System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oko złożone Drosophila melanogaster to dobrze zbudowany i wszechstronny układ około 800 ommatidiów, wykazujący symetryczny i sześciokątny wzór. Ta regularność i łatwość obserwacji sprawiają, że system oka Drosophila jest potężnym narzędziem do modelowania różnych chorób neurodegeneracyjnych człowieka. Jednak sposoby ilościowego określania nieprawidłowych fenotypów, takie jak ręczne klasyfikowanie ocen nasilenia oka, mają ograniczenia, zwłaszcza w przypadku oceny słabych zmian w morfologii oka. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak Flynotyper. Zastosowanie lampy pierścieniowej pozwala na uzyskanie lepszej jakości obrazów uzyskujących dostęp do nienaruszonego stanu poszczególnych ommatidiów. Jednakże, obrazy te nie mogą być analizowane bezpośrednio przez Flynotyper ze względu na cienie na ommatidiach wprowadzane przez światło pierścieniowe. W tym miejscu opisujemy bezstronny sposób ilościowego określania szorstkich fenotypów oczu obserwowanych w modelach choroby Drosophila poprzez połączenie dwóch programów, ilastik i Flynotyper. Dzięki wstępnemu przetwarzaniu obrazów za pomocą ilastik, za pomocą Flynotyper można osiągnąć pomyślną kwantyfikację fenotypu szorstkiego oka.
Wprowadzenie
Genom Drosophila melanogaster zawiera ~75% ortologów genów związanych z ludzką chorobą. Dodatkowo, podczas rozwoju oka Drosophila, około dwie trzecie genów w genomie ulega ekspresji, co czyni oko Drosophila wyjątkowym systemem genetycznym do badania różnych funkcji molekularnych i komórkowych, rozwoju i modeli chorób1,2. Tak więc system oka Drosophila jest użytecznym narzędziem eksperymentalnym do badania różnych procesów biologicznych.
Oko złożone Drosophila to dobrze skonstruowany i wszechstronny zestaw ~800 ommatidia, które wykazują symetryczny i sześciokątny wzór3. Regularność tego sześciokątnego wzoru może być wykorzystana do oszacowania efektu wprowadzenia mutacji i zmian ekspresji genów w morfologii oka4. Wcześniejsze badania, które wymagały oceny morfologii oka, w dużej mierze opierały się na ręcznym rankingu nasilenia fenotypów oka wykrywanych gołym okiem. Aby uszeregować fenotypy oka, obrazy morfologii oka zewnętrznego są wykonywane za pomocą mikroskopu stereoskopowego5,6. Fenotyp oka każdej grupy ocenia się, dzieląc oko zewnętrzne na cztery obszary i obliczając proporcję zwyrodnienia w każdym obszarze5,6. Następnie wartości są używane do obliczania średnich, które są porównywane z wartościami uzyskanymi z kontroli much7. Punktacja jest oparta na stopniu fuzji, utracie ommatidii i organizacji szczeciny7,8. Zdjęcia oczu muchy wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego są pozyskiwane przez jednego badacza, a analiza fenotypu oka jest wykonywana przez innego badacza za pomocą potrójnych zestawów walidacyjnych7,8.
Jeśli chodzi o klasyfikację słabych zmian w morfologii oka gołym okiem, istnieją ograniczenia4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak FLEYE i Flynotyper1,9. Flynotyper to nowatorska metoda obliczeniowa służąca do ilościowego szacowania zmian morfologicznych w systemie oka Drosophila1. Automatycznie wykrywa oko Drosophila i poszczególne ommatidium, obliczając wyniki fenotypowe (P-Scores) na podstawie nieregularnościoka1. Wyższy wskaźnik P-Score wskazuje, że oko muchy jest bardziej zdegenerowane. To oprogramowanie zostało z powodzeniem wykorzystane do ilościowego określenia nieprawidłowości oczu Drosophila10. Chociaż Flynotyper zapewnia zautomatyzowany proces, nadal nie może być z powodzeniem zastosowany do niektórych obrazów oczu wykonanych różnymi metodami mikroskopii świetlnej.
Jakościowo, preferujemy pierścieniowe źródło światła w porównaniu z jednopunktowym źródłem światła, ponieważ oferuje ono dokładniejsze odwzorowanie każdego ommatidium. Jednak gdy używana jest lampa pierścieniowa, generuje cień w kształcie pierścienia na górze każdego ommatidium ze względu na półkulisty kształt ommatidium. Ten cień w kształcie pierścienia hamuje dokładne wykrywanie ommatydialne przez Flynotyper, co prowadzi do nieprawidłowego obliczania P-Scores.
Aby przezwyciężyć te problemy, wdrożyliśmy ilastik, narzędzie oparte na uczeniu maszynowym do różnych analiz, do klasyfikowania ommatidia na obrazach oczu muchy11. Następnie wprowadziliśmy obrazy wygenerowane przez ilastik do Flynotyper, aby obliczyć P-Scores. To pozwala nam na obiektywne określenie wad morfologicznych oka Drosophila1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie do kwantyfikacji
- Pobierz i zainstaluj ilastik11, ImageJ i wtyczkę ImageJ Flynotyper1. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać linki do stron internetowych z instalacją. Pobierz odpowiednie pakiety zgodnie z systemem operacyjnym komputera (Mac, Windows, Linux itp.). Postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji dokładnie tak, jak podano.
UWAGA: Konieczne jest postępowanie zgodnie ze wskazówkami podanymi w podanych linkach. Używany komputer wymaga 64-bitowego systemu operacyjnego; W przeciwnym razie nie ma innych wymaganych specyfikacji. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacją komputera systemu używanego dla tego protokołu. - Użyj standardowego obrazu, aby wytrenować model uczenia maszynowego. Zrób zdjęcie zdrowego oka muchy za pomocą mikroskopu świetlnego ze światłem pierścieniowym (takim jak w1118 x GMR-GAL4), używając środka oka jako punktu ogniskowego. Analizuj samce i samice osobno; Dlatego uzyskaj standardowy obraz dla mężczyzn i kobiet.
UWAGA: Ustawienia będą się znacznie różnić w zależności od mikroskopu i aparatu. Zobacz drugi akapit dyskusji, aby uzyskać bardziej ogólne informacje na temat przygotowania muchy i pozyskiwania obrazów. - Zrób zdjęcia eksperymentalnych oczu muchy, używając tych samych ustawień, które są używane do standardowej akwizycji obrazu.
UWAGA: Dobra orientacja ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji. Zobacz Rysunek 4 jako przykład dla prawidłowej orientacji.
2. Używanie ilastik do wykrywania ommatidia na podstawie obrazów z lotu ptaka
- Przed rozpoczęciem analizy upewnij się, że wszystkie grupy eksperymentalne, niezależnie od warunków eksperymentu, znajdują się w tym samym folderze plików, aby ułatwić następujące procesy. Upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i odróżnić samce od samic.
UWAGA: Zalecamy wydrukowanie protokołu i użycie komputera do powiększania rysunków, ponieważ ten protokół jest najłatwiejszy do naśladowania wizualnie. - Otwórz oprogramowanie.
UWAGA: Zaleca się, aby nie otwierać innych aplikacji podczas uruchamiania oprogramowania; W przeciwnym razie komputer może działać bardzo wolno, szczególnie w starszych lub mniej niezawodnych systemach. - Kliknij Utwórz nowy projekt | Inne przepływy pracy, wybierz Zliczanie gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu (Rysunek 1A).
- Kliknij na 1. Dane wejściowe | Dodaj nowy | Dodaj osobne obrazy. Wybierz standardowy obraz (Rysunek 1B).
- Kliknij 2. Wybór funkcji i wybierz funkcje, które mają być używane. Wybierz funkcje pokazane w Rysunek 1C; Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość (np. 10, 15, 20 itd.).
UWAGA: Jeśli zaznaczonych jest zbyt wiele pól, program może działać przez długi czas. - Kliknij na 3. Zliczanie i ustaw wartość sigma pierwszego planu na 5.00. Zaznacz 50 lub więcej pojedynczych ommatidium za pomocą narzędzia Pierwszy plan na standardowym obrazie.
UWAGA: Pięćdziesiąt oznaczeń jest zazwyczaj wystarczających do analizy; jednak im bardziej zaznaczono ommatidia, tym dokładniejsze będą wyniki (Rysunek 1D). - Kliknij na 3. Liczenie i użyj narzędzia Tło, aby oznaczyć zewnętrzną stronę ommatidia (Rysunek 1E). Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół ommatidia.
UWAGA: Podobnie jak w przypadku większej liczby oznaczeń na ommatidii, im więcej narysowanych zielonych linii, tym dokładniejsze będą wyniki. - Kliknij 4. Eksport gęstości | Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu, aby skonfigurować ustawienia obrazu (Rysunek 1F). Kliknij Informacje o pliku wyjściowym | wybierz Format i tif do dalszej analizy w Flynotyper.
- Kliknij na 5. Przetwarzanie wsadowe | Wybierz Raw Data Files i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane (Rysunek 1G). Lista zaimportowanych obrazów do analizy znajduje się w sekcji Wybierz pliki danych RAW (Rysunek 1H). Kliknij Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu 5. Sekcja przetwarzania wsadowego.
UWAGA: Przypominamy, że analizy mężczyzn i kobiet należy wykonywać oddzielnie. W zależności od używanego komputera ten krok może potrwać 10 minut lub dłużej, zwłaszcza jeśli istnieje wiele zaimportowanych obrazów. - Po zakończeniu działania oprogramowania sprawdź ten sam folder plików zawierający eksperymentalne obrazy oka muchy; będą tam czarne obrazy o nazwie "YourSampleName_Probabilities" (Rysunek 1I).
3. Używanie ImageJ do przygotowania zdjęć dla Flynotyper
- Otwórz plik .tif wygenerowany przez ilastik (czarne pola) w ImageJ.
UWAGA: Każdy plik .tif wygenerowany przez ilastik musi być obsługiwany oddzielnie. - Użyj narzędzia Zaznaczanie prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół samego oka. Po narysowaniu prostokąta przytnij obszar, wybierając Ctrl + X lub Ctrl + C (Rysunek 2A). Poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta.
UWAGA: System operacyjny komputera określi, czy użyć "Ctrl + X" czy "Ctrl + C". Zwykle "Ctrl + X" jest przeznaczony dla systemu Windows, a "Ctrl + C" jest używany dla komputerów Mac. - Otwórz teraz wycięte oko muchy za pomocą ImageJ; kliknij Plik | Nowość | Wewnętrzny schowek (Rysunek 2B).
- Zapisz wycięte oko muchowe jako JPEG, klikając Plik | Zapisz jako | Format JPEG. Wycięte obrazy znajdują się teraz w tym samym folderze plików, co oryginalne obrazy eksperymentalne.
UWAGA: Aby ułatwić następny krok, zaleca się utworzenie nowego folderu plików o nazwie "wytnij" i umieszczenie w nim wszystkich wyciętych obrazów.
4. Używanie Flynotyper do obliczania wyników fenotypowych
- Otwórz Flynotyper jako wtyczkę ImageJ, klikając Wtyczki | Flynotyper.
- Wybierz Dodaj genotypy i otwórz folder zawierający wycięte obrazy oka muchy (folder wyciętego pliku). Nazwa folderu pojawi się w sekcji Genotypy (Rysunek 2C).
- Zaznacz pola Mikroskop świetlny i Pionowo, ale w razie potrzeby odpowiednio dostosuj. Sprawdź pola Stabilność i Odległość od środka w obszarze Rank Ommatidia poprzez: (Rysunek 2C).
- W polu Liczba uwzględnionych ommatidii w rankingu wprowadź 200.
UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 200 to dobra liczba, ale dostosuj ją do preferencji. - Kliknij Uruchom i poczekaj, aż pojawią się wyniki analizy (Rysunek 2D).
UWAGA: Ten krok może potrwać 5 minut lub dłużej (lub krócej) w zależności od mocy obliczeniowej używanego komputera. - Skopiuj i wklej plik próbki i wskaźnik P-Score do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W poprzednim badaniu wykorzystaliśmy ten protokół do wyznaczenia modyfikatorów genetycznych mutantowego białka VCP powiązanego z bocznym stwardnieniem zanikowym z otępieniem czołowo-skroniowym (ALS-FTD)12. Dodatkowo metoda ta została zastosowana w innym artykule do oceny toksyczności ALS-FTD indukowanego przez CHCHD10S59L, nawet przy użyciu starszego stereomikroskopu13. Aby dodatkowo zwalidować te wyniki, zastosowaliśmy oprogramowanie ilastik oraz Flynotyper w te...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ommatidia Drosophila stanowią przydatny system do badania różnych funkcji biologicznych i chorób genetycznych. Regularność ommatidiów jest dobrym pomiarem do zbadania wpływu mutacji genetycznych4. Mimo że istnieje kilka metod obliczania regularności ommatidiału, takich jak ręczne klasyfikowanie, metody te mogą być mocno stronnicze. Aby przezwyciężyć to tendencyjne podejście, opracowano narzędzia półautomatyczne 1,11.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Pedro Fernandez-Funez za użycie mikroskopu i kamery użytych w tym protokole. Chcielibyśmy również podziękować Avie Schapman za przekazanie informacji zwrotnych na temat przejrzystości protokołu. Wsparcie finansowe zostało udzielone Nam Chul Kimowi przez The Wallin Neuroscience Discovery Fund.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Specyfikacja | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | Pobierz oprogramowanie tutaj: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | Oprogramowanie Open source. Nie należy stosować leku Flynotyper 2.0. W momencie publikacji 2.0 był dość nowy i ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem oryginalnej wersji Flynotypera. |
| ilastik | Berg, S. i in. (2019) | Pobierz oprogramowanie tutaj: https://www.ilastik.org/download.html | Oprogramowanie open source. Pobierz wersję 1.4.0.post1 w ramach regularnych kompilacji odpowiadających systemowi operacyjnemu komputera. |
| ImageJ | Pobierz oprogramowanie tutaj: https://imagej.net/ij/download.html | Oprogramowanie open source. Używano wersji 1.53 i 1.54. 1.54 jest zaktualizowaną wersją i jest domyślnym plikiem do pobrania. | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | System i oprogramowanie używane do akwizycji z-stack. |
| Mikroskop Leica Z16 APO z kamerą DMC2900 | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | Określany w tekście jako mikroskop i kamera Z-stack. Ten produkt został zarchiwizowany. |
Bibliografia
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
- Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
