Pokazujemy sprawdzoną metodę bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami zebranymi na polu. Metoda ta umożliwia szybką manipulację, identyfikację, pobieranie próbek genetycznych i potwierdzanie interakcji między roślinami a owadami za pomocą pyłku pobranego podczas pobierania próbek. Podejście to, łatwe do adaptacji, oferuje opłacalny, nieśmiercionośny sposób badania rzadkich grup owadów.
Artykuł metodologiczny
Szybka metoda ograniczania i bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami w terenie
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poprawa zrozumienia podstawowej biologii i ekologii wielu owadów zapylających, szczególnie specjalistycznych lub rzadkich taksonów, jest priorytetem dla wielu badaczy. W związku z tym często zachodzi potrzeba tymczasowego zamknięcia organizmów zebranych w terenie w sposób nieszkodliwy w celu uzyskania informacji lub wsparcia dodatkowych badań. Protokół ten stanowi dokładnie przetestowaną, szybką i niedrogą metodę terenową do bezpiecznego obchodzenia się z pszczołami budzącymi obawy o ochronę, którą można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb projektu, w tym identyfikacji organizmów, usuwania pyłku, znakowania i/lub pobierania nieśmiercionośnych próbek tkanek do analizy genetycznej. Metodologia ta może służyć jako dodatkowa opcja w zestawie narzędzi badacza do wykorzystania, gdy pojawią się pewne scenariusze. Przewiduje się, że metodologia ta może zostać zaadaptowana do stosowania w odniesieniu do innych gatunków owadów, jak również przez osoby o różnym doświadczeniu i poziomie umiejętności. Może to być bardzo cenne dla naukowców zajmujących się pszczołami wyspecjalizowanymi lub prowadzących badania specyficzne dla żywiciela. Gromadzenie danych, które jest możliwe dzięki temu protokołowi, będzie nieocenione, aby pomóc naukowcom w wypełnieniu krytycznych luk w danych dotyczących wielu gatunków owadów zapylających, struktur sieci roślin-zapylacze oraz inicjatyw w zakresie ochrony i zarządzania zapylaczami.
Wprowadzenie
Rosnąca liczba dowodów potwierdza spadek populacji dzikich pszczół i innych owadów zapylających oraz towarzyszące temu zmiany w społeczności zapylaczy1,2,3,4. Ciągłe straty zagrażają samej usłudze zapylania przez owady, która jest niezbędna do utrzymania różnorodności biologicznej, funkcjonowania ekosystemów i produkcji rolnej5. Co więcej, w przypadku wielu dzikich pszczół, zwłaszcza rzadkich gatunków, istnieją znaczne luki w wiedzy, które mogą utrudniać odpowiednie działania w zakresie zarządzania i ochrony6,7.
Aby pomóc w rozwiązaniu tych braków w danych, naukowcy opracowali różne metody badania owadów zapylających, związanego z tym wykorzystania siedlisk i ich preferencji kwiatowych. Podczas gdy pułapki patelniowe, pułapki niebieskołopatkowe, pułapki na złe samopoczucie, pułapki wyłaniające się i bezpośrednie zbieranie za pomocą siatki ręcznej są powszechnie stosowane, wiele z tych metod ma poważne wady8,9,10,11. Powszechnie stosowane metody identyfikacji zapylacza mogą prowadzić do śmiertelności organizmu, niezależnie od tego, czy próbka musi zostać zidentyfikowana w warunkach laboratoryjnych (np. przy użyciu mikroskopu). Śmiertelność może być uzasadniona i konieczna w wielu badaniach nad owadami. Jednak podczas pracy z zagrożonymi, rzadkimi lub niedostatecznie zbadanymi owadami, których status populacji jest ograniczony lub niepewny, naukowcy muszą złagodzić śmiertelność organizmów, obrażenia lub stres, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo negatywnego wpływu na te populacje owadów. W związku z tym podczas pracy z gatunkami zagrożonymi lub gatunkami, które można łatwo zidentyfikować na podstawie ich kluczowych cech wyróżniających, należy w miarę możliwości stosować mniej destrukcyjne podejścia do pobierania próbek.
Metody nieśmiercionośne, które zostały zaproponowane do pobierania materiału genetycznego od pszczół, obejmują zbieranie kału, exuviae12, oraz końcówki skrzydeł13. Jednak zastosowanie tych metod na pszczołach zebranych na polu może być niemożliwe do utrzymania ze względu na wymagany czas i/lub potencjalny wpływ na skrzydła, negatywnie wpływając na lot i inne zachowania. Wykazano, że częściowe usunięcie czułków nie zagraża przeżywalności pszczół euglossine14. Podobnie, pobranie próbek z końcowej części stępu środkowej części nogi nie zmniejszyło znacząco przeżywalności robotnic Bombus terrestris15. Dodatkowa nieśmiertelna metoda pobierania próbek polega na zbieraniu resztek białka poprzez tymczasowe zanurzenie pszczół w roztworze buforowym, a następnie ich uwolnienie16. Analiza przeżywalności wykazała, że nie ma istotnych różnic między pszczołami płukanymi buforem i niepłukanymi. Każda technika ma swoje ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę przy rozwiązywaniu konkretnych pytań badawczych i ogólnych celach projektu.
Dokładna identyfikacja taksonomiczna organizmów jest kluczowa dla efektywnych badań. W przypadku wielu taksonów owadów zapylających jest to jednak niezwykle zależne od gatunku będącego przedmiotem zainteresowania oraz poziomu wiedzy i doświadczenia badacza lub obserwatora. Chociaż w terenie można zidentyfikować wiele gatunków pszczół, posiadanie dowodów na poparcie obserwacji może mieć kluczowe znaczenie. Podczas gdy większość badań nad zapylaczami zazwyczaj zbiera i zachowuje osobniki jako dowód, wykorzystanie zdjęć i filmów, a także trójwymiarowego filmowania za pomocą rzeczywistości wirtualnej może być wykorzystane jako proxy do rozróżnienia niektórych gatunków bez poświęcania obserwowanych osobników17. Różnicowanie między niektórymi gatunkami może wymagać szczególnej uwagi i fotografii określonych cech morfologicznych; W takich sytuacjach organizmy muszą być w stanie manipulować i być ograniczone do unikalnej pozycji, tak aby złożone cechy wyróżniające mogły być wiarygodnie sfotografowane.
Tymczasowe ograniczenie pszczół w celu identyfikacji można przeprowadzić na kilka sposobów, w tym poprzez chłodzenie próbki i/lub używanie dwutlenku węgla do spowolnienia pszczół18,19. Jednak metody te mogą zmienić zachowanie, powodując, że leczone pszczoły wolniej odzyskują aktywność, co może wpływać na żerowanie, sprawność organizmu lub zwiększać ryzyko drapieżnictwa20,21,22. Ponadto takie techniki ostatecznie wydłużają czas, w którym organizmy są trzymane w zamknięciu i obchodzeniu się z nimi. To z kolei zwiększa stres organizmu i czas przetwarzania w terenie. W związku z tym wysoce pożądane byłyby bezpieczniejsze i skuteczniejsze metodyki.
W wielu badaniach wykorzystano pyłek zebrany od pszczół lub z innych źródeł, aby lepiej zrozumieć preferencje żywieniowe, zbudować sieci interakcji roślina-zapylacz, zidentyfikować zanieczyszczenie środowiska (np. pozostałości pestycydów) i ocenić ekologię żywieniową23,24,25,26,27,28,29. Wiele pszczół czyści się sama, gdy są zamknięte w pojemniku. W związku z tym zastosowano nieśmiercionośne metody pobierania próbek pyłku30 (np. probówki do mikrowirówek). Jednak w przypadkach, gdy samodzielna pielęgnacja nie ma miejsca, użycie bardziej dotykowego pojemnika, takiego jak zamykane plastikowe torby używane w tym protokole, pozwala na delikatne wywieranie nacisku na określone części ciała, tak aby pyłek zetknął się z plastikową torbą, co prowadzi do większego prawdopodobieństwa uzyskania próbki pyłku niż użycie tradycyjnych twardych pojemników.
Tutaj prezentujemy protokół, który został dobrze przetestowany na trzech zagrożonych taksonach pszczół. Choć pracochłonna, pozwala na kompleksowe zbieranie danych od owadów zapylających, jednocześnie minimalizując zagrożenie śmiertelnością poszczególnych organizmów. Ogólnym celem stosowania tej metodologii jest zapewnienie bezpiecznych i skutecznych środków chwytania, identyfikacji i bezpiecznego uwalniania owadów. Dodatkową zaletą tego protokołu jest to, że pokonuje on wiele ograniczeń tradycyjnego zbierania owadów. Zapewnia łatwy sposób znakowania osobników, zbierania nieśmiercionośnego materiału genetycznego i pobierania próbek pyłku, a wszystko to przy jednoczesnym zminimalizowaniu czasu obsługi i stresu dla organizmu. Podczas gdy tradycyjne metody zbierania owadów mają wiele zalet31, aby pomóc przezwyciężyć niektóre z ich ograniczeń, opracowaliśmy alternatywę, dzięki której owady mogą być zamknięte w celu identyfikacji przed szybkim i bezpiecznym uwolnieniem. W zależności od celów projektu można również podjąć dodatkowe kroki, gdy pszczoła jest ograniczona do zbierania innych ważnych danych.
Protokół
1. Przygotowanie kolekcji polowej
- Potwierdź cele projektu (np. identyfikacja organizmu, pobranie próbek tkanek genetycznych itp.).
- Przejrzyj tabelę materiałów i zbierz wszystkie istotne elementy specyficzne dla celów projektu.
- Upewnij się, że wszystkie urządzenia cyfrowe (np. smartfon, aparat fotograficzny, ręczny globalny system pozycjonowania [GPS]) są w pełni naładowane, a zapasowe baterie są naładowane i zapakowane.
2. Chwytanie i zabezpieczanie organizmu
- Zapisz interesujące Cię parametry terenu po przybyciu na pole, w tym datę, godzinę rozpoczęcia, miejsce/lokalizację pola i wszelkie inne istotne informacje (np. warunki pogodowe, dominujące rośliny okrywowe, rośliny kwitnące itp.), które mogą być potrzebne (Rysunek 1).
- Schwytaj pojedynczą pszczołę, która Cię interesuje, używając odpowiedniej techniki siatkowania. Stosować siatkę ręczną za pomocą siatki przeciw owadom lub siatki zamiatającej w zależności od gatunku głównego.
UWAGA: Inne techniki chwytania, takie jak zbieranie za pomocą fiolki/probówki wirówkowej, mogą być również stosowane do chwytania owadów. - Obserwuj wzrokowo okaz przez torbę siatkową, aby określić, czy przypomina takson będący przedmiotem zainteresowania. Jeśli nie, bezpiecznie wypuść próbkę i kontynuuj badanie.
- Jeżeli próbka wydaje się być gatunkiem centralnym, należy ją zabezpieczyć w worku siatkowym w taki sposób, aby nie mogła się wydostać (np. poprzez nałożenie górnej części worka siatkowego na ramę, skręcenie/ograniczenie szyjki worka siatkowego lub w inny sposób zamknięcie wszelkich potencjalnych wyjść).
- Zebrać zamykaną torebkę na próbkę i otworzyć ją otwarć.
- Upewnij się, że interesująca pszczoła znajduje się w pobliżu końcówki worka siatkowego.
- Jedną ręką chwyć worek siatkowy znajdujący się bezpośrednio pod próbką. Trzymaj siatkową torbę tak, aby końcówka (w miejscu, w którym uwięziony jest owad) była skierowana do góry, a otwór siatki (tj. obręcz) zwisał poniżej.
UWAGA: Większość owadów jest fototroficzna i gdy są zamknięte, zazwyczaj latają/pełzają w kierunku światła. - Drugą ręką (tj. ręką, która nie trzyma worka siatkowego) poprowadź zamykaną torebkę na próbkę w otworze siatki i przez worek siatkowy, aż dojdziesz do ręki znajdującej się bezpośrednio pod próbką.
- Ostrożnie zwolnić uścisk dłoni, ograniczając próbkę na tyle, aby ręka trzymająca zamykaną torebkę na próbkę mogła przenieść się do zamkniętego obszaru wraz z próbką. Zwróć uwagę na lokalizację okazu w zamkniętym obszarze, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo użądlenia, uszkodzenia okazu i ucieczki.
- Manipuluj zamykaną torebką na próbki, aby otworzyła się wystarczająco szeroko, aby umożliwić wejście próbki owada. W tym celu należy docisnąć torbę po obu stronach uszczelki lub przekręcić torbę kciukiem i środkowym palcem poniżej uszczelki.
- Umieść zamykany otwór w woreczku na próbkę nad próbką i delikatnie wsuń owada do worka. Jak wspomniano wcześniej, ponieważ większość owadów jest fototroficzna, należy skierować rękę zawierającą zamykaną torebkę na próbkę w stronę słońca/nieba, ułatwiając w ten sposób przemieszczanie się próbki do torby.
- Gdy próbka znajdzie się w środku, mocno zamknij zamykaną torebkę na próbki.
- Wyjąć zamykaną torebkę na próbkę zawierającą próbkę z siatki przeciw owadom.
UWAGA: Ponieważ owady mogą szybko i śmiertelnie przegrzać się w szczelnie zamkniętych workach, trzymaj próbkę z dala od bezpośredniego nasłonecznienia, najlepiej w zacienionym miejscu lub izolowanym pojemniku do czasu przetworzenia i ogranicz czas przetwarzania.
3. Zidentyfikuj organizm
- Dokładnie przyjrzyj się okazowi, aby upewnić się, że jest to takson będący przedmiotem zainteresowania. Jeśli jest to inny gatunek, bezpiecznie go wypuść i kontynuuj badanie.
UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia próbki, nigdy nie wywieraj bezpośredniego nacisku na owada, gdy znajduje się on w torbie. Próbki można unieruchomić, wywierając delikatny nacisk na plastik lub rozciągając obwód worka, aby worek napinał się wokół próbki, ograniczając w ten sposób ruch. - Jeśli tożsamość gatunku można łatwo i dokładnie potwierdzić wizualnie, zrób voucher ze zdjęciem (Rysunek 2). Zapisz wszelkie dodatkowe niezbędne informacje o okazie (np. czas schwytania, konkretna lokalizacja GPS, odwiedzona roślina, unikalne oznaczenia, obserwacja wielkości lub ubarwienia, zachowanie przed schwytaniem itp.).
- Jeśli określone cechy fizyczne muszą zostać sprawdzone w celu potwierdzenia tożsamości, wykonaj szczegółowe zdjęcia makro, podkreślając te kluczowe cechy przez zamykaną torbę na próbki (Rysunek 2).
- Jeśli zdjęcia o jakości wystarczającej do rozpoznania cech nie są osiągalne przez worek na próbkę, należy wyeksponować część (części) ciała próbki będącą przedmiotem zainteresowania do dokładnej kontroli, przecinając jedną z dwóch nieuszczelnionych końcówek narożnych worka na próbkę (tj. rogi, które są ze sobą zszyte lub nie można ich ponownie zamknąć). Na przykład wytnij mały otwór, aby odsłonić tylko głowę, brzuch lub nogę (Rysunek 3A-C). W tym celu manipuluj próbką w taki sposób, aby interesująca ją część ciała przesuwała się najpierw w kierunku otworu w wycięciu/narożniku.
UWAGA: Rozmiar i położenie otworu wyciętego w torbie oraz orientacja owada mogą wymagać zmiany w celu uzyskania niezbędnego zdjęcia. - Po dokonaniu identyfikacji przejdź do odpowiednich sekcji, aby zapoznać się z kolejnymi i pożądanymi metodami. Patrz sekcja 4 dotycząca techniki usuwania segmentów anteny, sekcja 5 dotycząca znakowania owadów i/lub sekcja 6 dotycząca pobierania próbek pyłku.
4. Pobieranie nieśmiercionośnych próbek genetycznych z anten
- Za pomocą nożyczek przeciąć po przekątnej jeden z dwóch nieuszczelnionych narożników (tj. rogów, które są ze sobą zszyte lub nie można ich ponownie zamknąć) zamykanej torebki na próbki. Upewnij się, że wykonane cięcie jest minimalnie większe niż szerokość głowy pszczoły (Rysunek 4).
- Manipuluj próbką tak, aby poruszała się głową do przodu w kierunku otworu w wycięciu/narożniku.
UWAGA: Ten etap można dostosować do pobierania innych próbek tkanek do analizy genetycznej (np. całej nogi, części nogi). W związku z tym może zaistnieć potrzeba zmiany wielkości i położenia otworu wyciętego w torbie oraz orientacji owada w celu uzyskania niezbędnej próbki. - Gdy głowa pszczoły wystaje z torby, delikatnie dociśnij otaczający ją plastik, aby napiął się wokół owada, ograniczając ruch (Rysunek 3A).
- Jeśli otwór jest zbyt duży, przetocz worek na siebie, aby jeszcze bardziej ograniczyć otwór i zabezpieczyć próbkę. Jeśli nie masz pewności co do odpowiedniego rozmiaru otworu, wykonaj kroki 4.2 i 4.3 wewnątrz siatki przeciw owadom lub klatki lotu, aby upewnić się, że próbka nie wydostanie się całkowicie. Użyj dodatkowej torby, jeśli oryginalne cięcie narożne jest zbyt duże.
- Umieścić worek w taki sposób, aby głowa owada znajdowała się bezpośrednio nad pojemnikiem do pobierania (np. probówką do mikrowirówki/fiolką zawierającą roztwór buforowy/etanolem) i aby pojemnik na próbkę genetyczną był odpowiednio oznaczony unikalnym identyfikatorem próbki odpowiadającym wszystkim innym danym próbki (Rysunek 3D).
- Za pomocą czystych i wysterylizowanych nożyczek preparacyjnych odetnij część jednego segmentu anteny. Sprawdź wzrokowo pojemnik, aby upewnić się, że próbka znajduje się w pojemniku.
UWAGA: Podczas cięcia pomocna jest praca na czystym, wysterylizowanym, jasnym podłożu (np. Kimwipe). Gwarantuje to, że jeśli próbka nie wpadnie do pojemnika do pobierania próbek, można ją łatwo pobrać za pomocą kleszczy przy minimalnym ryzyku zanieczyszczenia. - Zabezpiecz pokrywę pojemnika do pobierania próbek tkanek i obróć pojemnik tak, aby próbka była zawieszona w roztworze (np. roztworze buforowym/etanolu).
- Umieść pojemnik do pobierania próbek tkanek (wraz z próbką czułkową) w bezpiecznym pojemniku, najlepiej w chłodnym, zacienionym miejscu, chronionym przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych i/lub ekstremalnymi temperaturami, takim jak chłodnica polowa.
- Bezpiecznie uwolnij próbkę w pobliżu pierwotnego miejsca schwytania.
UWAGA: Próbka może być również oznaczona (patrz sekcja 5) przed wypuszczeniem, aby łatwo zidentyfikować ją jako pobraną próbkę, jeśli zostanie zauważona/złapana.
5. Oznaczanie organizmu
- Umieść próbkę w zamykanej torbie na próbki, wytnij mały otwór w środku worka na próbki.
UWAGA: Ten otwór jest dodatkiem do otworu utworzonego w sekcji 4. Otwór nie powinien być większy niż powierzchnia klatki piersiowej owada. Pozycja, w której należy wyciąć otwór, może się różnić w zależności od wielkości owada i pożądanego obszaru znakowania. - Wywierając delikatny nacisk na plastik po obu stronach próbki, manewruj owadem tak, aby klatka piersiowa znajdowała się bezpośrednio pod otworem (tj. aby górna część klatki piersiowej była odsłonięta przez torbę). Kontynuuj z delikatnym naciskiem, aby upewnić się, że próbka pozostaje na miejscu (Rysunek 5A).
UWAGA: Inne obszary oznaczania mogą być lepsze dla niektórych owadów (Rysunek 5B). Niektórzy użytkownicy uważają, że bardziej pomocne jest powiększenie istniejącego otworu (z sekcji 4) i złapanie pszczoły, trzymając ją za klatkę piersiową, gdy się wyłania (Rysunek 5C). Takie podejście może zwiększyć szansę na użądlenie. Dodatkowo, urządzenia do znakowania królowej pszczół miodnych mogą być modyfikowane w celu ograniczenia i oznaczenia pszczół, jeśli użytkownik uzna to za łatwiejsze. Jednak ta metoda wymaga przeniesienia do innego urządzenia i może zanieczyścić próbki pyłku. - Za pomocą pisaka do znakowania farbą (lub innego materiału do znakowania uznanego za odpowiedni dla danego taksonu) należy oznaczyć okaz zgodnie z wcześniej ustaloną metodologią specyficzną dla danego projektu.
UWAGA: Metody oznaczania będą się różnić w zależności od celów i mogą być proste, wskazujące, że dana osoba została schwytana, lub złożone, pozwalające na identyfikację osób (np. za pomocą unikalnego kodowania kolorami lub wzorów) (Rysunek 5C). - Przytrzymaj próbkę na miejscu, aż nałożony znak będzie odpowiednio suchy.
- Sfotografuj oznaczoną osobę, aby potwierdzić unikalne ubarwienie i pozycję koloru.
UWAGA: Schwytane osoby można łatwo i szybko sfotografować bezpośrednio przez zamykaną torbę na próbki (Rysunek 5D). - Bezpiecznie uwolnij próbkę w pobliżu pierwotnego punktu schwytania.
6. Pobieranie próbek pyłku
- Umieść próbkę w zamykanej torbie na próbki, dokładnie sprawdź, czy nie ma na niej widocznych pyłków.
UWAGA: Ponieważ rodzaj i ilość pyłku są bardzo zróżnicowane, czasami pyłek nie jest widoczny na próbce gołym okiem. Jeśli poprzednie kroki zostały już wykonane, możliwe, że resztki pyłku z próbki znajdują się już w worku. - Jeśli na próbce widoczny jest pyłek, ogranicz ruch próbki, wywierając delikatny nacisk na plastik po obu jego stronach.
- Za pomocą palca delikatnie pocieraj lub dociskaj plastik do szczeciny lub części ciała zawierającej pyłek, aby ułatwić usunięcie pyłku.
- Jeśli pyłek nie jest widoczny na próbce, zmaksymalizuj kontakt między próbką a plastikiem, aby sprawdzić, czy z powłoki usunięto jakiekolwiek małe resztki pyłku.
- Jeśli to możliwe, upewnij się, że pyłek znajduje się w zamykanej torbie na próbkę (Rysunek 4).
- Bezpiecznie uwolnij próbkę w pobliżu pierwotnego punktu schwytania.
- Szczelnie zamknąć zamykaną torebkę na próbkę zawierającą próbkę pyłku.
UWAGA: Jeśli w zamykanej torbie na próbkę wycięto otwór, należy go umieścić w innej zamykanej torbie na próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia lub utraty pyłku. - Oznacz zamykaną torebkę na próbki niepowtarzalnym identyfikatorem próbki odpowiadającym poszczególnym owadom i innymi danymi (np. identyfikatorem gatunku owada, datą, lokalizacją, godziną, płcią, rejestrem odwiedzin kwiatów itp.).
- Zamykaną torebkę z próbką pyłku należy umieścić w bezpiecznym pojemniku, najlepiej w chłodniejszym miejscu, aby chronić ją przed bezpośrednim działaniem promieni słonecznych i/lub ekstremalnymi temperaturami.
UWAGA: W razie potrzeby należy postępować zgodnie z protokołami specyficznymi dla projektu dotyczącymi ochrony pyłku w terenie (np. analiza genetyczna, morfologia pyłku).
Wyniki
Niniejsza metodologia została zastosowana w przypadku trzech zagrożonych gatunków pszczół (Osmia calaminthae, Caupolicana floridana oraz C. electa) w południowo-wschodnich Stanach Zjednoczonych. Do tej pory bezpiecznie odłowiono i wypuszczono setki pszczół i os. Żadna z pszczół nie zginęła podczas stosowania tej metodologii; osobniki wyznaczone jako okazy voucherowe i zachowane jako zapisy nowej lokalizacji w odpowiedniej agencji zarządzającej zostały poddane odpowiedniej eutanazji po zebraniu danych. Tabela 1 przedstawia różne oceniane cechy morfologiczne, a także inne mierzalne dane, które można zebrać zgodnie z tym protokołem14,32,33,34,35,36.
Rycina 1: Przykładowy arkusz danych przedstawiający informacje, które mogą być gromadzone w terenie. Zakres gromadzonych danych będzie różnić się w zależności od celów projektu. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 2: Zdjęcia służące jako dowody występowania. Wykonywanie zdjęć służących jako dowody (vouchery) potwierdzające występowanie gatunku jest niezbędne do celów sprawozdawczych. Zdjęcia charakterystycznych cech rozpoznawczych są konieczne, gdy wiele gatunków posiada podobne właściwości. Ten okaz Anthidium maculifrons znaleziony na Florydzie może zostać odróżniony od innych przedstawicieli rodzaju na podstawie żółtego zabarwienia czułkostrzały i głowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wykonanie otworu w strunowym worku na próbki. Położenie otworu w strunowym worku na próbki można zmieniać, aby odsłonić konkretne części ciała interesujące badacza w celu wykonania zdjęć lub pobrania próbek genetycznych. Na tym zdjęciu kompozytowym odsłonięto do fotografii (A) głowę pszczoły, (B) odwłok oraz (C) odnóże. Gdy pszczoła jest uwięziona i nie może się poruszać, często pozostaje w spoczynku, co pozwala na ustawienie jej do wykonania makrofotografii. (D) W tych pozycjach można również pobrać próbkę genetyczną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Torebka zbiorcza z pszczołą, z jednym narożnikiem przeciętym po przekątnej. W przypadku chęci dokładnej obserwacji głowy pszczoły, wielkość nacięcia w narożniku torebki powinna być dostosowana do rozmiaru głowy owada. W torebce mogą znajdować się pyłek, a nawet wydzieliny nektarowe, które mogą posłużyć do późniejszej identyfikacji pyłku. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Zdjęcia strunowej torby na próbki z pszczołami.Aby uniknąć użądlenia podczas znakowania pszczoły, w torbie można wykonać otwór, a następnie ustawić (A) tułów pod tym otworem. (B) W zależności od wielkości pszczoły, można ją również znakować na odwłoku. (C) Alternatywnie pszczołę można wypuścić przez otwór w narożniku i przycisnąć w okolicy tułowia w celu oznakowania. Technika ta może zwiększyć ryzyko użądlenia, ale wydaje się minimalizować rozmazywanie tuszu. Do rozróżniania osobników można zastosować unikalne kolorowanie lub numerację. (D) Ponownie odłowione okazy można szybko i łatwo sfotografować przez strunową torbę na próbki, a następnie wypuścić. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Tabela 1: Cechy morfologiczne oceniane zgodnie z tym protokołem. Próbki można również poddać analizie w celu zaobserwowania i udokumentowania licznych cech niewymienionych w tej tabeli (np. kształtu tergitów/sternitów, całkowitej długości, masy, liczby zębów, użylenia skrzydeł, odległości międzytegułarnej itp.). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Protokół ten określa polową metodę bezpiecznego obchodzenia się z rzadkimi pszczołami i ich kontroli, a jej ostatecznym celem jest uzyskanie pożądanych informacji o próbce nieśmiertelnej lub kuponie oraz bezpieczne wypuszczenie osobników ogniskowych z powrotem na wolność w pierwotnym miejscu schwytania. Zaletą tego protokołu w porównaniu z innymi metodami pobierania, takimi jak użycie fiolek, jest to, że próbka może być bezpiecznie zamknięta, aby umożliwić dokładne zbadanie kluczowych cech i pewną identyfikację, ograniczając szkody zarówno dla owada, jak i badacza. I odwrotnie, podobnie jak w przypadku innych metodologii18,19, protokół ten nie wymaga znieczulenia próbki; Można go szybko pobrać i uwolnić przy minimalnym wysiłku. Zamykane torebki na próbki są tanie, łatwe do zdobycia, lekkie, niezwykle przenośne i nadają się do recyklingu, co czyni je doskonałą alternatywą dla probówek wirówkowych. Ponieważ brakuje im sztywności niektórych alternatyw (np. probówek sokoła lub innych twardych pojemników), ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z żywymi okazami owadów. Jeśli cały okaz ma być traktowany jako kupon, umieszczenie go w solidnej obudowie zmniejszy potencjalne uszkodzenie okazu.
Dla badaczy stosujących tę metodę korzystne jest, aby mieli doświadczenie w obchodzeniu się z pszczołami i/lub innymi owadami, ponieważ wywieranie zbyt dużego nacisku na próbki, gdy znajdują się one w torbie, może spowodować obrażenia lub śmierć. Aby zdobyć większe doświadczenie w obchodzeniu się z pszczołami, początkujący badacze powinni ćwiczyć ten protokół na bardziej powszechnych gatunkach (np. pszczołach miodnych). Praktyka pomoże zminimalizować obrażenia lub śmiertelność owada. Należy zauważyć, że w zależności od taksonu głównego mogą istnieć ograniczenia tej metodologii. Zmniejszone rozmiary określonych taksonów mogą wymagać użycia bardziej kosztownego i specjalistycznego sprzętu do makrofotografii i/lub użycia mikroskopów polowych, ponieważ ich cechy mogą nie być możliwe do wyizolowania i sfotografowania za pomocą materiałów wymienionych w tej procedurze, im mniejszy cel, tym trudniej może być uzyskać odpowiednie obrazy37. Ponadto w przypadkach, gdy wymagane są niedostępne części ciała (np. język, narządy płciowe itp.), inne metody identyfikacji mogą być uzasadnione. Genitalia są jedną z najbardziej pouczających cech diagnostycznych owadów, które mogą być bardzo zmienne w zależności od gatunku i nieco stabilne w ich obrębie38,39. W takim przypadku mogą być konieczne metody śmiertelne, takie jak sekcja. Jednak w przypadku gatunków trudnych do zidentyfikowania do identyfikacji można wykorzystać małe, nieśmiertelne próbki genetyczne do identyfikacji po zebraniu w terenie40 , a do zebrania takich próbek można zastosować opisaną tutaj metodologię. Opracowywane jest również modelowanie statystyczne, które ma pomóc w powiązaniu obrazowania i sekwencjonowania DNA w celu identyfikacji owadów41.
Kolejnym ograniczeniem przedstawionej tu metodyki jest prawdopodobieństwo użądlenia podczas wykonywania tego protokołu, zwłaszcza w przypadku wycięcia otworu w torbie. Protokół ten minimalizuje jednak prawdopodobieństwo użądlenia; Autorzy rzadko byli użądleni przez worki z próbkami podczas obchodzenia się z okazami. Należy również zauważyć, że niektóre gatunki pszczół, chrząszczy i os były w stanie przeciąć torby za pomocą żuchwy, dlatego należy zachować ostrożność przy określaniu, czy to podejście zadziała w przypadku interesujących taksonów i w takich przypadkach zalecane byłyby grubsze torby plastikowe lub inne metodologie. We wszystkich przypadkach użytkownicy powinni zminimalizować użycie jednorazowych tworzyw sztucznych i poddać je recyklingowi, jeśli to możliwe.
Taksonem centralnym dla opracowania tego protokołu była niebieska pszczoła calaminthae, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae), która mierzy około 10-11 mm w rozmiarze32. Od czasu opracowania tej metody autorzy zastosowali ją na wielu innych błonkoskrzydłych o różnych rozmiarach, w tym na większych gatunkach Bombus (Hymnenoptera: Apidae) i gatunkach Caupolicana , C. electa i C. floridana (Hymenoptera: Colletidae). Caupolicana electa może mieć od 18 do 23 mm, podczas gdy C. floridana może wahać się od 16 do 18 mm33. Aby zminimalizować negatywny wpływ na gatunki zagrożone, zagrożone lub umieszczone w wykazie, zaleca się najpierw wypróbowanie go na blisko spokrewnionych i/lub powszechnych surogatach, aby pomóc w zdobyciu doświadczenia i zdobyciu biegłości. Egzoszkielet pszczół i innych owadów może się różnić, a mniej wytrzymałe okazy należy traktować ostrożnie. W sytuacjach, gdy badane są mniejsze lub bardziej miękkie ciała owadów, ta metodologia może być niewystarczająca. Użytkownicy muszą określić, które części tej metodologii będą odpowiednie dla ich taksonu głównego.
Poza głównym celem, jakim jest zamknięcie organizmów zebranych w terenie w celu identyfikacji, protokół ten może być modyfikowany w celu wykonywania różnych zadań związanych z badaniami, do których pszczoły muszą być bezpiecznie zamknięte. Na przykład organizmy mogą być ważone w terenie w zamykanych torebkach na próbki. Naukowcy mogą również wykonywać różne pomiary próbek za pomocą suwmiarki, gdy owad jest ograniczony. Na przykład oszacowanie zdolności naprowadzania pszczół można przeprowadzić przy użyciu rozmiaru ciała42; Nasza metodologia może pomóc w pozyskaniu danych, które ułatwią takie oszacowanie. Podobnie, zamiast używać suwmiarki, badacze mogą umieścić i sfotografować linijkę/podziałkę i/lub kartę kolorów bezpośrednio za próbką, aby zmierzyć kluczowe cechy morfologiczne podczas późniejszego przetwarzania obrazów. Przyszłe zastosowania tej metody mogą wykorzystać postępy w dziedzinie sztucznej inteligencji i uczenia maszynowego. Identyfikacja, zarówno w terenie, jak i w laboratorium, może zostać usprawniona dzięki inteligentnym urządzeniom, minimalizując w ten sposób czas obsługi i stres związany z próbkami.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Ivone de Bem Oliveira, Jonowi Elmquistowi, Emily Khazan, Nancy Kimmel i Kristin Rossetti za przejrzenie tego rękopisu. Badania te zostały sfinansowane z grantu U.S. Fish and Wildlife Service zarządzanego przez Florida Fish & Wildlife Conservation Commission (umowa nr 19008) oraz funduszy z Florida Biodiversity Foundation.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Lupa do oczu 30x 60x z podświetleniem jubilerskim | JARLINK | Soczewka ręczna (w razie potrzeby) do obserwacji cech diagnostycznych | |
| Powietrzna siatka | |||
| Bleech w butelce | Potrzebne tylko do nieśmiertelnego pobierania próbek genetycznych | ||
| Nożyczki dla dzieci z końcówką | Fiskar | z końcówką są korzystne, ponieważ można je bezpiecznie przechowywać w środku kieszenie | |
| Etanol w butelce | Potrzebny tylko do nieśmiertelnego pobierania próbek genetycznych | ||
| Dyfuzor błyskowy FD-1 | Dyfuzor lampy błyskowej Olympus do oświetlania próbki podczas robienia zdjęć kuponów | ||
| zestaw markerów | Sharpie | Pens do oznaczania pszczół | |
| Kimwipes | Kimtech | ||
| Probówki | Potrzebne tylko do nieśmiercionośnego pobierania próbek genetycznych | ||
| Zamykana torba na próbki | Amazon | W zależności od interesującej nas próbki. Preferujemy 50,8 mm x 76,2 mm lub 50,8 mm x 50,8 mm - Edvision 2 "x 3" Plastikowe torby, 200 Count 2 Mil przezroczyste torebki foliowe z zamkiem błyskawicznym, torby wielokrotnego zamykania na biżuterię, koraliki,, małe przedmioty - Soft 'N Style 500 Count Zamykane torebki foliowe z zamkiem błyskawicznym, 2 na 2 cale, 50 mm na 50 mm, przezroczyste | |
| do preparowania tęczówki ze stali nierdzewnej | Bardziej precyzyjne niż nożyczki z końcówką. Powinien być przechowywany w bezpiecznym miejscu. | ||
| TG-7 lub podobny aparat | Aparat Olympus | z ustawieniem makro do robienia zdjęć z kuponem |
Bibliografia
- Potts, S. G., et al. Global pollinator declines: trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evol. 25 (6), 345-353 (2010).
- IPBES. The Assessment Report of the Intergovernmental Science-Policy Platform on Biodiversity and Ecosystem Services on Pollinators. , Pollination and Food Production. Secretariat of the Intergovernmental Science-Policy Platform on Biodiversity and Ecosystem Services. Bonn, Germany. (2016).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botias, C., Rotheray, E. Bee declines driven by combined stress from parasites, pesticides, and lack of flowers. Science. 347 (6229), 1255957(2015).
- Zattara, E. E., Aizen, M. A. Worldwide occurrence records suggest a global decline in bee species richness. One Earth. 4 (1), 114-123 (2021).
- Allen-Wardell, A. G., et al. The potential consequences of pollinator declines on the conservation of biodiversity and stability of food crop yields. Conserv Biol. 12 (1), 8-17 (1998).
- Nieto, A., et al. European Red List of Bees. , Publication Office of the European Union. Luxembourg. (2014).
- Simpson, D. T., et al. Many bee species, including rare species, are important for function of entire plant-pollinator networks. Proc R Soc B. 289 (1972), 20212689(2022).
- Roulston, T. H., Smith, S. A., Brewster, A. L. A comparison of pan trap and intensive net sampling techniques for documenting a bee (Hymenoptera: Apiformes) fauna. J Kans Entomol Soc. 80 (2), 179-181 (2007).
- Gibbs, J., et al. Does passive sampling accurately reflect the bee (Apoidea: Anthophila) communities pollinating apple and sour cherry orchards. Environ Entomol. 46 (3), 579-588 (2017).
- Portman, Z. M., Bruninga-Socolar, B., Cariveau, D. P. The state of bee monitoring in the United States: a call to refocus away from bowl traps and towards more effective methods. Ann Entomol Soc Am. 113 (5), 337-342 (2020).
- Popic, T. J., Davila, Y. C., Wardle, G. M. Evaluation of common methods for sampling invertebrate pollinator assemblages: net sampling out-perform pan traps. PLoS One. 8 (6), e66665(2013).
- Bubnič, J., Mole, K., Prešern, J., Moškrič, A. Non-destructive genotyping of honeybee queens to support selection and breeding. Insects. 11 (12), 896(2020).
- Châline, N., Ratnieks, F. L., Raine, N. E., Badcock, N. S., Burke, T. Non-lethal sampling of honey bee, Apis mellifera, DNA using wing tips. Apidologie. 35, 311-318 (2004).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. J Insect Conserv. 17, 1071-1079 (2013).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumble bees for conservation genetics. Insectes Soc. 50, 277-285 (2003).
- Boyle, N. K., et al. A nonlethal method to examine non-Apis bees for mark-capture research. J Insect Sci. 18, 10(2018).
- Curran, M. F., et al. Use of 3-dimensional videography as a non-lethal way to improve visual insect sampling. Land. 9 (10), 340(2020).
- Austin, G. H. Effect of carbon dioxide anaesthesia on bee behaviour and expectation of life. Bee World. 36 (3), 45-47 (1955).
- Switzer, C. M., Combes, S. A. Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae) display reduced pollen foraging behavior when marked with bee tags vs. paint. J Melittology. 62, 1-13 (2016).
- Ribbands, C. R. Changes in the behaviour of honey bees following their recovery from anaesthesia. J Exp Biol. 27 (3-4), 302-310 (1950).
- Poissonnier, L. A., Jackson, A. L., Tanner, C. J. Cold and CO2 narcosis have long-lasting and dissimilar effects on Bombus terrestris. Insectes Soc. 62, 291-298 (2015).
- Wilson, E. E., Holway, D., Nieh, J. C. Cold anaesthesia decreases foraging recruitment in the New World bumblebee, Bombus occidentalis. J Apic Res. 45 (4), 169-172 (2006).
- Chauzat, M. P., Faucon, J. P. Pesticide residues in beeswax samples collected from honey bee colonies (Apis mellifera l) in France. Pest Manage Sci. 63 (11), 1100-1106 (2007).
- Jha, S., Stefanovich, L., Kremen, C. Bumble bee pollen use and preference across spatial scales in human-altered landscapes. Ecol Entomol. 38 (6), 570-579 (2013).
- Popic, T. J., Wardle, G. M., Davila, Y. C. Flower-visitor networks only partially predict the function of pollen transport by bees. Austral Ecol. 38 (1), 76-86 (2013).
- Bell, K. L., et al. Applying pollen DNA metabarcoding to the study of plant-pollinator interactions. Appl Plant Sci. 5 (6), 1600124(2017).
- Wood, T. J., Kaplan, I., Szendrei, Z. Wild bee pollen diets reveal patterns of seasonal foraging resources for honey bees. Front Ecol Evol. 6, 210(2018).
- Friedle, C., Wallner, K., Rosenkranz, P., Martens, D., Vetter, W. Pesticide residues in daily bee pollen samples (April-July) from an intensive agricultural region in Southern Germany. Environ Sci Pollut R. 28, 22789-22803 (2021).
- Lau, P., Lesne, P., Grebenok, R. J., Rangel, J., Behmer, S. T. Assessing pollen nutrient content: a unifying approach for the study of bee nutritional ecology. Phil Trans R Soc B. 377, 20210510(2022).
- Potter, C., et al. Pollen metabarcoding reveals broad and species-specific resource use by urban bees. PeerJ. 7, e5999(2019).
- Graham, J., Campbell, J., Tsalickis, A., Stanley-Stahr, C., Ellis, J. Observing bees and wasps: Why surveys and monitoring programs are critical and how they can improve our understanding of these beneficial hymenopterans. J Pollinat Ecol. 33, 139-169 (2023).
- Rightmyer, M. G., Deyrup, M., Ascher, J. S., Griswold, T. Osmia species (Hymenoptera, Megachilidae) from the southeastern United States with modified facial hairs: taxonomy, host plants, and conservation status. ZooKeys. 148, 257-278 (2011).
- Michener, C. D., Deyrup, M. Caupolicana from Florida (Hymenoptera: Colletidae). J Kansas Entomol Soc. 77 (4), 774-782 (2004).
- Michener, C. D. Bees of the World. , The Johns Hopkins University Press. Baltimore. (2007).
- Thorp, R. W. The collection of pollen by bees. Pl Syst Evol. 222, 211-223 (2000).
- Streinzer, M., Kelber, C., Pfabigan, S., Kleineidam, C. J., Spaethe, J. Sexual dimorphism in the olfactory system of a solitary and a eusocial bee species. J Comp Neurol. 521 (12), 2742-2755 (2013).
- Marshall, S. A. Field photography and the democratization of arthropod taxonomy. Am Entomol. 54 (4), 207-210 (2008).
- Eberhard, W. G. Sexual SelectionandAnimal Genitalia. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1985).
- Yassin, A. Unresolved questions in genitalia coevolution: bridging taxonomy, speciation, and developmental genetics. Org Divers Evol. 16, 681-688 (2016).
- Magoga, G., et al. Curation of a reference database of COI sequences for insect identification through DNA metabarcoding: COins. Database. 2022, baac055(2022).
- Badirli, S., et al. Classifying the unknown: Insect identification with deep hierarchical Bayesian learning. Methods Ecol Evol. 14 (6), 1515-1530 (2023).
- Guedot, C., Bosch, J., Kemp, W. P. Relationship between body size and homing ability in the genus Osmia (Hymenoptera: Megachilidae). Ecol Entomol. 34 (1), 158-161 (2009).
Przedruki i uprawnienia
