Artykuł metodologiczny

Charakterystyka pośredniczonego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trójelektrodowego, dwukomorowego układu bioelektrochemicznego

DOI:

10.3791/67204

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of BioSciences, Rice University, 2PhD Program in Systems, Synthetic, and Physical Biology, Rice University, 3Department of Bioengineering, Rice University, 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University, 5Rice Synthetic Biology Institute, Rice University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący pozakomórkowy transfer elektronów za pośrednictwem (EET) u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trzyelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego. Ilustrujemy tę metodę za pomocą Lactiplantibacillus plantarum i mediatora redoks kwasu 1,4-dihydroksy-2-naftoesowego i podajemy dokładny opis technik elektrochemicznych stosowanych do oceny EET, w którym pośredniczy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele bakterii przeprowadza zewnątrzkomórkowy transfer elektronów (EET), dzięki któremu elektrony są przenoszone z komórki do zewnątrzkomórkowego końcowego akceptora elektronów. Ten akceptor elektronów może być elektrodą, a elektrony mogą być dostarczane pośrednio przez cząsteczkę mediatora aktywnego redoks. W tym miejscu przedstawiamy protokół badania EET za pośrednictwem Lactiplantibacillus plantarum, probiotycznej bakterii kwasu mlekowego szeroko stosowanej w przemyśle spożywczym, przy użyciu systemu bioelektrochemicznego. Szczegółowo opisujemy, jak zmontować trójelektrodowy, dwukomorowy system bioelektrochemiczny i udzielamy wskazówek dotyczących charakteryzowania EET w obecności rozpuszczalnego mediatora przy użyciu technik chronoamperometrii i woltamperometrii cyklicznej. Wykorzystujemy reprezentatywne dane z eksperymentów EET za pośrednictwem kwasu 1,4-dihydroksy-2-naftoesowego (DHNA) z L. plantarum, aby zademonstrować analizę i interpretację danych. Techniki opisane w tym protokole mogą otworzyć nowe możliwości dla elektrofermentacji i bioelektrokatalizy. Niedawne zastosowania tej techniki elektrochemicznej z L. plantarum wykazały przyspieszenie przepływu metabolicznego w kierunku wytwarzania końcowych produktów fermentacji, które są krytycznymi składnikami smakowymi w fermentacji żywności. W związku z tym system ten ma potencjał do dalszego rozwoju w celu zmiany smaków w produkcji żywności lub produkcji cennych substancji chemicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy bioelektrochemiczne łączą mikroorganizmy z elektrodami, umożliwiając badanie mechanizmów zewnątrzkomórkowego transferu elektronów (EET) i dostarczając odnawialne podejścia do bioelektrokatalizy1,2,3. Drobnoustroje, które naturalnie wykonują EET, są znane jako egzoelektrogeny, które przenoszą elektrony pochodzące z metabolizmu do zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów końcowych, np. (wodoro)tlenków żelaza i elektrod1. Po raz pierwszy scharakteryzowany u gatunków Geobacter i Shewanella4,5, szlaki EET zostały od tego czasu zidentyfikowane u wielu bakterii. Te egzoelektrogeny odgrywają kluczową rolę w kilku mikrobiologicznych technologiach elektrochemicznych, takich jak wytwarzanie energii elektrycznej ze strumieni odpadów, wiązanie CO2 i wytwarzanie cennych substancji chemicznych poprzez elektrosyntezę1,6,7,8,9,10,11,12.

Jednym z takich egzoelektrogenów jest Lactiplantibacillus plantarum, Gram-dodatnia bakteria kwasu mlekowego13. L. plantarum to koczownicza, probiotyczna bakteria, która żyje w wielu różnych środowiskach, w tym w jelitach ludzi i innych kręgowców, a także w wielu rodzajach żywności, takich jak mięso, zboża, warzywa oraz sfermentowana żywność i napoje14,15,16,17. Jego genom koduje elastyczny, heterofermentatywny metabolizm, umożliwiając pomyślną adaptację w tych zróżnicowanych środowiskach. Jest dobrze przebadany, szeroko stosowany w przemyśle spożywczym i zdrowotnym oraz ogólnie uznawany za bezpieczny przez Agencję ds. Żywności i Leków18,19. W związku z tym L. plantarum ma potencjał, aby służyć jako użyteczna platforma dla technologii opartych na EET.

Ostatnie badania nad L. plantarum zidentyfikowały wielogenowy operon kodujący złożony szlak EET, pierwotnie scharakteryzowany u Listeria monocytogenes13,20. U L. plantarum białka zsyntetyzowane z tego operonu ułatwiają EET w układzie bioelektrochemicznym (BES), gdy dostarcza się kwas chinonowy 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy (DHNA) jako mediator elektronów13. Pierwszym niezbędnym białkiem w tym szlaku jest związana z błoną oksydoreduktaza NADH-chinonowa (Ndh2), która utlenia NADH i zmniejsza DHNA. DHNA dostarcza elektrony bezpośrednio do elektrody lub pośrednio przez białko pomocnicze PplA (Rysunek 1)13,21,22. Ostatnie badania wskazują, że L. plantarum może również wykorzystywać inne chinony, które są strukturalnie podobne do DHNA, jako mediatory elektronów; jednak L. plantarum nie jest zdolny do wytwarzania DHNA lub tych alternatywnych chinonów, dlatego mediatory muszą być egzogennie obecne w środowisku, aby mogło wystąpić EET13,22,23.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przepływ elektronów w Lactiplantibacillus plantarum EET. Ndh2 przekazuje elektrony z NADH do chinonu DHNA. Elektrony są przenoszone do elektrody w celu wytworzenia prądu, albo bezpośrednio przez zredukowany chinon, albo pośrednio przez białko pomocnicze PplA. Skróty: FAD = dinukleotyd flawinoadeninowy; FMN = mononukleotyd flawinowy; EET = zewnątrzkomórkowy transfer elektronów; NADH = zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadeninowy; Ndh2 = oksydoreduktaza NADH-chinonu; DHNA = kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy; PplA = fosfolipaza A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W tym artykule przedstawiamy obszerny protokół do scharakteryzowania metody opartej na BES do scharakteryzowania EET za pośrednictwem DHNA u L. plantarum. Trzyelektrodowy, dwukomorowy system ogranicza bakterie do elektrody roboczej, umożliwiając precyzyjną kontrolę potencjału przyłożonego do bakterii, jednocześnie zapobiegając przesłuchom między elektrodą roboczą a przeciwelektrodą. Przedstawiamy kompleksowy protokół obejmujący 5 dni, który obejmuje przygotowanie przed eksperymentem, montaż BES, analizę EET z wykorzystaniem chronoamperometrii (CA) i woltamperometrii cyklicznej (CV) oraz analizę próbki po eksperymencie. Protokół ten może być zastosowany do rozwikłania mechanizmów szlaków EET oraz do budowy systemów do elektrofermentacji i elektrokatalizy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Dwukomorowe zespoły BES będą określane jako "reaktory" w następującym protokole.

1. Przygotowanie mediów

  1. Przygotować podłoża hodowlane L. plantarum.
    1. Przygotuj komercyjne nośniki MRS (de Man Rogosa Sharpe) zgodnie z instrukcją i mMRS media24 zgodnie z opisem w Tabeli 1. Dostosuj pH mMRS do 6,5. Przefiltruj i wysterylizuj oba media, przepuszczając je przez filtr 0,22 μm i przechowuj je w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
    2. Przygotować chemicznie zdefiniowane podłoże z mannitolem (mCDM)13,25 zgodnie z opisem w Tabeli 2, i dostosować pH do 6,5. Przygotować pożywkę wystarczającą do napełnienia komory anodowej każdego reaktora 110 ml pożywki. Filtracja i sterylizacja mCDM przez filtr 0,22 μm.
      UWAGA: mCDM powinien być przygotowany świeży w dniu zamierzonego użycia. Roztwory składowe mogą być przygotowane z wyprzedzeniem. Przefiltrować-wysterylizować wszystkie roztwory składników przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przygotowując witaminy Wolfe's, przed sterylizacją dostosuj pH do 11 i przechowuj w ciemności lub zawinięte w folię. Przygotowując minerały Wolfe'a, dostosuj pH do 8 po dodaniu kwasu nitrylotrioctowego (NTA). Następnie dodaj pozostałe składniki, wysterylizuj i przechowuj w ciemności lub zawinięte w folię.
  2. Przygotuj 1x PBS i autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4 °C do stosowania w tym protokole.
  3. Przygotuj komercyjne pożywki M9 zgodnie z instrukcją (Tabela 3) i przelej autoklaw do sterylizacji. Przygotuj wystarczającą ilość pożywki, aby napełnić komorę katodową każdego reaktora 110 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Dzień 1: Montaż reaktora BES i początkowa hodowla L. plantarum

UWAGA: Odniesienie Rysunek 2 dla schematu reaktora BES i schematu szczegółowo opisującego elementy montażowe wskazane w protokole.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Komponenty BES i schemat montażu. (A) Schemat dwukomorowego reaktora BES. Bakterie (kolor zielony) w komorze anodowej przenoszą elektrony do elektrody roboczej (czarne kółko) w obecności mediatora chinonu. Elektrony przepływają przez obwód do komory katodowej, umożliwiając pomiary prądu między anodą a katodą za pomocą potencjostatu. (B) Obraz przedstawiający w pełni zmontowany reaktor BES, w tym igły wlotowe i wylotowe N2 w komorze anodowej. (C) Obraz przedstawiający wszystkie części zdemontowanego reaktora. Skrót: BES = system bioelektrochemiczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Montaż i sterylizacja reaktorów.
    1. Przygotuj elektrody roboczą i przeciwelektrodę. Przeszlifuj wstępnie przycięte druty tytanowe o średnicy 1,0 mm do elektrody roboczej i przeciwelektrody papierem ściernym z tlenku glinu, aż będą równomiernie błyszczące. Za pomocą szczypiec zegnij jeden koniec każdego roboczego drutu elektrody w mały haczyk. Wsuń okrągły filc węglowy o długości 16 cm2 na każdy drut elektrody roboczej, wplatając drut i wysuwając go z filcu węglowego raz i ciągnąc okrąg w dół drutu, aż zostanie przymocowany do haczyka. Zabezpiecz elektrody roboczą i przeciwelektrodę w nasadkach GL45, przekłuwając gumową przegrodę drutem i przeciągając ją przez kilka centymetrów.
    2. Aby zmontować sparowane reaktory, najpierw zmontuj O-ring i umieść wstępnie przyciętą membranę kationowymienną, która została wstępnie nasączona w wodzie, w zmontowanym O-ringu. Umieść O-ring z membraną między dużymi dolnymi otworami dwóch sparowanych butelek reaktora. Zabezpiecz butelki z parą reaktorów i O-ring z membraną za pomocą zacisku przegubowego, aby dokręcić palce. Wrzuć magnetyczny pręt mieszający do każdej komory anodowej, a następnie zamknij wszystkie małe otwory w górnej części każdej butelki za pomocą nakrętek GL14 wyposażonych w gumową septę.
      UWAGA: Nie dokręcaj zbyt mocno kastetu clamps ani żadnych nakrętek, ponieważ może to prowadzić do pęknięć lub pęknięć w butelkach.
    3. Napełnij każdą butelkę reaktora 110 ml wody dejonizowanej (DI), a następnie zamknij każdą butelkę odpowiednią nasadką GL45 dopasowaną do elektrody. Włóż nasadki wyposażone w okrągłą elektrodę roboczą z filcu węglowego, delikatnie dociskając górną część filcowej rundy, aby runda pozostała na haczyku.
      UWAGA: Świeży filc węglowy jest hydrofobowy i odpycha wodę w reaktorze podczas początkowego montażu. Autoklawowanie spowoduje, że filc węglowy stanie się odpowiednio hydrofilowy do eksperymentów.
    4. Zebrać nasadki elektrod GL14 wyposażone w silikonowe pierścienie uszczelniające.
    5. Delikatnie poluzuj wszystkie nakrętki GL45 przed sterylizacją w autoklawie. Autoklaw wypełnione wodą reaktory i nasadki elektrod do sterylizacji. Po sterylizacji w autoklawie pozwól reaktorom ostygnąć do temperatury pokojowej.
  2. Kultura L. plantarum NCIMB8826. W sterylnych warunkach zeskrob niektóre bakterie z wierzchu bulionu glicerolowego i zaszczepij w 3 ml komercyjnej pożywki MRS. Kulturę uprawiać przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
    UWAGA: L. plantarum nie wykorzystuje tlenu jako końcowego akceptora elektronów; W związku z tym nie jest konieczne natlenianie podłoża przez potrząsanie26. Jednak warunki hodowli będą się różnić, jeśli używane są inne drobnoustroje.

3. Dzień 2: Przygotowanie elektrod referencyjnych, przygotowanie reaktorów do rozpoczęcia eksperymentu i hodowla pod-L. plantarum

  1. Przygotuj elektrody referencyjne Ag/AgCl.
    UWAGA: Etapy te opisują przygotowanie elektrod referencyjnych Ag/AgCl wskazanych w Tabeli Materiałów. Użytkownicy powinni postępować zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli używają innej elektrody referencyjnej.
    1. Zdemontuj elektrody referencyjne Ag/AgCl i przeszlifuj przewody. Delikatnie wyciągnij elektrodę ze szklanej obudowy i potrząśnij szklaną obudową, aby opróżnić stary roztwór KCl. Delikatnie przeszlifuj druty elektrod papierem ściernym z tlenku glinu, aż będą równomiernie błyszczące, aby usunąć utleniony materiał.
    2. Zbierz wszystkie przeszlifowane druty elektrody referencyjnej w małej zlewce z małym mieszadłem i napełnij zlewkę 100% wybielaczem, aż druty zostaną całkowicie zanurzone. Chloruj druty, pozwalając im wybielić się na platformie mieszającej przez 30 minut, aż elektrody zmienią kolor na ciemnoszary. Po wybieleniu dokładnie spłucz druty elektrod wodą DI.
    3. Aby ponownie zmontować elektrodę referencyjną, za pomocą strzykawki całkowicie napełnij szklaną obudowę 3 M roztworem KCl nasyconym chlorkiem srebra, delikatnie stukając w bok, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Za pomocą tej samej strzykawki napełnij nasadkę drutu elektrody roztworem KCl, a następnie włóż drut do obudowy. Przyłóż spód szklanej obudowy do ręcznika papierowego na blacie stołu, włóż elektrodę do szklanej obudowy, a następnie mocno dociśnij nasadkę, aby zamknąć elektrodę. Przechowuj elektrody odniesienia w zlewce płytko wypełnionej roztworem KCl do czasu, gdy będą potrzebne, i powtórz tę czynność ze wszystkimi pozostałymi elektrodami odniesienia.
    4. Użyj multimetru cyfrowego, aby zmierzyć napięcie domowych elektrod referencyjnych Ag/AgCl.
      1. Zanurz końce elektrod referencyjnych Ag/AgCl (szacowanych na 197 mV w porównaniu ze standardową elektrodą wodorową, SHE) płytko w zlewce wypełnionej 3 M KCl. Bezpiecznie podłącz multimetr do zakupionej w handlu nasyconej elektrody kalomelowej (SCE, 241 mV w porównaniu z SHE) również zanurzonej w tych samych elektrolitach KCl.
      2. Zmierzyć różnicę potencjałów między każdą elektrodą odniesienia a SCE. Upewnić się, że elektrody odniesienia różnią się od SCE o 44 ± 10 mV. Zdemontuj i ponownie zmontuj każdą elektrodę odniesienia, która wykracza poza ten zakres.
    5. Uszczelnij szew w miejscu, w którym nasadka styka się ze szklaną obudową, za pomocą parafolii.
  2. Przygotuj reaktory do eksperymentów.
    1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego wymień autoklawowaną wodę w reaktorach na odpowiednie media. Wylej wodę z autoklawy. Napełnij komory katodowe 110 ml autoklawizowanego podłoża M9. Napełnij komory anodowe 110 ml świeżo przygotowanego mCDM.
    2. Zainstaluj elektrody referencyjne. Zdejmij jedną nasadkę GL14 z każdej komory anodowej i zastąp ją autoklawowaną nasadką elektrody (nasadka GL14 z silikonowym pierścieniem uszczelniającym). Spryskaj elektrody referencyjne 70% etanolem w celu sterylizacji, a następnie umieść jedną elektrodę odniesienia przez nasadkę elektrody w każdej komorze anodowej.
      UWAGA: Upewnij się, że elektroda referencyjna nie styka się bezpośrednio z okrągłym filcem węglowym.
    3. Przed wyjęciem reaktorów z szafy bezpieczeństwa biologicznego dokręć wszystkie nasadki i zaciski tak, aby były dokręcone palcami, aby uniknąć wycieku.
    4. Podłącz reaktory do systemu pompy wodnej. Umieść każdy reaktor na odpowiedniej platformie mieszadła. Połącz króćce płaszcza wodnego każdego reaktora z drugim za pomocą gumowych rurek, łącząc daktory końcowe z rurami doprowadzającymi i odpływowymi pompy wodnej.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie połączenia są szczelne i nie ma wycieków, w razie potrzeby używając opasek zaciskowych do zabezpieczenia przewodów.
    5. Napełnij pompę wodą i dodaj 4-6 kropli uzdatniacza wody. Włączyć układ pompy i ustawić temperaturę na 30 °C. Uruchomić pompę i obserwować przepływ wody przez wszystkie płaszcze wodne reaktora, upewniając się, że nie ma wycieków na żadnych połączeniach.
    6. Włącz platformy mieszające i ustaw je na ciągłe mieszanie z prędkością 220 obr./min.
    7. Podłącz reaktory do przewodów gazowych rozpylających azot. Podłącz filtr powietrza do 4-calowej igły 22 G i włóż igłę przez górną przegrodę komory anodowej reaktora do pożywki, która będzie służyć jako wlot azotu. Włóż kolejną igłę o długości 1 cala i pojemności 18 G do górnej przegrody komory anodowej, aby służyła jako wylot azotu. Podłącz przewody gazowe ze źródła azotu do filtra powietrza i otwórz zawór, aby gaz mógł delikatnie przedostać się przez reaktor. Upewnij się, że pęcherzyki azotu przepływają przez wszystkie komory anodowe w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać warunki beztlenowe.
      UWAGA: Upewnij się, że igła wlotowa jest ustawiona z dala od okrągłego filcu węglowego. Strumień pęcherzyków nie powinien stykać się ani z filcem węglowym, ani z elektrodami odniesienia.
    8. Podłącz bioreaktory do przewodów potencjostatu. Podłącz przewody zacisku krokodylkowego elektrody roboczej, licznika i elektrody odniesienia z potencjostatu do odpowiednich elektrod.
      UWAGA: Użyj multimetru, aby sprawdzić rezystancję między przewodem/kolektorem prądu a elektrodami, aby zapewnić prawidłowe połączenia elektryczne i zminimalizować potencjalne błędy pomiaru.
  3. Wprowadź parametry potencjostatu dla prerun.
    UWAGA: Krytyczne ustawienia techniki są podane poniżej. Tabela 4 zawiera rozszerzoną listę ustawień oprogramowania dla każdej techniki.
    1. Włącz potencjostat i zainicjuj oprogramowanie EC-lab na komputerze. Podłącz potencjostat do komputera, klikając przycisk symbolu potencjostatu w lewym górnym panelu w obszarze Urządzenia. Po nawiązaniu połączenia nazwa urządzenia pojawi się z zielonym kółkiem w polu tekstowym poniżej.
    2. Zsynchronizuj wszystkie kanały podłączone do bioreaktorów w jedną grupę, klikając kartę Edycja, a następnie wybierając opcję synchronizuj. Kliknij odpowiednie pola numeru kanału | OK.
    3. Dodaj technikę napięcia obwodu otwartego (OCV) do potencjostatu, klikając przycisk + w panelu Ustawienia parametrów po lewej stronie. W niebieskim polu ustawień; ustawić go tak, aby mierzył potencjał elektrody roboczej (EWE) w stosunku do elektrody odniesienia (RE), rejestrując czas w przedziale dt co 36 s przez łącznie 3 godziny.
    4. Następnie dodaj technikę woltamperometrii cyklicznej (CV) do potencjostatu. Ustaw potencjał początkowy EWE na Ei 0 V w porównaniu z RE z szybkością skanowania 2 mV/s. Przemiatanie do potencjału wierzchołkowego (E1) 0,4 V w porównaniu z RE odwracanie do potencjału wierzchołka (E2) -0,7 V w porównaniu z RE. Powtórz skanowanie, aby uzyskać łącznie dwa przebiegi.
      UWAGA: W mikrobiologicznych układach elektrochemicznych inokulacja mikrobiologiczna i tworzenie biofilmu indukują wysokie zdolności w porównaniu z materiałami metalowymi lub cząsteczkami nieorganicznymi. Podczas cyklicznego skanowania woltamperometrycznego potencjał zmienia się, a prąd ładowania działa jako tło. Aby osiągnąć wysoki stosunek sygnału do szumu, konieczne są niższe szybkości skanowania, chociaż wydłuża to czas skanowania. Ponieważ skanujemy dwa cykle obejmujące szerokie okno elektrochemiczne 1,1 V, szybkość skanowania 2 mV/s powoduje, że połowa cyklu trwa do 9,1 minuty. W związku z tym dwa cykle trwają łącznie 36,4 min. Dalsze zmniejszanie szybkości skanowania byłoby zbyt czasochłonne.
    5. Dodaj technikę chronoamperometria (CA). Zastosować stały potencjał EWE równy 0,2 V w stosunku do RE przez czas t = 200 h, rejestrując czas w odstępach dt co 25-40 s. Dostosuj przedział czasowy w oparciu o oprogramowanie potencjostatu, aby uzyskać żądany poziom szczegółowości.
      UWAGA: Potencjał punktu środkowego DHNA wynosi około -0,093 V w porównaniu z Ag/AgCl; w związku z tym przyłożony potencjał 0,2 V w stosunku do RE do elektrody roboczej jest wystarczający, aby umożliwić transfer elektronów z DHNA do elektrody.
    6. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów rozpocznij bieg, naciskając zielony trójkąt startowy. Zapisz plik zgodnie z potrzebami zgodnie z zaleceniami oprogramowania, a następnie kliknij przycisk Zapisz. Oprogramowanie rozpocznie technikę 1, "OCV". Obserwuj ślady OCV przez kilka minut, aby upewnić się, że wszystkie reaktory odczytują pozytywnie i zbliżają się do siebie ze stałym sygnałem. Pozostaw eksperyment do uruchomienia na noc, aby zakończyć OCV i początkowy CV (patrz rysunek uzupełniający S1 dla CV kontrolnego pożywki) i pozwól CA działać do momentu ustabilizowania się.
  4. W sterylnych warunkach subkulturuj kulturę MRS L. plantarum 1:200 w 50 ml mMRS. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
    UWAGA: Hodowla nocna o pojemności 50 ml zazwyczaj wytwarza więcej niż wystarczającą ilość komórek dla sześciu reaktorów, przy założeniu, że końcowy OD600 wynosi 0,2 w reaktorze. Dostosuj odpowiednio objętość hodowli dla większych lub mniejszych eksperymentów.

4. Dzień 3: Wstrzyknięcie komórek i DHNA/DMSO

  1. Umyj komórki i wstrzyknij je do reaktorów.
    1. Rano wyjąć kulturę mMRS L. plantarum z inkubatora. W sterylnych warunkach przenieś kulturę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i umieść ją na lodzie.
    2. Umyj komórki 2x w sterylnym, zimnym 1x PBS. W tym celu należy odwirować kulturę o sile 4 000 × g przez 5 minut w wirówce o temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek. W sterylnych warunkach delikatnie, ale dokładnie zawiesić komórki w 50 ml PBS, a następnie ponownie odwirować jak poprzednio; Powtórz dla drugiego prania. Po ostatnim wirowaniu ponownie zawiesić komórki w zimnym PBS do OD600 = 11.
    3. W sterylnych warunkach załadować 2 ml zawieszonych komórek do strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę do każdego reaktora.
    4. Na stacji reaktora odkręć strzykawkę z komórkami i włóż igłę do górnej części komory anodowej reaktora. Nie należy w tym momencie naciskać tłoka strzykawki; Powtórzyć tę czynność dla wszystkich reaktorów. Gdy wszystkie strzykawki znajdą się na swoim miejscu, naciśnij tłoki, aby wstrzyknąć komórki do reaktorów i zarejestrować czas wstrzyknięcia ze ścieżki CA. Ta objętość komórek wytwarza końcowy OD600 równy 0,2 w reaktorach. Wszystkie strzykawki należy wyrzucić do pojemników stanowiących zagrożenie biologiczne, a igły do wyznaczonego pojemnika na ostre przedmioty. Poczekaj, aż prąd ustabilizuje się do płaskiego poziomu na ścieżce CA przez 2-4 godziny
      UWAGA: Po wstrzyknięciu można zaobserwować wahania prądu na ścieżce CA. Po 2-4 godzinach wahania te ustabilizują się do płaskiego prądu (zmiana prądu <2 μA w ciągu godziny), w którym to momencie można wstrzyknąć DHNA.
  2. Zmierz początkowe pH i wstrzyknij DHNA.
    1. Przygotuj roztwór DHNA. W probówce o pojemności 1,5 ml przygotuj 500 μl roztworu DHNA o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając sproszkowany DHNA w 100% DMSO. Napełnij 3 strzykawki insulinowe 110 μl roztworu DHNA, a 3 strzykawki insulinowe 110 μl DMSO.
      UWAGA: Podczas gdy DHNA jest łagodnie rozpuszczalny w wodzie, DMSO jest lepszym rozpuszczalnikiem dla zapasów DHNA w tym stężeniu. Rozpuszczalnik mediatora może się różnić, jeśli stosowane są inne mediatory.
    2. Na stacji reaktora BES oznaczyć reaktory doświadczalne jako + DHNA, a reaktory do kontroli rozpuszczalnika jako - DHNA. Zdeponować strzykawkę DHNA i włożyć strzykawkę do górnej części każdej komory anodowej oznaczonej jako + DHNA. Włożyć strzykawkę obsługującą tylko DMSO do każdej komory anodowej oznaczonej jako - DHNA. W tym momencie nie należy naciskać tłoków strzykawki.
    3. Pobrać próbki z punktu czasowego w ciągu 0 godzin do analizy próbki. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w 2-calową igłę o pojemności 21 g, pobrać próbkę pożywki o objętości 2 ml z każdej komory anodowej przez nieużywaną przegrodę małej czapeczki i przenieść próbki na płytkę z 24 głębokimi dołkami w celu wykonania pomiarów pH dla punktu czasowego 0 h (punkt wstrzyknięcia DHNA). W razie potrzeby pobrać 1 ml zużytej pożywki z każdej komory anodowej i przefiltrować przez filtr 0,2 μm do czystych, znakowanych probówek w celu ilościowego określenia metabolitów za pomocą HPLC lub innych testów. Próbki zużytych pożywek należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Wcisnąć tłoki wszystkich strzykawek DHNA i DMSO, aby wstrzyknąć je do reaktorów. Zapisz czas wstrzyknięcia ze śladu CA. Wszystkie strzykawki i igły należy odpowiednio wyrzucić.
    5. Zmierzyć i zapisać 0 h pH próbek dla każdego reaktora.

5. Dzień 4: Zakończenie eksperymentu i pobranie próbki

  1. Przeprowadzić analizę elektrochemiczną 24 godziny po wstrzyknięciu DHNA i pobrać próbki końcowe.
    1. Zakończ przebieg CA 24 godziny po wstrzyknięciu DHNA.
    2. Pobrać próbki z 24-godzinnego punktu czasowego do analizy próbki zgodnie z krokiem 4.2.3.
    3. Uruchom ponownie CV dla 24-godzinnego punktu czasowego zgodnie z parametrami opisanymi w kroku 3.3.4.
    4. Zmierzyć i zapisać pH dla 24-godzinnych próbek z każdego reaktora.
  2. Zdemontuj i wyczyść reaktory.
    1. Wyłącz potencjostat. Następnie odłącz przewody robocze, licznik i odniesienie od każdego dławiki. Wytrzyj wilgoć z ołowianych zacisków krokodylkowych potencjostatu.
    2. Wyłącz dopływ azotu gazowego. Odłącz przewody gazowe, a następnie usuń igły doprowadzające i odpływowe. Wyrzuć wszystkie igły w odpowiedni sposób do pojemnika na ostre przedmioty.
    3. Wyłącz pompę wodną. Odłącz rurkę doprowadzającą i odpływową od pompy i pozwól, aby woda spłynęła do wiadra. Podczas odłączania należy trzymać końce przewodów uniesione powyżej przewodu wodnego w pompie, aby zapobiec wyciekaniu wody na podłogę. Jeden po drugim odłącz każdy reaktor od rurki z płaszczem wodnym, pracując od końcowego reaktora odpływowego do początkowego reaktora dopływowego.
    4. Opróżnij wszystkie media z reaktorów do dużego pojemnika na zagrożenie biologiczne. Postępuj zgodnie z normalnymi metodami wybielania kultur w celu usunięcia.
    5. Po opróżnieniu zdemontuj i wyczyść wszystkie elementy reaktora. Membrany kationitowe i krążki filcu węglowego należy wyrzucić do odpowiednich odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Oczyść elektrody referencyjne i druty tytanowe 70% etanolem i przechowuj oczyszczone elektrody referencyjne w zlewce płytko wypełnionej wodą. Delikatnie wyczyść butelki reaktora, nakrętki, O-ringi i zaciski w ciepłej wodzie z detergentem laboratoryjnym, dokładnie spłucz wodą DI i wysusz wszystkie części na powietrzu przed przechowywaniem.

6. Dzień 5: Analiza elektrochemiczna

UWAGA: Poniżej znajduje się ogólny opis wykresu danych dla tego protokołu. Bardziej szczegółowe opisy dotyczące analizy i interpretacji danych zostaną zamieszczone w sekcji Reprezentatywne wyniki.

  1. Dla analizy CA: Ustaw czas wstrzyknięcia DHNA jako punkt czasowy 0 h. Wykreślić średnią i odchylenie standardowe zmierzonej gęstości prądu (j w μA/cm2) mierzoną co 36 s dla wszystkich powtórzeń od punktu czasowego 0 h w funkcji czasu (h). Obliczyć gęstość prądu w funkcji powierzchni elektrody roboczej (16 cm2).
  2. Do analizy CV: Wykreślić reprezentatywny ślad CV dla każdego warunku doświadczalnego (tylko pożywka, DMSO lub DHNA) przedstawiający gęstość prądu (j w μA/cm2) w funkcji potencjału elektrody roboczej (EWE w V). Wykreśl drugi cykl wybranego przebiegu CV.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza chronoamperometryczna
EET L. plantarum można zaobserwować za pomocą danych chronoamperometrycznych (CA) przedstawionych na rysunku Rysunek 3, w którym ślad gęstości prądu wizualizuje transfer elektronów z L. plantarum do elektrody roboczej. Monitorowaliśmy gęstość prądu (j) w funkcji czasu przy zachowaniu stałego potencjału +200 mV w stosunku do Ag/AgCl przez 24 godziny. Po wstrzyknięciu 20 μg/ml DHNA do mieszającego roztworu elektrolitu zaobserwowano abiotyczny skok utleniania DHNA, po którym nastąpił gwałtowny wzrost gęstości prądu biotycznego, osiągając szczyt na poziomie 132,0 ± 2,47 μA/cm2 w przybliżeniu po 8 godzinach. I odwrotnie, wstrzyknięcie DMSO spowodowało znikomą gęstość prądu. Wyniki te podkreślają znaczenie DHNA jako niezbędnego i skutecznego mediatora ułatwiającego transfer elektronów między L. plantarum a elektrodą. Użytkownicy mogą regulować prąd wyjściowy, dostosowując stężenie DHNA w BES. Wcześniejsze badania wskazują również, że L. plantarum reaguje na DHNA w sposób zależny od dawki w szerokim zakresie stężeń DHNA, wytwarzając znaczny prąd w obecności stężeń DHNA tak niskich, jak 0,01 μg/mL13,22.

figure-results-1
Rysunek 3: Analiza chronoamperometryczna Lactiplantibacillus plantarum EET za pośrednictwem DHNA. DHNA (20 μg / ml) lub DMSO wstrzyknięto do elektrolitów mCDM (pH ~ 6,5) z czasem wstrzyknięcia określonym jako t = 0. j reprezentuje gęstość prądu w funkcji obszaru elektrody roboczej. Eksperymenty prowadzono przy napięciu 200 mV w porównaniu z Ag/AgCl za pomocą elektrody filcowej węglowej (16cm2) i mieszając. Wartości są wykreślane jako średnia ± sd uzyskana w potrójnych reaktorach BES. Skróty: EET = zewnątrzkomórkowy transfer elektronów; DHNA = kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy; DMSO = sultlenek dimetylu; mCDM = chemicznie zdefiniowane podłoże z mannitolem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Cykliczna analiza woltamperologiczna
Aby dokładniej ocenić EET za pośrednictwem DHNA w L. plantarum, przeprowadziliśmy cykliczną woltamperometrię 24 godziny po wstrzyknięciu DHNA. Tutaj pokazujemy ślady CV dla trzech stanów: L. plantarum z 20 μg/mL DHNA, L. plantarum z DMSO i pożywki z 20 μg/mL DHNA. Jak pokazano na Rysunek 4A, obecność 20 μg/mL DHNA w reaktorach zawierających L. plantarum powodowała wyraźny wzrost prądu utleniania przy 50 mV, który nie występował w obecności samego DMSO. Dane te potwierdzają, że dodanie mediatora redoks DHNA jest konieczne, aby ułatwić transfer elektronów między L. plantarum a anodą. Podczas gdy zaobserwowaliśmy różne mniejsze piki redoks w śladzie L. plantarum + DMSO, piki te były podobne do śladu kontrolnego pożywki i prawdopodobnie są przypisywane składnikom aktywnym redoks w mCDM (rysunek uzupełniający S1). W Rysunek 4B, porównaliśmy ślady DHNA w warunkach biotycznych (L. plantarum + DHNA) z DHNA w warunkach abiotycznych (Pożywka + DHNA). Podczas gdy oba ślady wykazywały wyraźny pik oksydacyjny DHNA około 50 mV, zaobserwowaliśmy trwały wzrost prądu powyżej 50 mV tylko w warunkach biotycznych. Pik katalityczny osiągnął gęstość prądu 129 μA/cm2 przy napięciu 300 mV, co stanowi wzrost o 256% w porównaniu ze śladem abiotycznym. Ten profil CV obrotu jest charakterystyczny dla mikrobiologicznej klasy EET27, wskazując na ponowną redukcję DHNA przez komórki L. plantarum w obecności źródła elektronów (mannitolu) po utlenieniu DHNA na anodzie. Dodatkowo ślad abiotyczny wykazywał nowe piki oksydacyjne w okolicach -240 mV i -180 mV. Wcześniejsze badania wskazują, że pojawienie się tych pików może być spowodowane degradacją DHNA do ACNQ (2-amino-3-karboksy-1,4-naftochinonu)21,28. Nie zaobserwowaliśmy tych pików w śladzie biotycznym, co wskazuje, że interakcja komórek L. plantarum z DHNA może stabilizować DHNA i zapobiegać degradacji. Należy zauważyć, że 24-godzinny ślad dla pożywek z 20 μg/ml DHNA przeprowadzono oddzielnie zgodnie z tym protokołem bez dodawania komórek.

figure-results-2
Rysunek 4: Reprezentatywne ślady woltamperometrii cyklicznej. Wszystkie eksperymenty CV przeprowadzono w mCDM przy użyciu filcu węglowego (16 cm2) jako elektrody roboczej z szybkością skanowania 2 mV/s podczas mieszania roztworu. (A) Ślady CV dla Lactiplantibacillus plantarum z DHNA (20 μg/ml) lub DMSO w t = 24 h. (B) ślady CV 20 μg/ml DHNA w L. plantarum (warunki biotyczne) lub tylko mCDM (warunki abiotyczne) w t = 24 h. Skróty: CV = woltamperometria cykliczna; mCDM = chemicznie zdefiniowane podłoże z mannitolem; DHNA = kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza pH
Aktywność EET u L. plantarum spowodowała znaczny spadek pH w ciągu 24 godzin. Jak pokazano na Rysunek 5, średnie pH próbki L. plantarum wystawionej na działanie DHNA spadło do 3,33 ± 0,01 (p = 6,85 × 10-6, n = 3), podczas gdy średnie pH próbki L. plantarum wystawionej na DMSO spadło do 6,50 ± 0,06 (p = 0,0409, n = 3). Jak wykazano we wcześniejszych badaniach, spadek ten przypisuje się wzrostowi metabolizmu fermentacyjnego, który występuje, gdy L. plantarum wykonuje EET13. L. plantarum normalnie metabolizuje mannitol poprzez glikolizę i szlaki fermentacyjne, które wytwarzają octan, mleczan i etanol jako produkty końcowej fermentacji i generują ATP poprzez fosforylację na poziomie substratu29. W warunkach EET zwiększa się przepływ metaboliczny przez fermentację, zwiększając w ten sposób produkcję produktów końcowej fermentacji w BES media13. Ta zmiana metaboliczna powoduje szybszy spadek pH pożywki w reaktorach z DHNA w porównaniu z reaktorami kontrolnymi DMSO.

figure-results-3
Rysunek 5: Analiza pH systemu bioelektrochemicznego Lactiplantibacillus plantarum. Próbki pobierano w czasie t = 0 i t = 24 h podczas chronoamperometrii. Wartości są wykreślane jako średnia ± sd uzyskana w potrójnych reaktorach BES. Istotność określono za pomocą jednostronnego testu t. DHNA: wartość P = 6,85 × 10-6. DMSO: wartość P = 0,0409. Skróty: DHNA = kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Składniki do przygotowania podłoża mMRS 24. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Składniki do przygotowania podłoża mCDM. Ta tabela została zaczerpnięta z Tejedor-Sanz et al.13 i Aumiller et al.25. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Składniki do przygotowania podłoża M9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Ustawienia parametrów EC-Lab dla technik OCV, CA i CV. Skróty: OCV = napięcie obwodu otwartego; CA = chronoamperometria; CV = woltamperometria cykliczna. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający S1: Reprezentatywne ślady cyklicznej woltamperometrii Lactiplantibacillus plantarum z samym DMSO i mCDM. Ślady CV dla L. plantarum z DMSO w t = 24 h i samym mCDM w t = 0 h. Wszystkie eksperymenty CV przeprowadzono przy użyciu filcu węglowego (16 cm2) jako elektrody roboczej z prędkością skanowania 2 mV/s podczas mieszania roztworu. Skróty: CV = woltamperometria cykliczna; mCDM = chemicznie zdefiniowane podłoże z mannitolem; DHNA = kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy; DMSO = dimetylosulfotlenek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego tutaj trójelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego, pokazaliśmy pomiar wytwarzania prądu z EET za pośrednictwem DHNA w L. plantarum. Te eksperymenty BES generują wysokiej jakości dane; jednak BES są wrażliwe. W związku z tym powodzenie protokołu zależy od precyzji użytkownika, szczególnie w zakresie montażu reaktora i elektrody referencyjnej, pozycjonowania igieł i elektrod w komorze anodowej oraz wymiany membrany kationowymiennej. Bardzo ważne jest, aby reaktory montować ostrożnie, upewniając się, że podczas autoklawowania lub eksperymentów nie dojdzie do wycieku wody/mediów. Wyciek wody można rozwiązać, upewniając się, że membrany kationitowe są przycięte tak, aby dokładnie pasowały do O-ringu i dokręcając zacisk zwrotnicy, aby dokręcił palec. Niezbędne jest również całkowite zanurzenie filcu węglowego w wodzie podczas autoklawowania, aby umożliwić mu uzyskanie hydrofilowości w celach eksperymentalnych. Zalecamy, aby nowi użytkownicy pozwolili, aby nowo zmontowane reaktory wypełnione wodą pozostały przez 2 godziny przed autoklawowaniem, sprawdzając, czy nie ma oznak powolnych wycieków poniżej głównych złączy butli. Co więcej, zapewnienie prawidłowego montażu elektrod referencyjnych gwarantuje spójną replikację danych między reaktorami. Jeśli fryta teflonowa wewnątrz szklanej obudowy zostanie odbarwiona, pęknięta lub wysuszona, może to spowodować wysoką rezystancję elektrody referencyjnej. Użytkownicy mogą wymienić szklaną obudowę, aby przywrócić wydajność elektrody referencyjnej.

Właściwa orientacja wszystkich igieł i elektrod w komorze anodowej podczas eksperymentowania ma kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Elektroda referencyjna nie może bezpośrednio stykać się z żadną częścią elektrody roboczej z filcu węglowego. Użytkownicy mogą regulować położenie filcu węglowego, delikatnie obracając drut tytanowy elektrody roboczej znad reaktora. Dodatkowo, umieszczenie igły do rozpylania azotu nie powinno mieć bezpośredniego kontaktu z elektrodami w komorze ani z żadnymi połączeniami elektroda/potencjostat nad komorą. Strumień azotu powinien być dostosowany tak, aby nie wpływał do żadnej elektrody. Na koniec użytkownicy powinni upewnić się, że mieszadło nie styka się z elektrodą roboczą, umieszczając elektrodę roboczą 1-2 cm nad mieszadłem. Jeśli w OCV zaobserwuje się nieregularny sygnał, można go zwykle rozwiązać, zapewniając prawidłowe rozmieszczenie elektrod i strumienia azotu w reaktorze oraz sprawdzając, czy połączenia między przewodami potencjostatu a elektrodami reaktora są prawidłowe i bezpieczne. Wreszcie, nasze doświadczenie pokazuje, że mediatory elektronów, takie jak DHNA, mogą być zatrzymywane w błonie kationowymiennej i powodować wysoki prąd tła, jeśli są ponownie używane zbyt wiele razy. Zalecamy wymianę membrany kationowymiennej po dwóch lub trzech użyciach, zwłaszcza w przypadku badania EET, w którym pośredniczy EET, aby zagwarantować wiarygodne wyniki eksperymentalne.

W przeciwieństwie do bezpośredniego EET, w którym bezpośrednie przyłączenie mikrobiologiczne do elektrody ułatwia przenoszenie elektronów, EET za pośrednictwem wymaga stałej dyfuzji wahadłowców elektronów przez błonę komórkową i elektrodę, co skutkuje unikalnymi ustawieniami BES opisanymi tutaj. Po pierwsze, wybraliśmy dwukomorowy BES zamiast jednokomorowego odpowiednika w naszym protokole, aby oddzielić reakcje anodowe i katodowe za pomocą membrany kationowymiennej. Ta separacja zapobiega swobodnej dyfuzji mediatorów elektronów (DHNA) i mikroorganizmom przed interakcją krzyżową z katodą, zapewniając, że mikrobiologiczny EET jest głównym źródłem elektronów do redukcji mediatorów elektronów i anody. Separacja umożliwia również precyzyjną kontrolę parametrów, takich jak stężenie/dystrybucja mediatora i potencjał przypadający na anodę. Dodatkowo wybraliśmy filc węglowy jako materiał anodowy spośród innych opcji, takich jak pręty grafitowe, elektrody metalowe, węgiel szklisty lub tlenek indu cyny (ITO). Dzieje się tak, ponieważ porowata struktura filcu węglowego 3D zapewnia znacznie większą powierzchnię niż te elektrody30, co pozwala na efektywne wykorzystanie mediatorów nawet przy wysokich stężeniach. Nasze trzyelektrodowe, dwukomorowe ustawienia BES zapewniają niezawodny i powtarzalny odczyt zapośredniczonego EET nawet w przypadku długotrwałego monitorowania; Jednak proces ten ma stosunkowo niską przepustowość. Protokół ten nadaje się do zrozumienia mechanizmów EET w skali laboratoryjnej lub do testowania prototypowych aplikacji EET. Alternatywne architektury BES, takie jak przenośne lub drukowane BESs31,32, komplementarne macierze półprzewodników z tlenku metalu (CMOS)33 lub ulepszone BESs34, mogą być rozważane przez badaczy do różnych celów podstawowych lub aplikacyjnych.

W protokole tym podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące najczęściej stosowanych technik elektrochemicznych: chronoamperometrii (CA) i woltamperometrii cyklicznej (CV). Warto zauważyć, że inne techniki elektrochemiczne, takie jak elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna (EIS) i woltamperometria impulsowa różnicowa (DPV), mogą zapewnić głębszy wgląd w BES poprzez analizę rezystancji przenoszenia ładunku i pojemności dwuwarstwowej 35,36,37. Chociaż ten protokół BES umożliwia pomiary EET, uzupełnienie danych elektrochemicznych o pomiary aktywności metabolicznej i biomasy komórek może być również niezbędne do kompleksowej analizy. Drobnoustroje, takie jak L. plantarum, angażują EET jako jeden z pochłaniaczy elektronów wraz z innymi produktami ubocznymi fermentacji, takimi jak mleczan i etanol. Ponadto warto zauważyć, że wzrost biomasy komórkowej służy również jako pochłaniacz elektronów13. Dlatego kwantyfikacja zużytych donorów elektronów (np. mannitolu), ocena wzrostu biomasy komórkowej i monitorowanie produktów ubocznych fermentacji zapewnia głębszy wgląd w wydajność i fizjologiczne konsekwencje EET. Metabolity komórkowe są zwykle oznaczane ilościowo za pomocą chromatografii i testów enzymatycznych, podczas gdy żywotność i wzrost komórek ocenia się, licząc jednostki tworzące kolonie i mierząc gęstość optyczną zużytych pożywek przy odpowiednio 600 nm13. Należy również zauważyć, że pomiary EET są wrażliwe na niewielkie zakłócenia w warunkach eksperymentalnych. Obejmuje to między innymi pH, temperaturę, prędkość mieszania i szybkość rozpryskiwania azotu38. Dlatego normalizacja mierzonych poziomów EET za pomocą pomiarów bioanalitycznych działa jak kontrola wewnętrzna, ułatwiając spójną ocenę w eksperymentach przeprowadzanych w różnych dniach.

Łącząc techniki elektrochemiczne z innymi pomiarami bioanalitycznymi, EET za pośrednictwem tej metody stwarza nowe możliwości dla elektrofermentacji i bioelektrokatalizy. Konwencjonalne stosowanie elektrokatalizatorów organicznych, nieorganicznych lub enzymatycznych stanowi wyzwanie ze względu na ich wysoki koszt i podatność na degradację. Alternatywnie, wykorzystanie mikroorganizmów jako żywych elektrokatalizatorów oferuje tańsze i bardziej skalowalne rozwiązanie ze względu na zdolność drobnoustrojów do samonaprawy i samoreplikacji39. L. plantarum, powszechnie uznawana za bezpieczną bakterię kwasu mlekowego, jest szczególnie intrygującym podwoziem. Korzystając z identycznych konfiguracji elektrochemicznych opisanych w tym protokole, wykazaliśmy wcześniej, że L. plantarum może fermentować sok z jarmużu w warunkach EET i przyspieszać przepływ metaboliczny w kierunku wytwarzania większej ilości produktów końcowych fermentacji, takich jak mleczan, octan i bursztynian13; Te kwasy organiczne są niezbędnymi związkami smakowymi w fermentacji żywności. Oznacza to, że przy użyciu technik elektrochemicznych EET za pośrednictwem L. plantarum może zostać potencjalnie przejęty w celu manipulowania strumieniem metabolicznym, zmiany smaków żywności lub wytwarzania cennych substancji chemicznych. Warto zauważyć, że techniki elektrochemiczne przedstawione w tym protokole mogą być stosowane nie tylko do L. plantarum, ale mogą być również ogólnie stosowane do innych rodzimych lub zmodyfikowanych drobnoustrojów, które wykonują EETza pośrednictwem 40,41. Różne mediatory elektronów, takie jak flawina, ferrocen, czerwień obojętna, żelazocyjanek, lawson i menadion, można wybrać na podstawie mechanizmu przenoszenia elektronów określonego drobnoustroju, który jest używany 22,42. Co więcej, protokół BES ustanowiony w tej pracy może zostać rozszerzony na egzoelektrogeny, które wykonują EET bez mediatora, jak wcześniej wykazano w przypadku gatunków Shewanella i Geobacter 43,44. Należy zastosować zoptymalizowaną pożywkę wzrostową, aby wspomóc aktywność komórkową danego drobnoustroju, aby ułatwić jego działanie EET. Protokół ten dostraja parametry EET za pośrednictwem DHNA w L. plantarum, ale oczekuje się modyfikacji, gdy stosuje się różne mikroorganizmy i mediatory elektronów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Ajo-Franklin za wnikliwe dyskusje na temat montażu, konserwacji, krytycznych kroków i rozwiązywania problemów z BES. Badania były sponsorowane przez Wojskowe Biuro Badawcze i zostały zrealizowane w ramach grantu o numerze W911NF-22-1-0239 (dla C. M. A-F, wspierającego R. A.) oraz przez Cancer Prevention and Research Institute of Texas, grant # RR190063 (dla C. M. A-F, wspierającego R. C., S. L. i B. B. K.). Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 1,4-dihydroksy-2-naftoesowy (DHNA)Sigma-Aldrich281255-25G
Drut tytanowy o średnicy 1,0 mmThermo Fisher Scientific045485.BYPrzycięty na wymiar do elektrod roboczych i przeciwelektrod
120-C Arkusze tlenku glinu 9 "x 11"Johnson Abrasives10108-15
3 ml plastikowe strzykawkiThermo Fisher Scientific14955457
Roztwór 3M KCl nasycony chlorkiem srebraMillipore Sigma60137-250ML
Filc węglowy o grubości 6,35 mmThermo Fisher Scientific043200.RFPocięty na 16 cm2 krążki
Ag/AgCl Elektroda referencyjna CHInstrumentsCH111
Igły podskórne Air-Tite PremiumThermo Fisher Scientific14-817-102
AlK(SO)4 * 12H2OSigma-Aldrich237086-100G
Cytrynian amonu trójzasadowyMillipore SigmaA1332
Avanti J-15R WirówkaBeckman CoulterB99517
BD Precyzyjna igła ślizgowa, 18 G x 1 calThermo Fisher Scientific14-826-5G
BD Precyzyjna igła ślizgowa, 21 G x 2 caleThermo Fisher Scientific14-821-13N
Bel-Art SP Scienceware Cleanware Aqua-Clear Water CondtionerThermo Fisher Scientific23-278339
BiotynaMillipore SigmaB4639
CaCl2Millipore SigmaC4901
D-(+)-pantotenian wapniaMillipore Sigma1087009
CasaminokwasyMillipore Sigma2240-OP
membrana kationowymiennaMembrany InternationalCMI-7000Pocięte w krążki pasujące do O-ringu BES
CoCl2 * 6H2OMillipore SigmaC8661
CuSO4 * 5H2OMillipore SigmaC8027
Cysteina-HCl * H2OMillipore Sigma30129
DMSOMillipore Sigma5439001000
DS-11+ SpektrofotometrDenovixN/A
EC-LAB SoftwareBioLogicN/A
ECO E 4 S cyrkulator grzewczyLauda-BrinkmannNr kat. Nr 115 V; 60 Hz : L001191
FeSO4 * 7H2OMillipore Sigma215422
Kwas foliowyMillipore SigmaF8758
H3BO3Millipore SigmaB6768
Strzykawki insulinowe z igłą BD Micro-Fine IVThermo Fisher Scientific14-829-1A
Lactiplantibacillus plantarum NCIMB8826N/AN/AIndeks: Tejedor-Sanz et al., 2022
Lactobacillus MRS BulionHiMediaM369
M9 RosółMilliport Sigma63011
Siarczan magnezu bezwodnyMillipore Sigma208094
Siarczan manganu jednowodnyMillipore Sigma221287
mannitolMillipore SigmaM1902-1KG
Mettler Toledo FiveEasy Laboratoryjny pH-metrHogentoglerF20-KIT
MgCl2 * 6H2OMillipore SigmaM9272
MgSO4 * 7H2OMillipore SigmaM2773
Millex - GV 0.22 & Mikro; m Filtr membranowy PVDFMillipore SigmaSLGV004SL
MnCl2 * 4H2OMillipore Sigma203734
MnSO4 * H2OMillipore Sigma221287
MOPSMillipore SigmaM1442
N2gaz AirgasFiltr NI UHP300przed użyciem
Na2MoO4 * 2H2OMillipore Sigma331058
Na2SO4Millipore Sigma238597
NaClMillipore SigmaS9888
NH4ClMillipore SigmaA9434
Kwas nikotynowyMillipore SigmaN-0761
Kwas nitrylotrioctowy (NTA)Kwas nitrolotrioctowyMillipore Sigma72560
Kwas p-aminobenzoesowyMillipore SigmaP9879
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 10x roztwórThermo Fisher ScientificBP399-1
Fosforan potasu dwuzasadowyMillipore SigmaP8281
potencjostatBioLogicVMP-300
Pepton proteazy #3Bacto211693
Pirydoksyna HClMilipor SigmaP6280
RyboflawinaMilipor Sigma555682
Platforma mieszadła magnetycznego RO10IKA3691000
Octan sodu trójwodnyMillipore Sigma935700
Baton mieszający w kształcie jajkaThermo Fisher Scientific14-512-121Miejsce w komorze anodowej BES
Tiamine HClMillipore SigmaV-014
Kwas tioktowy (kwas &alfa;-liponowy)Millipore SigmaT-1395
TryptofanMillipore Sigma9136
Tween80Millipore SigmaP4780
Witamina B12Millipore SigmaV6629
Zestaw MCF z płaszczem, 100 ml, NW25, 2 x GL14 portAdams & Chittenden Scientific GlassNADostosowany
ekstrakt drożdżowyMillipore SigmaY1625
ZnSO4 * 7H2OMillipore SigmaZ0251

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. TerAvest, M. A., Ajo-Franklin, C. M. Transforming exoelectrogens for biotechnology using synthetic biology. Biotechnol Bioeng. 113 (4), 687-697 (2016).
  2. Chen, H., Dong, F., Minteer, S. D. The progress and outlook of bioelectrocatalysis for the production of chemicals, fuels and materials. Nat Catal. 3 (3), 225-244 (2020).
  3. Chen, H., et al. Fundamentals, applications, and future directions of bioelectrocatalysis. Chem Rev. 120 (23), 12903-12993 (2020).
  4. Lovley, D. R., Phillips, E. J. P. Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese. Appl Environ Microbiol. 54 (6), 1472-1480 (1988).
  5. Myers, C. R., Nealson, K. H. Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor. Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).
  6. Koch, C., Harnisch, F. Is there a specific ecological niche for electroactive Microorganisms. ChemElectroChem. 3 (9), 1282-1295 (2016).
  7. Zhao, J., et al. Microbial extracellular electron transfer and strategies for engineering electroactive microorganisms. Biotechnol Adv. 53, 107682(2021).
  8. Zhang, J., Li, F., Liu, D., Liu, Q., Song, H. Engineering extracellular electron transfer pathways of electroactive microorganisms by synthetic biology for energy and chemicals production. Chem Soc Rev. 53 (3), 1375-1446 (2024).
  9. Logan, B. E. Exoelectrogenic bacteria that power microbial fuel cells. Nat Rev Microbiol. 7 (5), 375-381 (2009).
  10. Logan, B. E., Rabaey, K. Conversion of wastes into bioelectricity and chemicals by using microbial electrochemical technologies. Science. 337 (6095), 686-690 (2012).
  11. Gu, L., Xiao, X., Yup Lee, S., Lai, B., Solem, C. Superior anodic electro-fermentation by enhancing capacity for extracellular electron transfer. Bioresour Technol. 389, 129813(2023).
  12. Boucher, D. G., et al. Bioelectrocatalytic synthesis: concepts and applications. Angew Chem Int Ed. 62 (46), e202307780(2023).
  13. Tejedor-Sanz, S., et al. Extracellular electron transfer increases fermentation in lactic acid bacteria via a hybrid metabolism. eLife. 11, e70684(2022).
  14. Martino, M. E., et al. Nomadic lifestyle of Lactobacillus plantarum revealed by comparative genomics of 54 strains isolated from different habitats. Environ Microbiol. 18 (12), 4974-4989 (2016).
  15. Fidanza, M., Panigrahi, P., Kollmann, T. R. Lactiplantibacillus plantarum-nomad and ideal probiotic. Front Microbiol. 12, 712236(2021).
  16. Duar, R. M., et al. Lifestyles in transition: evolution and natural history of the genus Lactobacillus. FEMS Microbiol Rev. 41 (Suppl_1), S27-S48 (2017).
  17. Kaushik, J. K., et al. Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum. PLOS ONE. 4 (12), e8099(2009).
  18. Seddik, H. A., et al. Lactobacillus plantarum and its probiotic and food potentialities. Probiotics Antimicrob Proteins. 9 (2), 111-122 (2017).
  19. Siezen, R. J., et al. Phenotypic and genomic diversity of Lactobacillus plantarum strains isolated from various environmental niches. Environ Microbiol. 12 (3), 758-773 (2010).
  20. Light, S. H., et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature. 562 (7725), 140-144 (2018).
  21. Tolar, J. G., Li, S., Ajo-Franklin, C. M. The differing roles of flavins and quinones in extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Appl Environ Microbiol. 89 (1), e0131322(2023).
  22. Li, S., De Groote Tavares, C., Tolar, J. G., Ajo-Franklin, C. M. Selective bioelectronic sensing of pharmacologically relevant quinones using extracellular electron transfer in Lactiplantibacillus plantarum. Biosens Bioelectron. 243, 115762(2024).
  23. Blackburn, B., Alba, R., Hatch, A., Ajo-Franklin, C. M., Mevers, E. Understanding the Chemical Properties that Drive Extracellular Electron Shuttles. ChemRxiv. , (2024).
  24. De Man, J. C., Rogosa, M., Sharpe, M. E. A medium for the cultivation of Lactobacilli. J Appl Bacteriol. 23 (1), 130-135 (1960).
  25. Aumiller, K., et al. A chemically-defined growth medium to support Lactobacillus-Acetobacter sp. community analysis. PLOS ONE. 18 (10), e0292585(2023).
  26. Brooijmans, R. J. W., de Vos, W. M., Hugenholtz, J. Lactobacillus plantarum WCFS1 electron transport chains. Appl Environ Microbiol. 75 (11), 3580-3585 (2009).
  27. LaBelle, E., Bond, D. R. Cyclic voltammetry for the study of microbial electron transfer at electrodes. Bio-electrochemical systems: from extracellular electron transfer to biotechnological application. , (2009).
  28. Mevers, E., et al. An elusive electron shuttle from a facultative anaerobe. eLife. 8, e48054(2019).
  29. Dirar, H., Collins, E. B. End-products, Fermentation balances and molar growth yields of homofermentative Lactobacilli. Microbiology. 73 (2), 233-238 (1972).
  30. Huong Le, T. X., Bechelany, M., Cretin, M. Carbon felt based-electrodes for energy and environmental applications: A review. Carbon. 122, 564-591 (2017).
  31. Zhou, A. Y., Baruch, M., Ajo-Franklin, C. M., Maharbiz, M. M. A portable bioelectronic sensing system (BESSY) for environmental deployment incorporating differential microbial sensing in miniaturized reactors. PLOS ONE. 12 (9), e0184994(2017).
  32. Benjamin, S. R., de Lima, F., Nascimento, V. A. do, de Andrade, G. M., Oriá, R. B. Advancement in paper-based electrochemical biosensing and emerging diagnostic methods. Biosensors. 13 (7), 689(2023).
  33. Kumashi, S. R., et al. A CMOS multi-modal electrochemical and impedance cellular sensing array for massively paralleled exoelectrogen screening. IEEE Trans Biomed Circuits Syst. 15 (2), 221-234 (2021).
  34. Jadhav, D. A., et al. Scale-up of the bioelectrochemical system: Strategic perspectives and normalization of performance indices. Bioresour Technol. 363, 127935(2022).
  35. Kim, J., Cestellos-Blanco, S., Shen, Y., Cai, R., Yang, P. Enhancing biohybrid CO2 to multicarbon reduction via adapted whole-cell catalysts. Nano Lett. 22 (13), 5503-5509 (2022).
  36. He, Z., Mansfeld, F. Exploring the use of electrochemical impedance spectroscopy (EIS) in microbial fuel cell studies. Energy Environ Sci. 2 (2), 215-219 (2009).
  37. Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (19), 7856-7861 (2013).
  38. Zhang, X., Li, X., Zhao, X., Li, Y. Factors affecting the efficiency of a bioelectrochemical system: a review. RSC Adv. 9 (34), 19748-19761 (2019).
  39. Kornienko, N., Zhang, J. Z., Sakimoto, K. K., Yang, P., Reisner, E. Interfacing nature's catalytic machinery with synthetic materials for semi-artificial photosynthesis. Nat Nanotechnol. 13 (10), 890-899 (2018).
  40. Glasser, N. R., Saunders, S. H., Newman, D. K. The colorful world of extracellular electron shuttles. Annu Rev Microbiol. 71 (1), 731-751 (2017).
  41. Gemünde, A., Lai, B., Pause, L., Krömer, J., Holtmann, D. Redox mediators in microbial electrochemical systems. ChemElectroChem. 9 (13), e202200216(2022).
  42. Kundu, B. B., et al. Extracellular respiration is a latent energy metabolism in Escherichia coli. bioRxiv. , (2024).
  43. O'Brien, J. P., Malvankar, N. S. A simple and low-cost procedure for growing Geobacter sulfurreducens cell cultures and biofilms in bioelectrochemical systems. Curr Protoc Microbiol. 43 (1), A.4K.1-A.4K.27 (2016).
  44. Su, L., Fukushima, T., Ajo-Franklin, C. M. A hybrid cyt c maturation system enhances the bioelectrical performance of engineered Escherichia coli by improving the rate-limiting step. Biosens Bioelectron. 165, 112312(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular Electron TransferLactic Acid BacteriaBioelectrochemical SystemThree Electrode SystemMediated Electron TransferCyclic VoltammetryChronoamperometry TechniqueDHNA MediatorLactiplantibacillus PlantarumElectro Fermentation

Powiązane artykuły