Artykuł metodologiczny

Generowanie organoidów 3D śródmózgowia z indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/67228

⸱

14 lutego 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorską metodę tworzenia organoidów 3D śródmózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, kierując ich powstawaniem tak, aby naśladować natywną tkankę śródmózgowia, pomagając w ten sposób w badaniu rozwoju i zaburzeń.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój organoidów śródmózgowia (MO) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) stanowi znaczący postęp w zrozumieniu rozwoju mózgu, ułatwiając precyzyjne modelowanie chorób i postępując w badaniach terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metodę generowania organoidów specyficznych dla śródmózgowia przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), wykorzystując strategiczne podejście różnicujące. Kluczowe techniki obejmują hamowanie podwójnego SMAD w celu stłumienia sygnalizacji SMAD, podawanie czynnika wzrostu fibroblastów 8b (FGF-8b) oraz aktywację szlaku Sonic Hedgehog za pomocą agonisty purmorfaminy, kierując iPSC w kierunku losu śródmózgowia.

Organoidy wytwarzane tą metodą osiągają średnice do 2 mm i zawierają różnorodny wachlarz typów komórek neuroepitelialnych, odzwierciedlając wrodzoną różnorodność komórkową śródmózgowia. Walidacja tych organoidów jako autentycznych struktur śródmózgowia obejmuje ekspresję markerów specyficznych dla śródmózgowia, potwierdzając ich tożsamość. Godnym uwagi wynikiem tej metodologii jest skuteczne różnicowanie iPSC w neurony dopaminergiczne, które są charakterystyczne dla śródmózgowia.

Znaczenie tego protokołu polega na jego zdolności do wytwarzania funkcjonalnie dojrzałych, specyficznych dla śródmózgowia organoidów, które ściśle replikują istotne aspekty śródmózgowia, oferując cenny model do dogłębnego badania procesów rozwojowych śródmózgowia i patofizjologii powiązanych zaburzeń, takich jak choroba Parkinsona. W związku z tym protokół ten służy jako kluczowe źródło informacji dla naukowców dążących do lepszego zrozumienia ludzkiego mózgu i opracowania nowych metod leczenia chorób neurodegeneracyjnych, co czyni go niezbędnym narzędziem w dziedzinie badań neurologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki mózg, ze swoją skomplikowaną architekturą i złożonym składem komórkowym i molekularnym, stanowi ogromne wyzwanie w badaniach neurobiologicznych, szczególnie w kontekście modelowania chorób i rozwoju terapii komórkowej1. Wyzwania te dodatkowo komplikuje ograniczona dostępność zaawansowanych modeli in vitro, które naprawdę reprezentują złożoność ludzkiego mózgu. Jednak niedawne postępy w technologii indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), umożliwiające kontrolowane różnicowanie w określone podtypy neuronów, otworzyły obiecujące możliwości badania rozwoju ludzkiego mózgu, patogenezy chorób i strategii terapeutycznych opartych na komórkach.

Tradycyjnie, dwuwymiarowe (2D) hodowle neuronów pochodzące z iPSC były kamieniem węgielnym badań in vitro mających na celu naśladowanie ludzkiej fizjologii i patologii neuronalnej. Te jednowarstwowe kultury odegrały zasadniczą rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat chorób neurologicznych i odkryciu środków neuroprotekcyjnych2,3,4,5,6,7. Pomimo swojej użyteczności, te systemy 2D nie są w stanie emulować prawdziwej różnorodności komórkowej i trójwymiarowej (3D) struktury ludzkiego mózgu.

Pojawienie się technologii organoidów mózgowych stanowi znaczący krok naprzód w modelowaniu in vitro, dostarczając narzędzia, które ściśle naśladuje skomplikowaną biologię ludzkiego mózgu w fizjologicznie istotnych ramach8. Wczesne techniki rozwoju organoidów mózgowych wykorzystywały wrodzone właściwości regulacyjne iPSC do spontanicznego tworzenia pochodnych ektodermy, naśladując w ten sposób wczesne etapy rozwoju mózgu5,9,10,11,12. Biorąc pod uwagę złożone sieci tworzone przez neurony z innymi komórkami neuronalnymi i nieneuronalnymi, modelowanie 3D staje się niezbędne do dokładnego badania chorób neurodegeneracyjnych. Hodowle 3D zapewniają bardziej reprezentatywne środowisko in vivo, ułatwiając przyspieszone różnicowanie neuronów i tworzenie sieci12,13,14 i promują szerszą ekspresję genów neuronalnych w porównaniu z kulturami 2D15. Neurony rozwinięte w kontekstach 3D osiągają morfologię i atrybuty fizjologiczne bardziej przypominające ich odpowiedniki in vivo16.

Ostatnie osiągnięcia w modelach 3D mózgu były kluczowe w skuteczniejszym uchwyceniu przestrzennej i funkcjonalnej złożoności ludzkiego mózgu. W ciągu ostatniej dekady rozwój różnych protokołów do generowania zarówno organoidów całego mózgu, jak i modeli mózgu specyficznych dla regionu11,17,18,19,20,21,22, okazały się nieocenione w modelowaniu zaburzeń neurologicznych, takich jak małogłowie11, choroba Alzheimera14,23, oraz choroba Parkinsona24. Celem tego protokołu jest opracowanie i udoskonalenie metody tworzenia 3D ludzkich MO pochodzących z ludzkich iPSC. Protokół ten jest specjalnie ukierunkowany na generowanie organoidów, które są wzbogacone o neurony dopaminergiczne i zorganizowane przestrzennie w sposób, który ściśle naśladuje naturalną strukturę i funkcjonalność ludzkiego śródmózgowia. Głównym celem tych organoidów jest służenie jako zaawansowane modele in vitro do badania choroby Parkinsona, zapewniając dokładniejszy i bardziej fizjologicznie istotny system do badania procesów neurorozwojowych i patologii związanych z tym stanem. Wykorzystując iPSC pochodzące od pacjentów do generowania tych specyficznych dla śródmózgowia organoidów, protokół ma na celu lepsze zrozumienie mechanizmów choroby Parkinsona, ułatwienie odkrycia potencjalnych celów terapeutycznych i usprawnienie rozwoju terapii komórkowych. Dzięki temu innowacyjnemu podejściu, protokół ma na celu przezwyciężenie ograniczeń tradycyjnych kultur neuronalnych 2D i znaczący wkład w dziedzinę badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi, oferując potężne narzędzie do modelowania chorób in vitro i badania nowych strategii leczenia.

W ciągu ostatnich 10 lat różne zespoły badawcze opracowały organoidy śródmózgowia (MOs)8,21,25,26,27,28, wykorzystując metodologie, które wykazują kilka kluczowych podobieństw. Dążąc do pogłębienia zrozumienia choroby Parkinsona, opracowaliśmy protokół tworzenia 3D ludzkich MO pochodzących z ludzkich iPSC. Organoidy te, wzbogacone o przestrzennie ułożone neurony dopaminergiczne, stanowią idealny model do badania choroby Parkinsona. Nasz rozwój i udoskonalenie protokołów organoidowych specyficznych dla śródmózgowia zaowocowało zaawansowanymi modelami in vitro, które znacząco przyczyniły się do zrozumienia procesów neurorozwojowych i chorób neurodegeneracyjnych. Modele te, szczególnie w przypadku zastosowania do MO pochodzących od pacjentów, wykazały swoją skuteczność jako potężne narzędzia do modelowania chorób in vitro, oferując nowe perspektywy i metodologie w dziedzinie zaawansowanej hodowli komórek 3D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC wygenerowane z ludzkich normalnych fibroblastów Detroit 551 i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) linii 360, jak wcześniej opisano4. Komórki iPS uzyskano za zgodą Komitetu Badań nad Etycznym Zdrowiem Norwegii Zachodniej REK nr. 2012/919. Wszystkie komórki były regularnie monitorowane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma za pomocą zestawu MycoAlert MycoAlert Mycoplasma Detection Kit. Tabela materiałów zawiera informacje o wszystkich materiałach, odczynnikach i sprzęcie użytym w tym protokole. W tabeli 1 opisano użyte nośniki i inne materiały.

1. Rozmrażanie iPSC

  1. Płytka pokryta matrycą i preparat podłoża essential 8 (E8)
    1. Rozmrozić fiolkę z matrycą błony podstawnej na lodzie przez noc. Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w zimnym Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's F12 DMEM/F12 (1% stężenie końcowe) (patrz Tabela materiałów i Tabela 1). Porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.
    2. Rozmrozić rozcieńczoną błonę podstawną w temperaturze 4 °C; pokryć 6-dołkową płytkę 1 ml roztworu na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Wyjąć płytkę z inkubatora i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej (RT).
      UWAGA: Talerze można przechowywać w lodówce maksymalnie przez 2 tygodnie (przed użyciem należy je podgrzać do temperatury RT). W przypadku dłuższego przechowywania należy dodać 1 ml pożywki E8 (patrz Tabela materiałów i Tabela 1) do powlekanej płytki, aby uniknąć wysychania żelu.
  2. Preparat E8
    1. W sterylnym środowisku połączyć podłoże podstawowe E8 z suplementem E8 (patrz tabela materiałów i tabela 1).
      UWAGA: Można go przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie. Rozmrozić zamrożony suplement E8 przez noc w temperaturze 4 °C przed przygotowaniem pełnego podłoża. Nie rozmrażać w temperaturze 37 °C, ponieważ może to zagrozić jego stabilności. Przed użyciem podgrzej tylko wymaganą objętość medium E8 do temperatury pokojowej (RT), aż przestanie być chłodny w dotyku.

2. Rozsiewanie iPSC

  1. Podgrzej płytki pokryte matrycą i podłoże E8 w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną; przepłukać iPSC, które są przy zbiegu 60%-70%, solą fizjologiczną buforowaną fosforanami Dulbecco bez wapnia i magnezu (DPBS Ca2+/Mg2+-free, 4 ml na studzienkę w płytce 6-dołkowej).
  3. Dodać kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA, 0,5 mM, 1 ml na studzienkę, patrz Tabela Materiałów i Tabela 1); inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania brzegów kolonii (3-5 min).
  4. Zassać roztwór dysocjacyjny; aby odłączyć kolonie, ostrożnie pipetować wstępnie podgrzane podłoże E8 (4 ml na dołek) bezpośrednio na kolonie z większą niż zwykle siłą z pipety, która generuje miejscowy ruch płynu na powierzchni komórki.
  5. Podziel komórki w stosunku 1:2, przenosząc je do dwóch nowych dołków 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą, dodając 2 ml pożywki na dołek. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C.
  6. Wymieniaj się mediami codziennie, aż kolonie osiągną 80% zbieżności.
  7. Używając mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu, obserwuj kolonie, aby upewnić się, że mają odpowiednią wielkość, zwykle charakteryzującą się wyraźnym, okrągłym kształtem o średnicy od 0,5 do 1 mm. Upewnij się, że kolonie są gęstymi, zwartymi strukturami z zarysowanymi, gładkimi granicami.

3. Indukcja neuronalna

  1. Średnie przygotowanie i konfiguracja dnia 0
    1. Przygotować po 500 ml pożywki chemicznie zdefiniowanej (CDM), pożywki do indukcji neuronalnej (NIM) i pożywki wolnej od surowicy nerwowych komórek macierzystych (NSC SF), odnosząc się do Tabeli Materiałów i Tabeli 1.
    2. Opłucz komórki na 6-dołkowej płytce z 4 ml DPBS (1x) (bez Ca2+ / Mg2+- ) na studzienkę, a następnie dodaj 3 ml NIM na dołek do ustawienia dnia 0.
    3. Wymienić NIM (3 ml na studzienkę) w dniach 1, 3 i 5; obserwować codziennie pod mikroskopem.
    4. W dniu 6 odłącz rozety nerwowe od kultury zawiesiny, wykonując następujące czynności.
      1. Delikatnie przemyć raz DPBS (1x) (bez Ca2+/Mg2+) (4 ml na dołek w płytce 6-dołkowej). Dodaj kolagenazę IV (1 ml na dołek w 6-dołkowej płytce) i inkubować przez 1 minutę. Wyjmij kolagenazę dożylną i delikatnie spłucz raz DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 ml na studzienkę w 6-dołkowej płytce).
      2. Dodaj 2 ml pożywki NSC SF do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Odłącz komórki, skrobając dno studzienki, tworząc siatki z końcówką do pipety o pojemności 200 μl.
      3. Przenieść zawiesinę komórek z płytki 6-dołkowej do nieprzywierającego naczynia o średnicy 10 cm. Dostosuj objętość do 12 ml za pomocą NSC SF Medium.
      4. Umieść nieprzylegające naczynie na wytrząsarce (kompaktowa wytrząsarka orbitalna ssm1) z prędkością 85 obr./min pod kątem 0° w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 5% CO2 , aby zapobiec agregacji.

4. Wzór śródmózgowia

  1. W dniu 7 dodać 12 ml CDM ze 100 ng/ml FGF-8b; umieścić w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną.
  2. W dniach 8-13 zmieniaj pożywkę co 2 dni; obserwuj pod mikroskopem codziennie.
  3. W dniu 14 dodać 12 ml CDM ze 100 ng/ml FGF-8b i 1 μM purmorfaminą (PM); umieścić na wytrząsarce orbitalnej.
  4. W dniach 15-20 zmieniaj pożywkę co 2 dni; obserwuj pod mikroskopem codziennie.

5. Osadzanie Matrigelu oraz zakończenie i dojrzewanie MO

  1. Rozmrażać Matrigel na lodzie w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 1-2 godziny
    UWAGA: Rozmrozić odpowiednią ilość Matrigel, aby dostarczyć 15 μl na każde ciało zarodka (EB). Przechowywać Matrigel schłodzony na lodzie, aby uniknąć wczesnej polimeryzacji. Wszystkie plastikowe naczynia, które będą miały kontakt z Matrigelem, schłodzić w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
  2. Umieść sterylny arkusz do osadzania organoidów w pustym naczyniu.
  3. Za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 200 μl delikatnie wyjmij organoid z naczynia i przenieś go na powierzchnię zatapiania z jednym organoidem na studzienkę. Powtarzaj ten proces, aż na powierzchni osadzania zbierze się 12-16 EB.
  4. Ostrożnie usuń nadmiar pożywki z każdego EB, a następnie dodaj kroplami 15 μl zimnego Matrigelu na każdy EB. Za pomocą pipety przesunąć EB do środka kropli Matrigel.
  5. Inkubować płytkę w inkubatorze nastawionym na temperaturę 37 °C przez 15-20 minut, aby umożliwić polimeryzację Matrigelu.
  6. Za pomocą sterylnych kleszczyków podnieś arkusz do zatapiania z kropelkami Matrigel. Trzymaj arkusz bezpośrednio nad jednym dołkiem w 6-dołkowej płycie o bardzo niskiej przyczepności. Odpipetować 3 ml CDM z 10 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i 10 ng/ml neurotroficznego czynnika pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF) i delikatnie spłukać kropelki Matrigel z arkusza do każdej studzienki. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie 6-8 kropelek Matrigel zostanie przeniesionych do jednego dołka.
  7. Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 85 obr./min i wymieniać CDM na 10 ng/ml BDNF i 10 ng/ml GDNF co 3 dni.
    UWAGA: Utrzymuj zróżnicowane kultury przez okres do 3 miesięcy; Morfologia neuronalna pojawia się po 2 tygodniach od zakończenia. BDNF i GDNF nie są konieczne do hodowli trwającej dłużej niż 3 miesiące.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Użyj pipety o pojemności 1 000 μl, aby delikatnie wyjąć organoid z pożywki i delikatnie umieścić go na szkiełku mikroskopowym z minimalną ilością pożywki.
  2. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Dodaj 4% paraformaldehydu (PFA) (300 μl na próbkę) przez 30 minut
    UWAGA: PFA jest niebezpieczny i może mieć właściwości rakotwórcze. Należy obchodzić się z nim ostrożnie, unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą i oczami oraz zapewnić stosowanie w osłonie wyciągów chemicznych.
  3. Dodać 30% roztwór sacharozy (300 μl na próbkę) do szkiełek i pozostawić do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C.
  4. Blokować i przenikać organoidy, dodając bufor blokujący (BB) (300 μl na próbkę), który obejmuje PBS (z Ca2+/Mg2+), 0,3% Triton X-100 i 10% normalnej surowicy koziej, przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C). Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby wyznaczyć organoidy i ograniczyć bufor na szkiełku.
  5. Przykryj próbki odpowiednią objętością przeciwciała pierwszorzędowego w buforze blokującym (300 μl na próbkę), białkiem G1 (FOXG1, 1:200), homeoboksem antyortodynkowym 2 (OTX2, 1:100), pudełkiem anty-Forkhead A2 (FOXA2, 1:100), hydroksylazą anty-tyrozynową (TH, 1:100), anty-SRY (region determinujący płeć Y)-pole 2 (SOX2, 1:100), anty-sparowane białko pudełkowe (PAX6, 1:100) i białko związane z antymikrotubulami 2 (MAP2 1:500), i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności (patrz tabela materiałów).
  6. Umyj próbki w 1x PBS przez 3 godziny z dwiema lub trzema wymianami bufora na delikatnie kołyszącej się platformie.
  7. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (300 μl na próbkę), anty-Alexa Fluor 488 (1:800), anty-Alexa Fluor 594 (1:800) i anty-Alexa Fluor 647 (1:800) przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej ciemni. Dodać jednocześnie barwnik jądrowy Hoechst 33342 (1:5 000) (patrz tabela materiałów).
  8. Usunąć przeciwciało, szybko spłukać PBS, a następnie dodawać PBS zawierający 0,01% azydku sodu przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C w celu zahamowania zanieczyszczenia.
  9. Zassać PBS, usunąć nadmiar roztworu i zamontować organoidy za pomocą podłoża montażowego (patrz Tabela Materiałów). Umieścić szkiełko nakrywkowe, upewniając się, że nie tworzy się pęcherzyków powietrza, i przechowywać w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze suchej przez co najmniej 12 godzin, aby umożliwić pełną polimeryzację podłoża mocującego.
    UWAGA: Próbka jest teraz gotowa do obserwacji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wprowadzamy pionierski protokół do wyprowadzania MO z iPSC. Kluczowym elementem naszej metodologii jest innowacyjne zastosowanie podwójnej inhibicji SMAD, synergistycznie połączonej z FGF-8b i agonistą szlaku sonic hedgehog (SHH) purmorfaminy (PM). To podejście jest przedstawione w Rysunek 1. Proces różnicowania rozpoczyna się od skierowania iPSC w kierunku linii neuroektodermy, tworząc kolonie rozet neuroepitelialnych lub nerwowych. Osiąga się to poprzez podwójne hamowanie syg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu opracowaliśmy metodologię różnicowania MO od iPSC. Nasz protokół wykorzystuje strategię hamowania podwójnego SMAD wzmocnioną czynnikami morfogennymi, w tym FGF-8b i agonistą SHH PM. Takie podejście ściśle symuluje sygnały rozwojowe kluczowe dla ontogenezy śródmózgowia. Wprowadzony przez nas szlak różnicowania skłania do powstawania struktur neuroepitelialnych przypominających rozety nerwowe obserwowane podczas naturalnego rozwoju mózgu. Ta transformacja od kultur dwuwymiarowych do trójwymiarowych neu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 jest tworzony przy użyciu BioRender.com. Dziękujemy University of Bergen Meltzers Høyskolefonds (numer projektu: 103517133), Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson i Gerdt Meyer Nyquists legat (numer projektu: 103816102) za dofinansowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamera mikroskopowa CCD Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Niemcy
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyThermo Fisher Scientific11905031CDM Składnik
Kolagenaza  IVThermo Fisher Scientific17104019Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
Corning  niepoddawane obróbce naczynia hodowlaneSigma-AldrichCLS430589Kultura zawiesinowa 
DMEM/F-12, GlutaMAX suplementThermo Fisher Scientific10565018Różnicowanie astrocytów bazowe
Podłoże DPBSThermo Fisher Scientific14190250Stosowany do różnych płukania kultur komórkowych
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Odczynnik do delikatnej dysocjacji ludzkich iPSC
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Podstawowa pożywka do hodowli iPSC
Suplement Essential 8 (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Suplement do hodowli iPSC
FCCPAbcamab120081Eliminuje potencjał błony mitochondrialnej i barwienie TMRE
FGF-basicPeproTech100-18BSkładnik pożywki do różnicowania astrocytów
System aspiracji płynów Kontrola BVCVacuubrand, Niemcy
Formaldehyd (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Utrwalanie komórek 
GDNFPeprotech450-10DA neurony średni składnik
Geltrex (macierz błony podstawnej)Thermo Fisher ScientificA1413302Służy do mocowania i konserwacji ludzkich iPSC
Suplement GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Suplement do hodowli NSC
Inkubatory CO2 Heracell 150iFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Podłoże podstawowe dla inhibitora CDM
InSolution AMPKSigma-Aldrich171261Pożywka do indukcji neuronalnej
składnik InsulinaRoche1376497składnik CDM
iPSC pochodzące z fibroblatów Detroit 551 ATCCCCL-110
Mikroskop konfokalny Leica TCS SP8 STEDLeica Microsystems, Niemcy
MatrigelLife Science354230Matrigel zatapiający
monotioglicerolSigma-AldrichM6145CDM
Normalna kozia surowicaThermo Fisher ScientificPCN5000Służy do blokowania bufora
Orbital Wytrząsarki - SSM1Stuart Equipment, Wielka Brytania
Arkusz do zatapiania organoidówSTEMCELL Technologies8579zatapiania organoidów Matrigel
STEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Używany do różnych prań
Bromowodorek poli-D-lizynySigma-AldrichP7405Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
Roztwór poli-L-ornitynySigma-AldrichP4957Wspomaga przyczepianie i wzrost komórek nerwowych in vitro
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Montaż szkiełka nakrywkowego do obrazu konfokalnego
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Wspomaga różnicowanie neuronów DA
Rekombinowane ludzkie / mysie białko FGF-8b R& D Systems423-F8-025/CFWspomaga różnicowanie neuronów DA 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPPodłoże do indukcji neuronalnej
Składnik TRITON X-100VWR International9002-93-1Stosowany do przenikania komórek w testach immunologicznych
Kompaktowy wytrząsarka orbitalna SSM1 Norrscope51901-10 SSM1 Wytrząsarka, orbitalna, mini rotator 230 Vdo hodowli organoidów.
Kąpiel wodna Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
strong>Przeciwciała stosowane do barwienia immunologicznego
Primary przeciwciało
anti-DATAbcamab128848, RRID:AB_2665470Królik; 1:100 
anty-FOXA2ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110Królik; 1:100 
anty-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604Królik; 1:200
anty-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684Królik; 1:100 
anty-MAP2Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153Kurczak; 1:500
anty-OTX2ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176Królik; 1:100 
anty-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Królik; 1:100 
przeciwciało drugorzędoweRozcieńczenie (μ L)
  Alexa Fluor  594 kozia anty-królik IgGThermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  488 kozia anty-królicza IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 kozia anty-królicza IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 kozia anty-królicza IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 kozia anty-królicza IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 kozia anty-królicza IgG Thermo Fisher ScientificA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 kozia anty-kurczak IgG Thermo Fisher ScientificA-21469  1:400
Arkusz do < jedn.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463(2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223(2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5(2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555(2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604(2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482(2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podw jna inhibicja SMADszlak Sonic Hedgehogneurony dopaminergiczneczynnik wzrostu fibroblast wtypy kom rek neuroepitelialnychmodelowanie chor brozw j m zguchoroba Parkinsona
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły