Artykuł metodologiczny

Skalowalny proces bioprodukcji do produkcji i izolacji bioterapeutyków przeciwnowotworowych na bazie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67227

⸱

16 sierpnia 2024

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) mają obiecujący potencjał jako bioterapia przeciwnowotworowa. To oparte na metodologii badanie przedstawia skalowalny proces bioprodukcji w pętli zamkniętej, zaprojektowany do ciągłej produkcji i izolowania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości. Testy kontrolne w trakcie procesu są przeprowadzane w całym procesie bioprodukcji, aby zapewnić, że pojazdy elektryczne spełniają standardy jakości dotyczące wprowadzania produktu do obrotu.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EVs) są badane jako bioterapia przeciwnowotworowa. Posiadają unikalne właściwości jako cytotoksyczne nanopęcherzyki ukierunkowane na komórki nowotworowe oraz jako komunikatory immunomodulujące. Skalowalny proces bioprodukcji umożliwia produkcję dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości, aby spełnić wymagania przedkliniczne i kliniczne. Przepływ pracy wykorzystuje bioreaktor z pustymi włóknami w pętli zamkniętej, umożliwiający ciągłą produkcję NK-EV z linii komórkowej NK92-MI w warunkach wolnych od surowicy, ksenoizolacji, karmów i antybiotyków, zgodnie ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej. To oparte na protokole badanie przedstawia proces bioprodukcji do izolowania NK-EV przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości, ultrafiltracji i sterylizacji opartej na filtrach. Niezbędna charakterystyka produktu NK-EV jest przeprowadzana za pomocą analizy śledzenia nanocząstek, a ich funkcjonalność jest oceniana za pomocą zwalidowanego, opartego na żywotności komórek testu siły działania w stosunku do komórek rakowych. Ten skalowalny proces bioprodukcji ma znaczny potencjał, aby przyspieszyć kliniczne tłumaczenie bioterapeutyków przeciwnowotworowych opartych na NK-EV poprzez przestrzeganie najlepszych praktyk i zapewnienie odtwarzalności.

Wprowadzenie

W XXIwieku osiągnięto niezwykłe postępy w walce z rakiem. Wynika to głównie z rozwoju immunoterapeutyków przeciwnowotworowych, klasy leków, które wykorzystują układ odpornościowy do walki z rakiem. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z komórek NK (NK-EV) stanowią obiecujących rywali w rozwijającej się dziedzinie immunoterapii. Komórki NK, integrujące się z odpornością wrodzoną i nabytą, odgrywają kluczową rolę w obronie organizmu przed komórkami zakażonymi wirusem, zestresowanymi i złośliwymi. Wykorzystują szeroki arsenał maszyn przeciwnowotworowych do eliminowania nieprawidłowych komórek za pomocą środków cytotoksycznych1,2,3. Wśród tych mechanizmów jest produkcja i wydzielanie EVs, dwuwarstwowych struktur w nanoskali zawierających różne biomolekuły, takie jak białka, RNA i DNA, kluczowych dla ułatwienia komunikacji międzykomórkowej4,5,6. NK-EV jawią się jako obiecujące terapie bezkomórkowe ze względu na swoje unikalne właściwości nośnikowe. Należą do nich ich niewielkie rozmiary, umożliwiające sterylizację opartą na filtrach, wysoka biokompatybilność, preferencyjna akumulacja w obrębie guzów, szerokie spektrum dostarczania ładunków, zdolność do pokonywania barier biologicznych, takich jak bariera krew-mózg, oraz minimalny profil toksyczności. Z kilku powodów NK-EV eliminują potrzebę limfodeplecji pacjenta poprzez chemioterapię przed podaniem: 1) konwencjonalnie limfodeplecja jest stosowana w celu stworzenia bardziej przyjaznego środowiska dla terapii komórkowej, umożliwiając namnażanie się komórek infuzyjnych i wywieranie efektów terapeutycznych; 2) w przeciwieństwie do komórek, EV nie mają zdolności replikacji i mają znacznie mniejszą skalę; 3) EV działają w oparciu o odrębne mechanizmy i wykazują zmniejszoną immunogenność w porównaniu z komórkami5,6,7. Co więcej, NK-EV konsekwentnie wykazywały skuteczność in vitro przeciwko różnym modelom raka, a także wykazywały działanie immunomodulujące na komórki odpornościowe, które sprzyjają odpowiedziom przeciwnowotworowym8,9. Wyniki in vivo potwierdzają te ustalenia, wskazując na regresję raka po leczeniu NK-EV i znikomą toksyczność10,11,12. W związku z tym terapie oparte na NK-EV są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów związanych z leczeniem zimnych, immunologicznie obojętnych guzów litych13,14,15,16,17.

Nasze ostatnie badanie dotyczy istotnego wąskiego gardła w klinicznym translacji NK-EV poprzez bioprodukcję7. W artykule przedstawiono dowód słuszności koncepcji opłacalnego i skalowalnego procesu bioprodukcji pojazdów NK-EV, skrupulatnie zaprojektowanego w celu zapewnienia testów kontroli jakości w trakcie procesu. Podejście to w sposób ciągły wytwarzało duże ilości bioterapeutyków przeciwnowotworowych o wysokiej czystości na bazie NK-EV, z dokładną charakterystyką produktu przeprowadzoną zgodnie z wytycznymi MISEV201818. Skalowalność procesu bioprodukcji można osiągnąć poprzez zwiększenie rozmiaru wkładów lub równoległą pracę wielu bioreaktorów. Podobnie, skalowalność przepływu pracy izolacji EV można łatwo osiągnąć przy użyciu technik takich jak chromatografia cieczowa oparta na szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), chromatografia wykluczenia wielkości (SEC), ultrafiltracja (UF) i sterylizacja oparta na filtrach. System bioreaktora kapilarnego (HFB) w pętli zamkniętej wyhodował samowystarczalną linię komórkową NK IL-2 (komórki NK92-MI) bez konieczności suplementacji surowicy, systemu podawania i antybiotyków. Udało się to osiągnąć przy użyciu dostępnego na rynku, zdefiniowanego chemicznie i wolnego od ksenotypów podłoża (wersja GMP jest obecnie dostępna na rynku). W rezultacie, w ciągu 5-7 dni udało się wyprodukować duże ilości ogniw NK (10 9 żywotnych ogniw) i NK-EV (1012 EV) przy użyciu jednego średniej wielkości wkładu do bioreaktora, przy czym oba produkty zostały dokładnie scharakteryzowane. W całym procesie bioprodukcji zdrowie komórek było codziennie monitorowane za pomocą wymiernych wskaźników, takich jak pH, poziom glukozy i mleczanu, a także wskaźników wizualnych, takich jak kolor podłoża i wszelkie oznaki zanieczyszczenia, które są podstawowymi predyktorami jakości komórek i EV. Ocena żywotności i funkcjonalności komórek NK po zbiorach generowanych w systemie HFB, w szczególności cytotoksyczności, wykazała znaczną poprawę w porównaniu z hodowlami opartymi na kolbach7. Podobnie, oczyszczone NK-EV wykazywały wysoki profil czystości, pozbawione bakterii, mykoplazmy, powszechnych jednostek wirusowych i składników komórkowych oraz ze znikomym poziomem endotoksyn. Co ważne, oczyszczone NK-EV stanowiły ponad 99,9% wszystkich nanocząstek znalezionych w produkcie końcowym7. Wreszcie, te oczyszczone NK-EV zachowały kluczowe cechy NK, w tym markery powierzchniowe (CD2, CD45, CD56), ładunek cytokin (GzmB, PFN, IFN-g) i wykazały silną cytotoksyczność wobec białaczkowych komórek K562, złotego standardu w ocenie cytotoksyczności komórek NK7.

Obecny protokół szczegółowo opisuje skalowalny proces produkcji biologicznej omówiony powyżej. Wyjaśniono w nim metodologię izolowania NK-EV wytwarzanych przy użyciu FPLC-SEC w połączeniu z UF i sterylizacją opartą na filtrach. Ponadto w protokole opisano kluczowe etapy, w tym charakterystykę produktu za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), ocenę jakości przy użyciu różnych narzędzi (kwantyfikacja białek/dsDNA i testy mikrobiologiczne) oraz walidację funkcjonalną oczyszczonego produktu NK-EV przeciwko komórkom rakowym za pomocą testu żywotności komórek. Zazwyczaj ten przepływ pracy daje 1,0 - 1,5 ml produktu NK-EV o średnim stężeniu 1,18 x 1012 EVs/mL7, co daje co najmniej 1 x 1012 EV w oparciu o około 40 ml CM bogatego w EV. Proces ten umożliwia dopuszczenie produktu do różnych dalszych zastosowań, takich jak badania śledcze, przedkliniczne i multiomiczne (proteomika, transkryptomika, genomika, metabolomika, lipidomika i epigenomika) wymagające dużych ilości wysokiej jakości EV, a jednocześnie posiadające potencjał do translacji klinicznej, z wykazaną odtwarzalnością.

Protokół

1. Bioprodukcja NK-EV z komórek NK92-MI przy użyciu bioreaktora z zamkniętą pętlą

UWAGA: NK-EV są produkowane przy użyciu skalowalnego procesu bioprodukcyjnego, który przestrzega Dobrych Praktyk Produkcyjnych (GMP) i wykorzystuje ogniwa NK92-MI (zobacz Rysunek 1). Nasza najnowsza publikacja zawiera szczegółowe informacje na temat procedury bioprodukcji oraz tożsamości i profili bezpieczeństwa produktów NK-EV7.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Bioprodukcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z komórek NK (NK-EVs) w bioreaktorze z pustymi włóknami w pętli zamkniętej (HFB) ze skalowalnym przepływem pracy izolacji. Schematyczne przedstawienie procesu bioprodukcji w celu wytworzenia dużych ilości produktów NK-EV o wysokiej czystości. Samowystarczalne komórki NK92-MI IL-2 są wysiewane do wkładu HFB w pętli zamkniętej i hodowane w warunkach wolnych od surowicy (SF), ksenoizolacji (XF), karmów i antybiotyków, gdzie są hodowane w celu ciągłego zbierania kondycjonowanej pożywki bogatej w EV. Izolację NK-EV z CM bogatego w EV przeprowadza się za pomocą chromatografii wykluczającej z wykluczenia wielkości opartej na szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC-SEC) w połączeniu z ultrafiltracją (UF). NK-EV są charakteryzowane i oceniane za pomocą wielu testów, a ich funkcjonalność przeciwko komórkom białaczkowym K562 jest oceniana za pomocą testu siły przeżycia. Ten rysunek został zmodyfikowany z7(utworzony za pomocą Biorender.com). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zaczynając od 1 - 5 x 106 komórek NK92-MI i utrzymując gęstość komórek między 3 - 8 x 105 komórek/ml, hoduj komórki w kolbach T25 - T175 przy użyciu wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% stężeniem CO2 (patrz tabela materiałów). Pożywkę należy wymieniać co 2 - 3 dni, aż do uzyskania 1 x 108 komórek NK92-MI o żywotności co najmniej 70%.
    UWAGA: Zachowaj 1/5-1/3 kondycjonowanej pożywki (CM) podczas ponownego wysiewu komórek, ponieważ zawiera ona korzystne czynniki wzrostu.
  2. Wykonaj przygotowanie wkładu z pożywką HFB i inokulację komórek NK zgodnie z opisem poniżej.
    UWAGA: Wszystkie manipulacje powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić i utrzymać sterylność. Przed przeniesieniem systemu wkładów do szafy bezpieczeństwa biologicznego należy obficie spryskać 70% etanolem, zwracając szczególną uwagę na wąskie gardło zbiornika i połączenia strzykawek.
    1. Przygotuj kartridże HFB zgodnie z instrukcjami producenta19 (patrz Tabela materiałów; patrz Rysunek 2), jak opisano poniżej.
      1. Owiń połączenia Luer Lock folią woskową i wyreguluj natężenie przepływu pompy zgodnie z instrukcjami producenta19. Kondycjonować wkład HFB, pozwalając 150 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; patrz tabela materiałów) krążyć przez co najmniej pięć dni.
      2. Aby usunąć powietrze z zewnątrzkomórkowej przestrzeni kapilarnej (ECS; objętość wynosi około 29 ml), wstrzyknąć około 40 ml PBS przez lewy port ECS i pozwolić powietrzu uciec przez prawy port ECS. Robiąc to, zamknij zaciski lewego i prawego portu końcowego. Upewnij się, że strzykawka jest zawsze podłączona do lewego i prawego portu ECS.
      3. Po zakończeniu umieść wkład na pompie przepływowej (patrz tabela materiałów) wewnątrz inkubatora ustawionego na 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że po kilku dniach krążenia nie ma wycieków.
    2. Zastąp PBS 150 ml pożywki hodowlanej w butelce zbiornika i ECS na 2 dni przed wysiewem komórek do wkładu. Powtórzyć poprzednie etapy kondycjonowania (etap 1.2.1.) przy użyciu pożywki hodowlanej, ale przez 2 dni krążenia.
    3. Przed wysiewem komórek należy wymienić zawartość butelki zbiornika i ECS na 250 ml świeżej pożywki hodowlanej.
    4. Pobrać kolbę hodowlaną z inkubatora i przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 21 ml pożywki hodowlanej.
    5. Przygotować dwie podwielokrotności po 20,5 μl każda z zawiesiny komórek do zliczania komórek na automatycznym liczniku komórek (patrz tabela materiałów). Do każdej podwielokrotności zawiesiny komórek o objętości 20,5 μl dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz tabela materiałów) i wymieszać w górę i w dół co najmniej 10 razy < br / > UWAGA: Nie zalecamy stosowania błękitu trypanowego do dokładnego zliczania komórek NK. Alternatywnie użyj hemocytometru do ręcznego liczenia.
    6. Załadować 20 μl do każdej komory liczącej na szkiełku liczącym i przeprowadzić automatyczne liczenie komórek za pomocą odpowiedniego programu. Oblicz średnie stężenie żywych komórek i zwróć uwagę na żywotność.
    7. Wymieszaj roztwór komórek NK kilka razy przed jego odessaniem za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml i igły 18 G, aby zachować sterylność. Roztwór ten powinien zawierać około 1 x 108 żywych komórek NK w około 20 ml lub około 5 x 106 komórek/ml.
    8. Po wyjęciu igły ze strzykawki, delikatnie wstrzyknąć komórki NK do wkładu przez lewy port ECS. Aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek w całym kartridżu, delikatnie posunąć posuwisto-zwrotny roztwór komórek co najmniej 10 razy za pomocą strzykawek podłączonych do lewego i prawego portu ECS.
      UWAGA: roztwór powinien mieć jednakową mętność na obu strzykawkach, przy zamkniętym lewym i prawym porcie końcowym.
    9. Otworzyć lewy i prawy port końcowy i wstrzyknąć to, co pozostało w strzykawkach. Zamknij lewy i prawy port ECS za pomocą zacisków.
    10. Przenieś wkład do inkubatora i pozostaw go na 30 minut przed prawidłowym zainstalowaniem go na pompie przepływowej. Pozostaw wkład do bioprodukcji. Dostosuj natężenie przepływu zgodnie z producentem.
    11. Aby monitorować wskaźniki zdrowia komórek, należy pobrać 0,5 ml porcji pożywki dziennie z dokładnie wymieszanej pożywki w butelce zbiornika i przechowywać w temperaturze -20 °C po sprawdzeniu poziomu glukozy i pH. Poziom L-mleczanu można sprawdzić później (patrz Tabela Materiałów).
    12. Wymieniaj pożywkę w zbiorniku (250 - 500 ml) co 1 - 2 dni, aby utrzymać zawartość glukozy powyżej 50% początkowych poziomów znajdujących się w pożywce i pH powyżej 7,0 (zakres od 7,0 - 8,0).
  3. Zbieranie CM bogatego w NK-EV należy wykonywać codziennie po 1 dniu odpoczynku przy pierwszym wysiewie wkładu, jak opisano poniżej.
    1. Przenieś system wkładów do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie wstrzyknąć około 21 ml pożywki hodowlanej przez lewy port ECS, aby przepchnąć równoważną objętość CM bogatego w EV przez prawy ECS - nie mieszaj (patrz Rysunek 3).
      UWAGA: Zawsze używaj nowych plastikowych naczyń, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    2. Przenieść roztwór CM bogaty w EV do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. W międzyczasie przenieś system wkładów z powrotem do inkubatora na pompie przepływowej.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 2000 x g przez 10 minut. Ponownie przenieś supernatant do nowej probówki. Następnie podzielić CM bogaty w EV równomiernie na 3 probówki o pojemności 50 ml (~7 ml / probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania.
      UWAGA: Sekwencyjnie zbierany CM bogaty w EV jest łączony w tych trzech probówkach, generując trzy techniczne probówki z replikatami.
  4. Wykonaj zbieranie ogniw HFB-NK, aby kontynuować produkcję CM bogatego w pojazdy elektryczne przy użyciu tego samego wkładu HFB, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Komórki NK można pobrać z ECS HFB, wykonując protokół pobierania komórek HFB-NK", gdy wkład osiągnie konfluencję (maksymalnie 1 x 109 komórek). Dzieje się to po 5 - 7 dniach dla każdej partii lub gdy zawartość glukozy jest poniżej granicy wykrywalności glukometru (np. brak odczytu lub odczyty ~ 0) przez 2 kolejne dni. Jeśli jest to ostatnie pobranie komórek, pożywkę można zastąpić PBS w celu przepłukania wkładu i odzyskania komórek.
    1. Zbierz CM bogaty w pojazdy elektryczne dokładnie tak, jak opisano powyżej w kroku 1.3.
    2. Wstrzyknąć około 50 ml pożywki przez lewy port ECS. Aby zapewnić jednorodne rozproszenie komórek w całym kartridżu, delikatnie popychaj roztwór komórek w przód iw tył za pomocą strzykawek podłączonych do lewego i prawego portu ECS co najmniej 10 razy, aby poluzować komórki, zanim ostatecznie wepchniesz je i zbierzesz za pomocą strzykawki przez prawy port ECS. Przenieś zebrany CM bogaty w EV do probówki o pojemności 50 ml. Na razie odstawić w temperaturze 37 °C (łaźnia wodna lub inkubator).
      UWAGA: Działanie push-back pomaga usunąć komórki, zanim zostaną całkowicie wydalone i zebrane przez strzykawkę przez prawy port ECS. Roztwór powinien mieć jednakową mętność w obu strzykawkach, przy zamkniętym lewym i prawym porcie końcowym. Stuknięcie w wkład bioreaktora (zakłócenie fizyczne) może pomóc w prewencyjnym usunięciu klastra komórek na dnie wkładu. Agresywne mieszanie zawiesiny komórkowej może negatywnie wpłynąć na żywotność odzyskanych komórek. Należy zachować ostrożność i cierpliwość, aby zmaksymalizować żywotność.
    3. Powtórz ostatni krok 2x. W sumie należy odzyskać 150 ml zawiesiny komórek. Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.
    4. Ponownie zawiesić oba granulki komórkowe w 20 ml świeżej pożywki każdy i połączyć je. Zebrać dwie podwielokrotności po 20,5 μl każdej zawiesiny komórek do zliczania komórek na automatycznym liczniku komórek (patrz Tabela Materiałów).
      UWAGA: Zazwyczaj wymagane jest wielokrotne rozcieńczenia komórek przy użyciu PBS jako rozcieńczalnika, aby mieściły się w zakresie dynamicznym licznika komórek.
    5. Do podwielokrotności zawiesiny komórek o objętości 20,5 μl dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz Tabela Materiałów) i mieszać w górę i w dół co najmniej 10 razy. Załadować 20 μl do każdej komory liczącej na szkiełku liczącym i przeprowadzić automatyczne liczenie komórek za pomocą odpowiedniego programu.
    6. Uśrednić stężenie żywych komórek we wszystkich zliczeniach z korektą rozcieńczenia, określić całkowitą ilość żywych komórek i zapisać żywotność. Jak opisano powyżej, aby w sposób ciągły wytwarzać CM bogaty w EV przy użyciu tego samego wkładu bioreaktora, należy ponownie zasiać 1 x 108 komórek NK wyprodukowanych przez HFB.
      UWAGA: W razie potrzeby komórki NK wyprodukowane w HFB mogą być przechowywane przy użyciu pożywki do zamrażania kriokonserwacji i pojemnika do zamrażania w celu kontrolowania szybkości zamrażania (patrz Tabela materiałów).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Komponent i konfiguracja systemu bioreaktora z pustymi włóknami (HFB). Butelka zbiornika (1) zawiera kompletne medium, które krąży we wkładzie bioreaktora (2) w wyniku działania pompy perystaltycznej (nie pokazano) działającej na rurkę pompy (3). Komórki są wprowadzane do zewnątrzkomórkowej przestrzeni kapilarnej (ECS) przez lewy (4) i prawy (5) boczny port ECS. Po zamknięciu zacisków suwakowych ECS, lewy (6) i prawy (7) port po stronie końcowej są otwarte, aby umożliwić cyrkulację medium w całym systemie. Zwróć uwagę na dodanie filmu woskowego na złączu Luer Lock w pobliżu nakrętki zbiornika butelki z podłożem, aby zapobiec potencjalnemu zanieczyszczeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schematyczne przedstawienie procesu izolacji NK-EV. Po codziennym zbieraniu kondycjonowanej pożywki bogatej w EV (CM), roztwór odwirowywano różnicowo w celu usunięcia komórek (pierwszy wir przy 300 x g przez 5 minut) i resztek komórkowych (drugi wir przy 2000 x g przez 10 minut). Oczyszczony CM bogaty w EV przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu dalszej obróbki. Po przygotowaniu do izolacji NK-EV, zamrożony CM bogaty w EV jest rozmrażany i ponownie odwirowywany, aby zapewnić usunięcie resztek komórkowych (trzecie wirowanie przy 10 000 x g przez 30 min). Następnie CM bogaty w EV jest traktowany przez 2 - 4 godziny w temperaturze 37 °C endonukleazą w celu trawienia kwasów nukleinowych uważanych za zanieczyszczenia komórek gospodarza. Następnie CM bogaty w EV jest przetwarzany za pomocą chromatografii wykluczania wielkości opartej na szybkiej chromatografii cieczowej białka (FPLC-SEC) w celu oczyszczenia EV przy użyciu żywicy bimodalnej. Eluowane frakcje o objętości około 10 - 15 ml są łączone i filtrowane za pomocą filtrów 0,22 μM, aby zapewnić sterylność końcowego produktu NK-EV. Ultrafiltracja pozwala na zagęszczenie produktu około 35 - 50 razy, co daje gwarantowane stężenie ponad 1 x 1012 EVs/mL, co daje łącznie 1,0 - 1,5 mL. Ten rysunek został zmodyfikowany z7(utworzony za pomocą Biorender.com). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Oczyszczanie NK-EV przez FPLC-SEC w połączeniu z UF i sterylizacją opartą na filtrach

  1. Przygotuj następujące roztwory i przefiltruj je dwukrotnie za pomocą filtra 0,1 μm (patrz tabela materiałów): woda (przewodność 0 mS/cm), PBS: 50 ml 10x PBS + 450 ml wody (przewodność około 14,7 mS/cm), 20% etanolu, roztwór czyszczący (0,5 M NaOH i 30% alkoholu izopropylowego w wodzie).
  2. Wykonaj inicjację systemu FPLC zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Wykonaj czynności czyszczenia na miejscu przed i po uruchomieniu () zgodnie z instrukcjami producenta. Umyj wszystkie przewody i żywicę kolumny i spłucz wodą podwójnie filtrowaną (DF), roztworem czyszczącym, wodą DF i DF-PBS.
    UWAGA: Warto zauważyć, że w razie potrzeby można wykonać w innym dniu.
  3. Użyć kolumny chromatograficznej wypełnionej żywicą bimodalną (patrz tabela materiałów) o wysokości łoża 20 cm. Wykonać połączenia metodą kroplówka-kroplówka, aby upewnić się, że powietrze nie jest wprowadzane do wnętrza kolumny.
  4. Ustawić kolektor frakcji z odpowiednimi probówkami zbiorczymi i zmienić ustawienia frakcjonowania na żądaną objętość zbierania (np. 15 ml). Umieść wystarczającą ilość probówek i dwie dodatkowe probówki, aby zebrać całą objętość próbki.
  5. Przygotować próbkę w sposób opisany poniżej.
    1. Pobrać 40 - 80 ml CM o wysokiej zawartości EV z zamrażarki w temperaturze -80 °C i szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C. Załadować próbkę do ultrawirówki i wirować w temperaturze 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Rurki muszą być dokładnie wyważone wagowo, a nie objętościowo.
    2. Po odwirowaniu zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki. Aby obniżyć poziom dsDNA, potraktuj CM bogaty w EV 50 U/ml endonukleazy i 1,5 mM MgCl2 (patrz Tabela materiałów). Inkubować przez 2 - 4 godziny w inkubatorze (37 °C), co pozwala na umiarkowane mieszanie.
  6. Gdy system (linie i kolumna) jest gotowy do izolacji EV, załaduj CM bogaty w EV do strzykawki o pojemności 60 ml i podłącz go do linii próbkowania. Uruchom system, klikając opcję Manual Run (Uruchamianie ręczne) i ustaw natężenie przepływu na 0. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby zapobiegawczo zapisać przebieg, a następnie kliknij przycisk Start.
  7. Wybierz linię B (DF-PBS) i pracuj z prędkością przepływu 150 cm/h (natężenie przepływu 2,0 ml/min). Upewnij się, że rozwiązanie przechodzi przez kolumnę.
  8. Gdy przewodność się ustabilizuje, naciśnij Auto Zero UV. Zmień ścieżkę przepływu, aby skierować próbkę do pojemnika na odpady przed kolumną. Upewnij się, że do systemu nie zostały wprowadzone żadne bąbelki.
  9. Po upływie maksymalnie 5 - 20 s skierować próbkę do kolumny. Kliknij Frakcjonowanie, gdy odczyty UV osiągną około 230 mAU.
  10. Po całkowitym wstrzyknięciu próbki przez system przełącz system buforowy na DF-PBS (na zaworze próbki), aby kontynuować oczyszczanie. Kliknij ponownie przycisk Frakcjonowanie, gdy wartość promieniowania UV osiągnie około 1600 mAU.
    UWAGA: Odpowiada to przecięciu między odczytami UV a odczytami przewodności. Dłuższe frakcjonowanie tylko rozcieńcza retentat bez zwiększania wydajności EV.
  11. Połączyć wszystkie frakcje (rozcieńczone NK-EV) i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do sterylizacji i ultrafiltracji za pomocą filtra (UF).
  12. Kontynuuj uruchamianie DF-PBS, aż wartość UV osiągnie około 1000 mAU. Następnie zatrzymaj działanie i zapisz chromatogram jako dokument PDF.

3. Sterylizacja i zagęszczanie produktu NK-EV za pomocą filtra UF

  1. Schłodzić wirówkę do temperatury 10 °C. Zdezynfekować każdy element aparatu UF (patrz Tabela materiałów) poprzez przepłukanie 20 - 30 ml 90% etanolu. Wirować z prędkością 4000 x g przez 5 - 10 min.
    UWAGA: Filtr wykonany jest z regenerowanej celulozy MWCO o mocy 10 kDa.
  2. Odrzuć przepływ, a następnie powtórz płukanie przy użyciu sterylnego PBS w celu zrównoważenia urządzenia. Powtórz w sumie 2 razy.
  3. Aby zmaksymalizować sterylność, przefiltruj rozcieńczony roztwór NK-EV za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm wstępnie zwilżonego DF-PBS (patrz tabela materiałów). Zebrać filtrat bezpośrednio do wysterylizowanego aparatu zagęszczającego.
  4. Wirować z prędkością 4000 x g przez 15 - 40 minut (czas wirowania zależy od próbki). Po odwirowaniu wymieszać roztwór w górnej komorze filtra za pomocą pipety serologicznej. Wirować z prędkością 4000 x g przez dodatkowe 10 minut.
    UWAGA: Etap mieszania jest opcjonalny, ponieważ po prostu ułatwia etap zagęszczania, zapobiegając zatkaniu membrany przez pojazdy elektryczne.
  5. Tymczasowo odłóż przepływ i zbierz próbkę NK-EV, odwracając urządzenie filtrujące i podłączając je do urządzenia zbierającego.
  6. Wirować w temperaturze 2000 x g przez 2 minuty. Przenieść oczyszczony produkt NK-EV do probówki o pojemności 2 ml. Oczyszczony produkt NK-EV należy przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania (≤ 7 dni) lub zamrożony w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.

4. Charakterystyka NK-EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)

  1. Przygotować roztwór i przefiltrować go dwukrotnie przy 0,1 μm (patrz tabela materiałów): woda, PBS, roztwór czyszczący (10% wybielacz (UWAGA) w wodzie).
  2. Uruchom system NTA zgodnie z instrukcjami producenta. Podobnie należy wykonać kroki czyszczenia na miejscu przed i po uruchomieniu (). Umyj wszystkie przewody i spłucz wodą z podwójnym filtrem (DF), roztworem czyszczącym i wodą DF. Wyrównaj linie za pomocą DF-PBS.
  3. Sprawdź celę przepływową i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza. Usuń bąbelki, jeśli są obecne. Po oczyszczeniu ostrożnie ponownie włóż komórkę przepływową do przyrządu NTA.
    UWAGA: Chociaż nie jest to zalecane przez producenta, bardzo trudne do usunięcia pęcherzyki powietrza można łatwo usunąć, spłukując 20% etanolem, a następnie wodą DF.
  4. Gdy komórka przepływowa znajdzie się na swoim miejscu, a drzwi zostaną zamknięte, kliknij przycisk Uruchom kamerę. Przy liniach wypełnionych DF-PBS ekran powinien pokazywać absolutnie minimalną liczbę cząstek.
  5. Zmień ustawienia przechwytywania na wzmocnienie ekranu 2 i poziom kamery 14. Włącz również grzałkę, aby ustabilizować temperaturę komory przepływowej.
  6. Kliknij Pomiar standardowy, aby utworzyć skrypt w zakładce SOP do zbierania jednego ujęcia w ciągu 1 minuty przy natężeniu przepływu 30 cząstek/klatkę i temperaturze 23 °C.
  7. Tuż poniżej dodaj nazwę folderu i pliku do nazwy ścieżki, aby zapisać dane.
  8. Przygotować wcześniej rozcieńczenia oczyszczonego produktu NK-EV przy użyciu DF-PBS. W przypadku korzystania z NTA dokładna kwantyfikacja wymaga 30 - 80 cząstek/ramkę.
  9. Sproszkować próbkę przed włożeniem jej do strzykawki (patrz Tabela materiałów).
  10. Ostrożnie podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do przewodu ładowania instrumentu. Nie powinno być powietrza, ponieważ wpłynie to negatywnie na akwizycję i analizę. Powoli przepchnąć połowę próbki, pozostawiając około 0,5 ml w strzykawce.
  11. Gdy cząsteczki są widoczne na ekranie, ustaw ostrość kamerę tak, aby wokół każdej cząstki znajdowało się maksymalnie jedno halo. Kliknij Infuse na karcie Sprzęt z szybkością 1000 przez 5 s. Następnie zmniejsz go do 30.
  12. Naciśnij Uruchom skrypt i postępuj zgodnie z instrukcjami. Oprogramowanie upewni się, że temperatura jest ustawiona i zapyta, czy ustawienia są prawidłowe. Kliknij Tak i postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania.
  13. Po zakończeniu przechwytywania kliknij przycisk Anuluj, gdy oprogramowanie poprosi o przetworzenie lub wyeksportowanie plików. Kliknij Infuse na karcie Hardware (Sprzęt) z szybkością 1000 przez 10 - 15 s. W międzyczasie włącz z powrotem grzejnik i kamerę. Następnie zmniejsz szybkość do 30, aż cząsteczki się poruszą.
  14. Zbierz cztery kolejne ujęcia, powtarzając poprzednie kroki. Po zarejestrowaniu łącznie pięciu wychwytów na rozcieńczenia, należy przeprowadzić analizę po zaimportowaniu wszystkich pięciu wychwytów.
  15. Wybierz pliki do przetworzenia, podświetlając je. Kliknij przycisk Przetwarzaj wybrane pliki. Na karcie Proces dostosuj ustawienia analizy do wzmocnienia ekranu 2 i progu wykrywania 15,
    Ustawienia są zależne od próbki; Upewnij się, że widocznych jest 30 - 80 cząstek na klatkę.
  16. Zaznacz i kliknij przycisk OK do analizy.
  17. Po przetworzeniu plików oprogramowanie poprosi o ich wyeksportowanie. Kliknij przycisk Tak bez klikania dodatkowych pól lub kliknij przycisk Eksportuj.
  18. Powtórzyć te czynności dla wszystkich rozcieńczeń lub próbek EV. Wyłącz przyrząd NTA po zakończeniu wszystkich próbek i zakończeniu.

5. Testy zapewnienia jakości

  1. Wykonaj testy mikrobiologiczne za pomocą dwóch testów: 1) małą porcję oczyszczonych NK-EV dodaje się do autoklawowanej pożywki bulionowej LB oraz 2) małą porcję oczyszczonych NK-EV stosuje się do wykrywania mykoplazmy PCR (patrz Tabela materiałów).
    1. Test 1: hodowla LB w temperaturze 37 °C przez okres do 5 dni, z uwzględnieniem kontroli dodatniej i ujemnej. W razie potrzeby nagraj OD600.
    2. Test 2: przeprowadzić detekcję Mycoplasma PCR zgodnie z protokołem producenta.
  2. Określ ilościowo białko i dsDNA w oczyszczonych rozcieńczeniach NK-EV za pomocą testów opartych na fluorometrze zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).

6. Ocena siły działania komórek nowotworowych leczonych NK-EV przy użyciu zwalidowanego, wysoce czułego testu żywotności komórek opartego na resazurynie 20

  1. Posiewaj ludzkie komórki białaczkowe K562 przy użyciu RPMI-1640 z 10% inaktywowanym termicznie FBS przez kilka dni przed wykonaniem testu siły działania (patrz Tabela materiałów). Utrzymuj gęstość między 2 - 8 x 105 komórek/ml i wymieniaj pożywkę co 2 - 3 dni.
  2. Zaopatrzyć się w 96-dołkową płytkę z płaskim dnem (patrz Tabela materiałów) i zapobiegawczo dodać objętość pożywki testowej (uzupełnioną o 5% FBS o zawartości EV) wymaganą do celów normalizacji (patrz Tabela materiałów). Ostateczna objętość wynosi 150 μl/basenik.
    UWAGA: Użyj pipety powtarzalnej, aby zmniejszyć różnice między studniami.
  3. Zdobądź kulturę komórkową i przenieś komórki do probówki. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 min. Zawiesić osad komórkowy w roztworze jednokomórkowym, używając 2 - 5 ml podłoża do oznaczania.
  4. Pobrać podwielokrotność 20,5 μl zawiesiny komórek do zliczania komórek na automatycznym liczniku komórek (patrz tabela materiałów).
  5. Do podwielokrotności zawiesiny komórek o objętości 20,5 μl dodać równą ilość barwnika AO/PI (patrz tabela materiałów) i mieszać w górę i w dół co najmniej 10 razy < br /> UWAGA: Zalecamy AO/PI do dokładnego zliczania komórek. Alternatywnie użyj hemocytometru do ręcznego liczenia.
  6. Załadować 20 μl do każdej komory liczącej na szkiełku liczącym i przeprowadzić automatyczne liczenie komórek za pomocą odpowiedniego programu. Uśrednić stężenie żywych komórek i zapisać żywotność.
  7. Przenieś około 1 x 106 komórek do probówki wtórnej. Rozcieńczyć komórki dokładnie do 7 ml pożywki testowej i powtórzyć liczenie komórek. Stężenie powinno wynosić około 1,2 - 1,5 x 105żywych komórek/ml.
  8. Jak opisano powyżej, dostosuj stężenie zawiesiny pojedynczej komórki do 1 x 105 żywych komórek/ml i w razie potrzeby powtórz liczenie komórek.
    UWAGA: Współczynnik zmienności między liczbą duplikatów technicznych powinien być mniejszy niż 25%; zazwyczaj jest to mniej niż 5% przy zliczaniu AO/PI.
  9. Po osiągnięciu pożądanego stężenia przenieś 50 μl (± 1 μl) tego roztworu do każdej studzienki, aby zbliżyć się jak najbardziej do 5000 komórek/studzienkę (4900 - 5100 komórek/studzienkę). Przygotować techniczne triplikaty dla każdego warunku testu i użyć pipety powtarzalnej w celu zmniejszenia różnic między odwiertnikami.
  10. Przenieść płytkę do wytrząsarki orbitalnej (350 - 500 obr./min) na 2 min. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora, aż będą gotowe do rozpoczęcia leczenia NK-EV.
  11. Przygotować wymagane rozcieńczenia NK-EV (1:5, 1:10 i 1:100) za pomocą pożywki do oznaczania.
  12. Z tych rozcieńczeń zbadać następujące stężenia EV: 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 10 9, 1 x 1010, 5 x 1010 i 1 x 1011 cząstek/ml. Objętość dozowania jest ograniczona do 20% całkowitej objętości testu.
  13. Po przygotowaniu przenieść wymaganą objętość danego rozcieńczenia do studzienek wymagających pożądanego stężenia EV do obróbki. Dodać 15 μL 10x Triton-X do studzienki kontroli dodatniej (patrz tabela materiałów). Końcową objętość studzienki należy znormalizować do 150 μl.
  14. Dodać płytkę do wytrząsarki orbitalnej (350 - 500 obr./min) na 2 min. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 3 godziny.
  15. Podgrzej czytnik płytek (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C i załaduj następujący skrypt: 37 °C (zmniejsza wahania związane z temperaturą), mieszanie 450 obr./min przez 1 minutę (zapewnia jednorodność próbki) i przeczytaj.
  16. Dodać 15 μl odczynnika na bazie resazuryny do każdego dołka (patrz tabela materiałów). Chroń odczynnik przed światłem i użyj pipetora powtarzalnego, aby zmniejszyć różnice między studniami.
  17. Umieścić płytkę w wytrząsarce orbitalnej (350 - 500 obr./min) na 2 min. Przenieść płytkę do inkubatora i inkubować przez 60 min. Usunąć pęcherzyki powietrza za pomocą końcówki pipety nasączonej etanolem. Odczyt płytki przy użyciu wzbudzenia 560 nm i emisji 590 nm.
  18. Analiza danych: Średnie kontrpróby techniczne zostały uśrednione i skorygowane dla tła przed przeprowadzeniem analizy dawka-odpowiedź przy użyciu regresji nieliniowej dla efektu hamowania, pokazującej logarytm (inhibitor) w porównaniu ze znormalizowanym nachyleniem zmiennej odpowiedzi bez ograniczeń. Zapisz wartości nachylenia terenu i EC50.

Wyniki

NK-EVs posiadają naturalne funkcje cytotoksyczne i wykazały wysoką skuteczność przeciwko różnym modelom raka. Potrzebna jest jednak większa standaryzacja wśród obecnych badań dotyczących przepływu pracy bioprodukcji odpowiedniego do produkcji na dużą skalę NK-EVs6,21. Nasze poprzednie badanie opisywało wykonalność systemu bioreaktora z pustymi włóknami (HFB) w zamkniętej pętli do produkcji dużych ilości produktów NK-EV o wysokiej czystości7. W ramach kontynuacji, to oparte na protokole badanie szczegółowo opisuje przebieg bioprodukcji i demonstruje jego odtwarzalność poprzez wytwarzanie i izolowanie produktu NK-EV (Rysunek 1). Ponadto przed dopuszczeniem produktu do obrotu wymagana jest niezbędna charakterystyka i walidacja produktu, dzięki czemu w tym badaniu prezentowane są nowe i oryginalne dane.

System HFB został wybrany do produkcji NK-EV ze względu na łatwość użycia, niezawodność, skalowalność i zgodność z GMP7. W odniesieniu do konfiguracji systemu HFB, komórki NK są wstrzykiwane przez lewy port ECS i umieszczane we wkładzie bioreaktora (Rysunek 2). W tym samym czasie butelka z nośnikiem jest podłączona do HFB przez boczne porty, a media mogą przepływać przez cały system. Komórki NK są hodowane w pożywce bez surowicy, ksenozy, karmnika i antybiotyków, w której pożywka jest wymieniana, gdy zawartość glukozy spadnie poniżej 50%, aby utrzymać i zmaksymalizować zdrowie komórek w czasie. CM jest zbierany codziennie, przetwarzany przez wirowanie różnicowe i przechowywany w stanie zamrożonym (-80 °C) do momentu, gdy będzie gotowy do dalszego przetwarzania. Następnie izolację EV przeprowadza się poprzez kombinację wirowania różnicowego i FPLC-SEC w połączeniu z UF i filtracją (Rysunek 3). W ten sposób uzyskuje się skoncentrowany i sterylny produkt NK-EV o końcowej objętości około 1,0 - 1,5 ml. Przedstawiono reprezentatywny chromatogram izolacji FPLC-SEC NK-EV (Rysunek 4). Przed przetwarzaniem FPLC-SEC, CM bogaty w NK-EV jest traktowany endonukleazą, co znacznie obniża poziom dsDNA, potencjalnego zanieczyszczenia komórek gospodarza (NK) class7. W związku z tym opisany przebieg izolacji EV usuwa resztki komórkowe i zanieczyszczenia RNA/DNA z produktu NK-EV, co jest niezbędne do zapewnienia niskiego i niepożądanego potencjału immunogennego oraz tego, że produkt końcowy nadaje się do dalszych badań.

figure-results-1
Rysunek 4: Chromatogram izolacyjny NK-EV wygenerowany podczas wykluczenia rozmiaru szybkiej chromatografii cieczowej białek. Niebieska linia reprezentuje absorbancję (mAU; maksymalny odczyt 2000 mAU), czerwona linia reprezentuje przewodność, czerwony tekst reprezentuje dziennik przebiegu, a szary zacieniony obszar reprezentuje frakcjonowane NK-EV (oznaczone frakcjami T2 - T7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po izolacji, podstawowa charakterystyka NK-EV i testy zapewnienia jakości są używane do oceny, czy produkt NK-EV może zostać dopuszczony do dalszych eksperymentów. Zakres wielkości i stężenie cząstek produktu NK-EV są mierzone za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), o rozmiarach w zakresie od 76,30 do 174,30 nm średnicy (D10 z 78,38 ± 2,07 nm, D50 z 106,72 ± 2,43 nm i D90 z 169,80 ± 4,17 nm) i średnim stężeniu 1,39 x 1012 EVs/ml (Rysunek 5A-B). Dodatkowo, kwantyfikacja fluorometryczna wykazała stężenie białka i dsDNA odpowiednio 298,90 ± 66,62 mg/ml i 225,60 ± 37,7 ng/ml dla produktu końcowego (Figura 5C-D). Odpowiada to średniemu stosunkowi 5,06 x 106 EV/μg białka i 6,16 x10 12 EV/μg DNA. Zarówno testy mikrobiologiczne, jak i mykoplazmowe dały wyniki negatywne (dane nie pokazane). Wyniki te są zgodne z charakterystyką NK-EV z poprzednich prac7. Wcześniejsza publikacja7 zawiera również dalszą szczegółową charakterystykę produktów NK-EV zgodnie z wytycznymi MISEV (tj. TEM, western blot, poziom endotoksyny, jednostki wirusowe i cytometria przepływowa dla antygenów powierzchniowych i cytokin).

Na koniec, funkcjonalność produktu NK-EV (tj. cytotoksyczność wobec komórek rakowych) została oceniona za pomocą zwalidowanego, bardzo czułego testu żywotności komórek opartego na resazurynie po leczeniu NK-EV przeciwko białaczkowej linii komórkowej K5627,20. Traktowanie komórek K562 NK-EV przez 3 godziny wywołało zależny od dawki wpływ na żywotność komórek, odpowiadający EC50 wynoszącemu 9,33 x 109 EVs/ml (tj. dawka odpowiadająca zabiciu 50% populacji komórek; Rysunek 6A-B). W związku z tym, zgodnie z przedstawionymi kryteriami dopuszczenia produktu do obrotu, produkt NK-EV uznaje się za odpowiedni do dalszych eksperymentów.

figure-results-2
Rysunek 5: Charakterystyka produktu z oczyszczonego NK-EV. (A) Rozkład wielkości produktu NK-EV mierzony przez NTA, pokazany jako średnia z 5 niezależnych eksperymentów, każdy z 10 powtórzeniami technicznymi (5 ujęć wideo x 2 rozcieńczenia). (B) Stężenie cząstek stałych NK-EV (cząstki/ml) mierzone przez NTA, przedstawione jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każde zawiera duplikaty techniczne. (C) Stężenie białka produktu NK-EV (mg/mL) mierzono za pomocą fluorometru, przedstawionego jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy zawierał trzy egzemplarze techniczne. (D) Stężenie dsDNA produktu NK-EV (ng/ml) mierzone za pomocą fluorometru, przedstawione jako średnia ± SD z 5 niezależnych eksperymentów, z których każdy zawiera techniczne trzy próby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 6: Walidacja funkcjonalności oczyszczonego produktu NK-EV. NK-EV wykazują zależną od dawki cytotoksyczność wobec ludzkich komórek białaczki K562 traktowanych różnymi stężeniami NK-EV przez 3 godziny przy użyciu wysoce czułego testu żywotności komórek opartego na resazurynie. (A) Znormalizowane odczyty testu (zielona linia reprezentuje nieleczoną kontrolę komórek białaczki K562, a przerywana linia reprezentuje lizowaną kontrolę martwych komórek białaczki K562; poddane działaniu detergentu). Dane przedstawiono jako średnią ± SEM z 11 niezależnych eksperymentów z potrójnymi próbami technicznymi. (B) Analiza krzywej EC50 ze zmiennym nachyleniem dla leczenia NK-EV z 95% przedziałem ufności/pasmami predykcyjnymi (czerwona przerywana linia oznacza 50% odpowiedzi). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Kilka badań sugeruje, że NK-EV mają ogromny potencjał jako terapia przeciwnowotworowa 4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Jednak skalowalny system bioprodukcji zgodny z GMP, zdolny do wytwarzania dużych ilości NK-EV o wysokiej czystości, jest niezbędny do dalszych testów przedklinicznych i przyszłych zastosowań klinicznych. Aby rozwiązać ten problem, w poprzednim badaniu wykorzystano system HFB w zamkniętej pętli do ciągłego wytwarzania ogniw NK i CM bogatych w NK-EV, nadających się do dalszych eksperymentów. Ze względu na konstrukcję 3D, systemy HFB ściśle odzwierciedlają warunki panujące w układzie naczyniowym i mają niewiarygodnie wysoki stosunek powierzchni do objętości, co pozwala na pozostanie w hodowli ponad miliarda komórek, co ostatecznie prowadzi do poprawy produkcji EV 7,31,32. Co ważne, praca ta była pierwszą, w której opisano użycie systemu HFB do hodowli komórek NK, prawdopodobnie ze względu na samowystarczalność linii komórkowej IL-27.

Należy podjąć dodatkowe kroki w celu zapewnienia sterylności systemu HFB i produkcji pojazdów elektrycznych typu NK-EV o wysokiej czystości. Te środki ostrożności są szczególnie istotne w przypadku braku sterylnego, czystego pomieszczenia, co może mieć miejsce w przypadku kilku ośrodków badawczych. Przed wejściem do szafy bezpieczeństwa biologicznego system HFB jest skrupulatnie spryskiwany 70% etanolem w celu dezynfekcji wszystkich powierzchni zewnętrznych. Dodatkowo wszystkie połączenia Luer Lock są owijane folią woskową, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Jest to szczególnie ważne, ponieważ w procesie bioprodukcji nie stosuje się antybiotyków, o których wiadomo, że wpływają na profil biochemiczny komórek i produktów pochodzących z komórek33. Do oceny zdrowia komórek podczas bioprodukcji produktów komórkowych wykorzystano różne wskaźniki. Na przykład przeprowadzono codzienne oceny pH, poziomu glukozy i mleczanu w zbiorniku, ponieważ są to niezbędne substytuty zdrowia komórek do monitorowania. Oprócz ocen ilościowych, obserwacje jakościowe systemu HFB (np. kolor podłoża i wizualne oznaki zanieczyszczenia, takie jak zmętnienie) są również pomocne w monitorowaniu stanu komórek. Stwierdzono, że liczba komórek w codziennie pobieranym CM nie jest reprezentatywnym wskaźnikiem żywotności dla zdrowia kultury (dane nie pokazane). Jest to prawdopodobnie wynikiem martwych komórek pobranych podczas pobierania próbek CM, które zostały znalezione w rurce, w której pożywka nie mogła krążyć (mały odcinek między ECS a portem strzykawki ECS), zaniżając w ten sposób żywotność całej hodowli komórkowej. Tylko pobrane komórki NK wyprodukowane przez HFB na końcu partii produkcyjnej mogą zapewnić wiarygodny wskaźnik zdrowia hodowli. Ogniwa te konsekwentnie wykazywały wartości żywotności powyżej 70 % w partiach produkcyjnych7. Razem te metody oceny jakości zapewniają ciągłą produkcję pojazdów elektrycznych typu NK-EV o wysokiej czystości.

Opracowano kilka technik izolacji w celu oczyszczenia i wyizolowania EV34. Jedna z metod, SEC, wykorzystuje kolumnę wypełnioną porowatym materiałem - żywicą - co pozwala na separację cząsteczek w oparciu o dyskryminację wielkości. W tym przypadku większe EV są szybciej eluowane przez kolumnę; Ta metoda jest znana jako oczyszczanie przepływowe oparte na wykluczeniu wielkości. W tym samym czasie mniejsze zanieczyszczenia (dsDNA, swobodnie unoszące się białka, takie jak endonukleaza, sole, czerwień fenolowa itp.) są pozostawiane i dalej zatrzymywane w żywicy przez siły elektrostatyczne (tj. zastosowano żywicę bimodalną). Przetwarzanie oparte na SEC usuwa białka niezwiązane z EV, zachowując oryginalną strukturę i funkcjonalność EV35,36. Co więcej, oczyszczanie oparte na SEC jest łatwo skalowalne bez uszczerbku dla wysokiej wydajności i czystości, co czyni go odpowiednim wyborem do izolowania NK-EV do zastosowań bioterapeutycznych. Pomimo tych zalet, SEC ma pewne wady, takie jak stosunkowo rozcieńczony przepływ (eluent); w związku z tym UF jest wymagane do zagęszczenia produktu, ale umożliwia również wymianę buforu. Niesterylny aparat UF jest płukany 70% etanolem i PBS i przechowywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego przed użyciem w celu zapewnienia sterylności. Zazwyczaj przepływ może być skoncentrowany do 35x-50x objętości początkowej, jednocześnie usuwając małe cząsteczki, które mogłyby dostać się do eluentu. Wirowanie różnicowe i leczenie endonukleazą przeprowadza się przed FPLC-SEC w połączeniu z UF w celu usunięcia resztek komórek, szczątków komórkowych i długich nici antygenowego dsDNA7.

Po wyizolowaniu produktu NK-EV przeprowadza się charakterystykę i walidację funkcjonalną zgodnie z wytycznymi zawartymi w MISEV2018 i MISEV2023 w celu określenia przydatności produktu do dalszego użytkowania 6,18. Każda izolacja daje 1,0 - 1,5 ml produktu NK-EV o wysokiej czystości o minimalnym stężeniu 1 x10 12 EVs/mL, przy średnim stężeniu 1,39 x 1012 cząstek/ml. Wcześniej Gupta i wsp. ustalili, że mediana dawki EV in vivo wynosi 3,37 x 108 EVs/kg masy ciała myszy37. Leczenie medianą dawki wymagałoby 8,43 x 106 EV/mysz o masie ciała 25 g, wartości znacznie poniżej gwarantowanego minimum (1 x 1012 cząstek/ml) uzyskanego w tym przepływie pracy. W związku z tym opisany proces bioprodukcji może wyprodukować więcej niż wystarczającą ilość NK-EV do eksperymentów przedklinicznych lub do osiągnięcia celów dawkowania. Każda izolacja jest testowana pod kątem obecności mykoplazmy i drobnoustrojów w ramach oceny kontroli jakości produktu. Ponadto poprzednie badanie wykazało brak powszechnych jednostek wirusowych i endotoksyn w produkcie końcowym oraz brak składników komórkowych uważanych za zanieczyszczenia komórek gospodarza (w analizie western blot)7,34. Na koniec przeprowadzono ocenę funkcjonalną przy użyciu zwalidowanego, bardzo czułego testu żywotności komórek opartego na resazurynie, aby ocenić funkcjonalność NK-EV20. Opisany test żywotności działa poprzez redukcję rezazuryny (słabo fluorescencyjnej) do rezorufiny (wysoce fluorescencyjnej) przez metabolicznie aktywne komórki, co pozwala na ocenę żywotności komórek po leczeniu NK-EV. W porównaniu z innymi alternatywnymi testami żywotności komórek, test na bazie resazuryny zastosowany w badaniu jest bardzo wrażliwy na zmiany żywotności komórek (bardzo niski szum tła) i pozwala na skrócenie czasu inkubacji w celu zaobserwowania wyników (mniej niż 30 minut w celu uzyskania wyników istotnych statystycznie)20. Ogólnie rzecz biorąc, NK-EV wykazują zależny od dawki wpływ na żywotność K562. Przedstawione wyniki reprezentują produkt NK-EV, który spełnił kryteria dopuszczenia produktu do oceny przedklinicznej i nadaje się do dalszych zastosowań.

Podsumowując, to badanie oparte na protokole opisuje bioprodukcję NK-EV o potencjale klinicznym. Jak wspomniano, pojazdy NK-EV są produkowane przy użyciu systemu HFB w pętli zamkniętej w warunkach wolnych od surowicy, ksenoizolacji, karmów i antybiotyków7. Połączenie FPLC-SEC/UF izoluje i oczyszcza produkt NK-EV. Przed dopuszczeniem produktów do dalszego zastosowania, pojazdy NK-EV muszą zostać scharakteryzowane i zweryfikowane pod względem funkcjonalnym, aby upewnić się, że nadają się do użytku. Jak wykazano, przestrzeganie tego protokołu bioprodukcji może z powodzeniem wygenerować dużą ilość NK-EV o wysokiej czystości, które wykazują cytotoksyczność w miejscu docelowym wobec komórek nowotworowych. W związku z tym opisany protokół bioprodukcji może być atutem dla przyszłych badań, które wymagają produkcji NK-EV klasy klinicznej.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów ani nie ujawniają informacji.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować doktorom Simonowi Sauvé, Rogerowi Tamowi i Xu Zhangowi za ich krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Inicjatywy Badań i Rozwoju Genomiki (GRDI) Faza VII (2019-2025) rządu Kanady uzyskane przez JRL, LW, a także granty operacyjne z Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii RGPIN-2019-05220, Cancer Research Society/University of Ottawa 24064, Kanadyjski Instytut Zdrowia (CIHR) Research Operating Grant 175177 uzyskany przez LW, stypendium CIHR MSc uzyskane przez MK oraz stypendium królowej Elżbiety II w dziedzinie nauki i technologii (QEII-GSST) uzyskane przez FSDB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m Jednostka filtracji próżniowej Filtropur V50 Sarstedt83,3941,002
0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy Acrodisc Pall CorporationPN4612
Strzykawka 1 ml Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
Filtr odśrodkowySigmaUFC701008
strzykawka 60 ml BD Biosciences309653
96-dołkowe płaskie, przezroczyste dno z czarnego polistyrenu poddane działaniu TC Costar3603
Agaroza Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA Szybki chromatograf cieczowy białek Igła GE Lifesciences29022094
PrecisionGlide - 18GBD Biosciences305196
Nukleaza benzonazy SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 Czytnik wielomodowyBioTek SH1M2G-SN
Bufor ładujący do niebieskiego soku Żywica Invitrogen10816015
CaptoCore 700 Cytiva17548102
Celometr Auto 2000 Licznik żywotności Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 SigmaC2874
DPBS−/−  FisherBP399-1
Podwójny transluminator światła niebieskiego / białego LED InvitrogenLB0100
Duet P3202 FiberCell Systems
Buforowana fosforanami sól fizjologicznaGibco 14190250
Etanol Alkohole komercyjneP006EAAN
FBS zubożone w egzosomy GibcoA2720803
Fluorobryt DMEM GibcoA18967-01
GlukometrAccuCheckModel 930
Kolumna chromatograficzna HiScale 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (alternatywa dla pożywki GMP)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF Pożywka do ekspansji limfocytów T StemCell Technologies10981
Alkohol izopropylowy Ogniwa EMDPX1834-1
K562ATCCCCL-243
LB nośnik BioBasicSD7002
 Abcamab65331
Średni wkład z pustych włókien Systemy FiberCellC2011
MgCl2 Zestaw doM1028
 Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH Ogniwa SupelcoSX0607N-6
NK92-MI ATCCCRL-2408
Paski pH-Mquant Sigma1,09533
odczynnika żywotności komórek HS PrestoBlue Fluorometr InvitrogenP50200
Qubit 4 Invitrogen
Qubit dsDNA BR Zestaw testowyInvitrogenQ33262
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSInvitrogenQ33231 
Paski probówek do testów Qubit Flex Fluorometr InvitrogenQ33252
Qubit Flex InvitrogenQ33327
Zestaw do oznaczania białek kubitowych BR InvitrogenA50669
Szybkie ładowanie 1Kb Plus drabinka DNA NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
Pompa strzykawkowa Aparat Harvarda984730
Triton-X 100 Bufor SigmaT-9284
UltraPure TAE Invitrogen15558042
ViaStain Roztwór do barwienia pomarańczy akrydynowej i jodku propidyny (AO/PI) ESBE ScientificCS2-0106
10 kDa Centricon Plus-70 Medium zamrażające Pompa sterująca przepływem Zestaw do oznaczania L-mleczanu wykrywania Mycoplasma PCR Sigma Test Zestaw testowy

Bibliografia

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

EV z kom rek Natural Killerp cherzyki zewn trzkom rkowechromatografia wykluczania rozmiar wbioreaktor z pustymi w knamianaliza ledzenia nanocz steczektest ywotno ci kom rekultrafiltracjalinia kom rkowa NK92 MI

Powiązane artykuły