Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Podsumowanie

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Streszczenie

Wierna duplikacja genomu jest niezbędna do zachowania stabilności genetycznej dzielących się komórek. Replikacja DNA odbywa się podczas fazy S za pomocą dynamicznego kompleksu białek zwanego replisomem. U centrum odpowiedzi znajduje się helikaza CDC45-MCM2-7-GINS (CMG), która rozdziela dwie nici podwójnej helisy DNA tak, aby polimerazy DNA mogły kopiować każdą z nich. Podczas duplikacji genomu odpowiedzi muszą pokonać wiele przeszkód i wyzwań. Każda z tych sytuacji zagraża stabilności genomu, ponieważ brak pełnej i dokładnej replikacji DNA może prowadzić do mutacji, chorób lub śmierci komórek. Dlatego bardzo interesujące jest zrozumienie, jak CMG funkcjonuje w odpowiedzi zarówno podczas normalnego naprężenia replikacyjnego, jak i replikacyjnego. Tutaj opisujemy test mikroskopii całkowitej odbicia wewnętrznego (TIRF) z użyciem rekombinowanych oczyszczonych białek, który umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym powierzchniowych rozciągniętych cząsteczek DNA przez poszczególne kompleksy CMG. Ten test stanowi potężną platformę do badania zachowania CMG na poziomie pojedynczej cząsteczki, umożliwiając bezpośrednią obserwację dynamiki helikaz w czasie rzeczywistym nad warunkami reakcji.

Wprowadzenie

Replikacja DNA jest ściśle regulowana, ponieważ komórka musi dokładnie duplikować swój genom, aby zapobiec mutacjom, chorobom lub śmierci. Replikacja DNA eukariotycznego odbywa się przez kompleks rerespondsome, który rozwija DNA rodzicielskie i wykorzystuje jednoniciowe DNA (ssDNA) jako szablon do syntezy nowego DNA. W fazie G1 katalistycznie nieaktywne podwójne heksamery MCM2-7 są ładowane na DNA dwuniciowe (dsDNA) w miejscach początkowych replikacji¹. W fazie S kompleksy MCM2-7 są aktywowane przez wiązanie CDC45 i GINS² , tworząc 11-podjednostkowe kompleksy CMG (CDC45, MCM2-7, GINS). Każdy CMG inicjuje rozwijanie DNA w przeciwnych kierunkach, tworząc jądro, wokół którego odpowiadający układa^{się w 3}.

Dwadzieścia lat temu helikaza CMG została po raz pierwszy zidentyfikowana jako kompleks składający się z 11 podjednostek, niezbędny do replikacji DNA⁴. Od tego czasu nasza wiedza na temat CMG znacznie się rozwinęła, od ładowania i aktywacji ^5,6 do odwijania i zakończenia DNA⁷. Tradycyjne techniki biochemiczne i biologii strukturalnej odegrały kluczową rolę w wielu z tych odkryć; jednak metody te często były ograniczone w zakresie badania bardziej dynamicznych aspektów CMG. Metody pojedynczych cząsteczek wykorzystują fizyczną manipulację pojedynczych biomolekuł do pomiaru lub wizualizacji ich aktywności po cząsteczce na raz. Może to być wykorzystane do uzyskania wglądu w dynamikę białek w czasie rzeczywistym, które często są pomijane lub niewykrywalne przez inne techniki ^8,9.

Tutaj opisujemy całkowity test fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF), który pozwala na wizualizację rozwijania DNA przez helikazę CMG w czasie rzeczywistym. Oczyszczony, fluorescencyjnie oznakowany CMG jest ładowany na wolny 3' koniec długiego DNA zawierający gotową strukturę widłową DNA. DNA liniowe jest rozciągane na pokrywie biotyny-PEG w komórce przepływu mikrofluidycznego, łącząc oba końce DNA sekwencyjnie z powierzchnią. Takie podejście pozwala na bardziej jednolite powiązanie DNA, co znacząco zmniejsza zmienność uwzględnioną podczas analizy danych. W obecności ATP-γ-s, CMG jest ładowane na jednoniciowe DNA na końcu 3' widelecza. ATP-γ-s to powoli hydrolizowalny analog ATP, który pozwala na wiązanie CMG z DNA, ale nie na rozwijanie się. Kolejne dodanie ATP, wraz z oczyszczonym, fluorescencyjnie oznakowanym RPA, aktywuje CMG i rozpoczyna rozległe rozwijanie DNA. Wizualnie CMG translokuje się wzdłuż DNA, pozostawiając za sobą rosnący fragment ssDNA związanego z RPA. Nieuwięziony koniec DNA przemieszcza się razem z CMG, tworząc "ciasną kulę" w wyniku zagęszczenia spowodowanego wiązaniem RPA. Projekt komórki przepływowej pozwala na wymianę bufora w dowolnym momencie podczas odwijania, co daje doskonałą kontrolę podczas i nad każdym eksperymentem.

Protokół ten dzieli się na cztery metody, które mogą być wykonywane niezależnie od siebie. Sekcja 1 opisuje przygotowanie 20-kb liniowego podłoża DNA o rozwidleniu do testów pojedynczych cząsteczek. Sekcja 2 opisuje oczyszczanie i fluorescencyjne znakowanie Drosophila melanogaster CMG (DmCMG). Kluczowe informacje dotyczące ekspresji DMCMG znajdują się w sekcji notatek. Sekcja 3 obejmuje przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej, która może być stosowana w mikroskopie TIRF. Sekcja 4 opisuje, jak przeprowadzić test rozwijania DNA na pojedynczych cząsteczkach.

Protokół

1. Przygotowanie 20-kb liniowego DNA rozwidlonego używanego w testach pojedynczych cząsteczek (Rysunek 1)

Rysunek 1: Graficzne przedstawienie przygotowania substratu DNA. (A) Koniec rozwidlenia biotinylowanego DNA powstaje przez wyżarzenie dwóch częściowo komplementarnych oligonukleotydów: biotinylowanego i niebiotinylowanego. (B) Główny fragment dsDNA (~20 kb) jest generowany przez redukcyjne trawienie plazmidu pGC261 za pomocą dwóch enzymów, tworząc liniowe DNA z różnymi zwisami na każdym końcu. (C) Koniec DNA dupleksowego digoksygeniny uzyskuje się poprzez reakcję PCR przeprowadzaną w obecności digoksygeniny-dUTP, po której następuje trawienie restrykcyjne. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

1. Generowanie końcówki widełki biotinylowanego DNA.
   1. Wyświetl widelec DNA.
      1. Wymieszaj dwa oligonukleotydy (oHY502 i oHYbio85) w 1x buforze STE (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0; 1 mM etylendiaminetetraoctowego kwasu [EDTA]). Końcowe stężenie oligonukleotydów wynosi 10 μM, a końcowa objętość reakcji to 100 μL.
      2. Inkubuj reakcję w temperaturze 80 °C przez 5 minut na bloku termicznym. Wyłącz blok grzewczy i pozwól reakcji stopniowo stygnąć, zostawiając ją w bloku grzewczym aż temperatura spadnie poniżej 30 °C.
   2. Zweryfikować efektywność wyżarzania na żelu elektroforezy Tris-Borate-EDTA (TBE)-elektroforezy z żelem poliakrylamidowym (PAGE).
      1. Przygotuj żel akryloamidowy - TBE 8% (dla 4 żeli: 32,8 mL H₂O; 4,8 mL buforu 10x TBE (1 M Tris, 1 M kwas borowy, 20 mM EDTA), 9,6 mL 40% roztworu akrylamidu/bis, 37,5:1; 0,8 mL 10% persiarczanu amonu [APS], 40 μL tetrametyloetylendiaminy [TEMED]).
         UWAGA: TBE, akrylamid, APS, TEMED są toksyczne/szkodliwe.
      2. Przeprowadzić niewielką objętość (1 μL) wyżarzonych oligonukleotydów obok poszczególnych oligonukleotydów rozcieńczonych barwnikiem 6x ładowającym na żelu akrylamid-TBE 8% w temperaturze 80 V, przez 1 godzinę w RT.
      3. Namocz żel w 1x TBE uzupełnionym odpowiednim barwikiem kwasu nukleinowego przez 30 minut na huśtawce bujającej, a następnie zeskanuj żel za pomocą systemu obrazowania żelowego.
   3. Rozwiązuj wyżarzone DNA na żelu TBE-PAGE do wycięcia żelu.
      1. Jeśli oligonukleotydy są prawidłowo wyżarzone, rozłóż resztę próbki w obecności BSA (~100 μL próbki wyżarzonej, 25 μL barwnika 6x obciążenia, 2 μL 33 mg/mL BSA). Aby załadować większą objętość żelu, połącz kilka wgłębień sterylnym skalpelem.
      2. Żel pozostawić w 1x TBE z odpowiednim barwieniem kwasu nukleinowego na 30 minut na huśtawce do bujania.
      3. Przełóż żel do szklanej tacy i wyobraź sobie DNA w ciemnym pomieszczeniu pod niebieskim światłem. Używaj odpowiedniego ekranu ochronnego lub okularów ochronnych podczas korzystania z niebieskiego światła.
      4. Wytnij pożądany pasek sterylnym skalpelem. Usuń nadmiar żelu.
   4. Oczyść wyżarzany widelec przez elektroeluencję.
      1. Przetnij kawałek rurki dializacyjnej na tyle długi, żeby włożyć żelowy kawałek, zwilż go w 1x TBE i przypiąń jeden koniec.
      2. Rozcieńcz BSA do 0,3 mg/mL w 500 μL 1x TBE i pipetuj całą objętość do rurki.
      3. Użyj metalowej łopatki, żeby wsunąć kawałek żelu do środka. Przesuń kawałek żelu na jedną stronę rurki, aby zapewnić przestrzeń buforową dla migracji DNA podczas elektroelucii.
      4. Wyciśnij nadmiar bufora i przytnij drugi koniec rurki.
         UWAGA: Pozostała objętość zdecyduje o ostatecznej objętości i stężeniu.
      5. Umieść rurkę dializową w zbiorniku elektroforezy żelu agarozowego w buforze 1x TBE, zapewniając całkowite zanurzenie.
         UWAGA: Upewnij się, że element żelu znajduje się po stronie najbliższej elektrodzie ujemnej, aby DNA mogło migrować z żelu do worka dializowego.
      6. Elektroeluję przełącz na 80 V przez 1-2 godziny.
   5. Zdializuj elektroelutowane DNA do 10 mM buforu Tris (pH 8).
      1. Po elektroelucii wyjmij worek dializacyjny z zbiornika i osusz jeden koniec chusteczką. Unikaj dotykania środkowej części rurki chusteczką, gdzie znajdują się żel i próbka.
      2. Wyjmij klips z wyschniętego końca i delikatnie pifikuj próbkę w górę i w dół wewnątrz rurki, aby wymieszać DNA z buforem.
      3. Zanurz czystą szpatułkę w buforze TBE 1x i wyjmij żelowy kawałek z rurki.
         UWAGA: Podczas zdejmowania żelu usuń jak najmniej buforu.
      4. Ponownie zatrzasz otwarty koniec woreczka dializy, usuwając powietrze z wnętrza.
      5. Umieść worek dializ do 2-litrowej zlewki wypełnionej 1,5 L buforu Tris o pojemności 10 mM (pH 8), 20 mM NaCl i 2 mM_MgCl2. Owiń klipsy parafilmem, aby przykleić rurkę do krawędzi zlewki, całkowicie zanurzając rurkę w buforze.
         UWAGA: Sól stabilizuje krótkie oligo duplexy.
      6. Użyj magnetycznego pręta, aby delikatnie wymieszać bufor i dializować próbkę w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 3-4 godziny lub w 4 °C przez noc.
      7. Po dializie osusz jeden koniec worka dializacyjnego chusteczką (nie rozcieńczając DNA) i odpiąć ten koniec.
      8. Delikatnie pipetuj próbkę w górę i w dół wewnątrz rurki i przelej ją do czystej probówki o pojemności 1,5 mL.
      9. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
2. Generowanie fragmentu 20-kb
   1. Wykonaj restrykcyjne trawienie plazmidu pGC261¹⁸ z użyciem enzymów NotI/I-CeuI.
      1. Delikatnie wymieszaj 8 μL NotI-HF (20 000 U/mL), 8 μL I-CeuI (5 000 U/mL) oraz plazmid pGC261 (końcowe stężenie plazmidów ~40 ng/μL w reakcji 200 μL) w buforze zalecanym przez producentów enzymów restrykcyjnych.
      2. Inkubuj reakcję w 37 °C przez noc.
   2. Oczyszcz strawiony plazmid przez elektroeluację.
      1. OPCJONALNIE: Najpierw przeprowadź niewielką ilość reakcji na żelu agarozowym o pojemności 0,6%, aby sprawdzić efektywność trawienia przed załadowaniem całej reakcji.
      2. Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 0,6% zgodnie z krokami 1.2.2.3-1.2.2.4.
      3. Wymieszaj 0,48 g proszku agarozowego z 80 mL buforu 1x TBE. Podgrzej roztwór w mikrofalówce, aż zacznie się gotować. Zamieszaj, aby agaroza była całkowicie roztopiona. Odstaw do ostygnięcia przez kilka minut, a następnie wlej do wyznaczonego zbiornika.
      4. Aby połączyć wgłębienia i pomieścić większą objętość próbki, najpierw przyklej kawałek taśmy na kilka wgłębień grzebienia.
      5. Gdy żel się zastygnie, delikatnie wyjmij grzebień i uzupełnij zbiornik 1x buforem TBE. Delikatnie wymieszaj próbkę z barwnikiem do załadunku DNA i uciekaj żelem na 120 V przez 1 godzinę.
      6. Żel pozostawić w 1x TBE uzupełnionym odpowiednim bejcowaniem kwasu nukleinowego na huśtawce do zabarwienia, aż zostanie zabarwiony.
      7. Przenieś zabarwiony żel na szklaną tackę i wyobraź sobie DNA w ciemnym pomieszczeniu pod niebieskim światłem.
      8. Wytnij pożądany pasek sterylnym skalpelem. Usuń nadmiar żelu.
      9. Oczyść pożądany fragment przez elektroeluję, zgodnie z krokami 1.1.4 i 1.1.5. Pomijam sól z buforu dializ, ponieważ jest on potrzebny tylko do stabilizacji krótkiego oligo duplexu.
   3. Opcjonalnie: pomiń krok 1.2.2 i zamiast tego dezaktywuj endonukleazy ograniczające zgodnie z instrukcjami dostawcy. To może zmniejszyć uszkodzenia DNA. Dodatkowy fragment DNA zostanie usunięty po oczyszczeniu końcowego substratu w kroku 1.4.3.
3. Generowanie końca DNA dwupłciowego digoksygeniny
   1. Wykonaj reakcję PCR z digoksygeniną-dUTP (dig-dUTP) z użyciem DNA pGC261 jako szablonu.
      1. Mieszanka: 400 μL wody, 8 μL pGC261 (0,8 ng/μL), 3,5 μL podkładu oHY507 (100 μM), 3,5 μL spodka oHY508 (100 μM), 8 μL dig-dUTP (1 mM), 400 μL mieszanki 2x PCR (przygotowanej z 2 000 U/mL polimerazy DNA (20 μL), 10 mM dNTP (40 μL), 5x bufor wysokiej wierności (HF) (400 μL) oraz woda (540 μL).
      2. Przeprowadź następującą reakcję w cyklerze termicznym:
         98 °C - 1 min
         30x: 98 °C - 20 s; 65 °C - 20 s; 72 °C - 30 s;
         72 °C - 10 minut
         4 °C - Trzymaj
   2. Trawi i oczyszcza produkt PCR znakowany digoksygeniną
      1. Oczyść produkt PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA.
      2. Wymieszaj 10 μL NotI-HF (20 000 U/mL) z produktem PCR w buforze zalecanym przez dostawcę enzymu (końcowe stężenie DNA ~50 ng/μL w reakcji ~200 μL). Inkubuj reakcję w 37 °C przez noc.
      3. Oczyść strawione DNA za pomocą komercyjnego zestawu do czyszczenia DNA.
4. Złóż składniki, aby stworzyć podłoże DNA.
   1. Delikatnie wymieszaj biotinylowany koniec widełka, fragment DNA o masie 20 kb oraz fragment PCR z oznakowaniem digoksygeniny Not-I z 5 μL ligazy DNA T4 (400 000 U/mL) w buforze zalecanym przez dostawcę enzymu w reakcji 200 μL. Jednak na podstawie dodanego fragmentu DNA o masie 20 kb (1-5 μg) dodano około 100-krotny nadmiar molowy zarówno biotinylowanego końca widełki, jak i fragmentu PCR.
   2. Zachowaj reakcję do rurek PCR (każda po 50 μL) i inkubuj w temperaturze 16 °C w cyklerze termicznym na noc.
   3. Rozwarstwienie próbki ligowanej na żelu agarozowym o stężeniu 0,6% i oczyszczenie ligowanego DNA przez elektroelucję, zgodnie z krokami 1.2.2 i 1.2.3.
   4. Przechowuj błyskawicznie zamrożone DNA w temperaturze -80 °C.

2. Oczyszczanie Drosophila melanogaster CMG (Rysunek 2)

Rysunek 2: Oczyszczanie CMG Drosophila melanogaster z 4 litrów komórek Hi Five. Białka zostały rozdzielone na żelu poliakrylamidowym Bis-Tris 4%-12% pod ciśnieniem 200 V w obecności buforu MOPS. Próbka jest prezentowana na każdym etapie oczyszczania (lizat komórkowy - 2 μL, elucia FLAG - 10 μL, po pierwszej kolumnie wymiany jonowej - 10 μL, a po oznakowaniu i drugiej kolumnie jonowej - 1 μL). (A) barwienie Coomassie potwierdza obecność wszystkich 11 podjednostek kompleksu CMG przed (10 μL), oraz po (1 μL) znakowaniu fluorescencyjnym. (B) Efektywność oznakowania podjednostki MCM3 została zweryfikowana poprzez skanowanie Cy5 analizatorem obrazu fluorescencyjnym przy użyciu filtra długoprzepustowego czerwonego (LPR). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

UWAGA: Aby przygotować fluorescencyjnie znakowany CMG Drosophila melanogaster , wprowadzono miejsce rozszczepienia TEV (ENLYFQG), a następnie cztery reszty gliny poniżej N-końcowego FLAG Tag na podjednostce MCM3 (w wektorze pFastBac1)¹⁰. Do ekspresji kompleksu użyto systemu ekspresji baculowirusa. Do początkowej transfekcji komórki Sf21 były używane osobno dla każdej podjednostki CMG (stadium wirusa P1). Aby jeszcze bardziej wzmocnić wirusy, użyto komórek Sf9 (stadium wirusa P2). Następnie hodowle komórek Sf9 (100 mL dla każdej podjednostki CMG; 0,5 x 10^{6 komórek} /mL) zostały zainfekowane wirusem P2 o stężeniu 0,5 mL uzupełnionym surowicą cielęcą płodu (stadium wirusa P3). Aby wyrazić cały kompleks CMG w 4 L komórek Hi Five (1 x 10^{6 komórek} /mL), użyto 200 mL wirusów P3 dla każdej z podjednostek. Po pobraniu komórek Hi Five wyrażających kompleks CMG, pellet komórkowy można szybko zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C. Całość oczyszczania należy wykonać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. można przygotować wcześniej, pod warunkiem, że środki redukujące (DTT lub 2-Merkaptoetanol) oraz inhibitory proteazy (UWAGA) zostaną dodane tuż przed użyciem. Upewnij się, że wszystkie są wcześniej schłodzone, przefiltrowane i odgazowane.

1. Przygotuj następujące.
   1. Przygotuj bufor resuspendacyjny A, mieszając 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethanosulfonowego (HEPES) pH 7,5, 0,02% Tween-20, 10% glicerolu, 15 mM KCl, 2 mM MgCl2_{, 2} mM 2-merkaptoetanolu, 1 mM EDTA oraz 1 mM glikolu etylenowego (β-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-kwasu tetraoctowego (EGTA).
      UWAGA: 2-merkaptoetanol, DTT i EDTA są toksyczne/szkodliwe
   2. Przygotuj bufor soli fizjologicznej z buforem Tris (TBS; 0,1 M Glycine HCl, pH 3,5) do przygotowania żelu powinowactwa ANTI-FLAG M2.
   3. Przygotuj bufor A-100, mieszając 25 mM HEPES o pH 7,5, 0,02% Tween-20, 10% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA oraz 1 mM EGTA.
   4. Przygotuj bufor dializowy, dodając 25 mM HEPES pH 7,5, 50 mM octana sodu, 10 mM octana magnezu, 10% glicerolu oraz 1 mM DTT.
   5. Przygotuj bufor TBS, mieszając 50 mM Tris-HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl.
2. Ponownie zawiesz pellet z 4 L hodowli komórek Hi Five w 200 mL buforu A z dodatkiem tabletek koktajlowych inhibitorów proteazy. Mieszaj rurki przez inwersję, aż cały pellet zostanie całkowicie zawieszony.
3. Przełóż ponownie zawiesinowane ogniwa do wstępnie schładzonego homogenizatora Dounce o pojemności 40 mL. Aby odzyskać jak najwięcej komórek, przemyj rurki używane do pelletów komórkowych tym samym rodzajem buforu i dodaj do homogenizatora Dounce. Upewnij się, że całkowita objętość w homogenizatorze nie przekracza zalecanego limitu. Rozlewaj komórki na lodzie 60-70 ruchami.
   UWAGA: Upewnij się, że tłok sięga dna rurki, ale nie wywieraj zbyt dużego nacisku, ponieważ homogenizator może się pęknąć. Uważaj, aby nie wyjmować tłoka powyżej poziomu płynu, ponieważ może to wprowadzić pęcherze.
4. Powtarzaj poprzedni krok, aż cała próbka się ujednolici i łącz ją w schłodzonej zlewce. Oceń ostateczną objętość próbki. Kropla po kropli dodawaj filtrowany KCl do końcowego stężenia 100 mM, delikatnie mieszając.
5. Wstępnie podgrzewa wirówkę do 4 °C. Wlej próbkę do probówek wirówkowych, upewniając się, że osiągnij zalecaną przez producenta objętość. Zrównoważ rurki na wadze.
   UWAGA: Rurki o zbyt małej objętości mogą pęknąć podczas wirowania.
6. Płucz komórki lizowane w stężeniu 23 500 x g przez 15-30 minut w temperaturze 4 °C. Tymczasem przygotuj żel powinowactwa ANTY-FLAG M2 zgodnie z kolejnym krokiem.
7. Delikatnie wymieszaj butelkę zawierającą żel powinowactwa ANTI-FLAG M2 (50% zawiesina). Odetnij koniec końcówki pipety P-100 (aby poszerzyć końcówkę) i użyj go do natychmiastowego przelania 4 mL zawiesiny (2 mL kulek) do kolumny chromatografii poliprepowej o pojemności 20 mL. Aby odzyskać koraliki utknięte w końcówce, umyć końcówkę TBS i dodać do kolumny. Pozwól wszystkim kulkom osiąść wewnątrz kolumny, ale uważaj, by ich nie wysuszyć.
8. Umyj żywicę 3x objętością kulek (łącznie 6 mL) 0,1 M, glycine HCl pH 3,5. Następnie myj koraliki objętością 3-5 koralików TBS (6-10 mL). Następnie umyj koraliki 3 razy (6 mL) za pomocą buforu A-100.
   UWAGA: Nie zostawiaj kulek w roztworze 0,1 M Glycine HCl o pH 3,5 dłużej niż 20 minut. Aby zwiększyć ciśnienie przepływu i szybkość prania, przykryj kolumnę pokrywą. Nie pozwól, by żywica wyschła w żadnym momencie.
9. Po przygotowaniu żywicy pozostaw 2 mL bufora A-100 nad żywicą i zamknij wylot kolumny.
10. Po wirowaniu delikatnie wlej supernatant do schłodzonych probówek 50 mL. Uważaj, żeby nie zakłócić granulki. Weź niewielką ilość aliquotu (~10 μL) do późniejszej weryfikacji za pomocą elektroforezy SDS-PAGE.
11. Dodaj równą ilość koralików ANTI-FLAG M2 (przygotowanych zgodnie z poprzednim krokiem) do każdej z probówek 50 mL. Spróbuj odzyskać wszystkie kulki z kolumny, ponownie je zawieszając kilkoma dodatkowymi mililitrami Buforu A-100 i przenosząc tę zawieszkę do rurek.
12. Inkubuj próbkę (supernatant) żywicą ANTI-FLAG M2, obracając się przez 2,5 godziny w temperaturze 4 °C.
13. Po inkubacji obróć próbkę w 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety usuń większość supernatantu. Za pomocą końcówki do cięcia ponownie zawiesz kulki w kilku mililitrach pozostałego supernatantu i przelej je do dwóch probówek po 15 mL. Aby odzyskać kulki przyklejone do ścianek probówek 50 mL, dodaj kilka mililitrów Buffer A-100 i przelej je również do probówek 15 mL.
14. Wiruj probówki 15 mL w 1000 x g przez 5 minut w 4 °C. Usuń supernatant.
15. Przemyj kulki, dodając do każdej rurki ~14 mL buforu A-100, następnie krótko, delikatnie obróć w temperaturze 4 °C i następnie obróć w 1000 x g przez 5 minut w 4 °C. Powtórz przemycia dwa razy. Pobieraj małe aliquoty każdego płukania (~10 μL), aby później zweryfikować to elektroforezą SDS-PAGE.
16. Ten krok (2.16) jest alternatywną procedurą dla poprzednich kroków (2.13-2.15).
    1. Po inkubacji żywicą ANTI-FLAG M2 wlej próbkę do dwóch kolumn chromatografii poliprepowej po 20 mL.
    2. Jeśli wybierasz tę metodę, pozwól kulkom osiąść na dnie kolumny, a niewiązana próbka przechodzi przez kolumnę przez przepływ grawitacyjny. Następnie dodaj bufor A-100 bezpośrednio do kolumny i pozwól mu wymywać próbkę za pomocą przepływu grawitacyjnego.
17. Przenieś kulki (ponownie zawieszone w buforze A-100) do dwóch kolumn chromatografii poliprepowej o pojemności 10 mL.
    1. Pozwól buforowi A-100 przejść przez żywicę, zamknij wylot, gdy poziom buforu osiągnie szczyt żywicy i eluuj białko z kulek, dodając Bufor A-100 uzupełniony peptydem 200 μg/mL (DYKDDDDDK) (bufor elucijny FLAG).
    2. Przy pierwszej elucii dodaj 3 mL bufora elucijnego FLAG i delikatnie obracaj zamkniętą kolumnę przez 15 minut w RT. Otwórz wylot, aby zebrać pierwszą frakcję elucijną.
    3. Zamknij wylot i dodaj 2 mL bufora elucijnego FLAG do każdej kolumny. Obróć przez kolejne 10 minut i zbierz ułamek drugiej elucii.
18. Połącz wszystkie eluowane ułamki razem (~10 mL) i utrzymuj w temperaturze 4 °C. Weź niewielką alikwotę eluowanej frakcji (~10 μL), aby później zweryfikować ją elektroforezą SDS-PAGE.
19. Filtruj eluowaną próbkę za pomocą filtrów strzykawkowych o średnicy 0,22 μm.
20. Wcześniej przygotuj kolumnę CaptoHiRes Q (5/50) (wysokorozdzielczą kolumnę do chromatografii jonowymiennej) podłączoną do systemu oczyszczania białek, zgodnie z protokołem producenta. Następnie wyrównaj kolumnę buforem A-100 i załaduj przefiltrowaną próbkę na wyważoną kolumnę.
21. Przemyj kolumnę objętościami 20 kolumn (CV) buforu A-100 (~20 mL łącznie, ponieważ objętość kolumny wynosi ~1 mL).
22. Aby eluować białko, przygotuj wcześniej dwa: Bufor A-100 i Bufor B o takim samym składzie jak bufor A-100, ale z 550 mM KCl zamiast 100 mM KCl. Przygotuj elucię gradientową na 20 CV (~20 mL) ze wzrostem stężenia soli z 100 mM do 550 mM KCl. Pobierz elucie 0,3-0,5 mL w kolektorze frakcyjnym.
    UWAGA: CMG powinien eluować przy stężeniu buforu B około 70%-75%. Weź małe alikwoty ułamków i eludowanych frakcji do elektroforezy SDS-PAGE.
23. Wykonaj elektroforezę SDS-PAGE, aby potwierdzić, że CMG jest obecne w wybranych frakcjach. W międzyczasie wyczyść kolumnę i system oczyszczania zgodnie z protokołem producenta.
24. Wybrane frakcje inkubuj proteazą TEV przez noc, mieszając 50 μL proteazy TEV (1 mg/mL) na 1 ml próbki.
25. Zwilż rurkę dializową i upewnij się, że membrana nie zostanie uszkodzona. Dodaj mieszankę CMG/TEV do rurki dializacyjnej i umieść ją w zlewce 2 litra z 1,5 litra schłodzonego Buffer A-100 i magnetycznym prętem w środku. Dializuj delikatnie przez noc w temperaturze 4°C.
26. W obecności 50 mM peptydu znakowanego LD655 wymieszaj próbkę z 50 μM peptydu znakowanego LD655 oraz enzymem sortazy 10 μg/mL_. Inkubuj reakcję w temperaturze 4 °C, obracając się przez 30 minut, aby upewnić się, że rurka jest osłonięta przed światłem. Weź niewielką ilość aliquotu przed i po oznakowaniu do elektroforezy SDS-PAGE.
27. Filtruj oznaczoną próbkę za pomocą filtrów wirówkowych o pojemności 0,22 μm przed załadowaniem do systemu oczyszczania, ponieważ peptyd może się wytrąc.
28. Przygotuj kolumnę wysokorozdzielczej chromatografii jonowowymiennej z wyprzedzeniem, jak opisano wcześniej (krok 2.20). Tym razem przykryj kolumnę i system zbieraczy frakcji folią aluminiową, aby chronić próbkę przed światłem.
29. Aby usunąć wolny peptyd, załaduj przefiltrowaną próbkę do kolumny do wysokorozdzielczej chromatografii jonowej. Oczyszczenie wykonaj w taki sam sposób, jak opisano wcześniej (kroki 2.21-2.22). Upewnij się, że oznaczony CMG eluuje w stężeniu Buforu-B podobnym do poprzedniego.
30. Wykonaj elektroforezę SDS-PAGE w celu weryfikacji jakości wybranych ułamków. Aby obrazować fluorescencję, nie gotuj próbek przed załadowaniem i upewnij się, że zbiornik elektroforezy jest chroniony przed światłem. Najpierw zwizualizuj fluorescencję białek za pomocą systemu obrazowania żelowego, następnie zabarw żel barwnikiem Coomassie i zrób obraz, aby zobaczyć wszystkie białka.
31. Dializuj wybrane frakcje przez noc w temperaturze 4 °C, przy 1,5 L bufora dializacyjnego. Jeśli to konieczne, skoncentruj próbkę.
32. Błyskawicznie zamroz białko w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

3. Przygotowanie komórki przepływowej (Rysunek 3)

1. Przygotuj pokrywki biotyno-PEG zgodnie z wcześniej opisanym protokołem¹¹, pomijając etap pieczenia w piekarniku. Pokrywki biotyny-PEG są stabilne przez co najmniej miesiąc pod próżnią na RT. Aby przygotować komórkę przepływową, przetnij pokrywę biotynowo-PEG (24 mm x 60 mm) na pół (około 24 mm x 30 mm).
   UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać centralnej części pokrywy, gdzie będą się znajdowały kanały przepływu.
2. Przygotuj małe szklane kawałki, trawiąc i łamiąc szklaną szkiełkę na kawałki o wymiarach około 2,4 cm x 1 cm.
3. Wywierć dwa otwory oddalone od siebie o 1,4 cm za pomocą wiertła powlekanego diamentem 0,8 mm, z których jeden jest nieco szerszy od drugiego (0,043" = wlot, 0,048" = wylot). Sprawdź, czy otwory mają odpowiedni rozmiar, próbując włożyć kawałek rury wlotowej/wylotowej, używając tego samego wiertła, aby poszerzyć otwór, aż rurka będzie pasować. Upewnij się, że rurka jest na tyle szczelna, aby łatwo nie wypadła.
   UWAGA: Stosuje się węższe rury wlotowe, aby zminimalizować objętość martwą.
4. Wytnij taśmę dwustronną o takim samym kształcie jak szklane elementy.
5. Wyrównaj suwak na taśmie i przebij igłę przez każdy otwór, aby oznaczyć ich pozycję na tejpce. Używając żyletki, wytnij kanał obejmujący oba otwory.
   UWAGA: Nie tnij kanału zbyt długo, ponieważ nadmiar przestrzeni po przeciwnej stronie każdego otworu może pozostać suchy podczas dopływu cieczy i prowadzić do problemów z pęcherzykami powietrza podczas przepływu. Podczas cięcia staraj się ciąć długie krawędzie jednym czystym cięciem, ponieważ postrzępione krawędzie po wielokrotnych cięciach mogą wpływać na jakość kanału przepływowego. W podobnym celu nie wycinaj krawędzi kanału przepływowego, ponieważ cięcia w użytecznym kawałku mogą wpływać na przepływ cieczy lub nawet powodować wyciek w zmontowanej komórce.
6. Wyczyść szkło acetonem i chusteczką aż wyschnie, a następnie połóż na czystej powierzchni. Zdejmij jedną stronę taśmy klejącej i przyklej ją do szklanej części tak, aby oba otwory były całkowicie wewnątrz kanału.
7. Taśmę uszczelnij do szklanego elementu, używając końcówki pipety p1000, aby wyeliminować pęcherzyki poprzez mocne, ale umiarkowane naciskanie powierzchni. Przejdź przez całą powierzchnię, aby uszczelnić.
8. Obierz drugą krawędź taśmy z obu szklanych elementów i połóż je na czystej powierzchni tak, że lepka strona jest do góry. Umieść szkiełki blisko siebie, ale nie dotykając się w miejscu, w którym będą przymocowane do pokrywy (pozostawij wystarczająco dużo miejsca między nimi, aby epoksyd mógł całkowicie uszczelnić każdą szklankę).
9. Podnieś pół pokrywy biotyny-PEG za pomocą plastikowej pęsety, trzymając tylko za krawędź (nie dotykaj miejsca, gdzie powstaje kanał przepływowy), i opuszcz funkcjonalizowaną stronę PEG na klej. Zabezpiecz ją, naciskając palcem, aby ją przymocować, a następnie uszczelnienie zakończ, mocno pocierając powierzchnię końcówką pipety, aby usunąć pęcherzyki powietrza (nie na obszarze kanału przepływowego, bo mogą się rozbić), a następnie odwróć na bok.
   UWAGA: Ostrożnie obchodz się z listwą przykrywką.
10. Dla każdej komórki przepływowej wycinaję ~10 cm każdego typu rurek polietylenowych (PE20 i PE60). Użyj węższej rury jako wlotu do komory przepływowej, aby zmniejszyć martwą objętość.
11. Włóż ręcznie rurkę do otworów w zamku. Jeśli średnica otworów jest prawidłowa, upewnij się, że rurka sama stoi w otworze po włożeniu. Przytnij końcówkę rurki pod lekkim kątem <45°, aby ułatwić jej włożenie i zapobiec tworzeniu uszczelnienia przy slipie pokrywającym (co może się zdarzyć, jeśli koniec jest płaski (może to utrudniać przepływ).
    UWAGA: Dokładne dopasowanie rurki do szklanej części sprawia, że konstrukcja komórek przepływowych jest bardziej niezawodna i pomaga uniknąć wprowadzania pęcherzyków do komórki przepływowej.
12. Dobrze wymieszaj składniki epoksydowe, a następnie użyj końcówki p200, aby nałożyć epoksyd, uszczelniając rurkę i tworząc uszczelnienie wokół każdego kawałka szkła. Dodaj tyle epoksydu, by sięgało do krawędzi okrągłego slipu, co dodatkowo wzmocni delikatną pokrywkę. Upewnij się jednak, że żadna epoksydowa nie dostanie się na spodzie pokrywy, ponieważ może zapobiec jej położeniu się płasko na scenie.
    UWAGA: W razie potrzeby można zeskrobać niewielkie ilości nadmiaru epoksydu z spodu żyletką.
13. Pozostawić co najmniej 30-60 minut, aż epoksyd całkowicie utwardzi.
    UWAGA: Jeśli ogniwa przepływowego nie należy używać od razu, przechowuj je pod próżnią w RT po pełnym utwardzeniu.
14. Po użyciu komórki przepływowej odzyskaj kawałki szkła i używaj ich w nieskończoność. Wyciągnij rurkę i umieść komorę przepływową w słoiku z acetonem na co najmniej 24 godziny, aby zmiękczyć epoksyd i klej dwustronny, co pozwala łatwo usuwać szklane elementy. Przed ponownym użyciem do stworzenia kolejnej komórki przepływowej, wyczyść szkła, szorując je gąbką i wodą z mydłem, wysusz i wyszoruj acetonem oraz bibułką.

Rysunek 3: Graficzne przedstawienie przygotowania komórki przepływowej. (A) Przyciąć taśmę dwustronną, aby dopasowała rozmiar szklanego elementu. Ustaw suwak na górze taśmy i zaznacz pozycję każdego otworu igłą. Używając żyletki, przetnij wokół każdego uchwytu, tworząc kanał. (B) Obierz jedną stronę taśmy i przyklej ją do szklanego elementu. Upewnij się, że oba otwory znajdują się wewnątrz kanału. Obierz drugi koniec taśmy i przyklej na wierzch pokrywkę biotynowo-PEG. (C) Włóż rurkę polietylenową do każdego otworu i uszczelnij rurkę epoksydem, jednocześnie uszczelniając każdy element szkła z pokrywką. (D) Po użyciu obu kanałów wyjmij rurkę i umieść komórkę przepływową w słoiku do barwienia wypełnionym acetonem. Po około 24 godzinach epoksyd i taśma zmiękną, a warstwy komórki przepływowej można rozdzielać. Kawałki szkła można odzyskać i przechowywać w acetonie, aby być wykorzystywane w nieskończoność do tworzenia kolejnej komórki przepływowej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Test TIRF z pojedyncząłką do wizualizacji rozwijania DNA podleganego CMG

1. Przygotuj następujące.
   1. Przygotuj bufor blokujący (20 mM Tris, pH 8,0; 50 mM NaCl; 2 mM EDTA; 0,2 mg/mL BSA). Przefiltruj bufor za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 μm i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotuj 10x bufor reakcji 1 (250 mM HEPES pH 7,5; 50 mM NaCl; 100 mM octana magnezu). Przefiltruj bufor za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 μm i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotuj 10x bufor reakcji 2 (250 mM Tris, pH 7,5; 100 mM octan magnezu; 1,25 M glutaminian potasu; 1 mM EDTA; 0,025% Tween-20). Przefiltruj bufor za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 μm i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
2. Odgazuj około 2,5 mL buforu blokującego i 5 mL wody ultraczystej, umieszczając otwarte rurki w osuszaczce i pozostawiając je w próżni przez 15 minut.
   UWAGA: Nie napełniaj rurek po brzegi, ponieważ pęcherzyki podczas odgazowywania mogą powodować rozpryskiwanie cieczy.
3. Umieść komorę przepływową na podłożu mikroskopowym i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą klejowej masy na obu końcach. Ważne jest, aby dobrze zabezpieczyć, aby zapobiec późniejszemu przesuwaniu się komórki przepływowej podczas akwizycji.
4. Podłącz rurkę wylotową komórki przepływowej z pompą strzykawkową, która ma rurkę przymocowaną do strzykawki z igłą na drugim końcu. Włóż tę igłę do rury wylotowej, aby połączyć komórkę przepływową.
5. Włącz podgrzewacz obiektywu na 30 °C.
6. Przymocuj 1-2 mL odgazowanej wody w rurce na osobnym kawałku kleju blisko komory przepływowej, aby rurka wlotowa mogła zostać włożona i sięgnąć dna rurki.
7. Przepuszczaj wodę przez kanał, a następnie użyj szybszego przepływu, aby usunąć uwięzione pęcherzyki w pobliżu rury wlotowej, dodając więcej wody w razie potrzeby. W przeciwnym razie duże pęcherzyki mogą zostać później przesunięte i przejść przez kanał. Poczekaj na kilka minut, aby przepływ całkowicie ustał, ponieważ szybki przepływ może powodować resztkowe wyciąganie płynu przez pewien czas po zatrzymaniu, gdy ciśnienie wewnątrz strzykawki się stabilizuje.
   UWAGA: Każde DNA, które ma kontakt z bańką, staje się bezużyteczne, nawet po ponownym nawodnieniu.
8. Dodaj 100 μL odgazowanego bufora blokującego do 20 μL aliquotu 1 mg/mL streptawidyny. Przymocuj otwartą rurkę do szpachli klejowej i przenieś rurkę wlotową z wody do streptawidyny. Przepływ z prędkością 40 μL/min przez 2 minuty (łącznie 80 μL) i inkubacja przez 5 minut.
9. Usuń nadmiar streptawidyny za pomocą buforu blokującego (50 μL/min dla 100 μL).
10. Przepływ w biotinylowanym DNA, rozcieńczonym w buforze blokującym 25 nM SYTOX pomarańczowym. Obraz za pomocą podglądu na żywo laserem 532 nm, aby obserwować DNA przyczepiające się do powierzchni w czasie rzeczywistym.
11. Gdy osiągnięta jest przybliżona gęstość DNA na powierzchni, przepływ w buforze blokującym, również z 25 nM SYTOX (50 μL/min dla 100 μL), aby wypłukać wolne DNA.
12. Przepływ biotynowo zorganizowanego przeciwciała antydigoksygeniny (~10 μg/mL) rozcieńczonego w buforze blokującym zawierającym 25 nM pomarańczowego SYTOX (100 μL/min dla 300 μL).
    UWAGA: Pomarańcz SYTOX wplata się między parami zasad DNA, wydłużając długość konturu. Oznacza to, że długość DNA od końca do końca rośnie w odcieniu pomarańczowym SYTOX, co pozwala drugiemu łańcuchowi przyczepić się do powierzchni dalej od pierwszego, co daje lepsze rozciągnięcie DNA, gdy pomarańczowy SYTOX zostanie później wyblaknięty. Użycie innej części na każdym końcu DNA pozwala na bardziej równomierne przywiązanie DNA do powierzchni pokrywy (Rysunek 4). Gdy oba końce są biotinylowane, łączą się w tym samym etapie, co powoduje znaczne różnice w pozycjach przystawu. Użycie digoksygeniny na jednym końcu daje większą kontrolę nad pokryciem DNA przed przywiązaniem drugiego. Pozwala to również zwiększyć pokrycie DNA poprzez inkubację.
13. Usuń biotynilowane przeciwciało antydigoksygeniny oraz pomarańczę SYTOX z buforem blokującym (50 μL/min dla 100 μL).
14. Zrób 120 μL 'ATP-g-s mieszanki' (1x bufor reakcji 1, 0,75 mg/mL BSA, 1,25 mg/mL kazeiny, 8 mM DTT, 0,33 mM ATP-g-s), dodaj 30 μL do nowej rurki, a następnie przepłynij 50 μL z oryginalnej rurki do komory przepływowej (50 μL/min dla 50 μL). Pomaga to zminimalizować efekt mieszania buforowego poprzez cofnięcie lub dyfuzję z rury wyjściowej.
15. Dodaj oczyszczony CMG do ~100 nM końcowej mieszanki w 30 μL mieszanki ATP-g-s, następnie wprowadzaj z ciśnieniem 20 μL/min przez 20 μL. Inkubuj przez 15 minut.
16. Składa się z 120 μL mieszanki 'ATP/RPA' (1x bufor reakcji 1, 0,75 mg/mL BSA, 8 mM DTT, 3,3 mM ATP, 20 nM EGFP-hRPA) i przepływ do komory przepływowej z prędkością 40 μL/min przez 80 μL.
17. Natychmiast zacznij robić zdjęcia. Uzyskuj 6 x 6 pól widzenia dla każdej klatki co 30 sekund (lub odpowiednią liczbę klatek dla eksperymentu). Niższe liczby klatek na sekundę mogą zmniejszyć ekspozycję laserową i fotobielenie fluoroforem. Wizualizuj EGFP-hRPA za pomocą lasera 488 nm przy mocy 1%. Jeśli CMG jest oznaczone, np. LD655, wyobraź sobie CMG z laserem 640 nm (maksymalna moc = 30 mW) przy mocy 10%. Wizualizuj DNA barwione pomarańczowo SYTOX laserem o średnicy 532 nm z mocą 0,5%. Używaj każdego lasera z ekspozycją 50-100 ms.
    UWAGA: Za każdym razem, gdy rurka wlotowa komory przepływowej jest przenoszona z jednej rurki z cieczą do drugiej, należy kilka razy stuknąć końcówką rurki o dno rurki przed jej wyjmowaniem z cieczy. Pomaga to zapobiec przedostawaniu się bąbelków podczas transferu. Minimalizuj czas, przez jaki końcówkę rury wlotowej jest trzymana poza cieczą i nie kieruj końcówki do góry ani nie unosz jej znacznie, ponieważ powoduje to odpływ cieczy w kierunku kanału i wciąganie powietrza do końcówki. Podczas przenoszenia rurki dolotowej staraj się nie naprężać rury, ponieważ może to wyciągnąć ją z epoksydu i przymocować do komórki przepływowej. Do obrazowania odwijania DNA, w obecności pomarańczowego SYTOX do wizualizacji dwuniciowego DNA, zamień 10x bufor reakcji 1 na 10x bufor reakcji 2 dla mieszanki ATP/RPA. SYTOX pomarańczowy lepiej wiąże się z DNA w takich warunkach. Całkowicie opróżnij pompę strzykawkową na końcu każdego eksperymentu. Od czasu do czasu myj, napełniając wodą i opróżniając kilka razy lub rozbierając i myjąc wodą z mydłem.

Rysunek 4: DNA przywiązujące się do powierzchni. (A) Podczas łączenia substratów DNA biotyną na obu końcach odległość między dwoma linami może się różnić w zależności od tego, jak końce stykają się z powierzchnią (i). Stosując digoksygeninę na jednym końcu, można oddzielić czasowo połączenia każdego końca, aby uzyskać bardziej spójne odległości i równomiernie rozciągnięte DNA (ii). (B) Przykładowe pole widzenia pokazujące DNA powiązane na obu końcach (znakowane digoksygeniną) i barwione fluorescencyjnym barwieniem kwasów nukleinowych. DNA, które jest połączone na obu końcach, pojawia się jako linia, natomiast DNA związane tylko jednym końcem pojawia się jako plamki. Idealnie DNA powinno być sprzężone jak najgęstsze bez nakładania się na inne DNA. Obraz ma wymiary 512 x 512 pikseli (rozmiar piksela = 154,6 nm). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Wyniki

Gdy CMG rozwija DNA, charakterystyczny trakt RPA będzie się rozwijał z czasem (Rysunek 5). 5-stopowy koniec nieowiniętego DNA jest przywiązany do powierzchni; dlatego postrzega się go jako liniowy odcinek sygnału RPA między liną a widłem. Koniec 3' nie jest powiązany i dlatego porusza się razem z wideleciem i jest obserwowany jako zwarty sygnał EGFP-RPA. Pozycja skompresowanej nienawitej linii translokacyjnej odpowiada mniej więcej pozycji widelca replikacyjnego, który porusza się razem z LD655-CMG wizualizowanym za pomocą lasera 640 nm.

Ważne jest, aby minimalizować uszkodzenia substratu DNA, ponieważ uszkodzenia takie jak nacięcia pojedynczoniciowe zmniejszają liczbę obserwowalnych zdarzeń rozwijania, ograniczając ilość danych, które można zebrać (Rysunek 6).

Rysunek 5: Test rozwijania DNA na pojedynczą. Podłoże DNA jest przymocowane do powierzchni pokrywkowej. Oczyszczony CMG oznaczony LD655 jest inkubowany z DNA przez 15 minut w ATP-g-s. Dodaje się ATP oraz oczyszczone RPA znakowane EGFP, co inicjuje rozległe rozwijanie DNA przez CMG. Pokazano schemat rysunkowy (po lewej) oraz kymograf reprezentatywnych danych (po prawej). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Uszkodzenie DNA zmniejsza przepustowość testu. (A) CMG nie może rozwinąć DNA poza przerwaniem w szkieletu DNA (DNA cięcie). Nacięcie na szablonie wiodącej nici powoduje zsuwanie się CMG z DNA, a zarówno CMG, jak i szablon wiodącej nici zostają utracone. Uszkodzenie na zaciętej nici powoduje oddzielenie się od reszty DNA, a każdy fragment DNA cofa się do swojego odpowiedniego połączenia. Ilustrują to (i) rysunki kreskówkowe oraz (ii) kymografie tych wydarzeń (ii). Reprezentatywne dane z (B) minimalnie uszkodzonym substratem DNA w porównaniu do (C) bardziej uszkodzonego substratu DNA w (i) 5 min, (ii) 15 min i (iii) 60 min w jednym polu widzenia. Bardziej uszkodzone podłoże DNA nie generuje długich odcinków rozwijania, ponieważ CMG napotykają rany wcześniej, mimo podobnego poziomu aktywności rozwijania (podobna gęstość rosnących plam RPA po 5 minutach, co wskazuje na podobną efektywność ładowania/rozwijania CMG). Pole widzenia wynosi 512 x 512 pikseli (rozmiar piksela = 154,6 nm). 1% mocy lasera (488 nm) obrazowanie EGFP-RPA. Pasek skali pokazujący 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Ten test stanowi platformę do obserwacji i badania dynamiki poszczególnych CMG w czasie rzeczywistym, zarówno w izolacji, jak i w kontekście pożądanych dodatkowych czynników. Jednak, jak w przypadku wielu technik fluorescencji pojedyncząłych, istnieją pewne typowe wyzwania, które wymagają optymalizacji. Zazwyczaj dotyczą one fluoroforów obrazowania przez długi czas (fotobielenie, jasność), przygotowania substratu DNA (uszkodzenia DNA), jakości powierzchni komórek przepływowych (szum tła, interakcje niespecyficzne) lub jakości przygotowania oczyszczonego białka (zanieczyszczenie nukleazą, efektywność znakowania).

Każdy fluorofor różni się pod względem fotostabilności i jasności, dlatego ważne jest, aby wybrać odpowiednią cząsteczkę. Podczas obrazowania fluorescencyjnie oznakowanych białek oligomerowych, takich jak RPA, można użyć niższej mocy lasera, ponieważ wiele fluoroforów zostanie wzbudzonych w bliskim sąsiedztwie, generując widoczny sygnał. Do obrazowania pojedynczych fluoroforów, na przykład CMG oznaczonych na pojedynczej podjednostce, potrzebna jest wyższa moc lasera, aby wyraźnie obserwować fluorofor. Żywotność fluoroforu można wydłużyć poprzez minimalizację ekspozycji laserowej, na przykład poprzez zmniejszenie częstotliwości wykonywania zdjęć. Dodatkowo, pobudzenie fluoroforu generuje reaktywne ilości tlenu (ROS), które mogą przyczyniać się do fotobielenia. Włączenie systemu usuwania tlenu do bufora obrazowego może wydłużyć żywotność fluoroforów poprzez eliminację ROS. Jednak niektóre systemy usuwania tlenu mogą wpływać na pH¹².

W przypadku przygotowania podłoża DNA kluczowe jest minimalizowanie uszkodzeń DNA, takich jak nacięcia czy szczeliny jednoniciowe. Nadmierne uszkodzenia zapobiegają rozległemu rozwijaniu DNA, ograniczając ilość danych, które można zebrać. Uszkodzenia mogą powstać w wyniku ścinania mechanicznego, nadmiernego nagrzewania, zanieczyszczenia nukleazą lub ROS powstającego podczas obrazowania. Strzyżenie można zminimalizować, obchodząc się z próbką DNA ostrożnie, stosując szerokie końcówki do pipetowania, pipetując powoli i unikając przesuwania próbki. Wpływ ROS można zminimalizować poprzez zmniejszenie ekspozycji na laser lub włączenie systemu usuwania tlenu do bufora obrazowania. Po przygotowaniu substratu DNA można użyć komercyjnych zestawów naprawczych DNA do naprawy uszkodzeń przed przeprowadzeniem reakcji odwijającej.

Skuteczność rozwijania DNA zależy również od czystości i aktywności CMG. Dobrą praktyką jest ocena czystości próbki po każdym kroku oczyszczania za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, aby określić, gdzie konieczna jest optymalizacja. Jeśli po ostatnim kroku zaobserwowane zostanie zbyt wiele zanieczyszczeń, może pomóc modyfikacja objętości gradientu soli używanej do elucii z kolumny CaptoHiRes Q (5/50). Bardzo ważne jest również usunięcie nadmiaru fluorescencyjnego peptydu używanego do znakowania białek, ponieważ może on tworzyć niepożądane tło na powierzchni pokrywy. Ważne jest również unikanie zanieczyszczenia nukleazą, ponieważ może to degradować podłoże DNA. Po eksperymencie zabarwienie pozostałego DNA SYTOX na pomarańcz może być dobrym sposobem na sprawdzenie, czy DNA uległo znacznej degradacji. Pewien poziom uszkodzenia DNA jest nieunikniony w trakcie eksperymentu, ale poważne uszkodzenia często wskazują na problematyczne zanieczyszczenie nukleazą.

Test jest również z natury ograniczony rozdzielczością plam ograniczonych dyfrakcją, wymagając, aby białka fluorescencyjne znajdowały się setki par zasad (jeśli nie więcej), aby odróżnić je jako oddzielne. Ogranicza to szczegółowość, z jaką można obserwować postęp i interakcje CMG.

Liczba obserwowanych zdarzeń rozwijania się w każdej analizie różni się. Aby eksperyment był udany, spodziewamy się co najmniej kilku odcinków RPA o wystarczającej długości na pole widzenia 512x512 pikseli (rozmiar piksela = 154,6 nm). W tym samym eksperymencie można obrazować wiele pól widzenia, co pozwala na większą ilość danych, gdy jest to konieczne. Drogi nie muszą mieć tej samej długości ani sięgać końca DNA, aby były użyteczne. Na przykład średnią odległość lążenia dla każdego eksperymentu można określić, mierząc długość DNA barwionego SYTOX przed dodaniem CMG. Można to wykorzystać do oszacowania, ile DNA zostało odwinięte w dowolnym traktie RPA (o ile jest wystarczająco dużo DNA, by widocznie poruszać widelec), przeliczając odległość z "μm przejęte" na "kb unwound".

CMG wykazuje aktywność rozwijania na różnych substratach DNA, jednak konieczne jest zapewnienie wolnego 3' końca DNA na poliT płatku o co najmniej 30 nt, aby pomieścić powierzchnię CMG¹⁰. Umieszczenie wielu części biotynowych na rozwidleniu zapewnia solidne ukojenie powierzchniowe. Reszta substratu DNA może być przeprojektowana na wiele sposobów, na przykład uwzględniając różne sekwencje, długości i modyfikacje chemiczne DNA. Konformacja DNA może być zmieniona przez zastosowanie różnych stężeń octana magnezu. W wyższych stężeniach (≥10 mM) octana magnezu filament ssDNA pokryty RPA ulega zagęszczeniu, co prowadzi do wyciągania DNA przez wiązanie RPA podczas rozwijania. Może to być przydatne, ponieważ zapobiega nadmiernemu przesuwaniu się DNA, pozwalając dokładniej zmierzyć położenie CMG i rozwijający się progresję. W niskich stężeniach (~3 mM) octana magnezu RPA-ssDNA pozostaje rozluźnione przez cały czas.

Opisany test pojedyncząłowy stanowi platformę, którą można rozwijać i modyfikować w celu dalszego badania aspektów replikacji DNA. Podczas replikacji DNA CMG działa jak rdzeń, wokół którego składa się odpowiedź i jej składniki. Dlatego do tego testu można dodać dodatkowe oczyszczone białka, w tym czynniki dodatkowe takie jak TIMELESS, TIPIN i CLASPIN, aby badać ich wpływ na dynamikę CMG. Wykazano, że te białka wpływają na szybkość replikacji widełek¹³, ale nie jest jasne, w jaki sposób wpływają na tempo rozwijania CMG. Dlatego warto zbadać, jak różne białka reresponsivesome wpływają na CMG za pomocą tego testu. Dodawanie polimeraz DNA może dać lepszy wgląd w replikację DNA wykraczającą poza samo rozwijanie DNA, jak opisano wcześniej w przypadku białek drożdżowych¹⁴. Ponadto oczyszczanie zmodyfikowanego CMG może lepiej zrozumieć, jak niektóre mutacje lub modyfikacje potranslacyjne wpływają na aktywność helikazy^15,16. Dodatkowo, projektowanie różnych substratów DNA pozwala na badanie rozwijania DNA przez CMG w różnych warunkach naśladujących stres replikacyjny¹⁷. Modyfikacje te obejmują przeszkody DNA ^9,18, połączenia międzynici 19,20,2 ¹ oraz nieciągłości w nici DNA²².

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148-25ML
Akryloamid / roztwór Bis 40%	BioRad	1610148
Agarose UltraPure	Invitrogen	16500-500	Używany do przygotowania Tris Buffer (pH 8)
Ä KTA Pure	GE Healthcare	-	Używany z kolektorem frakcji F9-C; System oczyszczania białek
ŻEL POWINOWACTWA ANTY-FLAG M2	Sigma-Aldrich	A2220
APS 10%	Sigma-Aldrich	A3678-25G
ATP (200 mM)	Sigma-Aldrich	A7699-5G
ATP-g-s (100 mM)	Sigma-Aldrich	11162306001
Pokrywka biotynowo-PEG	Nie ma	Nie ma	Przygotowane zgodnie z opisem: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033
Biotynolowe przeciwciało antydigoksygeniny	Perkin Elmer	Nie ma
Blu Tack	Bostik	Nie ma	Maść klejowa
Kwas borowy	Thermo Fisher Scientific	B/3800/53
BSA; 33 mg/mL	SIGMA-ALDRICH	A3858-10G	Rozcieńczone z bulionu
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
CaptoHiRes Q (5/50)	Cytiva	29275878	Połączony z systemem oczyszczania białek AKTA; Kolumnowa chromatografia jonowa o wysokiej rozdzielczości
Kazeina (5% w wodzie, 50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	C4765-10ML
System ChemiDoc	Bio-Rad	Nie ma
Klipy	Nie ma	Nie ma
Deska do krojenia	Nie ma	Nie ma
Rurka dializowa (3,5 kDa)	Fisher Scientific	11425859
digoksygenina-11-dUTP	Roche	11209256910
barwnik do ładowania DNA 6x	NEB	B7024S
dNTP 10 mM	NEB	N0447S
Taśma dwustronna (0,14 mm grubości)	Nie ma	Nie ma
DTT	Fluorochem Limited	M02712-10G
PEPTYD DYKDDDDK	Nie ma	Nie ma	Syntetyzowane przez biologię chemiczną STP Instytutu Francisa Cricka
EDTA	Thermo Fisher Scientific	D/0700/68
EGFP-RPA	Nie ma	Nie ma	Oczyszczone, jak opisano w ' Single Molecule Analysis', Series Methods in Molecular Biology, tom 783 (2011), Peterman, E. J. G. i Wuite G. J. L. redaktorzy, Humana Press. Informacje o białku: 2 mM, ludzkie, wyrażane w E. coli.
EGTA	Sigma-Aldrich	03779-10G
Epoksyd - 5 minut	Devcon	20845
Fujifilm FLA-5000	Fujifilm	FLA-5000	Analizator obrazu fluorescencyjnego
GelRed barwienie kwasem nukleinowym; 10000x	Cambridge Bioscience	41003-BT	Przykład barwienia kwasów nukleinowych, które jest bezpieczniejszą alternatywą dla bromku etydu.
Szkło lub kwarc z otworami na rurki	Dremel Model 395		Suwak o grubości 1 mm, wycięty na 2,4 cm x 1 cm, dwa otwory wywiercone w odległości 1,4 mm. Otwory powinny być wiercone o różnych rozmiarach, aby pomieścić różne rury na każdym końcu.
Glicerol	Fisher Scientific	G/0650/17
Glycine HCl, pH 3,5	Sigma-Aldrich	G8898
Strzykawka Hamilton, seria 1000 GASTIGHT, zamek luer PTFE 1010TLL, zamek luer PTFE (ze szczelinami), objętość 10 mL	Merck	26211-U
HEPES pH 7,5	Sigma-Aldrich	H4034
I-Ceul	NEB	R0699L
KCl	Fisher Scientific	P/4280/53
Octan magnezu	Sigma-Aldrich	M2545
zestaw do dializ z rurką Maxi GeBa; MWCO 14 kDa	Generon	D055
Metalowa szpatułka	Nie ma	Nie ma
Metalowe pęsety	Nie ma	Nie ma
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Millex-GP (filtry strzykawkowe) 0,22 & mikro; m	Merck	SLGP033RS
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Igła	Nie ma	Nie ma
NotI-HF	NEB	R3189L
NuPAGE 4%– Żele białkowe Bis-Tris 12%	Thermo Fisher Scientific	10247002;
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer	Thermo Fisher Scientific	NP0001
Podgrzewacz obiektywu	Okolab	Nie ma
Mieszanka PCR - 2x			Przygotowane z polimerazy DNA Phusion (20 & mikro; L), 10 mM dNTP (40 i mikro; L), 5x bufor HF Phusion (400 i mikro; L) oraz wody (540 & micro; L).
Peptyd NH2-CHHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, znakowany LD655-MAL	Nie ma	Nie ma	peptyd NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, oznaczony LD655-MAL (Lumidyne Technologies) na resztie cysteiny, został zsyntetyzowany i oczyszczony przez chemię peptydów STP Instytutu Francisa Cricka
Plazmid pGC261	Nie ma	Nie ma	https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053
Polimeraza DNA Phusion o wysokiej wierności	NEB	M0530L
Plastikowe pęsety	Nie ma	Nie ma
Rury polietylenowe PE20 (średnica wewnętrzna 0,015", średnica zewnętrzna 0,043")	Becton Dickinson	427406
Rury polietylenowe PE60 (średnica wewnętrzna 0,03", średnica zewnętrzna 0,048")	Becton Dickinson	427416
kolumny chromatografii poliprep; 10 ml i 20 ml & nbsp;	Bio-Rad	7311550
Glutaminian potasu (kwas L-glutaminowy, sól potasowa monohydrata)	Sigma	G1501-1KG
Koktajl inhibitorów proteazy (cOmplete, wolny od EDTA)	Roche	5056489001
Pompa 11 Elite Infuzja/Pobieranie Programowalna Pojedyncza Strzykawka	Aparat Harvarda	70-4504
Zestaw do oczyszczania PCR QIAquick	QIAGEN	28104
Żyletka	VWR International Ltd	233-0156
rCutSmart Buffer; 10x	NEB	B6004S
Octan sodu	Thermo Fisher Scientific	S/2120/53
Sortaza (pentamutant)	Nie ma	Nie ma	Oczyszczony na podstawie: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108
Filtry rurowe wirówkowe Spin-X; 0,22 & mikro; octan celulozy m & nbsp;	Fisher Scientific	10310361
Skalpel sterylny	Nie ma	Nie ma
Steritop próżniowy system filtracji jednorazowej napędzanej; 0,22 um; PES;	Millipore	S2GPT05RE
Streptawidyna (1 mg/mL) w 1x buforze PBS	Sigma	S4762-10MG	20 & mikro; L alicytaty
SYBR Gold	Thermo Fisher Scientific	S11494	Wysoce czułe barwienie kwasu nukleinowego, którego użyliśmy do wizualizacji podłoża DNA fork.
SYTOX pomarańczowy; 5 & mikro; M w DMSO	Thermo Fisher Scientific	S11368
Ligaza DNA T4	NEB	M0202M
Bufor reakcji ligazy T4 DNA	NEB	B0202S
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-25ML
Proteaza TEV (1 mg/mL); EZCut	Biowizja	7847-10000
Młynki do tkanek, typ Dounce (40 mL, Wheaton)	DWK Nauki o Życiu	432-1273
Baza Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Używany do przygotowania Tris Buffer (pH 8)
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Tween-20	Promega UK Ltd	H5152