Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja adherentnych leukocytów wywołanych cukrzycą w unaczynieniu siatkówki

DOI:

10.3791/67220

⸱

24 stycznia 2025

 , 
1Gavin Herbert Eye Institute-Center for Translational Vision Research, Department of Ophthalmology, University of California, Irvine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy metodę oznaczania ścian układu krwionośnego siatkówki i przylegających leukocytów. Te przylegające leukocyty można następnie policzyć pod mikroskopem fluorescencyjnym jako parametr stanu zapalnego lub odpowiedź tego zapalenia na terapie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukostasis odnosi się do przyczepiania leukocytów do ściany światła układu krwionośnego. Ta interakcja leukocytów ze ścianą naczyń krwionośnych jest charakterystyczna dla stanu zapalnego i została przyczynowo powiązana z niedrożnością naczyń włosowatych w różnych tkankach i chorobach, w tym retinopatii cukrzycowej.

Białaczka jest od lat opisywana jako zagrażające życiu powikłanie hiperleukocytozy i może być zdiagnozowana tylko klinicznie. Biorąc pod uwagę znaczenie tego zjawiska, przeprowadzono intensywne badania w celu zrozumienia potencjalnych mechanizmów, które prowadzą do jego manifestacji; Jednak w warunkach laboratoryjnych nie ma złotego standardu techniki, która umożliwiałaby wizualizację i ilościowe określenie powagi zdarzenia.

W metodzie opisanej poniżej, układ krwionośny jest początkowo ukrwiany za pomocą buforu do usuwania krwi, a następnie konkanawalina A jest przenikana do układu krwionośnego, gdzie wiąże się ze wszystkimi odsłoniętymi ścianami komórkowymi i powoduje szczególnie jasne zabarwienie leukocytów. Jeśli perfuzja w celu usunięcia wszystkich niezwiązanych komórek krwi zakończyła się sukcesem, pozostałe leukocyty znakowane fluorescencyjnie są związane z układem naczyniowym i można je ręcznie określić ilościowo za pomocą dowolnego dostępnego mikroskopu fluorescencyjnego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukocyty (białe krwinki, WBC) odgrywają ważną rolę w optymalnym funkcjonowaniu układu krwi, takim jak utrzymanie płynności krwi i regulacja rozwiązania skrzepliny1. Odgrywają również kluczową rolę w niektórych stanach patologicznych, takich jak przyleganie do ściany światła układu krwionośnego przez dłuższy czas, co prowadzi do niedrożności naczyń, przynajmniej tymczasowo, zjawisko znane jako leukostasis2,3.

Retinopatia cukrzycowa jest jednym z najczęstszych powikłań długotrwałej cukrzycy i jedną z głównych przyczyn upośledzenia wzroku i ślepoty w USA i na świecie u osób w wieku 20-75 lat4. Powolne i postępujące zwyrodnienie układu krwionośnego siatkówki jest klinicznie znaczącym elementem wczesnych stadiów choroby, która u niektórych pacjentów prowadzi do niedokrwienia siatkówki z wynikającą z tego neowaskularyzacją siatkówki5,6. Skumulowane dowody wskazują, że stan zapalny odgrywa ważną rolę w rozwoju retinopatii7, a leukostaza jest uważana za subkliniczną wewnątrznaczyniową odpowiedź zapalną. Leukostaza występuje we wczesnych stadiach cukrzycy, na długo przed wystąpieniem jakichkolwiek wykrywalnych objawów klinicznych8,9,10. Powtarzające się zatykanie naczyń siatkówki przez przylegające leukocyty przez miesiące lub lata (przewlekła białaczka) w cukrzycy może przyczyniać się do niedrożności naczyń krwionośnych i zwyrodnienia naczyń włosowatych11,12,13. Nasilenie tej białaczki ma znaczenie patologiczne i może być wykorzystane do monitorowania ciężkości procesu chorobowego lub do oceny skuteczności terapii w warunkach badawczych.

Aby dokładniej badać specyficzny wpływ mikrośrodowiska hiperglikemicznego na białaczkę, zaprojektowano modele in vitro. Izolowane komórki śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki mogą być hodowane i układane w modele hodowli 2- lub 3D (mikrokrążenie-na-chipie14) w celu replikacji śródbłonka naczyniowego (monowarstwy komórek, która toruje światło naczyń). Jednak międzyeksperymentalna zmienność tych modeli ogranicza ich zastosowanie. Badania nad leukostazą w unaczynieniu siatkówki u ludzi in vivo są nadal ograniczone, dlatego większość obecnej wiedzy na temat białaczki siatkówki pochodzi z modeli zwierzęcych retinopatii cukrzycowej13,15.

Celem tego raportu jest opisanie standardowego protokołu opartego na metodach opisanych gdzie indziej16 do kwantyfikacji leukocytów dołączonych do układu naczyniowego siatkówki jako parametru leukostazy. Ten test może być wykorzystany do badania innych chorób naczyniowych, które również przebiegają w postaci białaczki, takich jak nowotwory złośliwe3,17,18,19 oraz niektóre stany zakaźne i alergiczne20. Protokół ten może być wdrożony w każdym laboratorium badań podstawowych bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu. W metodzie podsumowanej poniżej, układ krwionośny jest początkowo perfundowany buforem w celu usunięcia krwi, a następnie konkanawalina A jest perfundowana do układu krwionośnego, gdzie wiąże się ze wszystkimi odsłoniętymi ścianami komórkowymi i powoduje szczególnie jasne zabarwienie leukocytów21,22,23. Jeśli perfuzja w celu usunięcia wszystkich niezwiązanych komórek krwi powiedzie się, pozostałe fluorescencyjnie znakowane leukocyty, które są związane z układem krwionośnym, można ręcznie określić ilościowo za pomocą dowolnego dostępnego mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine i jest zgodny z regulacjami rządowymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. W tym protokole nie ma punktów zatrzymania. Średni czas przypadający na mysz to 30 minut.

1. Przygotowanie etapu perfuzji

  1. Przed użyciem rozgrzać worek z 0,9% solą fizjologiczną i roztworem konkanawaliny A w łaźni wodnej o temperaturze 37 oC przez 20-30 minut.
    UWAGA: Chronić konkanawalinę A przed ekspozycją na światło (przykryć folią).
  2. Ustaw tackę, aby zatrzymać krew i płyny przed kapaniem na powierzchnię, na której odbędzie się zabieg. Na wierzchu tacy umieść poduszkę grzewczą pokrytą chłonnym podkładem ławkowym lub dowolnym materiałem chłonnym.
    UWAGA: Celem jest uniknięcie utraty ciepła przez ciało myszy podczas zabiegu, ponieważ chłodzenie utrudnia usunięcie krwi podczas perfuzji.

2. Konfiguracja zaparzacza ciśnieniowego

  1. Połącz szeregowo worek z 0,9% solą fizjologiczną, zestaw cewnika dożylnego, zawór odcinający 4-drogowy i igłębnik do zgłębnika.
  2. Włóż worek z solą fizjologiczną o stężeniu 0.9% między siatkę a pęcherz powietrzny zaparzacza ciśnieniowego. Zawieś worek z solą fizjologiczną na haczyku znajdującym się z tyłu pęcherza powietrznego. Użyj pętli bieguna dożylnego, aby zawiesić zaparzacz ciśnieniowy w słupie dożylnym.
  3. Oczyść przewody i porty ze wszystkich pęcherzyków powietrza, pozwalając systemowi otworzyć się (uruchomić) na kilka minut i ustaw natężenie przepływu na 18-20 ml/min24. Aby napompować pęcherz powietrzny zaparzacza ciśnieniowego, obróć uchwyt zaworu odcinającego tak, aby był skierowany w stronę otwartego odpowietrznika zaworu odcinającego, a następnie pompuj bańkę do pompowania, aż manometr wskaże żądane ciśnienie. Ponownie wyreguluj ciśnienie przed perfuzją każdej myszy. Aby spuścić powietrze, przekręć uchwyt kranu prosto w dół w kierunku żarówki do pompowania.
    UWAGA: Jeśli worek z solą fizjologiczną 0.9% jest nowy, zwykle ciśnienie 150 mmHg zapewnia pożądane natężenie przepływu; Jednak ciśnienie powinno być regulowane empirycznie ze względu na różnice w markach zaparzaczy ciśnieniowych i w okresie użytkowania worka z solą fizjologiczną 0,9%.
  4. Podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną podgrzanym roztworem konkanawaliny A do zaworu 4-drogowego.
    UWAGA: Chronić strzykawkę przed światłem (przykryć folią).

3. Znieczulenie

  1. Dostarczyć znieczulenie przez dootrzewnowe (I.P.) wstrzyknięcie ketaminy:Ksylazyna; najczęściej stosowana dawka do operacji/zabiegu na myszach to 100:10 mg/kg masy ciała25. Oceń znieczulenie za pomocą odruchu pedałowania (mocne uszczypnięcie palca).
    UWAGA: Ta dawka zapewnia początek 4-6 minut przy 45-60 minutach znieczulenia chirurgicznego. Koktajl znieczulający można przechowywać w temperaturze pokojowej maksymalnie 2 tygodnie.

4. Perfuzja przezsercowa i barwienie konkanawaliną A

  1. Umieść mysz na etapie perfuzji w pozycji leżącej, aby umożliwić odsłonięcie klatki piersiowej i jamy brzusznej.
  2. Wizualnie zidentyfikuj wyrostek mieczykowaty, a mając hemostat w dominującej ręce, przypnij skórę i zablokuj ją. Po zabezpieczeniu hemostatu przenieś go do ręki niedominującej i unieś skórę.
  3. Użyj nożyczek w dominującej dłoni i wytnij pod kątem 90° do kręgosłupa skrawek skóry, aby odsłonić zewnętrzną ścianę brzucha.
  4. Mając teraz widoczny wyrostek mieczykowaty i klatkę piersiową, przeprowadź sekcję przez ścianę brzucha obustronnie, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów ani głównych naczyń.
  5. Gdy przepona jest teraz widoczna, uwidocznij komory serca i płuca przez przeponę. Czubkiem nożyczek przeciąć przeponę w jednym z boków, blisko kręgosłupa, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów ani głównych naczyń.
    UWAGA: Ten "otwór" w przeponie zrównoważy ujemne ciśnienie w klatce piersiowej z ciśnieniem atmosferycznym, a odma opłucnowa spowoduje zapadnięcie się płuc i cofnięcie serca, ułatwiając rozwarstwienie przepony bez uszkodzenia płuc lub serca.
  6. Kontynuuj preparację przez żebra i równolegle do płuc, aby utworzyć "klapę" klatki piersiowej. Zwolnij hemostat i przetnij wyrostek mieczykowaty w płaszczyźnie strzałkowej. Delikatnie otwórz szeroko wyrostek mieczykowaty ręcznie. Przyjrzyj się czterem komorom serca.
  7. Ręką niedominującą i kleszczami chwyć serce w pobliżu jego wierzchołka. Ręką dominującą przytrzymaj igłębkę (przymocowaną do cewnika dożylnego) i nakłuj wierzchołek serca. Aby uniknąć pełnej perforacji lewej komory lub dotarcia do układu naczyniowego płuc, a następnie słabej perfuzji układu krążenia, należy sprawdzić położenie końcówki końcówki kulowej igły do zgłębnika, która powinna znajdować się na krawędzi miejsca nakłucia lekko wystającego z serca. Zacisnąć igłę do zgłębnika za pomocą zakrzywionych kleszczy do komarów lub po prostu przytrzymać ją ręcznie podczas manipulowania kranem dożylnym.
  8. Otworzyć kran do 0,9% soli fizjologicznej i prawie jednocześnie rozciąć prawy przedsionek nożyczkami; perfuzja przez 2-3 min. W czasie perfuzji delikatnie przesuwaj igłę z boku na bok oraz w górę iw dół, aby zmniejszyć załamanie naczyń krwionośnych i zwiększyć odpływ krwi z serca.
  9. Po zalaniu solą fizjologiczną przekręć uchwyt kranu, aby odciąć przepływ soli fizjologicznej i umożliwić przepływ ze strzykawki do igły do zgłębnika. Perfuzję ręczną z roztworem konkanawaliny A w stanie ustalonym. Upewnij się, że 10 ml roztworu konkanawaliny A jest dozowane w ciągu 30-35 sekund.
  10. Po perfuzji z konkanawaliną A przekręcić zawór, aby odciąć przepływ ze strzykawki i umożliwić przepływ z 0,9% soli fizjologicznej do igły do zgłębnika. Perfuzjować z 0,9% roztworem soli fizjologicznej przez dodatkowe 2-3 minuty. Usunąć igłębnik z serca.
    UWAGA: Konkanawalina A sugerowana w tym protokole jest sprzężona z fluoresceiną (kolor zielony); jednak dostępna jest również konkanawalina A przyłączona do innych fluorochromów.

5. Wyłuszczenie i izolacja świeżej siatkówki

  1. Obróć mysz na bok i używając ręki niedominującej, połóż palec wskazujący i kciuk odpowiednio na powiece górnej i dolnej. Delikatnie cofnij powieki i skórę palcami i podeprzyj oko, sprawiając, że częściowo wybrzuszy się z oczodołu.
  2. Podczas gdy oko jest podniesione, użyj zakrzywionych nożyczek w dominującej dłoni i nabierz pod okiem pod kątem 45°. Przetnij przyczep mięśniowy i nerw wzrokowy. Używając tych samych nożyczek co szpatułka, przenieś oko do małego pojemnika lub bezpośrednio na scenę mikroskopu preparacyjnego.
    UWAGA: Uważaj, aby nie odciąć tylnej części oka i nie ciągnąć oka podczas tego kroku.
  3. Umieść oko na wosku dentystycznym, aby otworzyć kulę ziemską. Pod mikroskopem preparacyjnym i przy użyciu ręki niedominującej przytrzymać fałd twardówkowy lub resztki mięśni nadal przyczepione zewnętrznie do tylnego oka za pomocą mikrokleszczy i ustawić oko tak, aby rogówka była skierowana na bok.
    UWAGA: Aby zapobiec przesuwaniu się/przesuwaniu oka podczas otwierania gałki ziemskiej, na wosku dentystycznym można umieścić kawałek mokrej, niestrzępiącej się chusteczki.
  4. Jednym z ostrych rogów żyletki pokrytej teflonem wykonaj nacięcie 1-2 mm z tyłu i równolegle do rąbka (połączenie rogówka-twardówka). Przytrzymaj fałd twardówkowy lub mięsień za pomocą mikrokleszczy i przeciągnij ostrze po rąbku przy minimalnej sile skierowanej w dół. Kontynuuj cięcie maszynką do golenia, aby całkowicie oddzielić przedni odcinek (rogówka, tęczówka, soczewka i ciało szkliste) od tylnego odcinka (muszli ocznej).
    UWAGA: Nie piłuj tam iz powrotem.
  5. Przenieść przeciętą na pół muszlę oczną na małą szalkę Petriego za pomocą PBS.
    UWAGA: Unikaj kontaktu siatkówki z bibułką (uwaga w kroku 5.3), ponieważ będzie ona mocno przylegać do papieru i stanie się zasadniczo niemożliwa do odzyskania.
  6. Chwyć fałd twardówkowy lub pozostały mięsień na zewnątrz twardówki za pomocą mikrokleszczy. Całkowicie odłącz siatkówkę od twardówki, zrywając wszystkie połączenia na rąbku na obwodzie muszli ocznej za pomocą mikroszpatułki. Wyciągnij siatkówkę z twardówki za pomocą mikroszpatułki. Jeśli siatkówka jest nadal przymocowana do twardówki przez nerw wzrokowy, wsuń mikronożyczki między siatkówkę a twardówkę, aby przeciąć nerw wzrokowy.
  7. Usuń wszelkie pozostałości mięśnia szklistego i rzęskowego na obrzeżach siatkówki. Natychmiast przenieś izolowaną siatkówkę na szkiełko z niewielką ilością PBS.
    UWAGA: Każda inna technika izolacji siatkówki może być użyta w zależności od preferencji badacza.

6. Płaskie mocowanie siatkówki

  1. Rozłóż nieutrwaloną siatkówkę na szkiełku z niewielką ilością PBS. Za pomocą mikroszpatułki delikatnie ustaw siatkówkę ciałem szklistym do góry. Jeśli siatkówka jest zagięta do wewnątrz, użyj mikrokleszczyków, aby przytrzymać krawędzie siatkówki, podczas gdy siatkówka jest rozwijana za pomocą mikroszpatułki.
  2. Wykonaj 4-5 promienistych nacięć w siatkówce, tak aby leżała płasko (wzór koniczyny).
  3. Za pomocą niestrzępiącej się chusteczki osusz nadmiar PBS z dala od siatkówki.
    UWAGA: Nie dotykaj siatkówki tkanką; W przeciwnym razie próbka zostanie utracona. Preparat nakrywkowy jest pożądany, aby siatkówka była płaska.

7. Mikroskopia

UWAGA: Do tego kroku można użyć dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego z kanałem GFP/FITC (480/530 nm). Do tej pracy wykorzystaliśmy referencyjny mikroskop z 488 kanałami i powiązanym oprogramowaniem do akwizycji obrazu.

  1. Obserwuj niedawno płasko zamontowaną siatkówkę pod mikroskopem w powiększeniu 100x (obiektyw 10x) i policz fluorescencyjnie znakowane leukocyty (ręcznie), metodycznie skanując całą tkankę (od prawej do lewej lub od góry do dołu).
    UWAGA: Leukocyty to pojedyncze fluorescencyjne kropki, które mogą mieć okrągły lub owalny kształt. Mają średnicę 12-15 μm i nie wystają z naczyń włosowatych siatkówki (struktura jest całkowicie ograniczona przez światło naczynia).
  2. Uzyskaj reprezentatywne obrazy o pożądanym powiększeniu i wykonaj obróbkę końcową obrazów za pomocą wybranego oprogramowania (np. ImageJ [Fiji]).
  3. Wyraź liczbę jako leukocyty na siatkówkę. Wykres danych według średniej ± odchylenia standardowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dobrze wykonany protokół perfuzji i barwienia pokaże pełne unaczynienie siatkówki nakreślone konkanawaliną A (Rysunek 1). Słaba perfuzja myszy uniemożliwia znakowanie całego drzewa naczyniowego i późniejszą analizę leukocytów przylegających do światła (Rysunek 2), podczas gdy nadmierny nacisk spowodowany szybkim ściśnięciem strzykawki (mniej niż 30-35 s) może powodować przepuszczalność naczyń krwionośnych i pękanie naczyń krwionośnych ( Rysunek 3). Wynaczyniona ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leukostaza u ludzi odnosi się do objawów i objawów klinicznych związanych z hiperleukocytozą (całkowita liczba leukocytów (WBC) >100 000/μl) i jest nagłym przypadkiem medycznym20. Mechanizm(y) prowadzący do białaczki są przedmiotem intensywnych badań. Do tej pory badanie białaczki u ludzi in vivo nie jest jeszcze możliwe, a naukowcy muszą polegać na modelach zwierzęcych, aby zrozumieć ten proces. Różne choroby objawiają się białaczką, a posiadanie szczegółowego protokołu do wizualizacji z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Granty R01EY022938, R01EY022938-S1 i K99EY034928. Autorzy doceniają usługi CWRU (P30EY11373) i UCI (P30EY034070) Visual Science Research Center Cores, a także wsparcie departamentu z nieograniczonego grantu z Research to Prevent Blindness dla Gavin Herbert Eye Institute na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka
4-drogowy zawór odcinający Luer lock I.V.Baxter2C6204
Concanavalin A roztwórWektor FL-1001Przygotuj w PBS 1 mg / ml
narzędzi preparacyjnychZawiera hemostatyki, nożyczki i kleszcze
FIJIOprogramowanie do przetwarzania obrazu
Mikroskop fluorescencyjnyKleszcze NikonEclipse Ni
, Dumont #5, końcówka klasy biologicznejMikroskopia elektronowa Nauki (EMS)72700-D
Igła do zgłębnika 1,25 mm OD końcówka lufy x 30 mmFine Science18060-20
Kleszcze do komarów HalsteadFisher Scientific13-812-10
I.V. Zestaw cewników z zaciskiem regulacyjnym 70 caliBaxter2C5417s
I.V. Pole
Niestrzępiąca się tkankaKimpwipes to opcja
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji, Vannas, 3 mm prosteROBOZRS-5620
MikroszpatułkaFine Science Tools (FST)10091-12
NikonNIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)Oprogramowaniedo akwizycji obrazu
szalka Petriego (100 mmx15 mm)Corning351029
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Różowy woskdentystyczny Mikroskopia elektronowa Nauki ( EMS)72670
Zaparzacz ciśnieniowyInfuzor4010
Żyletki, jednokrawędziowa stal nierdzewna GEM, pokryta teflonemMikroskopia elektronowa Sciences (EMS)71970
Sól fizjologiczna 0,9%, klasa weterynaryjna, 1000 mlBaxter04925-04-10
Nożyczki do preparowania, zakrzywione końcówki 22 mmROBOZRS 5983
10 mlZestaw

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swystun, L. L., Liaw, P. C. The role of leukocytes in thrombosis. Blood. 128 (6), 753-762 (2016).
  2. Barouch, F. C., et al. Integrin-mediated neutrophil adhesion and retinal leukostasis in diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41 (5), 1153-1158 (2000).
  3. Macaron, W., Sargsyan, Z., Short, N. J. Hyperleukocytosis and leukostasis in acute and chronic leukemias. Leuk Lymphoma. 63 (8), 1780-1791 (2022).
  4. Kempen, J. H., et al. The prevalence of diabetic retinopathy among adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122 (4), 552-563 (2004).
  5. Kohner, E. M. Diabetic retinopathy. Br Med Bull. 45 (1), 148-173 (1989).
  6. Aouiss, A., Anka Idrissi, D., Kabine, M., Zaid, Y. Update of inflammatory proliferative retinopathy: Ischemia, hypoxia and angiogenesis. Curr Res Transl Med. 67 (2), 62-71 (2019).
  7. Tsalamandris, S., et al. The role of inflammation in diabetes: Current concepts and future perspectives. Eur Cardiol. 14 (1), 50-59 (2019).
  8. Adamis, A. P. Is diabetic retinopathy an inflammatory disease. Br J Ophthalmol. 86 (4), 363-365 (2002).
  9. Joussen, A. M., et al. A central role for inflammation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. FASEB J. 18 (12), 1450-1452 (2004).
  10. Serra, A. M., et al. CD11b+ bone marrow-derived monocytes are the major leukocyte subset responsible for retinal capillary leukostasis in experimental diabetes in mouse and express high levels of CCR5 in the circulation. Am J Pathol. 181 (2), 719-727 (2012).
  11. Kinukawa, Y., Shimura, M., Tamai, M. Quantifying leukocyte dynamics and plugging in retinal microcirculation of streptozotosin-induced diabetic rats. Curr Eye Res. 18 (1), 49-55 (1999).
  12. Linsenmeier, R. A., et al. Retinal hypoxia in long-term diabetic cats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (9), 1647-1657 (1998).
  13. Herdade, A. S., et al. Effects of diabetes on microcirculation and leukostasis in retinal and non-ocular tissues: Implications for diabetic retinopathy. Biomolecules. 10 (11), 1583(2020).
  14. Oakley, J., et al. Incorporating hemoglobin levels to map leukostasis risk in acute leukemia using microvasculature-on-chip technologies. Blood. 136 (Suppl 1), 9-10 (2020).
  15. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  16. Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
  17. Lester, T. J., Johnson, J. W., Cuttner, J. Pulmonary leukostasis as the single worst prognostic factor in patients with acute myelocytic leukemia and hyperleukocytosis. Am J Med. 79 (1), 43-48 (1985).
  18. Porcu, P., et al. Hyperleukocytic leukemias and leukostasis: a review of pathophysiology, clinical presentation and management. Leuk Lymphoma. 39 (1-2), 1-18 (2000).
  19. Giammarco, S., et al. Hyperleukocytosis and leukostasis: management of a medical emergency. Expert Rev Hematol. 10 (2), 147-154 (2017).
  20. Mank, V., Azhar, W., Brown, K. Leukocytosis. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).
  21. Bernhard, W., Avrameas, S. Ultrastructural visualization of cellular carbohydrate components by means of concanavalin A. Exp Cell Res. 64 (1), 232-236 (1971).
  22. Oliver, J. M., Zurier, R. B., Berlin, R. D. Concanavalin a cap formation on polymorphonuclear leukocytes of normal and beige (chediak-higashi) mice. Nature. 253 (5491), 471-473 (1975).
  23. Pink, J. R., Hoessli, D., Tartakoff, A., Hooghe, R. Characterisation of Concanavalin A-binding glycoproteins from mouse splenic leukocytes by two-dimensional electrophoresis: preferential binding of incompletely glycosylated forms of H-2 antigen to the lectin. Mol Immunol. 20 (4), 491-497 (1983).
  24. Janssen, B., Debets, J., Leenders, P., Smits, J. Chronic measurement of cardiac output in conscious mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (3), R928-R935 (2002).
  25. Flecknell, P. A. Anaesthesia of common laboratory species: Special considerations. Laboratory Animal Anaesthesia. Flecknell, P. A. , 3rd Edition, Academic Press. 181-241 (2009).
  26. Seemann, S., Zohles, F., Lupp, A. Comprehensive comparison of three different animal models for systemic inflammation. J Biomed Sci. 24 (1), 60(2017).
  27. Lessieur, E. M., et al. ICAM-1 on the luminal surface of endothelial cells is induced to a greater extent in mouse retina than in other tissues in diabetes. Diabetologia. 65 (10), 1734-1744 (2022).
  28. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns: I. Normal architecture. Arch Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  29. Tigner, A., Ibrahim, S. A., Murray, I. V. Histology, white blood cell. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Retinopatia cukrzycowaadhezja leukocyt wkwantyfikacja leukostazymikroskopia fluorescencyjnaperfuzja siatk wkibarwienie konkanawalin Aokluzja naczy w osowatychmodele zapalnebia e krwinki

Powiązane artykuły