Kwantyfikacja fenotypów oczu Drosophila melanogaster: podejście obliczeniowe integrujące ilastik i Flynotyper

Summary

System oczu Drosophila jest użytecznym narzędziem do badania różnych procesów biologicznych, szczególnie chorób neurodegeneracyjnych u ludzi. Jednak ręczna kwantyfikacja fenotypów szorstkiego oka może być stronnicza i niewiarygodna. Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której ilastik i Flynotyper są używane do ilościowego określania fenotypu oka w bezstronny sposób.

Abstract

Oko złożone Drosophila melanogaster to dobrze zbudowany i wszechstronny układ około 800 ommatidiów, wykazujący symetryczny i sześciokątny wzór. Ta regularność i łatwość obserwacji sprawiają, że system oka Drosophila jest potężnym narzędziem do modelowania różnych chorób neurodegeneracyjnych człowieka. Jednak sposoby ilościowego określania nieprawidłowych fenotypów, takie jak ręczne klasyfikowanie ocen nasilenia oka, mają ograniczenia, zwłaszcza w przypadku oceny słabych zmian w morfologii oka. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak Flynotyper. Zastosowanie lampy pierścieniowej pozwala na uzyskanie lepszej jakości obrazów uzyskujących dostęp do nienaruszonego stanu poszczególnych ommatidiów. Jednakże, obrazy te nie mogą być analizowane bezpośrednio przez Flynotyper ze względu na cienie na ommatidiach wprowadzane przez światło pierścieniowe. W tym miejscu opisujemy bezstronny sposób ilościowego określania szorstkich fenotypów oczu obserwowanych w modelach choroby Drosophila poprzez połączenie dwóch programów, ilastik i Flynotyper. Dzięki wstępnemu przetwarzaniu obrazów za pomocą ilastik, za pomocą Flynotyper można osiągnąć pomyślną kwantyfikację fenotypu szorstkiego oka.

Introduction

Genom Drosophila melanogaster zawiera ~75% ortologów genów związanych z ludzką chorobą. Dodatkowo, podczas rozwoju oka Drosophila, około dwie trzecie genów w genomie ulega ekspresji, co czyni oko Drosophila wyjątkowym systemem genetycznym do badania różnych funkcji molekularnych i komórkowych, rozwoju i modeli chorób^1,2. Tak więc system oka Drosophila jest użytecznym narzędziem eksperymentalnym do badania różnych procesów biologicznych.

Oko złożone Drosophila to dobrze skonstruowany i wszechstronny zestaw ~800 ommatidia, które wykazują symetryczny i sześciokątny wzór³. Regularność tego sześciokątnego wzoru może być wykorzystana do oszacowania efektu wprowadzenia mutacji i zmian ekspresji genów w morfologii oka⁴. Wcześniejsze badania, które wymagały oceny morfologii oka, w dużej mierze opierały się na ręcznym rankingu nasilenia fenotypów oka wykrywanych gołym okiem. Aby uszeregować fenotypy oka, obrazy morfologii oka zewnętrznego są wykonywane za pomocą mikroskopu stereoskopowego^5,6. Fenotyp oka każdej grupy ocenia się, dzieląc oko zewnętrzne na cztery obszary i obliczając proporcję zwyrodnienia w każdym obszarze^5,6. Następnie wartości są używane do obliczania średnich, które są porównywane z wartościami uzyskanymi z kontroli much⁷. Punktacja jest oparta na stopniu fuzji, utracie ommatidii i organizacji szczeciny^7,8. Zdjęcia oczu muchy wykonane za pomocą mikroskopu stereoskopowego są pozyskiwane przez jednego badacza, a analiza fenotypu oka jest wykonywana przez innego badacza za pomocą potrójnych zestawów walidacyjnych^7,8.

Jeśli chodzi o klasyfikację słabych zmian w morfologii oka gołym okiem, istnieją ograniczenia⁴. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano podejścia obliczeniowe, takie jak FLEYE i Flynotyper^1,9. Flynotyper to nowatorska metoda obliczeniowa służąca do ilościowego szacowania zmian morfologicznych w systemie oka Drosophila¹. Automatycznie wykrywa oko Drosophila i poszczególne ommatidium, obliczając wyniki fenotypowe (P-Scores) na podstawie nieregularnościoka¹. Wyższy wskaźnik P-Score wskazuje, że oko muchy jest bardziej zdegenerowane. To oprogramowanie zostało z powodzeniem wykorzystane do ilościowego określenia nieprawidłowości oczu Drosophila¹⁰. Chociaż Flynotyper zapewnia zautomatyzowany proces, nadal nie może być z powodzeniem zastosowany do niektórych obrazów oczu wykonanych różnymi metodami mikroskopii świetlnej.

Jakościowo, preferujemy pierścieniowe źródło światła w porównaniu z jednopunktowym źródłem światła, ponieważ oferuje ono dokładniejsze odwzorowanie każdego ommatidium. Jednak gdy używana jest lampa pierścieniowa, generuje cień w kształcie pierścienia na górze każdego ommatidium ze względu na półkulisty kształt ommatidium. Ten cień w kształcie pierścienia hamuje dokładne wykrywanie ommatydialne przez Flynotyper, co prowadzi do nieprawidłowego obliczania P-Scores.

Aby przezwyciężyć te problemy, wdrożyliśmy ilastik, narzędzie oparte na uczeniu maszynowym do różnych analiz, do klasyfikowania ommatidia na obrazach oczu muchy¹¹. Następnie wprowadziliśmy obrazy wygenerowane przez ilastik do Flynotyper, aby obliczyć P-Scores. To pozwala nam na obiektywne określenie wad morfologicznych oka Drosophila¹.

Protocol

1. Przygotowanie do kwantyfikacji

1. Pobierz i zainstaluj ilastik¹¹, ImageJ i wtyczkę ImageJ Flynotyper¹. Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać linki do stron internetowych z instalacją. Pobierz odpowiednie pakiety zgodnie z systemem operacyjnym komputera (Mac, Windows, Linux itp.). Postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji dokładnie tak, jak podano.
   UWAGA: Konieczne jest postępowanie zgodnie ze wskazówkami podanymi w podanych linkach. Używany komputer wymaga 64-bitowego systemu operacyjnego; W przeciwnym razie nie ma innych wymaganych specyfikacji. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się ze specyfikacją komputera systemu używanego dla tego protokołu.
2. Użyj standardowego obrazu, aby wytrenować model uczenia maszynowego. Zrób zdjęcie zdrowego oka muchy za pomocą mikroskopu świetlnego ze światłem pierścieniowym (takim jak w1118 x GMR-GAL4), używając środka oka jako punktu ogniskowego. Analizuj samce i samice osobno; Dlatego uzyskaj standardowy obraz dla mężczyzn i kobiet.
   UWAGA: Ustawienia będą się znacznie różnić w zależności od mikroskopu i aparatu. Zobacz drugi akapit dyskusji, aby uzyskać bardziej ogólne informacje na temat przygotowania muchy i pozyskiwania obrazów.
3. Zrób zdjęcia eksperymentalnych oczu muchy, używając tych samych ustawień, które są używane do standardowej akwizycji obrazu.
   UWAGA: Dobra orientacja ma kluczowe znaczenie dla dokładnej kwantyfikacji. Zobacz Rysunek 4 jako przykład dla prawidłowej orientacji.

2. Używanie ilastik do wykrywania ommatidia na podstawie obrazów z lotu ptaka

1. Przed rozpoczęciem analizy upewnij się, że wszystkie grupy eksperymentalne, niezależnie od warunków eksperymentu, znajdują się w tym samym folderze plików, aby ułatwić następujące procesy. Upewnij się, że pliki są odpowiednio nazwane, aby zidentyfikować grupy eksperymentalne i odróżnić samce od samic.
   UWAGA: Zalecamy wydrukowanie protokołu i użycie komputera do powiększania rysunków, ponieważ ten protokół jest najłatwiejszy do naśladowania wizualnie.
2. Otwórz oprogramowanie.
   UWAGA: Zaleca się, aby nie otwierać innych aplikacji podczas uruchamiania oprogramowania; W przeciwnym razie komputer może działać bardzo wolno, szczególnie w starszych lub mniej niezawodnych systemach.
3. Kliknij Utwórz nowy projekt | Inne przepływy pracy, wybierz Zliczanie gęstości komórek i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik projektu (Rysunek 1A).
4. Kliknij na 1. Dane wejściowe | Dodaj nowy | Dodaj osobne obrazy. Wybierz standardowy obraz (Rysunek 1B).
5. Kliknij 2. Wybór funkcji i wybierz funkcje, które mają być używane. Wybierz funkcje pokazane w Rysunek 1C; Wybierz więcej wartości sigma, aby zwiększyć czułość (np. 10, 15, 20 itd.).
   UWAGA: Jeśli zaznaczonych jest zbyt wiele pól, program może działać przez długi czas.
6. Kliknij na 3. Zliczanie i ustaw wartość sigma pierwszego planu na 5.00. Zaznacz 50 lub więcej pojedynczych ommatidium za pomocą narzędzia Pierwszy plan na standardowym obrazie.
   UWAGA: Pięćdziesiąt oznaczeń jest zazwyczaj wystarczających do analizy; jednak im bardziej zaznaczono ommatidia, tym dokładniejsze będą wyniki (Rysunek 1D).
7. Kliknij na 3. Liczenie i użyj narzędzia Tło, aby oznaczyć zewnętrzną stronę ommatidia (Rysunek 1E). Narysuj zielone linie w kształcie kraty wokół ommatidia.
   UWAGA: Podobnie jak w przypadku większej liczby oznaczeń na ommatidii, im więcej narysowanych zielonych linii, tym dokładniejsze będą wyniki.
8. Kliknij 4. Eksport gęstości | Wybierz opcję Eksportuj ustawienia obrazu, aby skonfigurować ustawienia obrazu (Rysunek 1F). Kliknij Informacje o pliku wyjściowym | wybierz Format i tif do dalszej analizy w Flynotyper.
9. Kliknij na 5. Przetwarzanie wsadowe | Wybierz Raw Data Files i wybierz wszystkie eksperymentalne zdjęcia much, które mają zostać przeanalizowane (Rysunek 1G). Lista zaimportowanych obrazów do analizy znajduje się w sekcji Wybierz pliki danych RAW (Rysunek 1H). Kliknij Przetwarzaj wszystkie pliki u dołu 5. Sekcja przetwarzania wsadowego.
   UWAGA: Przypominamy, że analizy mężczyzn i kobiet należy wykonywać oddzielnie. W zależności od używanego komputera ten krok może potrwać 10 minut lub dłużej, zwłaszcza jeśli istnieje wiele zaimportowanych obrazów.
10. Po zakończeniu działania oprogramowania sprawdź ten sam folder plików zawierający eksperymentalne obrazy oka muchy; będą tam czarne obrazy o nazwie "YourSampleName_Probabilities" (Rysunek 1I).

3. Używanie ImageJ do przygotowania zdjęć dla Flynotyper

1. Otwórz plik .tif wygenerowany przez ilastik (czarne pola) w ImageJ.
   UWAGA: Każdy plik .tif wygenerowany przez ilastik musi być obsługiwany oddzielnie.
2. Użyj narzędzia Zaznaczanie prostokąta, aby utworzyć prostokąt wokół samego oka. Po narysowaniu prostokąta przytnij obszar, wybierając Ctrl + X lub Ctrl + C (Rysunek 2A). Poczekaj, aż pojawi się ramka w kształcie konturu prostokąta.
   UWAGA: System operacyjny komputera określi, czy użyć "Ctrl + X" czy "Ctrl + C". Zwykle "Ctrl + X" jest przeznaczony dla systemu Windows, a "Ctrl + C" jest używany dla komputerów Mac.
3. Otwórz teraz wycięte oko muchy za pomocą ImageJ; kliknij Plik | Nowość | Wewnętrzny schowek (Rysunek 2B).
4. Zapisz wycięte oko muchowe jako JPEG, klikając Plik | Zapisz jako | Format JPEG. Wycięte obrazy znajdują się teraz w tym samym folderze plików, co oryginalne obrazy eksperymentalne.
   UWAGA: Aby ułatwić następny krok, zaleca się utworzenie nowego folderu plików o nazwie "wytnij" i umieszczenie w nim wszystkich wyciętych obrazów.

4. Używanie Flynotyper do obliczania wyników fenotypowych

1. Otwórz Flynotyper jako wtyczkę ImageJ, klikając Wtyczki | Flynotyper.
2. Wybierz Dodaj genotypy i otwórz folder zawierający wycięte obrazy oka muchy (folder wyciętego pliku). Nazwa folderu pojawi się w sekcji Genotypy (Rysunek 2C).
3. Zaznacz pola Mikroskop świetlny i Pionowo, ale w razie potrzeby odpowiednio dostosuj. Sprawdź pola Stabilność i Odległość od środka w obszarze Rank Ommatidia poprzez: (Rysunek 2C).
4. W polu Liczba uwzględnionych ommatidii w rankingu wprowadź 200.
   UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 200 to dobra liczba, ale dostosuj ją do preferencji.
5. Kliknij Uruchom i poczekaj, aż pojawią się wyniki analizy (Rysunek 2D).
   UWAGA: Ten krok może potrwać 5 minut lub dłużej (lub krócej) w zależności od mocy obliczeniowej używanego komputera.
6. Skopiuj i wklej plik próbki i wskaźnik P-Score do oprogramowania statystycznego w celu dalszej analizy.

Results

W poprzednim badaniu użyliśmy tego protokołu do określenia genetycznych modyfikatorów zmutowanego białka VCP związanego ze stwardnieniem zanikowym bocznym z otępieniem czołowo-skroniowym (ALS-FTD)¹². Dodatkowo, metoda ta została również wykorzystana w innym artykule do oceny toksyczności ALS-FTD za pośrednictwem^{CHCHD10 S59L}, nawet przy użyciu starszego mikroskopu stereoskopowego¹³. Aby jeszcze bardziej zweryfikować te wyniki, użyliśmy ilastik i Flynotyper w tej samej mutacji choroby ALS-FTD, co Baek i wsp.¹³; Jednak nieprzeszkolony personel laboratoryjny przeprowadził eksperyment i uzyskał podobne wyniki. Tak więc połączenie ilastik i Flynotyper jest solidną metodą bezstronnej oceny zwyrodnienia Drosophila ommatidia.

Preferujemy lampę pierścieniową, ponieważ pozwala ona na lepsze oceny jakościowe (Rysunek 3). Jednak użycie światła pierścieniowego powoduje cień, którego Flynotyper nie może bezpośrednio przeanalizować. Aby temu zaradzić, wstępnie przetworzyliśmy obrazy w ilastik przed ilościowym określeniem P-Scores za pomocą Flynotyper. Ogólnie rzecz biorąc, P-Score niezdegenerowanego (GMR-GAL4) oka muchy było znacznie niższe w porównaniu z umiarkowanie zdegenerowanym okiem (2x_S81L) i poważnie zdegenerowanym okiem (3x_S81L) (Rysunek 4A, B i Tabela 1). Jest to oczekiwany wynik, ponieważ wyższe wskaźniki P wygenerowane przez Flynotyper wskazują na bardziej zdegenerowane eye¹. Gdy ilastik nie był stosowany, istniały znikome różnice w P-Score między okiem niezdegenerowanym a okiem umiarkowanie zdegenerowanym (Rysunek 4C i Tabela 1). Sugeruje to, że Flynotyper ma trudności z dokładnym identyfikowaniem wzorców ommatidiów w warunkach oświetlenia pierścieniowego bez użycia ilastik. Dzieje się tak, ponieważ Flynotyper został zaprojektowany tak, aby używać obrazów wykonanych przy użyciu dwupunktowego światła, które jest konwertowane na skalę szarości z dodatkowymi korektami w celu identyfikacji centrum ommatidialnego¹. Ilastik odtwarza ten proces, umieszczając kropkę w środku każdego ommatidium, umożliwiając kwantyfikację w Flynotyper.

Rysunek 1: Przykładowy przepływ pracy ilastik. (A) Tworzenie nowego projektu w ilastik. (B) Wybór standardowego obrazu. (C) Wybieranie wartości sigma w obszarze Wybór funkcji. (D) Zaznaczanie pierwszego planu ommatidia pod kątem czułości. (E) Oznaczanie tła ommatidiów dla wrażliwości. (F) Wybór sposobu eksportu przetworzonych plików przez oprogramowanie. (G) Wybór eksperymentalnych obrazów oka muchy do analizy. (H) Pokazanie, które eksperymentalne obrazy oka muchy będą analizowane. (I) Gotowy produkt po uruchomieniu oprogramowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowy przepływ pracy Flynotyper. (A) Wybranie tylko oka muchy do dalszej analizy. (B) Otwarcie obrazu wyciętego oka w nowym oknie. (C) Wybór wyciętych obrazów do analizy i parametrów do sprawdzenia na potrzeby analizy. (D) Przykładowe wyniki. Wyniki fenotypowe są przedstawione po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Jakościowe obrazy oczu Drosophila. To samo oko muchowe wykonane w świetle pierścieniowym (po lewej) i wykonane w świetle dwupunktowym (po prawej) w warunkach niezdegenerowanych (na górze) i zdegenerowanych (na dole). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Użycie ilastik przed Flynotyperem w celu dokładnego określenia fenotypu szorstkiego oka u Drosophila. (A) Reprezentatywne obrazy oka Drosophila oka niezdegenerowanego (GMR-GAL4), oka umiarkowanie zdegenerowanego (2x_S81L) i oka poważnie zdegenerowanego (3x_S81L). (B) Wyniki oceny ilościowej za pomocą preparatu Flynotyper po zastosowaniu ilastik. Wartości P dwustronnego testu t permutacji zostały obliczone, aby ułatwić interpretację wyników (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Wyniki kwantyfikacji z Flynotyper bez użycia ilastik. Wartości P dwustronnego testu t permutacji zostały obliczone w celu ułatwienia interpretacji wyników (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 dla każdej grupy. Punkty danych są jitterowane lub ułożone w stos na osi x, co zapewnia przejrzystość wizualną. Ciągła linia pozioma reprezentuje średnią. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
Z ilastik	Bez ilastik	Z ilastik	Bez ilastik	Z ilastik	Bez ilastik
Z dnia 26,7	55,7	52,5	Norma 51,2	59,9	55,6
Rozdział 17,4	53,5	50	54,9	60,7	Rozdział 52
22,8	55,5	56,8	55,2	60,1	55,1

Tabela 1: P-Scores podczas korzystania z Flynotyper z ilastik i podczas korzystania z samego Flynotyper.

Rysunek uzupełniający S1: Montaż na głowicy muchowej ustawiony do pozyskiwania obrazów. Jest to przykład konfiguracji do pozyskiwania obrazów przy użyciu wielu arkuszy papieru. Można jednak zastosować każdą metodę, która zapewnia prawidłową orientację głowy i oka muchy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Wyniki ilościowe ilastik i Flynotyper przy użyciu wartości sigma 2,5 w wyborze funkcji. Użycie wartości sigma innej niż 5.0 w obszarze wyboru funkcji w ilastik może spowodować niedokładną kwantyfikację. W szczególności wartość sigma wynosząca 2,5 powoduje utratę czułości. Wartości p dwustronnego testu t permutacji zostały obliczone, aby ułatwić interpretację wyników (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 dla każdej grupy. Punkty danych są jitterowane lub ułożone w stos na osi x, co zapewnia przejrzystość wizualną. Ciągła linia pozioma reprezentuje średnią. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3: Utrata czułości i niedokładne punkty P z powodu martwiczych plam. Białe strzałki wskazują segmenty nekrotycznych plam. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: P-Scores przy użyciu wartości sigma 2,5 przy wyborze funkcji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Ommatidia Drosophila stanowią przydatny system do badania różnych funkcji biologicznych i chorób genetycznych. Regularność ommatidiów jest dobrym pomiarem do zbadania wpływu mutacji genetycznych⁴. Mimo że istnieje kilka metod obliczania regularności ommatidiału, takich jak ręczne klasyfikowanie, metody te mogą być mocno stronnicze. Aby przezwyciężyć to tendencyjne podejście, opracowano narzędzia półautomatyczne ^1,11.

Aby uzyskać dokładną ocenę ilościową oka, należy zoptymalizować przygotowanie i ustawienie muchy. Chociaż rozumiemy, że każde laboratorium będzie miało swoją konfigurację, udostępniamy następującą konfigurację w naszym laboratorium, aby dać czytelnikom wyobrażenie o tym, jak przygotować muchy do akwizycji obrazu. Muchy są zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Użyliśmy próby o wielkości 3, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że gdy GMR-GAL4 jest połączony z mutacją S81L, różnice w populacji są bardzo małe. Należy jednak pamiętać, że wielkość próby powinna być dostosowana do przeprowadzania testów istotności hipotezy zerowej. Aby zamontować muchy w celu uzyskania obrazu, głowica muchy spoczywa na bardzo małym arkuszu papieru, który działa jak poduszka, tak że środek oka znajduje się mniej więcej na płaszczyźnie ogniskowej (rysunek uzupełniający S1). Nasze laboratorium korzysta z mikroskopu Z-stack i kamery (patrz Tabela materiałów), ponieważ daje to ogólnie wyraźniejsze obrazy, co pozwala na najlepszą wizualizację całego oka, ponieważ oko muchy ma kształt kopuły. Jednak funkcja Z-stack nie jest wymagana dla tego protokołu, ponieważ z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę ze starszym mikroskopem stereoskopowym bez funkcji Z-stack¹³. Pokrętło światła pierścieniowego jasności jest obrócone nie więcej niż o 1/4 wysokości, aby uniknąć prześwietlenia. Całkowita grubość naszych próbek waha się od 300 do 450 mikronów.

W tym badaniu wykazaliśmy, że analiza oczu muchy za pomocą ilastik i Flynotyper generuje bezstronne i wiarygodne wyniki kwantyfikacji ommatidia. Przeanalizowaliśmy wzorce Drosophila ommatidia za pomocą ilastik, narzędzia do analizy bioobrazu opartego na uczeniu maszynowym, do oznaczania ommatidia, a następnie Flynotyper, metody obliczeniowej używanej do pomiaru regularności ommatidia ^1,11. Wolimy używać lampy pierścieniowej do uzyskiwania obrazów w celu lepszej oceny jakościowej. Jednak takie podejście nie pozwala firmie Flynotyper na uzyskanie wyników ilościowych przy użyciu tych obrazów. W związku z tym ilastik jest wdrażany do wstępnego przetwarzania tych obrazów, a te przetworzone obrazy zostały z powodzeniem wykorzystane z Flynotyper w celu uzyskania wyników ilościowych. Gdy obrazy nie były wstępnie przetwarzane za pomocą ilastik przed Flynotyperem, ogólne wskaźniki P były podobne między oczami zdrowymi i zwyrodnieniowymi. Podkreśla to, jak ważne jest, aby przy wdrażaniu lampy pierścieniowej w pierwszej kolejności wdrażać lampę pierścieniową w celu uzyskania wyników ilościowych.

Istnieją pewne ograniczenia w naszych metodach. Ustawienia w ilastik mogą się znacznie różnić i mogą powodować nieistotne dane. Na przykład przeprowadziliśmy kolejny zestaw analiz przy użyciu tych samych obrazów, ale dostosowaliśmy wartość sigma pierwszego planu w ilastik do 2,5 zamiast 5. Spowodowało to utratę wrażliwości w umiarkowanie zwyrodnieniowych fenotypach (rysunek uzupełniający S2 i tabela uzupełniająca S1). Kolejnym ograniczeniem jest utrata wrażliwości w oczach przy zbyt dużym zwyrodnieniu. W porównaniu z 3x_S81L okiem, oko z martwiczymi plamami jest jakościowo znacznie bardziej zwyrodniałe. Jednak średni P-Score dla 3x_S81L oczu wynosił 60,2, podczas gdy średni P-score dla oczu z martwiczymi plamami wynosił 60,9. Tak więc oczy ze zbyt dużym zwyrodnieniem, takie jak plamy martwicze, mogą również powodować utratę wrażliwości (rysunek uzupełniający S3).

Krytycznym krokiem tego protokołu jest wybór odpowiedniego standardowego obrazu, który służy do trenowania ilastik. Niezdegenerowany standardowy obraz z wyraźnym kontrastem między ommatydiami a otaczającymi komórkami pigmentowymi, takimi jak czerwone lub pomarańczowe oczy, spowoduje dokładniejsze określenie ilościowe w Flynotyper. Kolejnym krytycznym krokiem jest wybór funkcji w ilastik, gdzie czułość, reprezentowana jako wartości sigma, jest wybierana w celu precyzyjnego dostrojenia oprogramowania uczenia maszynowego (rysunek 1D). Wybór zbyt małej liczby cech może zmniejszyć czułość ilastik, co prowadzi do niedokładnego oznaczenia ommatidii. Wybór zbyt wielu cech wydłuży czas i moc obliczeniową wymaganą do wygenerowania wyników, obniżając wydajność procedury. Alternatywnie, jeśli zauważalne jest jakościowe zwyrodnienie oka, ale wyniki analizy nie są statystycznie istotne, zwiększenie wartości sigma wybranych cech byłoby potencjalnym rozwiązaniem. Jednak wybór funkcji zapewniony w tym protokole regularnie daje dokładne wyniki. Wykonanie krytycznych kroków, jak napisano, pomoże złagodzić najczęstsze problemy i rozwiązywanie problemów w przyszłości.

Podsumowując, metoda ta zapewnia lepszą jakość obrazów, a jednocześnie zapewnia bezstronną i wiarygodną ocenę ilościową systemu oka Drosophila . W związku z tym metoda ta może zwiększyć użyteczność zwyrodnienia oczu jako potężnego narzędzia do modelowania chorób zwyrodnieniowych w przyszłości.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Specyfikacja			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Pobierz oprogramowanie tutaj: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Oprogramowanie Open source. Nie należy stosować leku Flynotyper 2.0. W momencie publikacji 2.0 był dość nowy i ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem oryginalnej wersji Flynotypera.
ilastik	Berg, S. i in. (2019)	Pobierz oprogramowanie tutaj: https://www.ilastik.org/download.html	Oprogramowanie open source. Pobierz wersję 1.4.0.post1 w ramach regularnych kompilacji odpowiadających systemowi operacyjnemu komputera.
ImageJ		Pobierz oprogramowanie tutaj: https://imagej.net/ij/download.html	Oprogramowanie open source. Używano wersji 1.53 i 1.54. 1.54 jest zaktualizowaną wersją i jest domyślnym plikiem do pobrania.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System i oprogramowanie używane do akwizycji z-stack.
Mikroskop Leica Z16 APO z kamerą DMC2900	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Określany w tekście jako mikroskop i kamera Z-stack. Ten produkt został zarchiwizowany.