Method Article

Analiza elektroforetyczna replikacji przez podatne na strukturę powtórzenia DNA w ludzkim episomie opartym na SV40

DOI:

10.3791/67229

⸱

September 13th, 2024

 , 
1Department of Biology, Tufts University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy procedurę analizy przebiegu replikacji poprzez patogenne, podatne na struktury powtórzenia za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy żelowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwuwymiarowa neutralna/neutralna elektroforeza żelowa (2DGE) pojawiła się jako technika wzorcowa do analizy replikacji DNA przez naturalne przeszkody. Protokół ten opisuje, jak analizować progresję widełek replikacyjnych przez podatne na strukturę, rozszerzalne powtórzenia DNA w episomie opartym na małpim wirusie 40 (SV40) w komórkach ludzkich. Krótko mówiąc, po transfekcji plazmidu do komórek ludzkich, produkty pośrednie replikacji są izolowane za pomocą zmodyfikowanego protokołu Hirta i traktowane enzymem restrykcyjnym DpnI w celu usunięcia niereplikowanego DNA. Produkty pośrednie są następnie trawione przez odpowiednie enzymy restrykcyjne, aby umieścić interesujące nas powtórzenie w początkowo-dystalnej połowie fragmentu DNA o długości 3-5 kb. Półprodukty replikacji są podzielone na dwa prostopadłe wymiary, najpierw według rozmiaru, a następnie według kształtu. Po hybrydyzacji Southern blot, podejście to pozwala naukowcom obserwować zacinanie się wideł w różnych powtórzeniach tworzenia struktury na opadającej połowie łuku replikacji Y. Co więcej, takie pozycjonowanie miejsca przeciągnięcia pozwala na wizualizację różnych wyników powtarzalnego przeciągania wideł, takich jak odwrócenie wideł, nadejście zbieżnego widelca i rekombinacyjne ponowne uruchomienie wideł.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krótkie powtórzenia tandemowe (STR) to małe, zazwyczaj 2-9 par zasad (bp), powtarzające się sekwencje DNA, które stanowią około 3% ludzkiego genomu1. STR odgrywają ważną rolę w regulacji genów2; jednak ich powtarzalny skład sprawia, że są podatne na tworzenie się niekanonicznej struktury drugorzędowej DNA i późniejszą niestabilność genetyczną3,4. Od lewoskrętnych helis, przez spinki do włosów/krzyże, po helisy trzy- i czteroniciowe, te alternatywne struktury DNA powodują wewnętrzne wyzwania dla repliksomu. Naturalnym warunkiem wstępnym tworzenia struktury drugorzędowej jest odwijanie DNA, które jest warunkiem wstępnym replikacji DNA. Stanowi to wyjątkową zagadkę dla funkcjonowania genomu, ponieważ wiele z tych struktur może powstać podczas replikacji, utrudniając postęp replikacji i ostatecznie powodując zatrzymanie widełek replikacyjnych5,6,7, lub w ciężkich przypadkach zapadnięcie się widelca i uszkodzenie DNA8,9. Wykazano, że zarówno ponowne uruchomienie zablokowanych widełek, jak i szlaki naprawy DNA prowadzą do powtarzającej się niestabilności, takiej jak powtarzające się ekspansje10,11 i złożone rearanżacje genomu (CGR)12,13. Zdarzenia te mogą prowadzić do rozwoju około 60 chorób u ludzi znanych jako powtarzające się zaburzenia ekspansji, w tym zespół łamliwego chromosomu X, choroba Huntingtona, ataksja Friedreicha i inne14,15, a także choroby CGR, takie jak zespół Emmanuela16. Dlatego, aby lepiej zrozumieć mechanizmy chorób u ludzi napędzanych niestabilnością powtórzeń, konieczne jest zbadanie szczegółów progresji widełek replikacyjnych przez te powtórzenia.

Technika badania progresji replikacji pojawiła się w połowie lat 80., kiedy Brewer i Fangman starali się dostarczyć bezpośrednich dowodów na to, że inicjacja replikacji u Saccharomyces cerevisiae zachodzi przy autonomicznych elementach sekwencji replikacji (powszechnie znanej jako ARS)17. W ten sposób rozdzielili struktury produktów pośrednich replikacji drożdży w agarozie, adaptując wcześniejszą metodę Bella i Byersa, znaną jako 2-wymiarowa neutralna/neutralna elektroforeza żelowa (2DGE)18. Technika ta wykorzystywała fakt, że nieliniowe DNA przemieszcza się inaczej w żelu agarozowym niż jego liniowy odpowiednik o tej samej masie. Mówiąc dokładniej, w 2DGE wyizolowane DNA jest rozdzielane w dwóch prostopadłych wymiarach, najpierw według rozmiaru, a następnie przede wszystkim według kształtu, aby stworzyć kompleksową mapę replikacji w określonym regionie zainteresowania. W swoim oryginalnym artykule Brewer i Fangman zademonstrowali to jako łuk złożony z "prostych" struktur Y lub widełek replikacyjnych łączących niezreplikowane DNA z ich replikowanymi odpowiednikami. Dalej opisują inne obserwowane produkty pośrednie jako "bąbelki" i "podwójne Y", reprezentujące odpowiednio początki replikacji i zbieżne widełki.

2DGE może być używane do badania względnych populacji produktów pośrednich replikacji DNA w danym czasie. Dlatego, jeśli jedna populacja produktów pośrednich jest bardziej rozpowszechniona niż inna, byłoby to oczywiste po wizualizacji. To sprawia, że 2DGE jest szczególnie przydatnym narzędziem do badania progresji replikacji poprzez trudne sekwencje, takie jak powtórzenia tworzenia struktury. Na przykład, jeśli analizowany region zawiera sekwencję zdolną do wywołania zatrzymania widełek replikacyjnych, przedstawiłoby się to jako wybrzuszenie na łuku (Rysunek 1A), wskazując na akumulację widełek replikacyjnych w tym locus. Można to zaobserwować w replikacji zarówno sekwencji powtórzeń tworzących spinkę do włosów w drożdżach19,20,21 i powtórzeń tworzących triplex w komórkach ludzkich22,23,24. Oprócz opóźnienia, 2DGE może być używany do obserwacji struktur DNA, które nie są zgodne ze standardowym prostym Ys utworzonym podczas replikacji, jak w przypadku rekombinowanych produktów pośrednich25. Te półprodukty mają cięższą i bardziej rozgałęzioną strukturę w kształcie litery X, a zatem poruszają się wolniej zarówno w pierwszym, jak i drugim wymiarze niż standardowe widełki replikacyjne. Podobne wyniki można również zaobserwować w odniesieniu do odwrócenia widełek replikacji20,24,26. Wykazano, że w odpowiedzi na silny stres replikacyjny komórki eukariotyczne wykorzystują odwrócenie widełek replikacyjnych do ratowania zablokowanych wideł. Te odwrócone widelce mają podobną masę cząsteczkową do zablokowanych wideł; jednak ich struktura kurzej stopy powoduje wolniejszą ruchliwość elektroforetyczną w drugim wymiarze w stosunku do ich dopełnień w kształcie litery Y, co skutkuje wydłużeniem w górę i na zewnątrz łuku.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Analiza replikacji DNA za pomocą elektroforezy żelowej 2D. (A) Schemat typowego 2DGE przedstawiający replikację poprzez powtarzanie tworzące strukturę, zdolne do wywołania zablokowania wideł. Pośrednia wielkość i struktura będą miały wpływ na ruchliwość elektroforetyczną. (B) Łuk Y próbki z odpowiednio oznakowanymi ramionami wstępującymi i opadającymi. Skrót: 2DGE = Dwuwymiarowa neutralna/neutralna elektroforeza żelowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oczywiście, jednym z najważniejszych aspektów 2DGE jest jakość i ilość produktów pośrednich replikacji. Jednak rozdzielczość analizy 2DGE replikacji przez endogenne loci w komórkach ssaków jest niewystarczająca dla pojedynczej sekwencji docelowej w obrębie diploidalnego genomu ludzkiego o długości 6 × 109 pz, chociaż przeprowadzono ją dla genów wielokopijnych, takich jak silnie amplifikowany locus DHFR 27 lub rybosomalny RNA28. Replikacja oparta na SV40 jest wydajnym i dobrze scharakteryzowanym sposobem badania replikacji w komórkach eukariotycznych29. Zapewnia niezawodny model replikacji eukariotycznej, który wykorzystuje większość maszynerii replikacji replikosomu gospodarza do replikacji genomu wirusa, który po infekcji jest dzielony na nukleosomy30,31. Dwa godne uwagi wyjątki od replikomu ssaków to to, że antygen T (Tag), zamiast kompleksu CMG gospodarza, służy jako replikacyjna helikaza DNA, a delta polimerazy DNA syntetyzuje zarówno wiodące, jak i opóźnione nici DNA32. Wykorzystaliśmy ten system, umieszczając patogenne odcinki powtórzeń tworzących strukturę poniżej początku replikacji SV40 w plazmidzie, który został pierwotnie utworzony w laboratorium Massimo Lopesa22. Co ważne, plazmid ten zawiera również gen kodujący sam Tag, co skutkuje jego konstytutywną i niezwykle silną replikacją po transfekcji do różnych hodowanych komórek ludzkich. Cecha ta powoduje powstanie dużej ilości produktów, idealnych do analizy 2DGE produktów pośrednich powstających podczas i w odpowiedzi na replikację patogennych powtórzeń w komórkach ludzkich. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodę wizualizacji replikacji powtórzeń tworzących strukturę w ludzkim episomie opartym na SV40 przy użyciu 2-wymiarowej elektroforezy żelowej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Plazmid zaprojektowany do naszej opisanej analizy 2DGE w komórkach ssaków powinien zawierać pochodzenie replikacji SV40 kilka kb przed powtórzeniami podatnymi na strukturę (Rysunek 2). Przy wyborze orientacji względem początku należy pamiętać o syntezie wiodącej i opóźnionej, przy wyborze orientacji względem początku powtórzeń, które powinny być klonowane do plazmidu.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Trawienie plazmidu zawierającego powtórzenia do analizy 2DGE. Powtórzenia podatne na strukturę są przedstawione kilka kb poniżej widełek replikacyjnych poruszających się w prawo. Roztwarzanie za pomocą unikalnych frezów 1 i 2 umieści sekwencję powtórzeń na opadającym ramieniu łuku Y, biorąc pod uwagę, że sekwencja znajduje się poza połową strawionego fragmentu. Skrót: 2DGE = Dwuwymiarowa neutralna/neutralna elektroforeza żelowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Transfekcja plazmidu do komórek ssaków

  1. Wysiewaj 600 000 HEK293T komórek na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej przed transfekcją. Pozostawić komórki do odzyskania sprawności w temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: W tym eksperymencie można użyć wielu linii komórkowych, chociaż w celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się komórki zawierające znacznik SV40. UWAGA: HEK293T komórki są uważane za BSL-2, a wszystkie prace związane z hodowlą powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiedniej techniki aseptyki i odpowiednich środków ochrony osobistej.
  2. Gdy komórki osiągną 60% konfluencji, należy przetransfekować 8 μg plazmidowego DNA zawierającego powtórzenia do komórek nasiennych za pomocą odpowiednich odczynników do transfekcji zgodnie z protokołem producenta.
  3. Jeśli w tym czasie nie izoluje się produktów pośrednich, należy odessać stare pożywki i po 24 godzinach zastąpić je 10 ml świeżej pożywki.
  4. Rozpocznij pobieranie komórek 24-48 godzin po transfekcji.
    1. Odessać pożywkę i ostrożnie przemyć 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odłącz i zbierz komórki za pomocą 0,5 ml trypsyny i wiruj w temperaturze 340 × g przez 4 minuty.
    2. Odessać supernatant i przemyć granulki komórek PBS. Wirować ponownie z prędkością 340 × g przez 4 minuty i odsysać supernatant.
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać przez zamrożenie granulek komórkowych w temperaturze -80 °C. Znaleźliśmy najlepszą rozdzielczość izolującą produkty pośrednie replikacji 48 godzin po transfekcji; Jednak 24 godziny przyniosły realne rezultaty.

2. Izolacja produktów pośrednich replikacji

  1. Ponownie zawiesić komórki w 1,5 ml zmodyfikowanego buforu do lizy Hirta [10 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)] w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i rozpocząć lizę komórek.
    1. Dodać dodecylosiarczan sodu (SDS) do końcowego stężenia 0,6% (około 650 μl 2% SDS) i proteinazę K do końcowego stężenia 100 μg/ml (około 10 μl 20 mg/ml proteinazy K) w celu usunięcia nukleaz.
    2. Delikatnie mieszać pipetując do uzyskania jednorodnej konsystencji i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 90 minut.
  2. Zwiększ stężenie NaCl do 1 M (około 540 μL podstawowego 5 M NaCl) i delikatnie mieszaj do uzyskania jednorodności. Inkubować przez noc (18-24 h) w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie resztek komórkowych, RNA i białka poprzez wysolenie.
    UWAGA: Mieszanina będzie bardzo lepka, więc zachowaj ostrożność i cierpliwość podczas dobrego mieszania.
  3. Następnego dnia oddziel DNA od szczątków komórkowych, RNA i białka.
    1. Odwirować mieszaninę w temperaturze 29 500 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Przenieść supernatant zawierający DNA, dodać jedną objętość fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego 25:24:1 (v/v) i krótko wymieszać do uzyskania jednorodności.
      UWAGA: Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy jest materiałem niebezpiecznym i należy się z nim obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej w dygestoriach chemicznych.
    3. Ponownie odwirować przy 15 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś warstwę wodną do nowej stożkowej rurki.
  4. Wytrącić i umyć wyizolowane DNA.
    1. Dodać jedną objętość czystego izopropanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut. Odwirować DNA w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Zdekantować supernatant i umyć osad zimnym 70% etanolem, aby usunąć nadmiar soli.
    3. Wirować jeszcze raz w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, wysuszyć na powietrzu i delikatnie ponownie zawiesić osad w buforze Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
      UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C; należy jednak unikać cykli zamrażania/rozmrażania, ponieważ może to obniżyć jakość produktów pośrednich replikacji DNA.

3. Przygotowanie próbki i 2-wymiarowa elektroforeza żelowa

  1. Trawienie wyizolowanych produktów pośrednich replikacji plazmidu.
    1. Dodaj 100 jednostek odpowiednich enzymów restrykcyjnych do próbki, aby strawić plazmidowe DNA, w szczególności umieszczając sekwencję zawierającą powtórzenia na początkowo-dystalnej połowie fragmentu liniowego (Rysunek 2). Ponadto dodaj DpnI, aby przeciąć metylowane DNA, usuwając w ten sposób plazmidowe DNA, które nie zostało w pełni zreplikowane w hodowanych komórkach ludzkich.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, enzymy restrykcyjne powinny być unikalnymi frezami, które dają fragment o wielkości 3-5 kb, który umieszcza sekwencję podatną na strukturę na opadającym ramieniu łuku Y.
    2. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 6–10 godzin, aby umożliwić pełne trawienie plazmidu.
    3. Wytrącić DNA za pomocą 2,5 objętości zimnego czystego etanolu i inkubować w temperaturze -20 °C przez noc lub dodać jedną objętość izopropanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Odwirować przefermentowane i wytrącone próbki o masie 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zdekantować supernatant i przemyć próbkę zimnym 70% etanolem. Wirować ponownie w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Zdekantować supernatant, suszyć na powietrzu przez 10 minut i ponownie zawiesić próbki w 15 μl buforu TE.
  2. Przygotuj żel agarozowy pierwszego wymiaru o stężeniu 0,4-0,5% w 1x Tris-boran-EDTA (TBE) (89 mM zasada tris, 89 mM kwas borowy, 2 mM EDTA). Pozostawić roztwór do zestalenia się przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Rozpocznij ładowanie próbek do pierwszego wymiaru.
    1. Załaduj drabinę w odległości pierwszych 3 cm w stosunku do skrajnej lewej krawędzi żelu. Następnie załaduj całość przygotowanych próbek, zachowując 3 cm odstępu między każdą parą.
    2. Uruchom żel w 1x TBE przez 19-24 h przy 0,85 V/cm, aby oddzielić półprodukty pod względem ich wielkości. Upewnij się, że komora jest przykryta, aby chronić próbki przed światłem, które może spowodować uszkodzenie DNA.
  4. Następnego dnia wyjmij żel z buforu i oszacuj położenie strawionego fragmentu liniowego za pomocą linijki.
    1. Wyciąć pierwsze 3 cm żelu zawierającego drabinę i wybarwić segment żelu w 1x TBE zawierającym 0,3 μg/ml bromku etydyny przez 10-15 min. Wizualizacja drabiny za pomocą systemu dokumentacji żelu.
    2. Dodaj 1,3 cm do szacowanej lokalizacji, uzyskując wartość a. Następnie odejmij 7,5 cm od wartości a, uzyskując wartość b. Wyrównaj linijkę z żelem pierwszego wymiaru i przetnij poziomo w poprzek przy wartościach a i b. Następnie odetnij pionowo w dół 3 cm przestrzeni zarezerwowanej dla każdej próbki. Zapoznaj się z Rysunek 3, aby zapoznać się ze schematem wizualnym.
    3. W nowej tacy odlewniczej obróć segmenty zgodnie z ruchem wskazówek zegara i umieść je w pozycji studzienek na próbki (Rysunek 3).
  5. Przygotuj żel agarozowy drugiego wymiaru o stężeniu 1-1,3% w 1x TBE o stężeniu 0,3 μg/ml bromku etydyny.
    1. Po schłodzeniu do temperatury około 55 °C wylać żel drugiego wymiaru na obrócone segmenty pierwszego wymiaru i pozostawić do zestalenia się przez co najmniej 1 godzinę.
    2. Przenieść drugi wymiar do komory z 1x TBE o stężeniu 0,3 μg/ml bromku etydyny i pozostawić żel do zrównoważenia przez co najmniej 30 minut.
    3. Uruchomić żel, ponownie pod przykryciem, przez 9-10 godzin przy 4,23 V/cm w temperaturze 4 °C, aby oddzielić półprodukty pod względem ich kształtu.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Wycięcie produktów pośrednich pierwszego wymiaru przed separacją drugiego wymiaru. Na podstawie wizualizacji drabiny można oszacować ruchliwość niereplikowanych fragmentów. (I) Wartość ta może być następnie wykorzystana do określenia odpowiednich miejsc cięcia (a i b) w celu wycięcia go i jego zreplikowanych odpowiedników (II). Fragment żelu należy następnie obrócić i umieścić w pozycji studzienek do separacji w drugim wymiarze. Skrót: CW = zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Southern blotting i hybrydyzacja za pomocą radioznakowanej sondy

  1. Wyjmij żel drugiego wymiaru z komory i oczyszczaj fragmenty DNA przez 10 minut w roztworze 0,24 M HCl, delikatnie kołysząc. Żel spłukać wodą dejonizowaną i namoczyć w 0,4 M NaOH przez 10-15 min.
    UWAGA: HCl i NaOH są i należy się z nimi obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej w dygestoriach chemicznych.
  2. Rozpocznij montaż Southern blot, aby ułatwić przenoszenie oddzielonych produktów pośrednich z żelu do membrany. Zapoznaj się z Rysunek 4, aby zapoznać się z obszernym schematem.
    1. Napełnić pojemnik o odpowiedniej wielkości 1 litrem 0,4 M NaOH.
    2. Wyrównać długą taflę szkła w poprzek pojemnika i złożyć (wzdłuż długości) dwa długie arkusze bibuły chromatograficznej prostopadle do tafli szkła, rozciągając się do pojemnika NaOH.
    3. Zwilż górną część papieru NaOH i ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza pod jego powierzchnią.
    4. Namocz trzy arkusze bibuły chromatograficznej NaOH i umieść je na złożonym bibułce, ponownie usuwając wszelkie pęcherzyki.
    5. Odwróć żel drugiego wymiaru do góry nogami i przenieś go na papiery.
    6. Zwilż dodatnio naładowaną membranę nylonową (wielkość porów 0,45 μm) wodą DI i umieść ją na żelu.
    7. Na koniec dodaj trzy kolejne arkusze papieru, zwilżone wodą DI, na membranę.
    8. Przykryj odsłonięty NaOH w dolnym pojemniku folią, aby zapobiec parowaniu. Umieść stos serwetek lub ręczników papierowych na plamie, upewniając się, że ma 0,3-0,5 m wysokości. Umieść ciężarek na wierzchu, ściskając całą plamę, aby ułatwić szczelne działanie kapilarne. Odczekaj co najmniej 2 dni, aby DNA przeniosło się do błony.
      UWAGA: Długość i szerokość bibuły chromatograficznej i membrany zależą od wielkości żelu agarozowego użytego do drugiego wymiaru. Aby uzyskać najbardziej efektywny transfer, użyj papieru i membrany o takich samych wymiarach jak żel.
  3. Po przeniesieniu należy usieciować DNA z błoną za pomocą środka sieciującego UV przy 120 μJ/cm2 przez 1 min.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać, umieszczając membranę w hermetycznym, suchym i czystym ochraniaczu na prześcieradło w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć membranę 2x przez 5 min 2x solą fizjologiczną cytrynianu sodu (bufor SSC) (0,3 M NaCl, 0,03 M cytrynian sodu).
  5. Wstępnie zhybrydyzować błonę z 0,18 ml/cm2 buforu hybrydyzacyjnego Churcha i Gilberta [1 mM EDTA, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 M fosforanu sodu, 7% SDS] w temperaturze 65 °C, obracając w inkubatorze hybrydyzacji przez co najmniej 2 godziny
    UWAGA: Błona może ulegać prehybrydyzacji przez kilka dni.
  6. Przygotować sondę znakowaną radioizotopem przy użyciu α-32P, dATP lub dCTP i zestawu do znakowania DNA zgodnie z protokołem producenta.
    UWAGA: Znakowane radioizotopowo dNTP są niebezpieczne, a podczas obchodzenia się z nimi należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Wszystkie prace radioaktywne powinny być wykonywane za osłoną, a przeszkolone osoby powinny być monitorowane pod kątem absorpcji promieniowania za pomocą dozymetrów.
    1. Zaprojektuj liniowy fragment DNA o długości 400-900 pz komplementarny do sekwencji strawionej restrykcyjnie (Rysunek 2) i amplifikuj fragment za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
      UWAGA: Zalecamy posiadanie podstawowego fragmentu PCR o stężeniu 50-100 ng/μL
    2. Połącz 100 ng komplementarnego fragmentu PCR z DNA Pol I, buforem fragmentu Klenowa (3' 5' egzo-) i losowymi oligonukleotydami dekanukleotydowymi.
    3. Denaturować fragment w temperaturze 100 °C przez 10 min.
    4. Do próbki dodać 5 jednostek DNA Pol I, fragment Klenowa (egzo- 3' 5'), 50 μCi α-32P dNTP i 30-50 μmol mieszanki dNTP z niedoborem znakowanego radioaktywnie typu dNTP.
    5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić polimeryzację i włączenie znakowanego radioaktywnie dNTP.
    6. Dodać do próbki 30–50 μmol wcześniej nieobecnego typu dNTP i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    7. Oczyszczać znakowany radioizotopowo fragment za pomocą kolumny wirowej o masie 3 000 × g przez 2 minuty.
  7. Dodać znakowaną radioaktywnie sondę do 50 ml buforu do hybrydyzacji i inkubować z membraną przez noc w temperaturze 65 °C, obracając się w inkubatorze do hybrydyzacji.
  8. Następnego dnia wyjmij sondę i przemyj membranę 2x buforem płuczącym 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) w temperaturze 42 °C i 2x buforem płuczącym 2 (2x SSC, 0,1% SDS) w temperaturze 65 °C.
    UWAGA: Wszystkie mycia należy wykonywać w inkubatorze szybkimi obrotami przez 15 minut.
  9. Suszyć membranę przez 10 minut i umieścić ją w cienkim, przezroczystym ochraniaczu na arkusz. Szczelnie uszczelnioną membranę należy przechowywać w kontrolowanej, odpornej na promieniowanie kasecie z ekranem wrażliwym na luminofor. Pozostaw membranę na działanie ekranu przez 1-10 dni.
  10. Wizualizacja wyników za pomocą obrazowania biomolekularnego ustawionego na obrazowanie luminoforowe. W razie potrzeby umyć i ponownie narazić.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Montaż Southern blot. Obszerny schemat typowego aparatu stosowanego do przenoszenia produktów pośrednich metodą Southern blot z drugiego wymiaru na membranę nylonową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jeśli się powiedzie, po wizualizacji, można zaobserwować ostry łuk widełek replikacyjnych rozciągających się w górę i na zewnątrz od masywnego punktu 1n (Rysunek 5A). Rozmiar fragmentu lub procent, który jest replikowany, określa ruchliwość fragmentu w pierwszym wymiarze. W miarę jak półprodukty rozwijają bardziej połączoną strukturę, zaczną podróżować wolniej w drugim wymiarze. Dlatego, jeśli produkt pośredni przemieszczał się powoli w obu wymiarach, można stwierdzić, że jest to wysoce replikowana cząsteczka ze znaczną zmiennością połączeń w stosunku do konwencjonalnych widełek replikacyjnych. W przypadku syntezy opóźnionej nici powtórzenia (GAA)100, zatrzymanie widełek jest wskazywane przez zaciemniony zdefiniowany punkt na łuku (I), reprezentujący nagromadzenie widełek replikacyjnych po napotkaniu powtórzenia (Rysunek 5B), prawdopodobnie z powodu tworzenia się triplexów. Towarzyszą temu cięższe, bardziej rozgałęzione półprodukty (II i III) powyżej miejsca obory. Charakter tych półproduktów opisaliśmy bardziej szczegółowo w Rastokina et al. 202324. Krótko mówiąc, prawdopodobnie reprezentują one kombinację wideł cofających się w odpowiedzi na przeciągnięcie (II), a także pojawienie się zbieżnego widelca (Rysunek 5B) (III).

Jednym z obserwacji, które można poczynić na podstawie wizualizacji, jest niezbyt idealny, szeroki łuk. W najgorszym przypadku może to oznaczać całkowite podwojenie łuku. Zazwyczaj oznacza to słabe oddzielenie produktów pośrednich w pierwszym wymiarze. Można to przypisać kilku czynnikom, z których najbardziej prawdopodobnym jest zanieczyszczenie solą lub białkiem w próbce pośredniej replikacji. Oczyszczanie fenolu i chloroformu po strawieniu produktów pośrednich, a następnie intensywne mycie 70% etanolem, może zminimalizować to ryzyko. Należy jednak zauważyć, że dodatkowa ekspozycja na fenol może zwiększyć szansę na denaturację produktów pośrednich, które mogą objawiać się jako ciemniejsza intensywność liniowego DNA pod łukiem, reprezentująca zapadnięte produkty pośrednie replikacji (Rysunek 5C).

W najgorszym przypadku wizualizacja może skutkować całkowitym brakiem produktów pośrednich, czego dowodem jest brak łuku (Rysunek 5D). Jest mało prawdopodobne, aby brak łuku był przypisywany zdenaturowanym półproduktom replikacji, ponieważ pod oczekiwanym obszarem łuku nie ma ciemnego miejsca. Biorąc pod uwagę obecność szczególnie małej plamki 1n (IV), ogólna ilość DNA obecna w tym przedstawionym przykładzie jest minimalna, a zatem problem ten może być spowodowany niedostateczną replikacją plazmidu lub ogólnie słabą transfekcją lub izolacją DNA.

figure-results-1
Rysunek 5: Potencjalne wyniki analizy 2DGE. (A) Udana analiza 2DGE replikacji poprzez tworzenie struktury (GAA)100 powtórzeń w HEK293T komórkach. (I) odnosi się do wideł, które utknęły w powtórzeniu, podczas gdy (II) i (III) odnoszą się do bardziej strukturalnych półproduktów, które powstają w odpowiedzi na przeciągnięcie. Ilustracja fragmentu o wielkości 2,7 kb jest przedstawiona powyżej. (B) Reprezentatywne produkty pośrednie, które powstają podczas replikacji powtórzenia (GAA)100. Wykorzystując knockdowny siRNA genów odwrócenia i ponownego uruchomienia widełek replikacyjnych, ustanowiono kontrolę genetyczną w celu zidentyfikowania charakteru tych produktów pośrednich. (C) Przedstawienie nierozwiązanych produktów pośrednich replikacji, które mogą pojawić się, jeśli widełki zostaną zdenaturowane podczas izolacji. (D) Nieudany eksperyment 2DGE, na co wskazuje całkowity brak produktów pośrednich replikacji. IV reprezentuje liniowe, niereplikowane fragmenty strawionego plazmidu. Skrót: 2DGE = Dwuwymiarowa neutralna/neutralna elektroforeza żelowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

2DGE zapewnia półilościowy i kompleksowy obraz względnych populacji produktów pośrednich, które powstają podczas replikacji określonej sekwencji. Biorąc pod uwagę, że delikatne struktury molekularne widełek replikacyjnych muszą być utrzymywane przez cały czas trwania tej procedury, należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec fizycznemu ścinaniu i denaturacji chemicznej. Dlatego zdecydowanie zaleca się unikanie wszelkich zabiegów alkalicznych podczas izolacji plazmidu. Aby tego uniknąć, my i inni wdrożyliśmy zmodyfikowaną formę izolacji DNA Hirta, ustaloną przez Hirta w 1967roku33. Tutaj DNA jest oddzielane od białek, RNA i innych szczątków komórkowych poprzez traktowanie lizatu komórkowego 1 M NaCl w temperaturze 4 °C przez noc. Chociaż metoda ta okazała się wyjątkowa w zakresie zachowania jakości produktów pośrednich replikacji, nie wydaje się, aby w pełni oddzieliła plazmidowe DNA od genomowego DNA. Należy o tym pamiętać podczas projektowania sekwencji do sondowania znakowanego radioizotopowo, ponieważ zaprojektowana sonda nie powinna mieć dużego podobieństwa sekwencji do jakiegokolwiek genomowego DNA, aby jak najlepiej uniknąć wiązania poza celem. Co więcej, integralność produktów pośrednich replikacji może być znacznie zwiększona poprzez sieciowanie UV-psoralen. W tym przypadku komórki mogą być inkubowane z psoralenem przez kilka minut w ciemności, a następnie naświetlane promieniowaniem UV przy 366 nm34, tworząc w ten sposób wiązania kowalencyjne między cząsteczkami DNA. Oprócz wzmocnienia spoistości struktur pośrednich, może to również złagodzić wszelkie obawy związane z tworzeniem się struktur podczas izolacji, a nie in vivo.

Jednym z aspektów, który należy wziąć pod uwagę podczas projektowania tego eksperymentu, jest wielokrotne umieszczanie na rozwiązanym łuku końcowym. Pierwsza połowa łuku rozciągająca się od punktu 1n jest oznaczona jako ramię wstępujące, podczas gdy druga połowa jest znana jako ramię opadające (ryc. 1B). Aby zaobserwować zatrzymanie widełek replikacyjnych, powinno wystarczyć ponowne umieszczenie na dowolnym ramieniu łuku. Jednak, aby zaobserwować bardziej ustrukturyzowane produkty pośrednie, które powstają w sekwencjach powtórzeń, takie jak połączenia poreplikacyjne, zalecamy umieszczenie sekwencji powtórzeń na ramieniu zstępującym. Wynika to w dużej mierze z wolniejszej ruchliwości elektroforetycznej tych produktów pośrednich w obu wymiarach, co może skutkować komigracją z prostymi strukturami Ys na dalszym etapie ich postępu, jeśli sekwencja zawierająca powtórzenia zostanie umieszczona na ramieniu wstępującym, utrudniając w ten sposób jakąkolwiek szczegółową analizę. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, zalecamy umieszczenie sekwencji powtórzeń w zakresie od 60% do 90% w interesującym fragmencie w stosunku do początku replikacji.

Dbałość o szczegóły powinna być wykorzystana podczas etapu transferu DNA i późniejszej obróbki błony. Niezwykle ważne jest, aby Southern blot był złożony w sposób ułatwiający równomierny i ścisły transfer DNA do błony. Oznacza to, że wszystkie elementy transferu są wolne od pęcherzyków powietrza, a urządzenie jest jednolite na całej swojej powierzchni. Aby w tym pomóc, standardowo odwraca się żel drugiego wymiaru przed dodaniem go do Southern blot. Zakłada się, że spód żelu jest bardziej płaski niż góra; dlatego odwrócenie żelu zapewnia możliwie najpłynniejszy transfer DNA do błony.

Jeśli w końcowej rozdzielczości plamy obecne jest silne tło, może to wskazywać na niespecyficzne wiązanie sondy znakowanej radioizotopem. Można temu zaradzić na wiele sposobów. Po pierwsze, należy sprawdzić, czy sonda nie zawiera dużego podobieństwa sekwencji do jakiegokolwiek genomowego DNA. Można to łatwo zweryfikować za pomocą narzędzia Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), które jest łatwo dostępne na stronie internetowej NIH35. W przeciwnym razie niespecyficznie związane sondy można usunąć poprzez dodatkowe rygorystyczne mycie. Zalecamy rozpoczęcie od dwóch dodatkowych płukań buforem 1 (0,1x SSC, 0,1% SDS) w temperaturze 42 °C w odstępach 15-minutowych każde; Jednak może być konieczne więcej prań. Wreszcie, temperatura, w której zachodzi hybrydyzacja, może również ulec zmianie. W przypadku większości sond zawierających zawartość G/C 40-60%, 65 °C wydaje się być wystarczające, chociaż nie jest to wartość statyczna. Skuteczne wiązanie sondy zależy od jej temperatury topnienia i dlatego może wymagać zmian temperatury hybrydyzacji.

Biorąc pod uwagę, że 2DGE zapewnia przegląd względnych populacji produktów pośrednich replikacji w danym czasie, jedną z jego największych wad jest to, że nie zapewnia silnej miary czasu progresji replikacji. W tym celu zalecamy stosowanie analizy pojedynczych cząsteczek, takiej jak czesanie DNA. Ponadto, podczas gdy 2DGE pozwala na analizę produktów pośrednich replikacji, które powstają w odpowiedzi na opóźnienie, konieczne jest ustanowienie kontroli genetycznej w celu odkrycia ich dokładnej tożsamości, co może nastąpić w odpowiednim czasie. Chociaż mikroskopia elektronowa jest kosztowna, nadal lepsza w identyfikacji dokładnej struktury cząsteczek DNA.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jorge Cebrianowi i Anastasii Rastokinie, którzy rozpoczęli rozwój tego podejścia w naszym laboratorium, Massimo Lopesowi za dostarczenie nam plazmidu pML113 i bezcennych porad, Ylli Doksani za wnikliwe dyskusje, oraz członkom laboratorium Mirkin za ich wsparcie. Prace w laboratorium Mirkin są wspierane przez National Institute of General Medical Sciences [R35GM130322] oraz NSF-BSF [2153071].

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x Bufor TBEBio Rad1610733
20x Bufor SSCFisher ScientificBP1325-1
Komórki 293TATCCCRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol RevvityBLU512H250UC
Agaroza FisherScientificBP160-500
Amersham Hybond-N+Fisher ScientificRPN303B
BAS Magazynowanie ekranów luminoforowychFisher Scientific28956482
Church i bufor hybrydyzacyjny GibertaFisher Scientific50-103-5408
Etykietowanie DNA DecaLabel zestawThermoFisher ScientificK0622
DMEM, wysoka gluktoza, suplement GltaMAX, pirogronianThermoFisher Scientific10569010
DpnINew England BiolabsR0176SNależy również zakupić dodatkowe enzymy restrykcyjne
EDTA 0,5 M, pH 8Fisher ScientificBP2482500
Etanol, 70%Fisher Scientific
Płodowa surowica bydlęca VWR97068-085
Roztwór kwasu solnego, 12 MMillipore Sigma13-1683
IsopropanolFisher ScientificBP26184
Odczynnik do transfekcji DNA i siRNA jetPRIME z buforemVWR101000027
MycoZap Plus-CLVWR75870-448
NaClMillipore Sigma746398-500G
Probówki wirówkowe szybkoobrotowe Nalgene Oak RidgeThermoFisher Scientific3139-0050
Bufor fosforanowy Solanka, pH 7,4ThermoFisher Scientific10010023
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna, pH 7,5ThermoFisher Scientific10010024
Proteinaza KThermoFisher ScientificEO0491
Proteinaza KThermoFisher ScientificEO0492
Bibuła do chromatografii z czystej celulozyFisher Scientific05-714-4
Bibuła do chromatografii z czystej celulozyFisher Scientific05-714-5
LinijkaFisher Scientific09-016
SkalpelFisher Scientific12-460-451
DodecylosiarczansoduMillipore Sigma436143-25G
Wodorotlenek soduFisher ScientificS25548
Wirówka superszybka Sorval LYNX 4000ThermoFisher Scientific75006580
Subkomórkowy system elektroforezy poziomejBio Rad1704401
TH13-6 x 50 Wahadłowy wirnik kubełkowyThermoFisher Scientific75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7,5Fisher ScientificBP1757-500
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaThermoFisher Scientific25200056
BP82031GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).">Liao, X., et al. Repetitive DNA sequence detection and its role in the human genome. Commun Biol. 6 (1), 1-21 (2023).
  2. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).">Fotsing, S. F., et al. The impact of short tandem repeat variation on gene expression. Nat Genet. 51 (11), 1652-1659 (2019).
  3. A brief review of short tandem repeat mutation. GPB. 5 (1), 7-14 (2007).">Fan, H., Chu, J. -Y. A brief review of short tandem repeat mutation. GPB. 5 (1), 7-14 (2007).
  4. On the wrong DNA track: Molecular mechanisms of repeat-mediated genome instability. J Biol Chem. 295 (13), 4134-4170 (2020).">Khristich, A. N., Mirkin, S. M. On the wrong DNA track: Molecular mechanisms of repeat-mediated genome instability. J Biol Chem. 295 (13), 4134-4170 (2020).
  5. Trinucleotide repeats affect DNA replication in vivo. Nat Genet. 17 (3), 298-304 (1997).">Samadashwily, G. M., Raca, G., Mirkin, S. M. Trinucleotide repeats affect DNA replication in vivo. Nat Genet. 17 (3), 298-304 (1997).
  6. Large-scale contractions of Friedreich's ataxia GAA repeats in yeast occur during DNA replication due to their triplex-forming ability. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (3), 1628-1637 (2020).">Khristich, A. N., Armenia, J. F., Matera, R. M., Kolchinski, A. A., Mirkin, S. M. Large-scale contractions of Friedreich's ataxia GAA repeats in yeast occur during DNA replication due to their triplex-forming ability. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (3), 1628-1637 (2020).
  7. Large-scale expansions of Friedreich's ataxia GAA repeats in yeast. Mol Cell. 35 (1), 82-92 (2009).">Shishkin, A. A., et al. Large-scale expansions of Friedreich's ataxia GAA repeats in yeast. Mol Cell. 35 (1), 82-92 (2009).
  8. Double-strand break repair pathways protect against CAG/CTG repeat expansions, contractions and repeat-mediated chromosomal fragility in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 184 (1), 65-77 (2010).">Sundararajan, R., Gellon, L., Zunder, R. M., Freudenreich, C. H. Double-strand break repair pathways protect against CAG/CTG repeat expansions, contractions and repeat-mediated chromosomal fragility in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 184 (1), 65-77 (2010).
  9. Chromosome fragility at GAA tracts in yeast depends on repeat orientation and requires mismatch repair. EMBO J. 27 (21), 2896-2906 (2008).">Kim, H. -M., et al. Chromosome fragility at GAA tracts in yeast depends on repeat orientation and requires mismatch repair. EMBO J. 27 (21), 2896-2906 (2008).
  10. Role of recombination and replication fork restart in repeat instability. DNA Repair. 56, 156-165 (2017).">Polleys, E. J., House, N. C. M., Freudenreich, C. H. Role of recombination and replication fork restart in repeat instability. DNA Repair. 56, 156-165 (2017).
  11. Restarted replication forks are error-prone and cause CAG repeat expansions and contractions. PLoS Genet. 17 (10), e1009863(2021).">Gold, M. A., et al. Restarted replication forks are error-prone and cause CAG repeat expansions and contractions. PLoS Genet. 17 (10), e1009863(2021).
  12. Homologous recombination restarts blocked replication forks at the expense of genome rearrangements by template exchange. Mol Cell. 39 (3), 346-359 (2010).">Lambert, S., et al. Homologous recombination restarts blocked replication forks at the expense of genome rearrangements by template exchange. Mol Cell. 39 (3), 346-359 (2010).
  13. Mechanisms of structural chromosomal rearrangement formation. Mol Cytogenet. 15 (1), 23(2022).">Burssed, B., Zamariolli, M., Bellucco, F. T., Melaragno, M. I. Mechanisms of structural chromosomal rearrangement formation. Mol Cytogenet. 15 (1), 23(2022).
  14. Repeat expansion diseases. Handb Clin Neurol. 147, 105-123 (2018).">Paulson, H. Repeat expansion diseases. Handb Clin Neurol. 147, 105-123 (2018).
  15. Molecular mechanisms underlying nucleotide repeat expansion disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (9), 589-607 (2021).">Malik, I., Kelley, C. P., Wang, E., Todd, P. Molecular mechanisms underlying nucleotide repeat expansion disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (9), 589-607 (2021).
  16. GeneReviews®. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).">Emanuel, B. S., Zackai, E. H., Medne, L. Emanuel Syndrome. GeneReviews®. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle, Seattle, WA. (1993).
  17. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).">Brewer, B. J., Fangman, W. L. The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae. Cell. 51 (3), 463-471 (1987).
  18. Separation of branched from linear DNA by two-dimensional gel electrophoresis. Anal Biochem. 130 (2), 527-535 (1983).">Bell, L., Byers, B. Separation of branched from linear DNA by two-dimensional gel electrophoresis. Anal Biochem. 130 (2), 527-535 (1983).
  19. Replication stalling at unstable inverted repeats: Interplay between DNA hairpins and fork stabilizing proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (29), 9936-9941 (2008).">Voineagu, I., Narayanan, V., Lobachev, K. S., Mirkin, S. M. Replication stalling at unstable inverted repeats: Interplay between DNA hairpins and fork stabilizing proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (29), 9936-9941 (2008).
  20. Differential requirement of Srs2 helicase and Rad51 displacement activities in replication of hairpin-forming CAG/CTG repeats. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4519-4531 (2017).">Nguyen, J. H. G., et al. Differential requirement of Srs2 helicase and Rad51 displacement activities in replication of hairpin-forming CAG/CTG repeats. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4519-4531 (2017).
  21. Trinucleotide Repeat Protocols. Kohwi, Y. , Humana Press. Totowa, NJ. (2004).">Krasilnikova, M. M., Mirkin, S. M. Analysis of triplet repeat replication by two-dimensional gel electrophoresis. Trinucleotide Repeat Protocols. Kohwi, Y. , Humana Press. Totowa, NJ. (2004).
  22. Friedreich's ataxia-associated GAA repeats induce replication-fork reversal and unusual molecular junctions. Nat Struct Mol Biol. 20 (4), 486-494 (2013).">Follonier, C., Oehler, J., Herrador, R., Lopes, M. Friedreich's ataxia-associated GAA repeats induce replication-fork reversal and unusual molecular junctions. Nat Struct Mol Biol. 20 (4), 486-494 (2013).
  23. Effects of Friedreich's ataxia GAA repeats on DNA replication in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 40 (9), 3964-3974 (2012).">Chandok, G. S., Patel, M. P., Mirkin, S. M., Krasilnikova, M. M. Effects of Friedreich's ataxia GAA repeats on DNA replication in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 40 (9), 3964-3974 (2012).
  24. Large-scale expansions of Friedreich's ataxia GAA•TTC repeats in an experimental human system: role of DNA replication and prevention by LNA-DNA oligonucleotides and PNA oligomers. Nucleic Acids Res. 51 (16), 8532-8549 (2023).">Rastokina, A., et al. Large-scale expansions of Friedreich's ataxia GAA•TTC repeats in an experimental human system: role of DNA replication and prevention by LNA-DNA oligonucleotides and PNA oligomers. Nucleic Acids Res. 51 (16), 8532-8549 (2023).
  25. Visualization of recombination-mediated damage-bypass by template switching. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 884-892 (2014).">Giannattasio, M., et al. Visualization of recombination-mediated damage-bypass by template switching. Nat Struct Mol Biol. 21 (10), 884-892 (2014).
  26. Pathogenic CANVAS (AAGGG)n repeats stall DNA replication due to the formation of alternative DNA structures. Nucleic Acids Res. 52 (8), 4361-4374 (2024).">Hisey, J. A., et al. Pathogenic CANVAS (AAGGG)n repeats stall DNA replication due to the formation of alternative DNA structures. Nucleic Acids Res. 52 (8), 4361-4374 (2024).
  27. Characterizing replication intermediates in the amplified CHO dihydrofolate reductase domain by two novel gel electrophoretic techniques. Mol Cell Biol. 16 (9), 4923-4931 (1996).">Kalejta, R. F., Lin, H. B., Dijkwel, P. A., Hamlin, J. L. Characterizing replication intermediates in the amplified CHO dihydrofolate reductase domain by two novel gel electrophoretic techniques. Mol Cell Biol. 16 (9), 4923-4931 (1996).
  28. Initiation and termination of DNA replication in human rRNA genes. Mol Cell Biol. 13 (10), 6600-6613 (1993).">Little, R. D., Platt, T. H., Schildkraut, C. L. Initiation and termination of DNA replication in human rRNA genes. Mol Cell Biol. 13 (10), 6600-6613 (1993).
  29. SV40 DNA replication: From the A gene to a nanomachine. Virology. 384 (2), 352-359 (2009).">Fanning, E., Zhao, K. SV40 DNA replication: From the A gene to a nanomachine. Virology. 384 (2), 352-359 (2009).
  30. Structure of replicating simian virus 40 minichromosomes: The replication fork, core histone segregation and terminal structures. J Mol Biol. 189 (1), 189-204 (1986).">Sogo, J. M., Stahl, H., Koller, T., Knippers, R. Structure of replicating simian virus 40 minichromosomes: The replication fork, core histone segregation and terminal structures. J Mol Biol. 189 (1), 189-204 (1986).
  31. The replication protein A binding site in simian virus 40 (SV40) T antigen and its role in the initial steps of SV40 DNA replication. J Virol. 72 (12), 9771-9781 (1998).">Weisshart, K., Taneja, P., Fanning, E. The replication protein A binding site in simian virus 40 (SV40) T antigen and its role in the initial steps of SV40 DNA replication. J Virol. 72 (12), 9771-9781 (1998).
  32. A Wolf in sheep's clothing: SV40 co-opts host genome maintenance proteins to replicate viral DNA. PLoS Pathog. 8 (11), e1002994(2012).">Sowd, G. A., Fanning, E. A Wolf in sheep's clothing: SV40 co-opts host genome maintenance proteins to replicate viral DNA. PLoS Pathog. 8 (11), e1002994(2012).
  33. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2024).">National Library of Medicine: National Center for Biotechnology Information. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool. , https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2024).
  34. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).">Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
  35. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Mol Cell. 21 (1), 15-27 (2006).">Lopes, M., Foiani, M., Sogo, J. M. Multiple mechanisms control chromosome integrity after replication fork uncoupling and restart at irreparable UV lesions. Mol Cell. 21 (1), 15-27 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA ReplicationStructure Prone RepeatsTwo Dimensional GelReplication Fork StallingSouthern BlotSV40 EpisomeHuman CellsRestriction Enzyme DigestionFork ReversalGel Electrophoresis

Related Articles