microenvironments and cell signaling ex vivo. Cell Commun Signal. 12, 73(2014).
  30. Brugger, M., et al. High precision-cut liver slice model to study cell-autonomous antiviral defense of hepatocytes within their microenvironment. JHEP Rep. 4 (5), 100465(2022).
  31. Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. Int J Mol Sci. 22 (13), 7137(2021).
  32. Lerche-Langrand, C., Toutain, H. J. Precision-cut liver slices: characteristics and use for in vitro pharmaco-toxicology. Toxicology. 153 (1-3), 221-253 (2000).
  33. van de Kerkhof, E. G., de Graaf, I. A., de Jager, M. H., Meijer, D. K., Groothuis, G. M. Characterization of rat small intestinal and colon precision-cut slices as an in vitro system for drug metabolism and induction studies. Drug Metab Dispos. 33 (11), 1613-1620 (2005).
  34. Perocheau, D., et al. Ex vivo precision-cut liver slices model disease phenotype and monitor therapeutic response for liver monogenic diseases. F1000Res. 12, 1580(2023).
  35. de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nat Protoc. 5 (9), 1540-1551 (2010).
  36. Bailey, K. E., et al. Embedding of precision-cut lung slices in engineered hydrogel biomaterials supports extended ex vivo culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 62 (1), 14-22 (2020).
  37. Graaf, I. A., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3 (6), 879-898 (2007).
  38. Leeman, W. R., van de Gevel, I. A., Rutten, A. A. Cytotoxicity of retinoic acid, menadione and aflatoxin B(1) in rat liver slices using Netwell inserts as a new culture system. Toxicol In Vitro. 9 (3), 291-298 (1995).
  39. Schumacher, K., et al. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
  40. Jetten, M. J., et al. Interindividual variation in response to xenobiotic exposure established in precision-cut human liver slices. Toxicology. 323, 61-69 (2014).
  41. Duryee, M. J., et al. Precision-cut liver slices from diet-induced obese rats exposed to ethanol are susceptible to oxidative stress and increased fatty acid synthesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (3), G208-G217 (2014).
  42. Starokozhko, V., et al. Maintenance of drug metabolism and transport functions in human precision-cut liver slices during prolonged incubation for 5 days. Arch Toxicol. 91 (5), 2079-2092 (2017).
  43. Vickers, A. E., et al. Organ slice viability extended for pathway characterization: an in vitro model to investigate fibrosis. Toxicol Sci. 82 (2), 534-544 (2004).
  44. Boess, F., et al. Gene expression in two hepatic cell lines, cultured primary hepatocytes, and liver slices compared to the in vivo liver gene expression in rats: possible implications for toxicogenomics use of in vitro systems. Toxicol Sci. 73 (2), 386-402 (2003).
  45. Zhang, W. Y., et al. Amelioration of insulin resistance by scopoletin in high-glucose-induced, insulin-resistant HepG2 cells. Horm Metab Res. 42 (13), 930-935 (2010).
  46. Smith, J. T., et al. Effect of slice thickness on liver lesion detection and characterisation by multidetector CT. J Med Imaging Radiat Oncol. 54 (3), 188-193 (2010).
  47. Drobner, C., Glockner, R., Muller, D. Optimal oxygen tension conditions for viability and functioning of precision-cut liver slices. Exp Toxicol Pathol. 52 (4), 335-338 (2000).
  48. Hart, N. A., et al. Oxygenation during hypothermic rat liver preservation: an in vitro slice study to demonstrate beneficial or toxic oxygenation effects. Liver Transpl. 11 (11), 1403-1411 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla przeci w trobykrojenie w wibratomiezatapianie tkanekmodel w troby mysiejprzeci organotypowedynamiczny system hodowlizatapianie w agaroziebufor Krebsa Henseleitawytrz sarka orbitalna

Powiązane artykuły