Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

Podsumowanie

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Streszczenie

Istnieje szereg modeli biofilmu bakterii do testowania antybiotyków. Jednak wiele z nich ogranicza się do jednego wyniku eksperymentalnego, takiego jak jednostki tworzące kolonie lub aktywność metaboliczna. Co więcej, wiele modeli biofilmu nie odzwierciedla biologicznych i fizykochemicznych właściwości środowiska gospodarza człowieka. Jest to ważna kwestia w wielu schorzeniach, ale najbardziej zauważalna w mukowiscydozie (CF). Duża część osób z mukowiscydozą cierpi zarówno na przewlekłe, jak i okresowe infekcje, a testy wrażliwości na antybiotyki in vitro słabo korelują z wynikami leczenia pacjentów. Niektóre modele biofilmu zawierają pożywki związane z płucami mukowiscydozy, w tym syntetyczne naśladownictwo plwociny, ale nie uwzględniają wielomikrobiologicznej natury środowiska, która zmienia architekturę biofilmu, fizjologię i sposób, w jaki drobnoustroje reagują na leczenie. Opisany tutaj model biofilmu kolonii na granicy faz ciało stałe i powietrze jest wysoce elastyczny i obejmuje zarówno pożywki istotne dla mukowiscydozy, jak i kontekst polimikrobiologiczny. Model ten może być również wykorzystywany do średnioprzepustowych badań przesiewowych środków przeciwdrobnoustrojowych oraz do badania ich wpływu na dynamikę polidrobnoustrojów. Pomiary wyjściowe z modelu mogą obejmować jednostki tworzące kolonie, aktywność metaboliczną i analizę mikroskopii konfokalnej. Model można łatwo dostosować do różnych mikroorganizmów, mediów, temperatur i zmiennych warunków tlenowych i może być używany do testowania szerokiej gamy zabiegów chemicznych, biologicznych i fizycznych.

Wprowadzenie

Mukowiscydoza (CF) to choroba genetyczna, która dotyka ponad 11 000 osób w Wielkiej Brytanii i 162 000 osób na całym świecie^1,2. Chociaż mukowiscydoza jest chorobą wielonarządową, kluczowym objawem doświadczanym przez osoby z mukowiscydozą (pwCF) jest tworzenie się nienormalnie gęstego, odwodnionego śluzu w drogach oddechowych³. To, wraz ze zmniejszonym biciem rzęsek, może zwiększyć kolonizację płuc przez szeroką gamę bakterii, grzybów, wirusów i archeonów^4,5. Pomimo tego, że płuca z mukowiscydozą zapewniają warunki i selektywne naciski w celu ograniczenia wzrostu i przetrwania mikroorganizmów, bakterie takie jak Pseudomonas aeruginosa są wysoce przystosowane do tych trudnych środowisk⁶. Pozwala to zarówno na kolonizację, jak i przetrwanie, co skutkuje powstawaniem uporczywych przewlekłych infekcji⁷.

Wiele mikrobów, które powodują te przewlekłe infekcje, robi to za pomocą fenotypowego przejścia od początkowego planktonu do biofilmu, albo w formie przytwierdzonej powierzchni, albo w formie agregatów⁷. Te biofilmy charakteryzują się ciasno upakowanymi zbiorowiskami bakteryjnymi otoczonymi matrycą egzopolisacharydową (EPS) składającą się z różnych składników, w tym polisacharydów, białek, lipidów i środowiskowego DNA (eDNA)⁸. Ta matryca jest wspólną cechą mikroorganizmów; Jednak jego skład może się różnić. Na przykład głównymi składnikami polisacharydowymi macierzy bakteryjnej P. aeruginosa są Psl, Pel i alginian, w przeciwieństwie do grzybów Candida albicans, których głównymi składnikami matrycy polisacharydowej są mannany i glukany⁹. W biofilmach jednogatunkowych matryca ta może znacznie wpływać na tolerancję antybiotyków w porównaniu z planktonem, zmniejszając przenikanie antybiotyków do biofilmu, zmniejszając ich skuteczność¹⁰. Styl wzrostu biofilmu indukuje również tworzenie trwałych komórek o zmniejszonej aktywności metabolicznej w porównaniu z ich planktonowymi odpowiednikami, a tym samym dodatkowo zmniejsza podatność na antybiotyki¹¹. Ten styl wzrostu charakteryzuje się również regulacją w górę niektórych mechanizmów oporności na antybiotyki, takich jak pompy wypływowe i te wymagane do horyzontalnego transferu genów, umożliwiając wymianę genów oporności^11,12,13. Oprócz tego środowisko chorobowe gospodarza ma duży wpływ na fizjologię drobnoustrojów i sposób, w jaki reagują one na antybiotyki. Obejmuje to zwiększoną mikroaerobiozę w gęstym śluzie, a także dostępność niestandardowych źródeł węgla, takich jak aminokwasy i eDNA, pochodzących od gospodarza lub pochodzących z mikrobiologicznej degradacji produktów płucnych^14,15,16.

Te specyficzne interakcje są dodatkowo komplikowane przez polimikrobiologiczną naturę biofilmów, co wprowadza dodatkową warstwę złożoności ze złożonymi interakcjami nie tylko między bakteriami, ale także między bakteriami i grzybami. W porównaniu z biofilmami bakteryjnymi, mniej wiadomo na temat niektórych interakcji między biofilmami bakteryjnymi i grzybiczymi, mimo że C. albicans został wyizolowany od ponad 75% osób z mukowiscydozą¹⁵. Ogólnie rzecz biorąc, interakcje między C. albicans a bakteriami, takimi jak P. aeruginosa, są antagonistyczne, ale mogą prowadzić do bardziej przewlekłych i ciężkich infekcji¹⁸. Połączenie interakcji mikrobiologicznych, zarówno patogennych, jak i komensalnych, wraz z szeregiem czynników środowiskowych związanych z mukowiscydozą może ostatecznie skutkować zwiększoną tolerancją na antybiotyki^19,20. Wiele z tych czynników nie jest często branych pod uwagę w przedklinicznych testach antybiotykowych, mimo że przypisuje się je zwiększonej tolerancji na antybiotyki w istniejących modelach²¹.

Te warunki są również trudne do podsumowania in vitro, w wyniku czego wiele modeli nie ma obecności specyficznych czynników indukujących tolerancję obecnych w pwCF, takich jak te zwiększające produkcję beta-laktamazy u P. aeruginosa²², indukcja małych wariantów kolonii u Staphylococcus aureus i hamowanie dzielenia wyrazów u C. albicans; wykazano, że wszystkie te czynniki występują w plwocinie CF^23,24.

Istnieje zatem duża rozbieżność między warunkami stosowanymi w obecnych metodach testowania wrażliwości na antybiotyki, opartych na planktonowych lub agarowych kulturach hodowanych na standardowych podłożach, takich jak Mueller-Hinton z dyfuzją krążkową, Etest i testami mikrorozcieńczenia bulionu CLSI, a warunkami napotkanymi w środowisku gospodarza²⁵. Często nie pozwala to na dokładne określenie wrażliwości na antybiotyki²⁶. Problem ten dodatkowo komplikuje brak standaryzacji w testowaniu biofilmu przeciwdrobnoustrojowego, co utrudnia dokładne przełożenie skuteczności przeciwdrobnoustrojowej z laboratorium na klinikę^27,28.

Model polimikrobiologiczny, który tutaj opracowaliśmy, wykazuje zwiększoną tolerancję Pseudomonas aeruginosa na szereg środków przeciwdrobnoustrojowych, w tym meropenem i tobramycynę. Ilustruje to dużą różnicę między obecnymi testami przeciwdrobnoustrojowymi z wykorzystaniem biofilmów jednogatunkowych a modelem biofilmu wielodrobnoustrojowego opracowanym w tym badaniu w celu określenia minimalnych stężeń hamujących. Model ten utrzymuje również stosunkowo wysoką przepustowość i niski koszt, co jest pożądane w przypadku testów przeciwdrobnoustrojowych. Model może być również wykorzystany do zbadania wpływu terapii przeciwdrobnoustrojowej na dynamikę polidrobnoustrojów i ustalenia, czy dane leczenie może prowadzić do dominacji określonego patogenu, co umożliwia przewidywanie dalszych powikłań. Chociaż model ten pozwala na tworzenie złożonych biofilmów, jego tworzenie nie wymaga zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego i stanowi platformę dla szerokiego zakresu wyników klinicznych i badawczych.

Protokół

1. Przygotowanie syntetycznego środka do mukowiscydozy media-2 (SCFM2) i płytek

1. Przygotuj SCFM2 zgodnie z recepturą opisaną w Palmer et al.¹⁶ w butelce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 500 ml w stężeniu 2x z kilkoma modyfikacjami.
   1. Zważyć i przygotować zapasy zgodnie z tabelą 1. Przygotować zapasy aminokwasów zgodnie z tabelą 2.
   2. Odważyć 5 g mucyny (z żołądka świni (typ II)) i 600 mg eDNA (z nasienia łososia) w 100 ml dH₂O w butelce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 200 ml. Mieszać w temperaturze 4 °C przez noc przed sterylizacją w autoklawie.
   3. Do wysterylizowanej butelki o pojemności 500 ml dodaj 0,54 g glukozy, 6,06 g NaCl i 2,228 g KCl. Dodaj po 10 ml każdego z bulionów przygotowanych w kroku 1.1.1. Doprowadzić pH do 6,9 za pomocą 1 M NaOH lub HCl.
   4. Dodać 10 ml dH₂O, a następnie 10 ml 0,175 M CaCl₂ i 0,0606 M MgCl₂. Przygotuj i dodaj 10 ml 0,93 M kwasu L-mlekowego. Bezpośrednio przed użyciem dodać 10 ml 0,36 mM Fe(III)SO₄7H₂O
   5. Filtruj wysterylizuj SCFM2 za pomocą jednostki filtrującej i pompy próżniowej, a następnie dodaj autoklawowaną mucynę i eDNA.
      UWAGA: Przygotowany SCFM2 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
2. Przygotuj płytki agarowe SCFM2 zgodnie z poniższym opisem.
   1. Podgrzej 25 ml 2x SCFM2 w probówce o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C przed zmieszaniem z 25 ml wstępnie stopionego 3% (w/v) agaru technicznego, co daje mieszaninę 1x SCFM2 i 1,5% (w/v) agaru technicznego.
   2. Za pomocą pipety serologicznej przenieść 5 ml mieszaniny do każdego dołka płytki 6-dołkowej.
   3. Przygotuj taką samą liczbę krążków poliwęglanu o średnicy 13 mm i wielkości porów 0,2 μm, umieszczając je na dnie szalki Petriego i stosując UV-C przez 600 s przy długości fali 254 nm i częstotliwości 60 Hz. Odwróć krążki i powtórz procedurę UV-C.
   4. Po związaniu 1x SCFM2-1,5% (w/v) agaru technicznego, użyj sterylnych kleszczyków, aby dodać pojedynczy krążek poliwęglanowy do powierzchni każdej studzienki płytki 6-dołkowej.

2. Przygotowanie bakterii do infekcji

1. Przed ustawieniem modelu należy przygotować płytkę agarową na wymagane szczepy bakterii i grzybów zgodnie ze standardowym agarem używanym w laboratorium dla P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 i C. albicans SC5314 (np. bulion lizogeniczny z agarem 1,2% (w/v) dla bakterii i agarem z dekstrozą Sabouraud dla C. albicans).
   UWAGA: Aby ustalić model, użyto specyficznych laboratoryjnych szczepów referencyjnych. Jednak model ten był również stosowany w przypadku innych szczepów, w tym izolatów klinicznych, z pewnymi modyfikacjami, takimi jak wydłużenie czasu tworzenia się biofilmu przed leczeniem wolniej rosnących szczepów.
2. Użyj pętli inokulacyjnej o pojemności 1 μl, aby wybrać pojedynczą kolonię każdego mikroorganizmu, aby zaszczepić 5 ml standardowych laboratoryjnych płynnych pożywek (np. bulion lizogeniczny dla P. aeruginosa, S. aureus i dekstroza peptonu drożdżowego (YPD) dla C. albicans). Inkubuj te kultury, aż osiągną fazę wzrostu wykładniczego przy 200 obr./min, 37 °C dla bakterii i 200 obr./min, 30 °C dla C. albicans.
   UWAGA: Napowietrzanie będzie się różnić w zależności od inkubatora z wytrząsaniem i promienia obrotu

3. Konfiguracja modelu interfejsu stałego powietrza

UWAGA: Ogólny schemat modelu można zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym 1.

1. Przenieś 1 ml każdej płynnej kultury do oddzielnej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj przez 2 minuty przy 8 000 x g w celu osadzenia bakterii/grzybów. Wykonaj ten i wszystkie poniższe etapy wirowania w temperaturze pokojowej.
2. Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić granulki w 1 ml PBS przed ponownym odwirowaniem przez 2 minuty przy 8 000 x g.
3. Usunąć supernatant jak poprzednio i ponownie zawiesić granulki w 1 ml PBS. Rozcieńczyć zawieszone komórki P. aeruginosa i S. aureus w stosunku 1:10 w PBS i zmierzyć gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm.
4. Dostosować umyte próbki do 1 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml w oparciu o uprzednią walidację, że OD₆₀₀ 0,05 dla P. aeruginosa i 0,1 dla S. aureus jest równoważne 1 x 10⁸ CFU/ml.
5. W przypadku C. albicans rozcieńczyć umyte próbki w stosunku 1:100 w PBS, dodać po 10 μl każdej z nich do dwóch oddzielnych komór hemocytometru i użyć ustalonych wymiarów komory i rozcieńczenia użytego do obliczenia CFU/ml. Korzystając z ulepszonego hemocytometru Neubauera, obliczenia będą następujące:
   Liczba komórek = średnia liczba komórek × 10 000 / (współczynnik rozcieńczenia)
6. Obliczone jtk reprezentują C. albicans CFU/ml we wstępnie rozcieńczonej próbce. Dostosować próbkę C. albicans do 1 x 10⁸ jtk/ml w PBS, tak jak w przypadku kultur bakteryjnych.
7. Aby przygotować inokulum do dodania do biofilmu, należy dostosować inokulum P. aeruginosa do 1 x 10⁴ CFU/ml (2x 100-krotne rozcieńczenia), C. albicans do 1 x 10⁵ CFU/ml (100-krotne rozcieńczenie, a następnie 10-krotne rozcieńczenie) i na koniec S. aureus do 1 x 10⁶ CFU/ml (100-krotne rozcieńczenie) za pomocą PBS.
8. W przypadku biofilmów jednogatunkowych dodać 10 μl rozcieńczonego pożądanego drobnoustroju do środka krążka poliwęglanowego uprzednio umieszczonego na sześciodołkowych płytkach 1x SCFM2-1,5 % z agarem technicznym i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 24 godziny przed poddaniem działaniu lub przerwaniem.
9. W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych dodać 10 μl każdego S. aureus i C. albicans jeden na drugi na tym samym krążku. Inkubować zaszczepiony krążek statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Kolejność, w jakiej dodawane są inokulum S. aureus i C. albicans, nie wpływa na rozwój modelu i daje takie same wyniki.
10. Następnie przenieś krążki poliwęglanowe na świeże 1x SCFM2-1,5% płytki z agarem technicznym za pomocą sterylnych kleszczyków i dodaj 10 μl rozcieńczenia 1 x 10⁴ CFU/ml P. aeruginosa na wierzch wcześniej ustalonego biofilmu S. aureus - C. albicans. Inkubować przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: P. aeruginosa dodaje się 24 godziny po S. aureus i C. albicans, aby odzwierciedlić kolejność, w jakiej organizmy te często kolonizują płuca mukowiscydozy u osób z mukowiscydozą. Zapobiega to również wyrastaniu P. aeruginosa z pozostałych dwóch mikroorganizmów. Po dodaniu P. aeruginosa biofilm może być hodowany dłużej niż 24 godziny; Jednak krążek poliwęglanu z biofilmem musi być przenoszony na świeże podłoże co 24 godziny. Przed rozerwaniem biofilmy można wykorzystać do mikroskopii przy użyciu szczepów, które wyrażają białka fluorescencyjne, barwniki fluorescencyjne lub przeciwciała specyficzne dla szczepu/drobnoustroju. Warto jednak zauważyć, że niektóre barwniki plamią krążek poliwęglanowy.

4. Przerwanie biofilmu

1. Dodaj kulki ceramiczne o średnicy 2,8 mm do płytek i usieciuj płytki promieniami UV, jak opisano w kroku 1.3. Dodaj 5 kulek ceramicznych do sterylnej probówki homogenizatora o pojemności 2 ml za pomocą sterylizowanych płomieniowo kleszczy. Następnie odpipetować 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do probówki homogenizacyjnej o pojemności 2 ml.
2. Rurki wirować przez co najmniej 10 s lub do momentu, gdy biofilm zostanie usunięty z krążka poliwęglanowego, zgodnie z oględzinami, w którym to momencie należy usunąć krążek z poliwęglanu.
3. Umieść probówki z kulkami w homogenizatorze i ubijaj 2x przez 10 s z prędkością 6 m/s z 10-sekundowym odstępem między uderzeniami.
   UWAGA: Ta kombinacja kulek, czasu ubijania i użycia homogenizatora powoduje wystarczające rozerwanie biofilmu przy minimalnej lizie, jak określono za pomocą mikroskopii i jednostek tworzących kolonie. Może się to różnić w zależności od konkretnego użytego ubijaka do koralików.
4. Wlać uszkodzony biofilm z probówki homogenizatora do 7 ml biżu zawierającego 4 ml PBS, uzyskując końcową objętość 5 ml.
5. Upewnij się, że cały płyn z probówek homogenizatora został przeniesiony do biżu, odwirowując probówki o sile 8 000 x g przez 2 minuty i przenosząc pozostałą ciecz do 7 ml bijou.
   UWAGA: Z tych 5 ml uszkodzonego biofilmu można przeprowadzić szereg testów, ale kluczowe jest, aby pamiętać o rozcieńczeniu PBS biofilmu o pojemności 1 ml do końcowej objętości 5 ml.

5. Badanie aktywności metabolicznej

1. Dodać 200 μl uszkodzonego biofilmu z kroku 4 powyżej do czarnej 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem. Następnie dodać 10 μl 0,02% (w/v) roztworu rezazuryny.
2. Inkubować biofilm potraktowany resazuryną za pomocą czytnika płytek i odczytać aktywność metaboliczną. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, stosując wytrząsanie orbitalne co 30 minut przez 10 s przy prędkości 200 obr./min przed wykonaniem jakichkolwiek odczytów fluorescencyjnych.
3. Zmierzyć fluorescencję, stosując wzbudzenie 540 nm i emisję 590 nm. Powtarzaj ten 30-minutowy cykl przez 4 godziny za pomocą czytnika płytek.
   UWAGA: Stosuje się 4-godzinny punkt czasowy, ponieważ zapewnia on wyraźniejsze różnice między próbkami poddanymi działaniu substancji i niepoddanymi działaniu substancji oraz między próbkami o różnych stężeniach antybiotyków.

6. Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe

1. Aby przetestować tolerancję na środki przeciwdrobnoustrojowe standardowych antybiotyków, należy rozpuścić wybrane antybiotyki w odpowiednim rozpuszczalniku i dodać go do 1x SCFM2-1,5% (w/v) technicznego podłoża agarowego, gdy jest jeszcze płynny, przed przeniesieniem 5 ml do każdej studzienki płytki sześciodołkowej. Po związaniu przenieś biofilm wyhodowany na krążku poliwęglanowym na wierzch pożywki zawierającej antybiotyk za pomocą sterylnych kleszczyków i dodaj 10 μl kropli o odpowiednim stężeniu antybiotyku na wierzch biofilmu.
   UWAGA: W tym badaniu zastosowano 2-logarytmiczne seryjne rozcieńczenie między 64 μg/ml a 0,125 μg/ml meropenemu i tobramycyny, aby odzwierciedlić klinicznie istotne stężenia. Podawanie antybiotyków lub innych środków przeciwbakteryjnych/przeciwzjadliwych wyłącznie na wierzch biofilmu jest wystarczające, ponieważ zaobserwowano podobne reakcje po dodaniu zarówno do pożywki, jak i do biofilmu.
2. Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C z poddaniem działaniu substancji, należy zobrazować biofilmy i rozbić, jak opisano w kroku 4.
3. Z 5 ml zakłóconej hodowli pobrać podwielokrotność i przeprowadzić 10-krotne seryjne rozcieńczenie za pomocą PBS. Umieść 10 μl plamek w trzech egzemplarzach na agarze w celu określenia jednostek tworzących kolonie za pomocą metody Milesa i Misry³⁰.
   UWAGA: Objętość dodana do płytek agarowych wpłynie na granicę wykrywalności, większe objętości zmniejszą granicę wykrywalności, ale wymagają większej ilości próbek i płytek agarowych.
4. W przypadku biofilmów jednogatunkowych P. aeruginosa i S. aureus należy umieścić smugi na płytkach agarowych LB, a C. albicans na agarze SDA.
5. W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych należy umieścić podwielokrotności na trzech różnych selektywnych pożywkach zawierających antybiotyki, aby wyizolować każdy z trzech gatunków i umożliwić oznaczenie CFU. Obejmuje to agar do izolacji Pseudomonas i agar z solą mannitolu zawierający nystatynę w stężeniu 10 μg/ml w celu wyizolowania odpowiednio P. aeruginosa i S. aureus oraz agar dekstrozowy Sabouraud z tetracykliną w stężeniu 125 μg/ml w celu wyizolowania C. albicans. Inkubować płytki S. aureus w temperaturze 37 °C przez noc, a płytki P. aeruginosa i C. albicans w temperaturze 30 °C.
   UWAGA: Inkubować płytki P. aeruginosa w temperaturze 30 °C, aby zminimalizować przerost kolonii i zmniejszyć rój.

Wyniki

Prostota modelu biofilmu na granicy faz ciało stałe i powietrze umożliwia badanie przesiewowe dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych w różnych klinicznie istotnych warunkach jednocześnie. Model ten pozwala na ocenę skuteczności antybiotyków za pomocą liczby CFU i testów metabolicznych zarówno w biofilmach mono-, jak i wielodrobnoustrojowych, które można przeprowadzić w ciągu tygodnia. Ze względu na charakter modelu umożliwia on również łatwą manipulację warunkami środowiskowymi, takimi jak zmiana składu podłoża i umieszczanie biofilmów w warunkach o obniżonej zawartości tlenu i beztlenowych. Korzystając z tego modelu, wykazaliśmy zmiany w tolerancji na dwa antybiotyki powszechnie stosowane w pwCF między P. aeruginosa hodowanym w biofilmach jednogatunkowych i wielomikrobiologicznych (Rysunek 1). Oprócz tego udało nam się określić, w jaki sposób leczenie przeciwdrobnoustrojowe może wpływać na dynamikę populacji w biofilmach polimikrobiologicznych (Rysunek 2).

Aby przeprowadzić te eksperymenty, początkowe inokulum zostało przygotowane zgodnie z powyższym protokołem, co doprowadziło do powstania stabilnych mono gatunków i wielomikrobiologicznych biofilmów z powtarzalnymi CFU/ml i małymi odchyleniami standardowymi, określonymi przez jedno- lub dwukierunkową ANOVA. Model ten podkreślił również konsekwentny wzrost i odzysk CFU, a także umożliwił połączenie tych klasycznych technik mikrobiologicznych z innymi technikami, które nie zostały przeprowadzone w tym badaniu, bez konieczności zaawansowanego przetwarzania. Należą do nich obrazowanie, takie jak żywy/martwy, wizualizacja matrycy i analiza molekularna, których inne modele trójwymiarowe nie są w stanie zaoferować w tak przystępny sposób (Rysunek 1)³¹. Należy zauważyć, że odchylenie standardowe oczekiwane dla jtk/ml wzrasta, gdy dane są wyświetlane jako procent przeżycia w porównaniu z CFU/ml (Rysunek 1). Porównując skuteczność leczenia antybiotykami między biofilmami monogatunkowymi i wielodrobnoustrojowymi, zaobserwowano znaczny wzrost wszystkich stężeń antybiotyków wymaganych do osiągnięcia 50% zabijania. Do osiągnięcia tego poziomu zabijania meropenemu i tobramycyny potrzebny był wzrost stężenia antybiotyku o 2 log (Ryc. 1). Stwierdzono również ogólny wzrost przeżywalności P. aeruginosa w obecności S. aureus i C. albicans w biofilmie wielodrobnoustrojowym po leczeniu tobramycyną w stężeniu 64 μg/ml, podczas gdy w przypadku meropenemu było odwrotnie.

Metoda używana do określania aktywności metabolicznej mierzy ogólną aktywność całego wielomikrobiologicznego biofilmu, nie będąc w stanie rozróżnić indywidualnego wkładu każdego gatunku. Z tego powodu wykazano tylko zmiany metaboliczne jednogatunkowe, aby wykazać zastosowanie testów aktywności metabolicznej w tym modelu. W przypadku biofilmów jednogatunkowych stwierdzono silny związek między przeżywalnością P. aeruginosa a aktywnością metaboliczną zarówno meropenemu, jak i tobramycyny (Ryc. 2). Wykorzystanie zarówno aktywności metabolicznej, jak i liczby CFU z tych samych próbek umożliwia łatwą identyfikację zarówno efektów bakteriostatycznych, jak i bakteriobójczych. W przypadku biofilmów wielodrobnoustrojowych określenie aktywności metabolicznej może wskazać, w jaki sposób ukierunkowanie na jeden gatunek może wywołać ogólny wzrost aktywności metabolicznej biofilmu, a tym samym potencjalnie zwiększyć wzrost drobnoustrojów innych gatunków.

Chociaż CFU są złotym standardem do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, w biofilmach wielomikrobiologicznych pozwalają również na ocenę składu gatunkowego w obrębie biofilmu. Traktując P. aeruginosa w biofilmach wielomikrobiologicznych, jesteśmy w stanie nie tylko wykazać zwiększony MBEC50 dla tego organizmu, ale także ustalić wpływ, jaki ma to na inne współizolowane gatunki (Rysunek 3). Jest to widoczne na przykład w przypadku meropenemu (antypseudomonal), gdzie zmniejszeniu liczby P. aeruginosa towarzyszy wzrost liczby S. aureus i C. albicans CFU, co powoduje, że S. aureus staje się najbardziej rozpowszechnionym organizmem po ekspozycji na pewne stężenia antybiotyków (Ryc. 3A). Podkreśla to znaczenie uwzględnienia polimikrobiologicznego charakteru biofilmu ze względu na potencjalny wzrost liczebności populacji innych gatunków chorobotwórczych podczas leczenia konkretnego patogenu.

Rysunek 1: Różnice w tolerancji przeciwdrobnoustrojowej P. aeruginosa na meropenem i tobramycynę między mono i polimikrobiologicznymi biofilmami hodowanymi w modelu granicy faz ciało stałe-powietrze. P. aeruginosa PAO1 hodowany w mono lub poli biofilmach mikrobiologicznych z S. aureus i C. albicans został ustalony przy użyciu modeli granicy faz ciało stałe-powietrze przez 24 godziny na SCFM2. Biofilmy traktowano zakresem stężeń (A) meropenemu lub (B) tobramycyny od 0,125 μg/ml do 64 μg/ml wraz z kontrolą bez antybiotyków. Oznaczono jtk/ml każdego biofilmu. P. aeruginosa (P. aeruginosa) CFU oznaczono w PIA i przeliczono na przeżycie procentowe przy użyciu kontroli ujemnej jako 100% przeżycia. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych pochodzi z 3 powtórzeń biologicznych, z których każdy ma trzy powtórzenia techniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zmienność aktywności metabolicznej biofilmów P. aeruginosa w obecności meropenemu lub tobramycyny hodowanych w modelu granicy faz ciało stałe-powietrze. P. aeruginosa (P. aeruginosa) Biofilmy PAO1 hodowano na SCFM2 w modelu granicy faz ciało stałe-powietrze i dodano zakres stężeń (A) meropenemu lub (B) tobramycyny od 0,125 μg/ml do 64 μg/ml wraz z kontrolą bez antybiotyków. Tabliczka była odczytywana fluorescencyjnie przy wzbudzeniu 540 nm i emisji 590 nm co 30 min. Procentową aktywność metaboliczną obliczono, określając procent tej aktywności w każdej próbce poddanej działaniu antybiotyku w porównaniu z kontrolą bez antybiotyku. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych pochodzi z 3 powtórzeń biologicznych, z których każdy ma trzy powtórzenia techniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wpływ na całkowitą liczbę CFU P. aeruginosa, S. aureus i C. albicans odzyskanych z polimikrobiolnego modelu granicy faz ciało stałe-powietrze po leczeniu przeciwbakteryjnym. S. aureus i C. albicans były hodowane na SCFM2 na modelu granicy faz ciało stałe-powietrze. Dodano P. aeruginosa, a do biofilmów dodano zakres stężeń od 0,125 μg/ml do 64 μg/ml (A) meropenemu lub (B) tobramycyny wraz z kontrolą bez antybiotyków. Oznaczono jtk/ml każdego biofilmu. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe, a każdy punkt danych został uzyskany z 3 powtórzeń biologicznych, z których każdy ma trzy powtórzenia techniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Ustanowienie i przepływ pracy modelu interfejsu bryłowo-powietrznego. Graficzna reprezentacja ustanowienia modelu granicy faz ciało stałe-powietrze, rozerwanie biofilmu i wyniki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisany tutaj model biofilmu pozwala nam naśladować niektóre aspekty środowiska zakażenia płuc mukowiscydozą poprzez włączenie szeregu powszechnych interakcji wielodrobnoustrojowych w sposób bardziej przystępny niż obecnie stosowane metody testowania przeciwdrobnoustrojowego in vitro , takie jak reaktor CDC i model biofilmu^{Lubbock 31}. Jest to ważne, gdy szereg czynników, w tym właściwości fizyczne biofilmu, dostępność składników odżywczych i interakcje molekularne między gatunkami w biofilmie, może wpływać zarówno na aktywność środka przeciwdrobnoustrojowego, jak i na odpowiedź drobnoustrojów na środek przeciwdrobnoustrojowy²¹. Uwzględniając te czynniki, byliśmy w stanie opracować wysoce wszechstronny model, który może dokładniej umożliwić przewidywanie wyników leczenia przeciwdrobnoustrojowego niż obecne modele, które nie uwzględniają wyżej wymienionych czynników.

P. aeruginosa, S. aureus i C. albicans zostały wybrane jako reprezentatywne Gram-dodatnie, Gram-ujemne i grzyby powszechnie izolowane w CF³². Udało nam się jednak również wykazać, że model ten może być stosowany w przypadku szeregu innych drobnoustrojów istotnych dla mukowiscydozy, w tym Burkholderia cenocepacia, Burkholderia multivorans, Aspergillus fumigatus, a obecnie jest dostosowywany do stosowania z bakteriami beztlenowymi, takimi jak Prevotella melaninogenica. Świadczy to o wszechstronności modelu, ponieważ można w nim uwzględnić szeroką gamę drobnoustrojów, co podkreśla zdolność adaptacyjną tego modelu do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko szerokiej gamie patogenów mikrobiologicznych. Model można również łatwo dostosować do szeregu warunków środowiskowych w celu bardziej spersonalizowanych testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe, w tym zastąpienia SCFM2 plwociną od pacjenta.

Zasadnicze znaczenie ma również uwzględnienie modeli biofilmu wielodrobnoustrojowego do testowania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, ponieważ mogą one wypełnić istniejącą lukę w procesie opracowywania środków przeciwdrobnoustrojowych przed ich zastosowaniem w badaniach na zwierzętach lub ludziach^33,34. Jednocześnie model utrzymuje stosunkowo wysoką przepustowość i pozwala na uzyskanie szeregu wyników istotnych zarówno dla przemysłu, jak i badań.

Chociaż w tym artykule dotyczącym metod przedstawiliśmy tylko przykłady CFU i aktywności metabolicznej, wykazaliśmy również użyteczność modelu w analizie egzometabolomu biofilmu przy użyciu spektrometrii mas do ekstrakcji cieczą (LESA). Pozwala to na zbadanie niektórych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tolerancji na środki przeciwdrobnoustrojowe³⁵. Oprócz tych innych wyników zademonstrowaliśmy również wykorzystanie tego modelu do testowania nowych systemów dostarczania środków przeciwdrobnoustrojowych. Należą do nich koniugaty polimer-cyprofloksacyna w celu zwiększenia penetracji tego antybiotyku w biofilmie, jednocześnie zwiększając jego aktywność i zmniejszając rozwój oporności³⁶.

Kluczowe kroki i zagadnienia
Ważne jest, aby zachować sterylność, zwłaszcza podczas produkcji SCFM2 i pożywki, ponieważ zanieczyszczenie może spowodować wprowadzenie gatunków niewystępujących naturalnie, co może zakłócić wyniki. Różne szczepy tego samego drobnoustroju i różne drobnoustroje mogą wymagać różnych warunków środowiskowych do wzrostu lub mogą mieć różną charakterystykę wzrostu. Dlatego model musi zostać zoptymalizowany przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów wrażliwości na antybiotyki. Zalecamy przeprowadzenie małego badania pilotażowego trwającego 24 godziny i 48 godzin dla monogatunków i biofilmu wielodrobnoustrojowego w celu oceny wzrostu w standardowych warunkach modelowych. Odkryliśmy, że różne szczepy P. aeruginosa i pewne stężenia antybiotyków mogą indukować roj się od krążka poliwęglanowego. Można to łatwo przezwyciężyć, stosując dyski o większych rozmiarach, które są dostępne na rynku. Rozbijanie biofilmu może również wymagać optymalizacji w zależności od ubijaka do kulek i zastosowanych mikroorganizmów. Zoptymalizowaliśmy metodę przerywania, określając CFU/ml znanej próbki przed i po ubiciu ściegu. Wykorzystaliśmy również mikroskopię do wizualizacji próbek uderzeń koralików, aby zobrazować, jak dobrze biofilm został przerwany.

Jednym z ograniczeń tego modelu biofilmu naśladującego mukowiscydozę jest przyczepienie się do stałej powierzchni zawierającej poliwęglan, który nie znajduje się w płucach mukowiscydozy, a nie jest swobodnie unoszącym się agregatem w plwocinie mukowiscydozy³⁷ . Jednak przedstawiony tutaj model stałego agaru wyklucza potrzebę płukania biofilmów w celu usunięcia drobnoustrojów planktonowych i zapewnia, że wyniki obejmują tylko drobnoustroje pochodzące z biofilmu, a nie mieszaną hodowlę biofilmu planktonowego. Odkryliśmy również, że przenikanie niektórych antybiotyków do głębszych obszarów tego modelu biofilmu może być zmniejszone, a zastosowanie DNazy może być wymagane do zmiany reologii macierzy zewnątrzkomórkowej i zmniejszenia oddziaływań elektrostatycznych z eDNA.

Uważamy, że model ten doskonale nadaje się do testów przeciwdrobnoustrojowych ze względu na jego wszechstronność, zdolność adaptacji i uwzględnienie czynników środowiskowych, których wiele istniejących modeli nie bierze pod uwagę. Jego zastosowanie w badaniach podstawowych i przedklinicznych testach wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe może zapewnić bardziej istotne klinicznie podejście do AST próbek klinicznych i opracowania nowych środków terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 &mikro; Pętle inokulacyjne L
13 mm 0,2 i mikro; M Rozmiar porów Krążki poliwęglanowe	Izopore	GTTP01300	Dostępne są również większe tarcze
Wzmocnione probówki 2 ml	Rybak termiczny
kulki ceramiczne o pojemności 2,5 ml	Qiagen	13114-325
500 ml butelka Duran ze szkła borokrzemianowego	Sigma Aldrich	Z305197	większych butelek dostępnych w większych pojemnościach pożądane są
6-dołkowe płytki hodowlane	Greiner	657165
7 ml Bijou	Thermofisher	129B
Płytki 96-dołkowe	Thermofisher	167008	do seryjnych rozcieńczeń w teście CFU
Płytki agarowe do przygotowania płytek z P. aerugnisa, S. aureus, i C. albicans			LB młynarz do P. aeruginosa i S. aureus i dekstrozy Sabouraud  dla C. albicans  Ubijak do kulek
- pasuje do probówek 2 ml	Fisherbrand	15515799	Młynek do kulek Thermofisher 24
wirówka stołowa			musi być zdolny do co najmniej 8000 x g
Czarne przezroczyste dno 96-dołkowe płytki	Costar	3603
Palnik Bunsena
Pojemniki do utylizacji skażonego sprzętu i materiałów zgodnie z przepisami BHP instytutu.
woda dejonizowana
eDNA	Sigma Aldrich	31149
Jednostka filtrująca	Marka rybacka	FB12566504	Wymienne w zależności od zastosowanej pompy próżniowej, ale muszą mieć wielkość porów 0,2 i mikro; m
Hemocytometr i szkiełko nakrywkowe	Hawksley	HC001	mogą różnić się rozmiarem i objętością. Dokładnie sprawdź i odpowiednio dostosuj obliczenia CFU
Rosół LB	Oxoid	1.46813
Agar z solą mannitolu	Oxoid
meropenem	abcr	Ab243429
Mucyna z żołądka świni Typ II	Sigma Aldrich	M2378
Milipory nystatyny
szalki Petriego	SLS	SLS2000
Solanka buforowana fosforanami
Agar do izolacji Pseudomonas	Millipore	17208
Sól sodowa rezazuryny	Sigma Aldrich
Agar dekstrozowy Sabouraud	Oxoid	CM0041
dobór kleszczy			kleszczyki z cienką końcówką i tkankowe z zębami do przenoszenia kulek ceramicznych
pipety
wytrząsanie i inkubatory statyczne			musi być sterowany temperaturą
Czytnik mikropłytek Sparks	Tecan		W przypadku testu Resazuryny czytnik płytek do mikromiareczkowania musi być wyposażony w odpowiednie filtry lub być monochromatorem do wykrywania fluorescencji.
spektrofotometr
Agar techniczny (Agar Techniczny nr 2 )	Oxoid	LP0012B
tetracyklina	Sigma Aldrich	UV T7660
	Spektrolina	11-992-89
pompa próżniowa/ kolba	Fisherbrand
kąpiel wodna			musi być zdolny do utrzymania 55 stopni Celsjusza;
Bulion C YPD	Milipore	Y1375	Można kupić gotowe lub wykonane z podstawowych składników