Artykuł metodologiczny

Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67227

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) mają obiecujący potencjał jako bioterapia przeciwnowotworowa. To oparte na metodologii badanie przedstawia skalowalny proces bioprodukcji w pętli zamkniętej, zaprojektowany do ciągłej produkcji i izolowania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości. Testy kontrolne w trakcie procesu są przeprowadzane w całym procesie bioprodukcji, aby zapewnić, że pojazdy elektryczne spełniają standardy jakości dotyczące wprowadzania produktu do obrotu.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) są badane jako bioterapia przeciwnowotworowa. Posiadają unikalne właściwości jako cytotoksyczne nanopęcherzyki ukierunkowane na komórki nowotworowe oraz jako komunikatory immunomodulujące. Skalowalny proces bioprodukcji umożliwia produkcję dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości, aby spełnić wymagania przedkliniczne i kliniczne. Przepływ pracy wykorzystuje bioreaktor z pustymi włóknami w pętli zamkniętej, umożliwiający ciągłą produkcję NK-EV z linii komórkowej NK92-MI w warunkach wolnych od surowicy, ksenoizolacji, karmów i antybiotyków, zgodnie ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej. To oparte na protokole badanie przedstawia proces bioprodukcji do izolowania NK-EV przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości, ultrafiltracji i sterylizacji opartej na filtrach. Niezbędna charakterystyka produktu NK-EV jest przeprowadzana za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, a ich funkcjonalność jest oceniana za pomocą zwalidowanego, opartego na żywotności komórek testu siły działania w stosunku do komórek rakowych. Ten skalowalny proces bioprodukcji ma znaczny potencjał, aby przyspieszyć kliniczne tłumaczenie bioterapeutyków przeciwnowotworowych opartych na NK-EV poprzez przestrzeganie najlepszych praktyk i zapewnienie odtwarzalności.

Wprowadzenie

W XXIwieku osiągnięto niezwykłe postępy w walce z rakiem. Wynika to głównie z rozwoju immunoterapeutyków przeciwnowotworowych, klasy leków, które wykorzystują układ odpornościowy do walki z rakiem. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EV) stanowią obiecujących rywali w rozwijającej się dziedzinie immunoterapii. Komórki NK, integrujące się z odpornością wrodzoną i nabytą, odgrywają kluczową rolę w obronie organizmu przed komórkami zakażonymi wirusem, zestresowanymi i złośliwymi. Wykorzystują szeroki arsenał maszyn przeciwnowotworowych do eliminowania nieprawidłowych komórek za pomocą środków cytotoksycznych1,2,3. Wśród tych mechanizmów jest produkcja i wydzielanie EVs, dwuwarstwowych struktur w nanoskali zawierających różne biomolekuły, takie jak białka, RNA i DNA, kluczowych dla ułatwienia komunikacji międzykomórkowej4,5,6. NK-EV jawią się jako obiecujące terapie bezkomórkowe ze względu na swoje unikalne właściwości nośnikowe. Należą do nich ich niewielkie rozmiary, umożliwiające sterylizację opartą na filtrach, wysoka biokompatybilność, preferencyjna akumulacja w obrębie guzów, szerokie spektrum dostarczania ładunków, zdolność do pokonywania barier biologicznych, takich jak bariera krew-mózg, oraz minimalny profil toksyczności. Z kilku powodów NK-EV eliminują potrzebę limfodeplecji pacjenta poprzez chemioterapię przed podaniem: 1) konwencjonalnie limfodeplecja jest stosowana w celu stworzenia bardziej przyjaznego środowiska dla terapii komórkowej, umożliwiając namnażanie się komórek infuzyjnych i wywieranie efektów terapeutycznych; 2) w przeciwieństwie do komórek, EV nie mają zdolności replikacji i mają znacznie mniejszą skalę; 3) EV działają w oparciu o odrębne mechanizmy i wykazują zmniejszoną immunogenność w porównaniu z komórkami5,6,7. Co więcej, NK-EV konsekwentnie wykazywały skuteczność in vitro przeciwko różnym modelom raka, a także wykazywały działanie immunomodulujące na komórki odpornościowe, które sprzyjają odpowiedziom przeciwnowotworowym8,9. Wyniki in vivo potwierdzają te ustalenia, wskazując na regresję raka po leczeniu NK-EV i znikomą toksyczność10,11,12. W związku z tym terapie oparte na NK-EV są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów związanych z leczeniem zimnych, immunologicznie obojętnych guzów litych13,14,15,16,17.

Nasze ostatnie badanie dotyczy istotnego wąskiego gardła w klinicznym translacji NK-EV poprzez bioprodukcję7. W artykule przedstawiono dowód słuszności koncepcji opłacalnego i skalowalnego procesu bioprodukcji pojazdów NK-EV, skrupulatnie zaprojektowanego w celu zapewnienia testów kontroli jakości w trakcie procesu. Podejście to w sposób ciągły wytwarzało duże ilości bioterapeutyków przeciwnowotworowych o wysokiej czystości na bazie NK-EV, z dokładną charakterystyką produktu przeprowadzoną zgodnie z wytycznymi MISEV201818. Skalowalność procesu bioprodukcji można osiągnąć poprzez zwiększenie rozmiaru wkładów lub równoległą pracę wielu bioreaktorów. Podobnie, skalowalność przepływu pracy izolacji EV można łatwo osiągnąć przy użyciu technik takich jak chromatografia cieczowa oparta na szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), chromatografia wykluczenia wielkości (SEC), ultrafiltracja (UF) i sterylizacja oparta na filtrach. System bioreaktora kapilarnego (HFB) w pętli zamkniętej wyhodował samowystarczalną linię komórkową NK IL-2 (komórki NK92-MI) bez konieczności suplementacji surowicy, systemu podawania i antybiotyków. Udało się to osiągnąć przy użyciu dostępnego na rynku, zdefiniowanego chemicznie i wolnego od ksenotypów podłoża (wersja GMP jest obecnie dostępna na rynku). W rezultacie, w ciągu 5-7 dni udało się wyprodukować duże ilości ogniw NK (10 9 żywotnych ogniw) i NK-EV (1012 EV) przy użyciu jednego średniej wielkości wkładu do bioreaktora, przy czym oba produkty zostały dokładnie scharakteryzowane. W całym procesie bioprodukcji zdrowie komórek było codziennie monitorowane za pomocą wymiernych wskaźników, takich jak pH, poziom glukozy i mleczanu, a także wskaźników wizualnych, takich jak kolor podłoża i wszelkie oznaki zanieczyszczenia, które są podstawowymi predyktorami jakości komórek i EV. Ocena żywotności i funkcjonalności komórek NK po zbiorach generowanych w systemie HFB, w szczególności cytotoksyczności, wykazała znaczną poprawę w porównaniu z hodowlami opartymi na kolbach7. Podobnie, oczyszczone NK-EV wykazywały wysoki profil czystości, pozbawione bakterii, mykoplazmy, powszechnych jednostek wirusowych i składników komórkowych oraz ze znikomym poziomem endotoksyn. Co ważne, oczyszczone NK-EV stanowiły ponad 99,9% wszystkich nanocząstek znalezionych w produkcie końcowym7. Wreszcie, te oczyszczone NK-EV zachowały kluczowe cechy NK, w tym markery powierzchniowe (CD2, CD45, CD56), ładunek cytokin (GzmB, PFN, IFN-g) i wykazały silną cytotoksyczność wobec białaczkowych komórek K562, złotego standardu w ocenie cytotoksyczności komórek NK7.

Obecny protokół szczegółowo opisuje skalowalny proces produkcji biologicznej omówiony powyżej. Wyjaśniono w nim metodologię izolowania NK-EV wytwarzanych przy użyciu FPLC-SEC w połączeniu z UF i sterylizacją opartą na filtrach. Ponadto w protokole opisano kluczowe etapy, w tym charakterystykę produktu za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), ocenę jakości przy użyciu różnych narzędzi (kwantyfikacja białek/dsDNA i testy mikrobiologiczne) oraz walidację funkcjonalną oczyszczonego produktu NK-EV przeciwko komórkom rakowym za pomocą testu żywotności komórek. Zazwyczaj ten przepływ pracy daje 1,0 - 1,5 ml produktu NK-EV o średnim stężeniu 1,18 x 1012 EVs/mL7, co daje co najmniej 1 x 1012 EV w oparciu o około 40 ml CM bogatego w EV. Proces ten umożliwia dopuszczenie produktu do różnych dalszych zastosowań, takich jak badania śledcze, przedkliniczne i multiomiczne (proteomika, transkryptomika, genomika, metabolomika, lipidomika i epigenomika) wymagające dużych ilości wysokiej jakości EV, a jednocześnie posiadające potencjał do translacji klinicznej, z wykazaną odtwarzalnością.

Protokół

1. Bioprodukcja NK-EV z komórek NK92-MI z wykorzystaniem bioreaktora w obiegu zamkniętym

UWAGA: NK-EV są wytwarzane przy użyciu skalowalnego procesu biomanufaktury, który jest zgodny z Dobrą Praktyką Wytwarzania (GMP) i wykorzystuje komórki NK92-MI (patrz Rycina 1). Nasza niedawna publikacja zawiera szczegółowe informacje na temat procedury biomanufaktury oraz profili tożsamości i bezpieczeństwa produktów NK-EV7.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Bioprodukcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK (NK-EVs) w bioreaktorze z włóknami kapilarnymi (HFB) w obiegu zamkniętym ze skalowalnym procesem izolacji. Schematyczny przebieg procesu bioprodukcji w celu uzyskania dużych ilości wysokiej czystości produktów NK-EV. Samowystarczalne pod względem IL-2 komórki NK92-MI są wysiewane do kartridża HFB w obiegu zamkniętym i hodowane w warunkach bezsurowiczych (SF), wolnych od białek pochodzenia zwierzęcego (XF), bez komórek wspierających oraz bez antybiotyków, gdzie są namnażane w celu ciągłego zbierania bogatego w EV medium warunkującego. Izolacja NK-EV z bogatego w EV medium warunkującego jest przeprowadzana za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego opartej na szybkej cieczowej chromatografii białkowej (FPLC-SEC) połączonej z ultrafiltracją (UF). NK-EV są charakteryzowane i oceniane za pomocą wielu testów, a ich funkcjonalność przeciwko komórkom białaczki K562 jest oceniana za pomocą testu żywotności (viability potency assay). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie 7(stworzony w Biorender.com). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Zaczynając od 1 - 5 x 106 komórki NK92-MI oraz utrzymywanie gęstości komórek w zakresie 3–8 x 105 komórek/ml, hodować komórki w kolbach T25 – T175, używając uprzednio ogrzanego pożywki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (patrz Tabela materiałów). Wymieniać pożywkę co 2–3 dni, aż do osiągnięcia liczebności 1 x 108 Komórki NK92-MI są otrzymywane przy żywotności wynoszącej co najmniej 70%.
    UWAGA: Zachować 1/5th-1/3B&R warunkowanej pożywki (CM) podczas ponownego wysiewu komórek, ponieważ zawiera ona korzystne czynniki wzrostu.
  2. Należy przeprowadzić przygotowanie kartridża HFB z medium oraz inokulację komórek NK zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Wszystkie czynności należy przeprowadzać w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, aby zapewnić i utrzymać sterylność. Przed umieszczeniem systemu kartridżowego w komorze należy obficie spryskać go 70-procentowym etanolem, zwracając szczególną uwagę na szyjkę zbiornika oraz połączenia strzykawek.
    1. Przygotować kartridż HFB zgodnie z instrukcjami producenta19 (patrz Tabela materiałów; patrz Rycina 2) zgodnie z poniższym opisem.
      1. Zabezpieczyć połączenia Luer Lock folią woskową i ustawić szybkość przepływu pompy zgodnie z instrukcją producenta19Kondycjonuj kartridż HFB, przepuszczając przez niego 150 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej fosforanowej (PBS; patrz Tabela materiałów) w celu cyrkulacji przez co najmniej pięć dni.
      2. Aby usunąć powietrze z zewnątrzkapilarnej przestrzeni pęcherzykowej (ECS; objętość wynosi około 29 ml), należy wstrzyknąć około 40 ml PBS przez lewy port ECS, pozwalając powietrzu ujść przez prawy port ECS. Podczas tej czynności należy zamknąć zaciski lewego i prawego portu końcowego. Należy upewnić się, że strzykawka jest stale podłączona do lewego i prawego portu ECS.
      3. Po zakończeniu umieść kartridż na pompie przepływowej (patrz Tabela materiałów) wewnątrz inkubatora ustawionego na 37 °C oraz 5% CO22Upewnij się, że po kilku dniach cyrkulacji nie występują żadne wycieki.
    2. Zastąp PBS 150 ml pożywki hodowlanej w butelce zbiorniku oraz ECS na 2 dni przed zasianiem komórek do kartridża. Powtórz poprzednie kroki kondycjonowania (krok 1.2.1.), stosując pożywkę hodowlaną, jednak przez 2 dni cyrkulacji.
    3. Przed wysianiem komórek należy wymienić zawartość butelki zbiornika oraz ECS na 250 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    4. Wyjmij kolbę z hodowlą z inkubatora i przenieś komórki do probówki o pojemności 50 ml. Wiruj przy 300 x g przez 5 min. Osad komórkowy resuspendować w 21 ml pożywki hodowlanej.
    5. Przygotować dwie alikwoty 20.5 µL każdy z zawiesin komórkowych w celu policzenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów). Do każdego 20.5 µL alikwot zawiesiny komórkowej, dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz Tabela materiałów) i wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół co najmniej 10 razy.
      UWAGA: Nie zalecamy stosowania błękitu trypanu do dokładnego liczenia komórek NK. Alternatywnie można użyć komory countingowej (hemocytometru) do ręcznego liczenia.
    6. Załaduj 20 µL do każdej komory liczącej szkiełka do liczenia i przeprowadź automatyczne zliczanie komórek przy użyciu odpowiedniego programu. Oblicz średnie stężenie żywych komórek i odnotuj żywotność.
    7. Kilkakrotnie wymieszaj roztwór komórek NK, a następnie odessij go za pomocą strzykawki 20 ml i igły 18 G, aby zachować sterylność. Roztwór ten powinien zawierać około 1 x 108 żywe komórki NK w około 20 ml lub około 5 x 106 komórek/ml
    8. Po wyjęciu igły z zestawu strzykawki, delikatnie wstrzyknij komórki NK do kartridża przez lewy port ECS. Aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie komórek w całym kartridżu, delikatnie przemieszczaj roztwór komórkowy w przód i w tył co najmniej 10 razy, używając strzykawek podłączonych do lewego i prawego portu ECS.
      UWAGA: roztwór powinien mieć taką samą mętność w obu strzykawkach, przy zamkniętych lewym i prawym porcie końcowym.
    9. Otwórz lewy i prawy port końcowy i wstrzyknij pozostałą zawartość strzykawek. Zamknij lewy i prawy port ECS za pomocą zacisków.
    10. Przenieś kartridż do inkubatora i pozostaw go na 30 min przed prawidłowym zamontowaniem w pompie przepływowej. Pozostaw kartridż w celu przeprowadzenia bioprodukcji. Dostosuj szybkość przepływu zgodnie z zaleczeniami producenta.
    11. W celu monitorowania parametrów kondycji komórek, codziennie pobierać 0,5 ml medium z dokładnie wymieszanego medium w butelce-zbiorniku i przechowywać w temperaturze -20 °C po zweryfikowaniu poziomów glukozy i pH. Poziomy L-mleczanu można zweryfikować później (patrz Tabela materiałów).
    12. Wymieniać medium w zbiorniku (250–500 ml) co 1–2 dni, aby utrzymać zawartość glukozy na poziomie powyżej 50% wartości początkowych w medium oraz pH powyżej 7,0 (zakres od 7,0 do 8,0).
  3. Zbieranie pożywki warunkowanej (CM) bogatej w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe komórek NK (NK-EV) należy przeprowadzać codziennie po jednym dniu odpoczynku od pierwszego zasiewu w kartridżu, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Przenieś system kartridżowy do komory z laminarnym przepływem powietrza. Delikatnie wstrzyknij około 21 ml pożywki hodowlanej przez lewy port ECS, aby wypchnąć równą objętość CM bogatego w EV przez prawy port ECS – nie mieszać (patrz Rysunek 3).
      UWAGA: Zawsze należy używać nowych wyrobów plastikowych, aby zapobiec kontaminacji.
    2. Przenieś roztwór CM bogaty w EV do probówki o pojemności 50 ml i wiruj przy 300 x g przez 5 min. W tym czasie przenieś system z kartridżem z powrotem do inkubatora na pompie przepływowej.
    3. Przenieś supernatant do nowej probówki i odwiruj przy 2000 x g przez 10 min. Ponownie przenieś nadsącz do nowej probówki. Następnie podziel bogatą w EV pożywkę warunkową (CM) w równych częściach do 3 probówek o pojemności 50 ml (~7 ml/probówkę) i przechowuj w temperaturze −80 °C do czasu dalszego przetwarzania.
      UWAGA: Sekwencyjnie zbierane CM bogate w EV łączy się w tych trzech probówkach, tworząc trzy próbki będące powtórzeniami technicznymi.
  4. Przeprowadź zbiór komórek HFB-NK, aby kontynuować produkcję CM bogatego w EV, korzystając z tego samego kartridża HFB, zgodnie z opisem poniżej.
    UWAGA: Komórki NK można zebrać z ECS układu HFB, wykonując protokół zbioru komórek HFB-NK" gdy w kartridżu zostanie osiągnięta konfluencja (maksymalnie 1 x 109 komórki). Dzieje się to po 5–7 dniach dla każdej partii lub gdy stwierdzono, że zawartość glukozy znajduje się poniżej granicy wykrywalności glukometru (np. brak odczytu lub odczyty ok. 0) przez 2 kolejne dni. Jeśli jest to końcowe zbieranie komórek, pożywkę można zastąpić roztworem PBS w celu przepłukania kartridża i odzyskania komórek.
    1. Zbierz CM bogate w EV dokładnie tak, jak opisano powyżej w kroku 1.3.
    2. Wstrzyknij około 50 mL pożywki przez lewy port ECS. Aby zapewnić jednorodną dyspersję komórek w kartridżu, delikatnie przesuwaj roztwór komórkowy w przód i w tył za pomocą strzykawek podłączonych do lewego i prawego portu ECS co najmniej 10 razy, aby odczepić komórki, a następnie wypchnij i zbierz je strzykawką przez prawy port ECS. Przenieś zebrane bogate w EV CM do probówki o objętości 50 mL. Odstaw do 37 °C (kąpiel wodna lub inkubator) na ten moment.
      UWAGA: Ruch cofający pomaga odłączy komórki przed ich całkowitym wypchnięciem i zebraniem za pomocą strzykawki przez prawy port ECS. Roztwór powinien mieć jednakową mętność w obu strzykawkach przy zamkniętych lewym i prawym porcie końcowym. Opukanie wkładu bioreaktora (bodziec mechaniczny) może pomóc w uprzednim odłączeniu skupiska komórek znajdującego się na dnie wkładu. Intensywne mieszanie zawiesiny komórkowej ruchem posuwisto-zwrotnym może negatywnie wpłynąć na żywotność odzyskanych komórek. Aby zmaksymalizować żywotność, należy postępować z ostrożnością i cierpliwością.
    3. Powtórz ostatni krok 2 razy. Łącznie należy odzyskać 150 mL zawiesiny komórkowej. Odwiruj przy 300 x g przez 5 min. Odrzucić nadsącz.
    4. Resuspender oba osady komórkowe w 20 ml świeżej pożywki każdy, a następnie połączyć je ze sobą. Pobrać dwie porcje 20.5 µL każdą zawiesinę komórkową w celu policzenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest wykonanie licznych rozcieńczeń komórek z użyciem PBS jako rozcieńczalnika, aby zmieścić się w zakresie dynamicznym licznika komórek.
    5. Do 20.5 µL alikwot zawiesiny komórkowej, dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz Tabela materiałów) i wymieszać poprzez co najmniej 10-krotne pipetowanie. Nanieść 20 µL do każdej komory liczącej szkiełka do liczenia i przeprowadzić zautomatyzowane liczenie komórek przy użyciu odpowiedniego programu.
    6. Oblicz średnią koncentrację żywych komórek dla wszystkich zliczeń skorygowanych o rozcieńczenie, określ całkowitą liczbę żywych komórek i odnotuj żywotność. Zgodnie z powyższym opisem, aby w sposób ciągły otrzymywać CM bogate w EV przy użyciu tego samego wkładu bioreaktora, ponownego wysiej 1 x 108 Komórki NK wytworzone w systemie HFB.
      UWAGA: W razie potrzeby komórki NK wyprodukowane z HFB można przechowywać, stosując medium do kriokonserwacji oraz pojemnik do zamrażania w celu kontrolowania szybkości zamrażania (patrz Tabela materiałów).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Elementy i konfiguracja systemu bioreaktora z kapilarami pustymi w środku (HFB). Butelka z rezerwuarem (1) zawiera pełną pożywkę, która krąży przez wkład bioreaktora (2) dzięki działaniu pompy perystaltycznej (nie pokazano) oddziałującej na przewód pompy (3). Komórki wprowadza się do pozakomórkowej przestrzeni kapilarnej (ECS) poprzez lewy (4) i prawy (5) boczne porty ECS. Po zamknięciu zacisków do slajdów ECS, lewy (6) i prawy (7) boczne porty końcowe pozostają otwarte, aby umożliwić krążenie pożywki w całym systemie. Zwróć uwagę na dodanie folii woskowej na połączeniu Luer Lock w pobliżu zakrętki butelki z pożywką w celu zapobiegania potencjalnemu zanieczyszczeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schematyczny przebieg procesu izolacji NK-EV. Po codziennym zbieraniu bogatego w EV medium warunkującego (CM), roztwór poddawano wirowaniu różnicowemu w celu usunięcia komórek (pierwsze wirowanie przy 300 x g przez 5 min) oraz debris komórkowego (drugie wirowanie przy 2000 x g przez 10 min). Oczyszczone bogate w EV CM przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki. W celu izolacji NK-EV, zamrożone bogate w EV CM rozmrażano i wirowano ponownie, aby zapewnić usunięcie debris komórkowego (trzecie wirowanie przy 10 000 x g przez 30 min). Następnie bogate w EV CM inkubowano przez 2 - 4 h w temperaturze 37 °C z endonukleazą w celu trawienia kwasów nukleinowych uznanych za zanieczyszczenia pochodzące z komórek gospodarza. Kolejno bogate w EV CM poddawano chromatografii wykluczania cząsteczkowego opartej na szybkim chromatografii cieczowej białek (FPLC-SEC) w celu oczyszczenia EV z wykorzystaniem żywicy bimodalnej. Eluowane frakcje o objętości około 10 - 15 mL łączono i filtrowano filtrami 0,22 µM, aby zapewnić sterylność końcowego produktu NK-EV. Ultrafiltracja pozwala na zagęszczenie produktu około 35 - 50X, co daje gwarantowane stężenie powyżej 1 x 1012 EVs/mL przy całkowitej objętości 1,0 - 1,5 mL. Rysunek zmodyfikowano na podstawie 7(stworzony za pomocą Biorender.com). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Oczyszczanie NK-EV za pomocą FPLC-SEC w połączeniu z UF i sterylizacją filtrem

  1. Przygotować następujące roztwory i przefiltrować je dwukrotnie za pomocą filtra 0,1 µm (patrz Tabela materiałów): wodę (przewodność 0 mS/cm), PBS: 50 mL 10x PBS + 450 mL wody (przewodność około 14,7 mS/cm), 20% etanol, roztwór czyszczący (0,5 M NaOH i 30% alkohol izopropylowy w wodzie).
  2. Przeprowadzić inicjację systemu FPLC zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Wykonać kroki czyszczenia w miejscu (CIP) przed i po analizie zgodnie z instrukcjami producenta. Przepłukać wszystkie linie oraz żywicę w kolumnie, stosując wodę dwukrotnie filtrowaną (DF), roztwór czyszczący, wodę DF i DF-PBS.
    UWAGA: Należy zaznaczyć, że procedurę CIP można przeprowadzić w innym dniu, jeśli jest to konieczne.
  3. Użyć kolumny chromatograficznej wypełnionej żywicą bimodalną (patrz Tabela materiałów) o wysokości złoża 20 cm. Połączenia wykonać metodą „kropla do kropli”, aby zapobiec wprowadzeniu powietrza do wnętrza kolumny.
  4. Przygotować kolektor frakcji z odpowiednimi probówkami do zbierania i zmienić ustawienia frakcjonowania na pożądany объем pobierania (np. 15 mL). Umieścić wystarczającą liczbę probówek oraz dwie dodatkowe, aby zebrać całą objętość próbki.
  5. Przeprowadzić przygotowanie próbki zgodnie z poniższym opisem.
    1. Pobrać 40 – 80 mL CM bogatego w EV z zamrażarki -80 °C i szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C. Załadować próbkę do ultrawirówki i wirować przy 10 000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Probówki muszą być precyzyjnie wyważone masowo, a nie objętościowo.
    2. Po wirowaniu zebrać nadsącz i przenieść go do nowej probówki. Aby obniżyć poziom dsDNA, potraktować CM bogaty w EV endonukleazą w stężeniu 50 U/mL oraz MgCl2 w stężeniu 1,5 mM (patrz Tabela materiałów). Inkubować przez 2 – 4 h w inkubatorze (37 °C), zapewniając umiarkowane mieszanie.
  6. Gdy system (linie i kolumna) będzie gotowy do izolacji EV, nabić CM bogaty w EV do strzykawki 60 mL i podłączyć go do linii próbki. Uruchomić system, klikając Manual Run, i ustawić szybkość przepływu na 0. Postępować zgodnie z komunikatami oprogramowania, aby zapisać analizę z wyprzedzeniem, a następnie kliknąć Start.
  7. Wybrać Line B (DF-PBS) i prowadzić przepływ z prędkością liniową 150 cm/h (przepływ 2,0 mL/min). Upewnić się, że roztwór przepływa przez kolumnę.
  8. Po ustabilizowaniu się przewodności nacisnąć Auto Zero UV. Zmienić ścieżkę przepływu tak, aby skierować próbkę do butelki z odpadami przed kolumną. Upewnić się, że do systemu nie dostały się pęcherzyki powietrza.
  9. Po maksymalnie 5 – 20 s skierować próbkę do kolumny. Kliknąć Fractionation , gdy odczyty UV osiągną około 230 mAU.
  10. Po całkowitym wstrzyknięciu próbki do systemu przełączyć system buforowy na DF-PBS (na zaworze próbki), aby kontynuować oczyszczanie. Ponownie kliknąć Fractionation , gdy wartość UV osiągnie około 1600 mAU.
    UWAGA: Odpowiada to punktowi przecięcia odczytów UV i odczytów przewodności. Dłuższe frakcjonowanie powoduje jedynie rozcieńczenie retentatu bez zwiększenia wydajności EV.
  11. Połączyć wszystkie frakcje (rozcieńczone NK-EV) i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia sterylizacji filtracyjnej i ultrafiltracji (UF).
  12. Kontynuować przepływ DF-PBS, aż wartość UV osiągnie około 1000 mAU. Następnie zatrzymać proces i zapisać chromatogram w formacie PDF.

3. Sterylizacja i zagęszczanie produktu NK-EV za pomocą filtrów i ultrafiltracji (UF)

  1. Schłodzić wirówkę do 10 °C. Zdezynfekować każdy element aparatury do ultrafiltracji (patrz Tabela materiałów), płucząc go 20 - 30 mL 90% etanolu. Wirować przy 4000 x g przez 5 - 10 min.
    UWAGA: Filtr jest wykonany z regenerowanej celulozy o MWCO 10 kDa.
  2. Wylać filtrat, a następnie powtórzyć płukanie za pomocą sterylnego PBS w celu wyrównania urządzenia. Powtórzyć łącznie 2x.
  3. Aby zmaksymalizować sterylność, przefiltrować rozcieńczony roztwór NK-EV przez filtr strzykawkowy 0,22 µm uprzednio zwilżony DF-PBS (patrz Tabela materiałów). Zebrać filtrat bezpośrednio do wysterylizowanego urządzenia do koncentracji.
  4. Wirować przy 4000 x g przez 15 - 40 min (czas wirowania zależy od próbki). Po wirowaniu wymieszać roztwór w górnej komorze filtra za pomocą pipety serologicznej. Wirować przy 4000 x g przez dodatkowe 10 min.
    UWAGA: Etap mieszania jest opcjonalny, ponieważ ułatwia on proces koncentracji, zapobiegając zapychaniu membrany przez EV.
  5. Tymczasowo odstawić filtrat i zebrać próbkę NK-EV, odwracając urządzenie filtracyjne i dołączając je do urządzenia zbierającego.
  6. Wirować przy 2000 x g przez 2 min. Przenieść oczyszczony produkt NK-EV do probówki 2 mL. Przechowywać oczyszczony produkt NK-EV w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użycia (≤ 7 dni) lub zamrozić w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

4. Charakterystyka NK-EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Przygotować roztwór i przefiltrować go dwukrotnie przez filtr 0,1 µm (patrz Tabela materiałów): wodę, PBS, roztwór czyszczący (10% wybielacza (UWAGA) w wodzie).
  2. Uruchomić system NTA zgodnie z instrukcjami producenta. W podobny sposób przeprowadzić kroki czyszczenia w miejscu (CIP) przed i po pomiarze. Przepłukać wszystkie linie, używając dwukrotnie filtrowanej (DF) wody, roztworu czyszczącego i wody DF. Zrównoważyć linie za pomocą DF-PBS.
  3. Zweryfikować celę przepływową i sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza. Jeśli są obecne, usunąć pęcherzyki. Po oczyszczeniu ostrożnie ponownie włożyć celę przepływową do instrumentu NTA.
    UWAGA: Choć nie jest to zalecane przez producenta, bardzo trudne do usunięcia pęcherzyki powietrza można łatwo usunąć, płucząc celę 20% etanolem, a następnie wodą DF.
  4. Po umieszczeniu celi przepływowej i zamknięciu drzwiczek kliknąć Start Camera. Przy liniach wypełnionych DF-PBS na ekranie powinna być widoczna absolutnie minimalna liczba cząstek.
  5. Zmienić ustawienia przechwytywania na wzmocnienie ekranu (screen gain) równe 2 i poziom kamery (camera level) równy 14. Włączyć również grzałkę, aby ustabilizować temperaturę celi przepływowej.
  6. Kliknąć Standard measurement, aby utworzyć skrypt w zakładce SOP w celu zarejestrowania jednego pomiaru w czasie 1 min przy szybkości przepływu 30 cząstek/klatkę i temperaturze 23 °C.
  7. Tuż poniżej dodać nazwę folderu i pliku do ścieżki zapisu danych.
  8. Przygotować wcześniej rozcieńczenia oczyszczonego produktu NK-EV przy użyciu DF-PBS. Podczas pomiaru NTA dokładna kwantyfikacja wymaga uzyskania 30 - 80 cząstek/klatkę.
  9. Wymieszać próbkę w wirówce typu vortex przed nabraniem jej do strzykawki (patrz Tabela materiałów).
  10. Ostrożnie podłączyć 1 mL strzykawkę do pobierania do linii zasilającej instrument. Nie może być w niej obecne powietrze, ponieważ negatywnie wpłynie to na akwizycję i analizę. Powoli przepchnąć połowę próbki, pozostawiając około 0,5 mL w strzykawce.
  11. Gdy cząstki staną się widoczne na ekranie, ustawić ostrość kamery tak, aby wokół każdej cząstki znajdowała się maksymalnie jedna aureola. W zakładce Hardware kliknąć Infuse przy szybkości 1000 przez 5 s. Następnie zmniejszyć szybkość do 30.
  12. Nacisnąć Run Script i postępować zgodnie z komunikatami. Oprogramowanie sprawdzi, czy temperatura jest ustawiona, i zapyta, czy ustawienia są poprawne. Kliknąć Yes i postępować zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
  13. Po zakończeniu przechwytywania kliknąć Cancel, gdy oprogramowanie zapyta o przetworzenie lub eksport plików. W zakładce Hardware kliknąć Infuse przy szybkości 1000 przez 10 - 15 s. W tym czasie ponownie włączyć grzałkę i kamerę. Następnie zmniejszyć szybkość do 30, aż cząstki zaczną się poruszać.
  14. Zarejestrować cztery kolejne pomiary, powtarzając poprzednie kroki. Po zarejestrowaniu łącznie pięciu pomiarów dla każdego rozcieńczenia przeprowadzić analizę po zaimportowaniu wszystkich pięciu plików.
  15. Wybrać pliki do przetworzenia, zaznaczając je. Kliknąć Process Selected Files. W zakładce Process dostosować ustawienia analizy do wzmocnienia ekranu (screen gain) 2 i progu detekcji (detection threshold) 15.
    Ustawienia zależą od próbki; należy upewnić się, że widocznych jest 30 - 80 cząstek na klatkę.
  16. Sprawdzić ustawienia i kliknąć OK, aby rozpocząć analizę.
  17. Po przetworzeniu plików oprogramowanie zapyta o ich eksport. Kliknąć Yes bez zaznaczania dodatkowych pól lub kliknąć Export.
  18. Powtórzyć procedurę dla wszystkich rozcieńczeń EV lub próbek. Wyłączyć instrument NTA po zakończeniu wszystkich pomiarów i przeprowadzeniu procedury CIP.

5. Testy zapewnienia jakości

  1. Przeprowadź testy mikrobiologiczne za pomocą dwóch metod: 1) dodania małej ilości oczyszczonych NK-EVs do autoklawowanej pożywki LB oraz 2) wykorzystania małej ilości oczyszczonych NK-EVs do detekcji mycoplasma metodą PCR (patrz Tabela materiałów).
    1. Test 1: inkubuj pożywkę LB w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 5 dni, uwzględniając kontrole pozytywne i negatywne. W razie potrzeby zmierz OD600.
    2. Test 2: przeprowadź detekcję mycoplasma metodą PCR zgodnie z protokołem producenta.
  2. Oznacz ilość białka i dsDNA w rozcieńczeniach oczyszczonych NK-EVs, stosując testy fluorometryczne zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).

6. Ocena potencji komórek nowotworowych traktowanych NK-EV przy użyciu zwalidowanego, wysokoczułego testu żywotności komórek opartego na rezazurynie 20

  1. Kulturować ludzkie komórki białaczki K562 w pożywce RPMI-1640 z 10% inaktywowaną ciepłem FBS przez kilka dni przed przeprowadzeniem testu aktywności (patrz Tabela materiałów). Utrzymywać gęstość między 2 - 8 x 105 komórek/mL i wymieniać pożywkę co 2 - 3 dni.
  2. Przygotować płytkę 96-dołkową z płaskim dnem (patrz Tabela materiałów) i uprzednio dodać objętość pożywki do testu (suplementowanej 5% FBS pozbawionym EV) wymaganą do celów normalizacji (patrz Tabela materiałów). Objętość końcowa wynosi 150 µL/dołek.
    UWAGA: Należy użyć pipety wielokanałowej lub powtarzalnej, aby zmniejszyć zmienność między dołkami.
  3. Pobrać kulturę komórkową i przenieść komórki do probówki. Wirować przy 300 x g przez 5 min. Resuspendować osad komórkowy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, używając 2 - 5 mL pożywki do testu.
  4. Pobrać alikwot 20,5 µL zawiesiny komórkowej do zliczenia komórek za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
  5. Do alikwotu 20,5 µL zawiesiny komórkowej dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz Tabela materiałów) i wymieszać przez co najmniej 10x za pomocą pipety.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie AO/PI w celu dokładnego zliczenia komórek. Alternatywnie można użyć komory countingowej (hemocytometru) do ręcznego zliczania.
  6. Nanieść 20 µL do każdej komory liczbowej preparatu do zliczania i przeprowadzić automatyczne zliczanie komórek przy użyciu odpowiedniego programu. Obliczyć średnie stężenie żywych komórek i odnotować żywotność.
  7. Przenieść około 1 x 106 komórek do drugiej probówki. Rozcieńczyć komórki dokładnie do 7 mL pożywki do testu i powtórzyć zliczanie komórek. Stężenie powinno wynosić około 1,2 - 1,5 x 105 żywych komórek/mL.
  8. Zgodnie z powyższym, dostosować stężenie zawiesiny pojedynczych komórek do 1 x 105 żywych komórek/mL i w razie potrzeby powtórzyć zliczanie komórek.
    UWAGA: Współczynnik zmienności między technicznymi powtórzeniami zliczeń powinien być mniejszy niż 25%; zazwyczaj przy zliczaniu AO/PI jest on mniejszy niż 5%.
  9. Po uzyskaniu pożądanego stężenia, przenieść 50 µL (± 1 µL) tego roztworu do każdego dołka, aby uzyskać wartość jak najbliższą 5000 komórek/dołek (4900 - 5100 komórek/dołek). Przygotować powtórzenia techniczne w triplikatach dla każdego warunku testowego i użyć pipety powtarzalnej, aby zmniejszyć zmienność między dołkami.
  10. Przenieść płytkę na wstrząsarkę orbitalną (350 - 500 RPM) na 2 min. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora do czasu rozpoczęcia traktowania NK-EV.
  11. Przygotować wymagane rozcieńczenia NK-EV (1:5, 1:10 i 1:100) w pożywce do testu.
  12. Z tych rozcieńczeń przetestować następujące stężenia EV: 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 oraz 1 x 1011 cząsteczek/mL. Objętość dawki jest ograniczona do 20% całkowitej objętości testu.
  13. Po przygotowaniu przenieść wymaganą objętość danego rozcieńczenia do dołków wymagających określonego stężenia EV do traktowania. Dodać 15 µL 10x Triton-X do dołka kontroli pozytywnej (patrz Tabela materiałów). Końcowa objętość w dołku powinna zostać znormalizowana do 150 µL.
  14. Umieścić płytkę na wstrząsarce orbitalnej (350 - 500 RPM) na 2 min. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 3 h.
  15. Podgrzać czytnik płytek (patrz Tabela materiałów) do 37 °C i załadować następujący program: 37 °C (zmniejsza zmienność związaną z temperaturą), mieszanie 450 RPM przez 1 min (zapewnia homogeniczność próbki) i odczyt.
  16. Dodać 15 µL odczynnika opartego na rezazurynie do każdego dołka (patrz Tabela materiałów). Chronić odczynnik przed światłem i użyć pipety powtarzalnej, aby zmniejszyć zmienność między dołkami.
  17. Umieścić płytkę na wstrząsarce orbitalnej (350 - 500 RPM) na 2 min. Przenieść płytkę do inkubatora i inkubować przez 60 min. Usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety zamoczonej w etanolu. Odczytać płytkę przy pobudzeniu 560 nm i emisji 590 nm.
  18. Analiza danych: Wyznaczyć średnie z powtórzeń technicznych i skorygować o tło przed przeprowadzeniem analizy zależności dawka-odpowiedź przy użyciu regresji nieliniowej dla efektu inhibicji, wykazującej nachylenie log(inhibitor) względem znormalizowanej zmiennej odpowiedzi bez ograniczeń. Odnotować wartości Hillslope i EC50.

Wyniki

NK-EV wykazują wrodzone funkcje cytotoksyczne i zademonstrowały wysoką skuteczność przeciwko różnym modelom nowotworowym. Niemniej jednak, w aktualnych badaniach istnieje potrzeba większej standaryzacji w zakresie przepływu bioprodukcyjnego odpowiedniego do wielkoskalowej produkcji NK-EV6,21. Nasze poprzednie badanie opisało wykonalność zastosowania systemu bioreaktora z włóknami kapilarnymi (HFB) w obiegu zamkniętym do produkcji dużych ilości wysokiej czystości produktów NK-EV7. Jako kontynuacja, niniejsze badanie oparte na protokole szczegółowo opisuje przepływ bioprodukcyjny i wykazuje jego powtarzalność poprzez produkcję i izolację produktu NK-EV (Rycina 1). Ponadto, przed dopuszczeniem produktu do użytku wymagana jest niezbędna charakterystyka i walidacja produktu, przy czym w niniejszym badaniu zaprezentowano nowe i oryginalne dane.

System HFB wybrano do produkcji NK-EV ze względu na łatwość obsługi, niezawodność, skalowalność oraz zgodność z normami GMP7. W odniesieniu do konfiguracji systemu HFB, komórki NK są wstrzykiwane przez lewy port ECS i wysiewane do wkładu bioreaktora (Ryc. 2). Jednocześnie butelka z medium jest podłączana do HFB przez porty boczne, a medium swobodnie przepływa przez cały system. Komórki NK są hodowane w medium bezsurowiczym, bez składników pochodzenia ksenogenicznego (xeno-free), bez komórek pokarmowych oraz bez antybiotyków; medium jest wymieniane, gdy zawartość glukozy spadnie poniżej 50%, aby utrzymać i zmaksymalizować kondycję komórek w czasie. CM jest zbierane codziennie, przetwarzane poprzez wirowanie różnicowe i przechowywane w zamrożeniu (-80 °C) do momentu dalszego przetwarzania. Następnie izolacja EV jest przeprowadzana za pomocą kombinacji wirowania różnicowego i FPLC-SEC w połączeniu z UF i filtracją (Ryc. 3). Wynikiem jest sterylny, skoncentrowany produkt NK-EV o końcowej objętości około 1,0 - 1,5 mL. Przedstawiono reprezentatywny chromatogram izolacji NK-EV metodą FPLC-SEC (Ryc. 4). Przed przetwarzaniem metodą FPLC-SEC, CM bogate w NK-EV jest traktowane endonukleazą, co znacznie redukuje poziom dsDNA, będącego potencjalnym zanieczyszczeniem pochodzącym z komórek gospodarza (NK)7. W ten sposób opisany schemat izolacji EV usuwa szczątki komórkowe oraz zanieczyszczenia RNA/DNA z produktu NK-EV, co jest niezbędne dla zapewnienia niskiego i niepożądanego potencjału immunogennego oraz zagwarantowania, że produkt końcowy nadaje się do dalszych badań.

figure-results-1
Rysunek 4: Chromatogram izolacji NK-EV uzyskany podczas szybkozbieżnej chromatografii cieczowej z wykluczaniem cząsteczkowym (FPLC SEC). Niebieska linia przedstawia absorbancję (mAU; maksymalna wartość 2000 mAU), czerwona linia przedstawia przewodność, czerwony tekst reprezentuje dziennik przebiegu, a szary obszar zaznacza frakcjonowane NK-EV (oznaczone frakcjami T2 – T7). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Po izolacji przeprowadzono podstawową charakterystykę oraz testy kontroli jakości NK-EV, aby ocenić, czy produkt NK-EV może zostać dopuszczony do dalszych eksperymentów. Zakres wielkości cząstek oraz stężenie produktu NK-EV zmierzono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA); średnice cząstek mieściły się w zakresie 76,30 - 174,30 nm (D10 wyniosło 78,38 ± 2,07 nm, D50 106,72 ± 2,43 nm, a D90 169,80 ± 4,17 nm), a średnie stężenie wyniosło 1,39 x 1012 EVs/mL (Rysunek 5A-B). Ponadto ilościowe oznaczenie fluorometryczne wykazało, że w produkcie końcowym stężenie białka wyniosło 298,90 ± 66,62 mg/mL, a stężenie dsDNA 225,60 ± 37,7 ng/mL (Rysunek 5C-D). Odpowiada to średniemu stosunkowi 5,06 x 106 EV/µg białka oraz 6,16 x 1012 EV/µg DNA. Badania w kierunku zanieczyszczeń mikrobiologicznych i obecności mycoplasmas dały wyniki negatywne (dane nie przedstawiono). Wyniki te są zgodne z charakterystyką NK-EV z poprzednich prac7. We wcześniejszej publikacji7 przedstawiono również bardziej szczegółową charakterystykę produktów NK-EV zgodnie z wytycznymi MISEV (tj. TEM, western blot, poziom endotoksyn, obecność cząstek wirusowych oraz cytometrię przepływową dla antygenów powierzchniowych i cytokin).

Na koniec oceniono funkcjonalność produktu NK-EV (tj. cytotoksyczność wobec komórek nowotworowych) przy użyciu zwalidowanego, wysokoczułego testu żywotności komórek opartego na rezazurynie po potraktowaniu linii komórek białaczkowych K562 produktem NK-EV7,20. Traktowanie komórek K562 pęcherzykami NK-EV przez 3 h wywołało zależny od dawki efekt w zakresie żywotności komórek, odpowiadający wartości EC50 wynoszącej 9.33 x 109 EVs/mL (tj. dawce odpowiadającej zniszczeniu 50% populacji komórek; Rysunek 6A-B). Zatem, zgodnie z opisanymi kryteriami zwolnienia produktu, produkt NK-EV uznano za odpowiedni do dalszych eksperymentów.

figure-results-2
Rycina 5: Charakterystyka oczyszczonego produktu NK-EV. (A) Rozkład wielkości produktu NK-EV pomierzony metodą NTA, przedstawiony jako średnia z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował 10 powtórzeń technicznych (5 nagrań wideo x 2 rozcieńczenia). (B) Stężenie cząsteczek produktu NK-EV (cząsteczek/mL) pomierzone metodą NTA, przedstawione jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował powtórzenia techniczne w duplikacie. (C) Stężenie białka w produkcie NK-EV (mg/mL) pomierzone przy użyciu fluorometru, przedstawione jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował powtórzenia techniczne w triplikacie. (D) Stężenie dsDNA w produkcie NK-EV (ng/mL) pomierzone przy użyciu fluorometru, przedstawione jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy obejmował powtórzenia techniczne w triplikacie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 6: Walidacja funkcjonalna oczyszczonego produktu NK-EV. NK-EV wykazują zależną od dawki cytotoksyczność wobec ludzkich komórek białaczki K562 poddanych działaniu różnych stężeń NK-EV przez 3 godziny, ocenianą za pomocą wysoce czułego testu żywotności komórek opartego na rezazurynie. (A) Znormalizowane odczyty z testu (zielona linia reprezentuje kontrolę nieleczonych komórek białaczki K562, a czarna przerywana linia reprezentuje kontrolę martwych, lizowanych komórek białaczki K562 po zastosowaniu detergentu). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM z 11 niezależnych eksperymentów z powtórzeniami technicznymi w trzech kopiach. (B) Analiza krzywej EC50 ze zmiennym nachyleniem dla leczenia NK-EV z 95% przedziałem ufności/pasmami predykcyjnymi (czerwona przerywana linia reprezentuje odpowiedź na poziomie 50%). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kilka badań sugeruje, że NK-EV mają ogromny potencjał jako terapia przeciwnowotworowa 4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Jednak skalowalny system bioprodukcji zgodny z GMP, zdolny do wytwarzania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości, jest niezbędny do dalszych testów przedklinicznych i przyszłych zastosowań klinicznych. Aby rozwiązać ten problem, w poprzednim badaniu wykorzystano system HFB w zamkniętej pętli do ciągłego wytwarzania ogniw NK i CM bogatych w NK-EV, nadających się do dalszych eksperymentów. Ze względu na konstrukcję 3D, systemy HFB ściśle odzwierciedlają warunki panujące w układzie naczyniowym i mają niewiarygodnie wysoki stosunek powierzchni do objętości, co pozwala na pozostanie w hodowli ponad miliarda komórek, co ostatecznie prowadzi do poprawy produkcji EV 7,31,32. Co ważne, praca ta była pierwszą, w której opisano użycie systemu HFB do hodowli komórek NK, prawdopodobnie ze względu na samowystarczalność linii komórkowej IL-27.

Należy podjąć dodatkowe kroki w celu zapewnienia sterylności systemu HFB i produkcji pojazdów elektrycznych typu NK-EV o wysokiej czystości. Te środki ostrożności są szczególnie istotne w przypadku braku sterylnego, czystego pomieszczenia, co może mieć miejsce w przypadku kilku ośrodków badawczych. Przed wejściem do szafy bezpieczeństwa biologicznego system HFB jest skrupulatnie spryskiwany 70% etanolem w celu dezynfekcji wszystkich powierzchni zewnętrznych. Dodatkowo wszystkie połączenia Luer Lock są owijane folią woskową, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Jest to szczególnie ważne, ponieważ w procesie bioprodukcji nie stosuje się antybiotyków, o których wiadomo, że wpływają na profil biochemiczny komórek i produktów pochodzących z komórek33. Do oceny zdrowia komórek podczas bioprodukcji produktów komórkowych wykorzystano różne wskaźniki. Na przykład przeprowadzono codzienne oceny pH, poziomu glukozy i mleczanu w zbiorniku, ponieważ są to niezbędne substytuty zdrowia komórek do monitorowania. Oprócz ocen ilościowych, obserwacje jakościowe systemu HFB (np. kolor podłoża i wizualne oznaki zanieczyszczenia, takie jak zmętnienie) są również pomocne w monitorowaniu stanu komórek. Stwierdzono, że liczba komórek w codziennie pobieranym CM nie jest reprezentatywnym wskaźnikiem żywotności dla zdrowia kultury (dane nie pokazane). Jest to prawdopodobnie wynikiem martwych komórek pobranych podczas pobierania próbek CM, które zostały znalezione w rurce, w której pożywka nie mogła krążyć (mały odcinek między ECS a portem strzykawki ECS), zaniżając w ten sposób żywotność całej hodowli komórkowej. Tylko pobrane komórki NK wyprodukowane przez HFB na końcu partii produkcyjnej mogą zapewnić wiarygodny wskaźnik zdrowia hodowli. Ogniwa te konsekwentnie wykazywały wartości żywotności powyżej 70 % w partiach produkcyjnych7. Razem te metody oceny jakości zapewniają ciągłą produkcję pojazdów elektrycznych typu NK-EV o wysokiej czystości.

Opracowano kilka technik izolacji w celu oczyszczenia i wyizolowania EV34. Jedna z metod, SEC, wykorzystuje kolumnę wypełnioną porowatym materiałem - żywicą - co pozwala na separację cząsteczek w oparciu o dyskryminację wielkości. W tym przypadku większe EV są szybciej eluowane przez kolumnę; Ta metoda jest znana jako oczyszczanie przepływowe oparte na wykluczeniu wielkości. W tym samym czasie mniejsze zanieczyszczenia (dsDNA, swobodnie unoszące się białka, takie jak endonukleaza, sole, czerwień fenolowa itp.) są pozostawiane i dalej zatrzymywane w żywicy przez siły elektrostatyczne (tj. zastosowano żywicę bimodalną). Przetwarzanie oparte na SEC usuwa białka niezwiązane z EV, zachowując oryginalną strukturę i funkcjonalność EV35,36. Co więcej, oczyszczanie oparte na SEC jest łatwo skalowalne bez uszczerbku dla wysokiej wydajności i czystości, co czyni go odpowiednim wyborem do izolowania NK-EV do zastosowań bioterapeutycznych. Pomimo tych zalet, SEC ma pewne wady, takie jak stosunkowo rozcieńczony przepływ (eluent); w związku z tym UF jest wymagane do zagęszczenia produktu, ale umożliwia również wymianę buforu. Niesterylny aparat UF jest płukany 70% etanolem i PBS i przechowywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego przed użyciem w celu zapewnienia sterylności. Zazwyczaj przepływ może być skoncentrowany do 35x-50x objętości początkowej, jednocześnie usuwając małe cząsteczki, które mogłyby dostać się do eluentu. Wirowanie różnicowe i leczenie endonukleazą przeprowadza się przed FPLC-SEC w połączeniu z UF w celu usunięcia resztek komórek, szczątków komórkowych i długich nici antygenowego dsDNA7.

Po wyizolowaniu produktu NK-EV przeprowadza się charakterystykę i walidację funkcjonalną zgodnie z wytycznymi zawartymi w MISEV2018 i MISEV2023 w celu określenia przydatności produktu do dalszego użytkowania 6,18. Każda izolacja daje 1,0 - 1,5 ml produktu NK-EV o wysokiej czystości o minimalnym stężeniu 1 x10 12 EVs/mL, przy średnim stężeniu 1,39 x 1012 cząstek/ml. Wcześniej Gupta i wsp. ustalili, że mediana dawki EV in vivo wynosi 3,37 x 108 EVs/kg masy ciała myszy37. Leczenie medianą dawki wymagałoby 8,43 x 106 EV/mysz o masie ciała 25 g, wartości znacznie poniżej gwarantowanego minimum (1 x 1012 cząstek/ml) uzyskanego w tym przepływie pracy. W związku z tym opisany proces bioprodukcji może wyprodukować więcej niż wystarczającą ilość NK-EV do eksperymentów przedklinicznych lub do osiągnięcia celów dawkowania. Każda izolacja jest testowana pod kątem obecności mykoplazmy i drobnoustrojów w ramach oceny kontroli jakości produktu. Ponadto poprzednie badanie wykazało brak powszechnych jednostek wirusowych i endotoksyn w produkcie końcowym oraz brak składników komórkowych uważanych za zanieczyszczenia komórek gospodarza (w analizie western blot)7,34. Na koniec przeprowadzono ocenę funkcjonalną przy użyciu zwalidowanego, bardzo czułego testu żywotności komórek opartego na resazurynie, aby ocenić funkcjonalność NK-EV20. Opisany test żywotności działa poprzez redukcję rezazuryny (słabo fluorescencyjnej) do rezorufiny (wysoce fluorescencyjnej) przez metabolicznie aktywne komórki, co pozwala na ocenę żywotności komórek po leczeniu NK-EV. W porównaniu z innymi alternatywnymi testami żywotności komórek, test na bazie resazuryny zastosowany w badaniu jest bardzo wrażliwy na zmiany żywotności komórek (bardzo niski szum tła) i pozwala na skrócenie czasu inkubacji w celu zaobserwowania wyników (mniej niż 30 minut w celu uzyskania wyników istotnych statystycznie)20. Ogólnie rzecz biorąc, NK-EV wykazują zależny od dawki wpływ na żywotność K562. Przedstawione wyniki reprezentują produkt NK-EV, który spełnił kryteria dopuszczenia produktu do oceny przedklinicznej i nadaje się do dalszych zastosowań.

Podsumowując, to badanie oparte na protokole opisuje bioprodukcję NK-EV o potencjale klinicznym. Jak wspomniano, pojazdy NK-EV są produkowane przy użyciu systemu HFB w pętli zamkniętej w warunkach wolnych od surowicy, ksenoizolacji, karmów i antybiotyków7. Połączenie FPLC-SEC/UF izoluje i oczyszcza produkt NK-EV. Przed dopuszczeniem produktów do dalszego zastosowania, pojazdy NK-EV muszą zostać scharakteryzowane i zweryfikowane pod względem funkcjonalnym, aby upewnić się, że nadają się do użytku. Jak wykazano, przestrzeganie tego protokołu bioprodukcji może z powodzeniem wygenerować dużą ilość NK-EV o wysokiej czystości, które wykazują cytotoksyczność w miejscu docelowym wobec komórek nowotworowych. W związku z tym opisany protokół bioprodukcji może być atutem dla przyszłych badań, które wymagają produkcji NK-EV klasy klinicznej.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów ani nie ujawniają informacji.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Simonowi Sauvé, Rogerowi Tamowi i Xu Zhangowi za ich krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Inicjatywy Badań i Rozwoju Genomiki (GRDI) Faza VII (2019-2025) rządu Kanady uzyskane przez JRL, LW, a także granty operacyjne z Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii RGPIN-2019-05220, Cancer Research Society/University of Ottawa 24064, Kanadyjski Instytut Zdrowia (CIHR) Research Operating Grant 175177 uzyskany przez LW, stypendium CIHR MSc uzyskane przez MK oraz stypendium królowej Elżbiety II w dziedzinie nauki i technologii (QEII-GSST) uzyskane przez FSDB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m Jednostka filtracji próżniowej Filtropur V50 Sarstedt83,3941,002
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy Acrodisc Pall CorporationPN4612
Strzykawka 1 ml Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
Filtr odśrodkowySigmaUFC701008
strzykawka 60 ml BD Biosciences309653
96-dołkowe płaskie, przezroczyste dno z czarnego polistyrenu poddane działaniu TC Costar3603
Agaroza Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Szybki chromatograf cieczowy białek Igła GE Lifesciences29022094
PrecisionGlide - 18GBD Biosciences305196
Nukleaza benzonazy SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Czytnik wielomodowyBioTek SH1M2G-SN
Bufor ładujący do niebieskiego soku Żywica Invitrogen10816015
CaptoCore 700 Cytiva17548102
Celometr Auto 2000 Licznik żywotności Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 SigmaC2874
DPBS−/−  FisherBP399-1
Podwójny transluminator światła niebieskiego / białego LED InvitrogenLB0100
Duet P3202 FiberCell Systems
Buforowana fosforanami sól fizjologicznaGibco 14190250
Etanol Alkohole komercyjneP006EAAN
FBS zubożone w egzosomy GibcoA2720803
Fluorobryt DMEM GibcoA18967-01
GlukometrAccuCheckModel 930
Kolumna chromatograficzna HiScale 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (alternatywa dla pożywki GMP)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF Pożywka do ekspansji limfocytów T StemCell Technologies10981
Alkohol izopropylowy Ogniwa EMDPX1834-1
K562ATCCCCL-243
LB nośnik BioBasicSD7002
 Abcamab65331
Średni wkład z pustych włókien Systemy FiberCellC2011
MgCl2 Zestaw doM1028
 Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH Ogniwa SupelcoSX0607N-6
NK92-MI ATCCCRL-2408
Paski pH-Mquant Sigma1,09533
odczynnika żywotności komórek HS PrestoBlue Fluorometr InvitrogenP50200
Qubit 4 Invitrogen
Qubit dsDNA BR Zestaw testowyInvitrogenQ33262
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ33231 
Paski probówek do testów Qubit Flex Fluorometr InvitrogenQ33252
Qubit Flex InvitrogenQ33327
Zestaw do oznaczania białek kubitowych BR InvitrogenA50669
Szybkie ładowanie 1Kb Plus drabinka DNA NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
Pompa strzykawkowa Aparat Harvarda984730
Triton-X 100 Bufor SigmaT-9284
UltraPure TAE Invitrogen15558042
ViaStain Roztwór do barwienia pomarańczy akrydynowej i jodku propidyny (AO/PI) ESBE ScientificCS2-0106
10 kDa Centricon Plus-70 Medium zamrażające Pompa sterująca przepływem Zestaw do oznaczania L-mleczanu wykrywania Mycoplasma PCR Sigma Test Zestaw testowy

Bibliografia

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

EV z komórek Natural Killerpęcherzyki zewnątrzkomórkowechromatografia wykluczania rozmiarówbioreaktor z pustymi włóknamianaliza śledzenia nanocząsteczektest żywotności komórekultrafiltracjalinia komórkowa NK92-MI
Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.