Artykuł metodologiczny

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67232

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) uwalniane przez mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zawierają zestaw mikroRNA pełniących funkcje regeneracyjne i przeciwzapalne. W związku z tym oczyszczone MSC-EV są postrzegane jako opcja terapeutyczna nowej generacji dla szerokiego spektrum chorób. W tym protokole przedstawiamy strategię skutecznego sortowania EV od supernatantu MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), często stosowanych w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej w ortopedii.

Najpierw opisaliśmy przygotowanie próbki, skupiając się na etapach izolacji EV i znakowania estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE) do wykrywania fluorescencji; następnie szczegółowo opisaliśmy proces sortowania, który stanowi główną część protokołu.

Oprócz zasad określonych w wytycznych MISEV 2023 i MIFlowCyt EV, zastosowaliśmy specyficzne warunki eksperymentalne dotyczące rozmiaru dyszy, częstotliwości i ciśnienia w osłonie. Parametry morfologiczne ustala się za pomocą koralików o średnicach dobranych tak, aby pokrywały teoretyczny zakres wielkości EV. Po sortowaniu ASC-EVs przeprowadziliśmy kontrolę czystości posortowanej frakcji, ponownie analizując ją za pomocą sortera i weryfikując rozkład wielkości EV za pomocą techniki analizy śledzenia nanocząstek.

Ze względu na rosnące znaczenie pojazdów elektrycznych, posiadanie czystej populacji do zbadania i scharakteryzowania staje się kluczowe. W tym miejscu przedstawiamy zwycięską strategię, aby skonfigurować sortowanie, aby osiągnąć ten cel.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna grupa pęcherzyków o strukturze błonowej, uwalnianych przez prawie wszystkie komórki, oddzielonych dwuwarstwą lipidową, niezdolnych do samodzielnej replikacji1. Można je znaleźć w kilku płynach biologicznych, takich jak osocze krwi, surowica, ślina, mleko matki, mocz, płyn z płukania oskrzeli, płyn owodniowy, płyn mózgowo-rdzeniowy i wodobrzusze złośliwe2. Jedną z głównych funkcji EV jest transport różnych cząsteczek, w tym kwasów nukleinowych, białek, lipidów i węglowodanów, między komórką dawcy a biorcą. Może się to zdarzyć poprzez różne mechanizmy, takie jak bezpośrednia fuzja błony, interakcja receptor-ligand, endocytoza i fagocytoza3,4. Z tego powodu wykazano, że odgrywają one ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych i są bardzo obiecujące jako nowe biomarkery choroby, jako nośniki dostarczania leków i jako środki terapeutyczne5,6.

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) to komórki multipotencjalne, które można wyizolować z wielu tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, miazgi zębowej, krwi pępowinowej, łożyska, płynu owodniowego, galaretki Whartona, a nawet mózgu, płuc, grasicy, trzustki, śledziony, wątroby i nerek. W ostatnich latach wzbudziły one spore zainteresowanie medycyną regeneracyjną7. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) mogą być pobierane z tkanki tłuszczowej za pomocą mniej inwazyjnej procedury w porównaniu z innymi źródłami, takimi jak szpik kostny, co skutkuje niższym ryzykiem poważnych powikłań i unikaniem problemów etycznych8.

Dodatkowo, tkanka tłuszczowa zawiera znacznie wyższe stężenie MSCs niż szpik kostny (1% w porównaniu do >0,01%) i inne źródła, takie jak skóra właściwa, miazga zębowa, pępowina i łożysko. MSCs odgrywają kluczową rolę w regeneracji uszkodzonych tkanek i komórek ze względu na ich zdolność do różnicowania i wydzielania szerokiego repertuaru czynników wzrostu, chemokin i cytokin; Te korzyści terapeutyczne wynikają z ich zdolności różnicowania, ale także z faktu, że wydzielają szeroki repertuar czynników wzrostu, chemokin i cytokin. Uderzającym przykładem jest potencjał terapeutyczny MSCs w przypadku schorzeń ortopedycznych, przy czym termin "choroby układu mięśniowo-szkieletowego" ma większą liczbę zarejestrowanych badań klinicznych w ramach clinicaltrials.gov (dostęp 13 maja 2024 r.).>

Ponadto, MSC mogą również wydzielać EVs, które biorą udział w regeneracji tkanek poprzez przekazywanie informacji do uszkodzonych komórek lub tkanek i wywierają aktywność biologiczną podobną do komórek macierzystych9,10. Z tego powodu MSC-EVs mogą być cennym substytutem terapii komórkowej w celu osiągnięcia podejścia bezkomórkowego11, z dwoma badaniami klinicznymi z udziałem MSC-EV w schorzeniach ortopedycznych (NCT05261360 i NCT04998058). Nadal jednak istnieje kilka wyzwań związanych z klinicznymi zastosowaniami pojazdów elektrycznych. Na przykład istnieją pewne obawy dotyczące technik izolacji pojazdów elektrycznych: większość z nich nie gwarantuje czystości ani integralności pęcherzyków. Co więcej, niektóre techniki izolacji są złożone, czasochłonne i mają niską powtarzalność, co czyni je nieodpowiednimi do użytku klinicznego12.

Sortowanie komórek, z drugiej strony, jest powszechnie stosowaną metodą, która pozwala na izolację pojedynczych komórek od heterogenicznych zawiesin komórkowych przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych13. Może być używany do wielu zastosowań i dostosowany do różnych typów próbek. Jednakże, chociaż sortowanie komórek jest dobrze ugruntowaną i szeroko stosowaną technologią, sortowanie EV jest nadal bardzo trudne, ponieważ większość EV znajduje się poniżej minimalnego progu wykrywalności nawet dla najbardziej czułych cytometrów przepływowych. Istnieje kilka cech, które sprawiają, że sorter jest bardziej odpowiedni do tego celu. Po pierwsze, zastosowanie systemu Jet-in-air, w którym strumień zawieszający cząstki jest badany przez lasery w powietrzu, a nie w komorze przepływowej; System ten zachowuje próbkę poprzez zmniejszenie naprężeń, którym jest poddawana. Drugim ważnym punktem jest obecność paska "zaciemniającego" między strumieniem a soczewką zbierającą, która zmniejsza szum optyczny tła instrumentu. Chociaż jest niski, szum tła nie jest całkowicie wyeliminowany i stanowi odniesienie, które zapewnia częściowy wgląd w zdarzenia, które mieszczą się w progu: jest to bardzo ważne dla analizy zdarzeń, które są bliskie "granicy wykrywalności" instrumentu14. Wreszcie, sortownik jest wyposażony w dwuścieżkowe rozproszenie do przodu (FSC) z dwiema różnymi maskami, które pozwalają na lepszą dyskryminację małych i dużych cząstek w próbce.

Na tej podstawie opracowaliśmy protokół mający na celu oddzielenie estrów sukcynimidylowych karboksyfluoresceiny (CFSE) oznaczonych MSC-EV za pomocą sortera komórek o wysokiej czułości. Aby zminimalizować manipulację pojazdami elektrycznymi oraz zachować ich integralność i ilość, uniknęliśmy etapów ultrawirowania podczas przygotowywania próbki. Ponadto dostosowano warunki sortowania w celu zminimalizowania naprężeń pęcherzyków, w tym dalszej optymalizacji naszego urządzenia poprzez zmniejszenie ciśnienia sortowania związanego z rozmiarem dyszy (dysza 70 μm przy ciśnieniu 35 psi).

Protokół

Protokół składa się z czterech części: (1) przygotowanie próbek, (2) charakterystyka ASC-EVs, (3) sortowanie ASC-EVs oraz (4) analiza po sortowaniu. Schemat przedstawiający przebieg pracy pokazano na Rysunku 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat protokołu. Schemat przedstawia etapy zawarte w protokole: (1) przygotowanie próbek, (2) charakterystyka pęcherzyków przed sortowaniem, (3) sortowanie oraz (4) analiza pęcherzyków po sortowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbek

  1. Zbiór nadnadkładki wzbogaconej w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV)
    1. Odmrozić lub zebrać mezenchymalne komórki macierzyste z tkanki tłuszczowej (ASC), które były hodowane w pasażu poprzedzającym zbiór EV (zazwyczaj pasaż 1–5), i zasiać dla każdego izolatu ASC identyczną liczbę komórek (np. 1 milion komórek na 175 cm2 powierzchni kolby pozwala uzyskać około 60%–70% konfluencji).
    2. Hodować ASC w odpowiedniej pożywce (dla tego protokołu DMEM-F12) uzupełnionej o płodową surowicę bydlęcą (FBS) wolną od EV lub ludzki lizat płytek krwi (hPL), zgodnie z wybranym protokołem, przez 48–72 h.
      1. Aby uzyskać FBS lub hPL wolne od EV, przeprowadzić ultrawirowanie przy 120 00 x g przez noc w temperaturze 4 °C i wykorzystać nadnadkładkę.
        UWAGA: Od tego momentu wskazana siła odśrodkowa jest zawsze rozumiana jako średnia dla użytego urządzenia, rotora i probówek. Należy pamiętać, że różne rotory lub probówki mogą mieć zmienną wartość g-force w przeliczeniu na rpm oraz różny współczynnik k. Aby łatwo porównać rotory i dostosować siłę g oraz prędkość, należy skorzystać z jednej z dostępnych tabel konwersji https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator.
    3. Przy 90% konfluencji komórek odłączyć i przeliczyć ASC, a następnie zawiesić w odpowiedniej objętości pożywki bezsurowiczej, optymalnie 1 mL na 1 x 106 ASC. Zasiać zawiesinę ASC na płytkach 24-dołkowych w ilości 1 mL na dołek. Bez surowicy komórki pozostaną w zawiesinie i utworzą sferoidy. Po 96 h zebrać nadnadkładkę.
    4. Usunąć pływające komórki i resztki poprzez szeregowe wirowanie w temperaturze 4 °C: 40 x g przez 10 min, 1 0 x g przez 10 min, 2 0 x g przez 10 min oraz dwukrotnie 4 0 x g przez 10 min.
    5. Przefiltrować nadnadkładkę przez filtr 0,2 µm, aby usunąć pozostałe cząstki większe niż 20 nm.
      UWAGA: Użyć natychmiast do dalszych zastosowań lub przechowywać maksymalnie przez jedną noc w temperaturze 4 °C bądź zamrozić w temperaturze -80 °C, jeśli kolejne etapy nie zostaną wykonane w ciągu 24 h.
  2. Barwienie EV do sortowania
    1. Przygotować 5 mM roztwór 5(6)-karboksyfluoresceiny diacetanu N-sukcynimidylowego (CFSE). Używać go świeżo przygotowanego lub przechowywać w zamrożeniu przy -20 °C, chroniąc przed światłem.
    2. Przejść bezpośrednio z kroków 1.1.1–1.1.5 (w ciągu 24 h) lub rozmrozić przechowywane w -80 °C nadnadkładki zawierające EV w temperaturze 4 °C.
    3. Przed barwieniem ogrzać nadnadkładki do 37 °C i dodać CFSE do uzyskania stężenia końcowego 10 µM (rozcieńczenie 50-krotne). Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C w ciemności.
    4. W czasie inkubacji dodać 2 mL PBS do koncentratora odśrodkowego (membrana z regenerowanej celulozy, MWCO 10 kDa), zamknąć i wirować przy 4 00 x g przez 10 min w rotorze z koszykami typu swing-out. Usunąć niefiltrowany PBS z dna urządzenia filtrującego i odessać filtrat z probówki zbiorczej.
      UWAGA: Opisany protokół ultrafiltracji odśrodkowej opiera się na przetwarzaniu do 15 mL próbki (objętość maksymalna).
    5. Dodać do 15 mL próbki do koncentratora odśrodkowego i zamknąć urządzenie. Wirować przy 4 0 x g do 30 min.
      UWAGA: Pozwoli to uzyskać końcową próbkę o objętości średnio 50 µL. Jednak w zależności od czynników takich jak natura próbki i szybkość przepływu, czas wirowania wymagany do osiągnięcia pożądanej koncentracji może się różnić.
    6. Wyjąć urządzenie z wirówki i opróżnić probówkę zbiorczą. Dodać 14 mL PBS do urządzenia filtrującego. Wirować przy 4 00 x g do 30 min.
    7. Powtórzyć krok 1.2.6.
    8. Odzyskać z urządzenia filtrującego skoncentrowaną próbkę EV zabarwionych CFSE (około 50 µL) i przechowywać 10 µL w temperaturze 4 °C w ciemności, kontynuując sortowanie pozostałej części próbki.

2. Charakterystyka ASC-EVs

  1. Analiza Western blot markerów EV
    1. Pellet ASC (1 x 106) przy 376 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej, a następnie zawiesić w odpowiednim buforze do lizy uzupełnionym o inhibitory proteaz. Przeprowadzić oznaczanie ilości białka wybraną metodą.
      UWAGA: Zgodnie z doświadczeniami uzyskanymi w niniejszym badaniu, najlepsze wyniki ilościowe uzyskano przy zastosowaniu metody kwasu bicinchoniminowego.
    2. Ilościowe oznaczenie supernatantu skoncentrowanego z ASC odpowiadającego 1 x 106 ASCs z zastosowaniem metody Bradforda lub osad EVs odpowiadający 1 x 106 ASCs przy 10 00x g w 4 °C przez 1 h, a następnie zawiesić w odpowiednim buforze lizującym z dodatkiem inhibitorów proteaz. Przeprowadzić kwantyfikację białek za pomocą wybranej metody oznaczania.
      UWAGA: Zgodnie z doświadczeniami uzyskanymi w niniejszym badaniu, najlepsze wyniki ilościowego oznaczania pelletów EV uzyskuje się przy zastosowaniu metody kwasu bicinchoniniowego.
    3. W przypadku zastosowania skoncentrowanego supernatantu zamiast oczyszczonych EV, należy poddać próbki lizie w 5% 2-merkaptoetanolu i 2x buforze Laemmliego.
      UWAGA: Jak wykazano w niniejszym badaniu, zarówno skoncentrowany naddatek, jak i oczyszczone pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) dają porównywalne wyniki w przypadku pozytywnych i negatywnych markerów EV.
    4. Naniesienie i rozdział próbek (1-10 µg) w 10% żelu poliakrylamidowym przy napięciu 10 V przez 90 min.
    5. Przenieś na membranę nitrocelulozową przy natężeniu 250 mA przez 120 min.
    6. Barwienie błony Ponceau S w celu wizualizacji próbek i transferu markera masy cząsteczkowej. Usunięcie Ponceau S za pomocą PBS przy delikatnym wstrząsaniu.
    7. Blokować membrany w 5% roztworze odtłuszczonego mleka w proszku i 0,1% Tween w PBS przez 60 min.
    8. Inkubuj membrany z odpowiednimi przeciwciałami w rozcieńczeniach roboczych, w tym z markerami EV pozytywnymi (np. w tej pracy CD9, CD81, TSG101 i flotyliną) oraz negatywnymi (np. w tej pracy kalneksyną), w 4 °C przez noc.
    9. Przemyć 0,1% Tween w PBS i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z peroksydazą przez 45 min w temperaturze pokojowej przed wizualizacją prążków przy użyciu wybranego systemu ECL. Wykonać zdjęcia za pomocą dostępnego systemu obrazowania (Rysunek 2A).
  2. Analiza markerów EV metodą cytometrii przepływowej: barwienie powierzchniowe
    1. Przed użyciem należy odwirować każde przeciwciało monoklonalne (mAb) przy 15 0–17 0 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia agregatów, które mogą powodować sygnały fałszywie dodatnie. Następnie przefiltrować przeciwciała monoklonalne (mAbs) do oddzielnych 0.22 µm probówki z filtrem do wirowania przy 10 x g w 4 °C aż do momentu, gdy cała mieszanina przejdzie przez filtr i na jego powierzchni nie pozostanie już płyn z przeciwciałami. Przechowywać przeciwciała monoklonalne (mAbs) w 4 °C.
    2. Przygotować rozcieńczenie 1:10 pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) znakowanych CFSE (patrz kroki 1.2.1-1.2.8) w 0.22 µm-filtrowany PBS.
    3. Inkubować 100 µL próbek lub 0.22 µm-filtrowany PBS, z lub bez swoistych dla EV przeciwciał monoklonalnych (anty-CD9/63/81) lub swoistych dla MSC przeciwciał monoklonalnych (anty-CD4), uprzednio miareczkowanych. Inkubację przeprowadzić w 4 °C w ciemności przez 30 min.
      UWAGA: Niniejszy protokół, opracowany w celu wykrywania typowych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) oraz markerów linii MSC, może zostać rozszerzony o wszystkie pozostałe markery powierzchniowe specyficzne dla innych linii komórkowych lub podtypów EV. Aby uniknąć nakładania się sygnałów z barwieniem CFSE pęcherzyków EV, nie należy stosować fluorochromów emitujących w kanale izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Barwienie jednobarwne należy przeprowadzić, stosując przeciwciała monoklonalne (mAb) sprzężone z jednym fluorochromem, na przykład z allofikocyjaniną (APC). Możliwe jest barwienie wielokolorowe, jednak należy uwzględnić odpowiednie kontrole w celu wyeliminowania potencjalnych problemów związanych z zawadą steryczną przeciwciał. Konieczne jest przetestowanie poszczególnych przeciwciał osobno lub w mieszaninie oraz upewnienie się, że sygnał jest porównywalny. Dodatkowo w ramach kontroli należy uwzględnić próbki FMO.
    4. Przeprowadzić kalibrację rozproszenia zgodnie z opisem w kroku 3.2.
    5. Utwórz wykres kropkowy (dot plot) skali logarytmicznej rozproszenia bocznego (SSC) względem skali logarytmicznej FITC i przeanalizuj probówkę z 0.22 µm-przefiltrowany bufor PBS lub niebarwione pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs); ustaw próg na kanale FITC i dostosuj go do najwyższych wartości, które wykluczają większość szumu tła. Wyznacz obszar identyfikujący zdarzenia pozytywne pod kątem CFSE.
    6. Utwórz histogram APC ograniczony do obszaru zdarzeń CFSE-dodatnich i przeanalizuj probówkę z 0.22 µm-przefiltrowany PBS lub niebarwione EV.
      UWAGA: W przypadku wzmocnienia sygnału APC należy zastosować wartość wzmocnienia ustaloną podczas kontroli jakości (QC) urządzenia, choć zaleca się przeprowadzenie specyficznego procesu dobierania wzmocnienia (gaintration) w celu optymalizacji parametrów pracy instrumentu.
    7. Dodaj 200 µL z 0.22 µm-przefiltrowany PBS do barwionych próbek i przeprowadź akwizycję. Użyj niskiego natężenia przepływu (10 µL (na minutę) w celu akwizycji i rejestracji. Jeśli to możliwe, należy zarejestrować co najmniej 5 0 zdarzeń w bramce FITC-dodatniej.
    8. Należy wykorzystać kontrolę PBS barwioną przeciwciałami monoklonalnymi (mAb) w celu wykrycia ewentualnych nieswoistych sygnałów przeciwciał mAb. Wszystkie probówki z próbkami należy odczytać przy tej samej prędkości przepływu, aby zapewnić spójność pomiędzy pomiarami.
    9. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek, pomiędzy każdą analizowaną probówką należy przeprowadzić płukanie detergentem przez 10 s, a następnie wodą dejonizowaną (DI) przez 10 s (Rysunek 2B).
      UWAGA: Aby uniknąć niestabilności urządzenia w układzie przepływowym, należy przeprowadzić akwizycję próbki przez 10 s, a następnie rozpocząć rejestrację.
  3. Analiza markerów EV metodą cytometrii przepływowej: barwienie wewnątrzkomórkowe
    UWAGA: Do barwienia wewnątrzkomórkowego należy użyć specjalistycznego zestawu zawierającego odczynniki do fiksacji i permeabilizacji. Przeciwciało mAb anty-Caveolin jest koniugowane z Alexa 48. Barwienie wewnątrzkomórkowe przeprowadzono bez użycia CFSE.
    1. Przed użyciem odwiruj mAb zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2.2.1).
    2. W celu przeprowadzenia barwienia wewnątrzkomórkowego należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 2C).
  4. Charakterystyka stężenia i wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Przygotuj odpowiednie rozcieńczenia próbek tak, aby w obszarze widoku wyświetlacza urządzenia NTA znajdowało się od 20 do 120 zdarzeń.
    2. Wprowadź próbki do komory pomiarowej urządzenia NTA, używając strzykawki insulinowej o objętości 1 ml.
    3. Skonfiguruj oprogramowanie NTA do pomiaru w następujący sposób: 5 pomiarów standardowych, każdy trwający 60 s, oraz pompa przepływowa ustawiona na wartość 30.
    4. Ustaw intensywność światła na odpowiednią wartość, która pozwoli na wyraźne odróżnienie cząsteczek od tła, a następnie uruchom skrypt przechwytywania w oprogramowaniu NTA.
      UWAGA: Ustawienie poziomu kamery może wpływać na detekcję cząstek. Jeśli wartość jest zbyt wysoka, pojawi się mleczne tło i silne rozpraszanie światła cząstek, co przesłoni większość sygnałów z cząstek. Jeśli wartość jest zbyt niska, mimo uzyskania ciemniejszego tła, istnieje ryzyko pominięcia większości zdarzeń o mniejszej jasności. W przypadku każdej próbki należy monitorować ustawienia w celu ich optymalizacji.
    5. Skoryguj współczynnik rozcieńczenia, jeśli liczba cząsteczek w jednej klatce jest mniejsza niż 20 lub większa niż 80.
    6. Ustaw próg na wartość 4, aby przeanalizować średnią wielkość modalną i stężenie cząstek w nad precipitates. Uwzględnij początkowe czynniki rozcieńczenia.
    7. Po każdej próbce należy oczyścić komorę urządzenia wodą dejonizowaną, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.
    8. Otwórz oprogramowanie do analizy NTA i przeprowadź analizę pobranych próbek, uwzględniając czynnik rozcieńczenia (Rysunek 2D).
  5. Charakterystyka morfologii EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    1. Zebrać znakcentrowany naddatek z ASC lub wyizolować EV za pomocą ultrawirówki (10 00 x g w 4 °C przez 1 h), a następnie zawieszenie osadu w tej samej objętości buforu PBS.
    2. Zezwól 5 μL skoncentrowanego supernatantu lub pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) pozostawić do adsorpcji na siatkach pokrytych węglem przez 10 min. Nadmiar cieczy odsączyć papierem filtracyjnym.
    3. Przeprowadzić barwienie negatywne 2% octanem uranylu w zawiesinie wodnej przez 10 min, stosując taką samą objętość jak w przypadku kropli próbki (5 µL). Nadmiar octanu uranylu należy usunąć, dotykając siatki papierem filtracyjnym.
    4. Osusz siatkę w temperaturze pokojowej (RT) i zbadaj ją za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 120 kV (Rycina 2E).

figure-protocol-2
Rycina 2: Charakterystyka ASC-EVs. (A) Reprezentatywny Western blot dla markerów pozytywnych (CD9, CD81, TSG101 i Flotillina) oraz negatywnych (Calnexyna) dla pęchelek zewnątrzkomórkowych (EVs). Podano odpowiadające im masy cząsteczkowe; jako kontrolę wykorzystano lizaty ASC. (B) Analiza markerów EVs metodą cytometrii przepływowej. Przeanalizowano ekspresję następujących markerów: CD9, CD63, CD81 i CD4. Pod kątem ekspresji markerów analizowano wyłącznie ASC-EVs wykazujące pozytywny wynik dla CFSE. Histogramy przedstawiają niebarwione (histogramy czerwone) i barwione (histogramy niebieskie) ASC-EVs.(C) Wewnątrzkomórkowa analiza markeru EVs Caveolina metodą cytometrii przepływowej. Histogramy przedstawiają niebarwione (histogram szary) i barwione (histogramy niebieskie) ASC-EVs.(D) Charakterystyka ASC-EVs za pomocą NTA. Histogramy przedstawiają stężenie (cząsteczki/mL)/rozmiar (nm) próbki. (E) Wizualizacja ASC-EVs za pomocą TEM. Paski skali = 10 nm. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

3. Sortowanie ASC-EVs

  1. Konfiguracja sortera komórek
    UWAGA: Sorter komórek to cytometr przepływowy, który umożliwia wyizolowanie czystej populacji z heterogenicznej próbki wyjściowej. Sorter komórek oddziela docelowe cząstki poprzez oscylację strumienia za pomocą piezoelektryka z wysoką częstotliwością, aby generować krople zawierające zdarzenie. Krople zawierające interesujące cząstki, takie jak komórki lub pęcherzyki, są ładowane i odchylane przez metalowe płyty odchylające. Posortowana frakcja jest wykorzystywana do dalszych analiz.
    1. Otwórz linię ciśnienia i próżnię.
      UWAGA: Niektóre sortery mają automatyczny start, inne start ręczny. Preferowany jest sorter z ręcznym startem, ponieważ pozwala on na optymalizację niektórych parametrów technicznych, takich jak częstotliwość, ciśnienie i wybór końcówki dyszy. W szczególności zaleca się pracę z częstotliwością 6 00 Hz, ciśnieniem 35 psi i dyszą 70 µm.
    2. Włącz urządzenie, otwórz komorę biologicznego bezpieczeństwa i uruchom oprogramowanie sortera.
    3. Uciśnij układ płynowy, a następnie włącz system płynowy.
    4. Aktywuj Drop Drive, kryształ piezoelektryczny w dyszy, który wibruje w celu wytworzenia kropli.
    5. Wykonaj procedurę Debubbling (usuwanie pęcherzyków powietrza), aby wyeliminować obecność pęcherzyków w systemie, a następnie przepuść probówkę 5 mL z roztworem czyszczącym przez 5 min przy wysokim ciśnieniu różnicowym oraz probówkę 5 mL z wodą DI przez 5 min.
    6. Wykonaj ręczną procedurę Startup (uruchomienie).
      1. W zakładce Laser Control Tab naciśnij przycisk Laser Power, aby włączyć zasilanie laserów.
        UWAGA: Powtórz tę procedurę dla wszystkich laserów: niebieskiego 48 nm, żółto-zielonego 561 nm, fioletowego 405 nm i czerwonego 640 nm.
      2. Sprawdź pionowe wyrównanie strumienia.
        UWAGA: W razie potrzeby przesuń zespół dyszy, w szczególności mikrometr przedni i tylny, mikrometr lewy i prawy oraz gimbal, aby dostosować pionowe wyrównanie i zweryfikować pionowy strumień za pomocą mikrometru górnego i dolnego; dla najlepszego wyrównania strumień musi być pionowy dla każdego lasera. Jeśli jest to pierwsze użycie konkretnej dyszy, należy wykonać procedurę Laser Delay (opóźnienie lasera). Na panelu ekranu dotykowego, w zakładce Laser and Stream Intercept, wybierz odpowiedni rozmiar dyszy, naciśnij przycisk Laser Delay i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby przeprowadzić procedurę opóźnienia lasera. Zasadniczo przy zmianie ciśnienia osłonki a w konsekwencji końcówki dyszy, przed znalezieniem wyrównania wykonuje się Laser Delay Determination. Po zakończeniu procedury Laser Delay sugeruje się wykonanie procedury Background Image Subtraction (odejmowanie tła) zgodnie z instrukcjami na ekranie, aby zminimalizować sygnał tła.
      3. Wykonaj procedurę Laser Spot Determination, naciskając w zakładce Laser Stream Intercept przycisk Green Arrow i postępując zgodnie z instrukcjami na monitorze dotykowym.
    7. Zainicjuj Intellisort. Ustaw częstotliwość Drop Drive oraz domyślną wartość amplitudy, która powoduje formowanie się kropli ze strumienia.
      1. Po wykonaniu tego kroku wczytaj zapisaną konfigurację. Aby wczytać zapisaną konfigurację ustawień, wybierz Load Sort Setting na pasku narzędzi oprogramowania sortera. Po sprawdzeniu różnych częstotliwości i amplitud wybierz najlepsze ustawienie zapewniające najwyższą stabilność kropli. Pracuj przy częstotliwości 6 0 Hz i amplitudzie około 40-45 V.
    8. Wykonaj procedurę Fine Laser Alignment (precyzyjne wyrównanie laserów).
      1. Włóż do próbnikowej probówki 5 mL kulek QC do wyrównania i uruchom pomiar; w zakładce Fine Alignment wybierz pożądany parametr na osi X i Y, aby uzyskać obraz kulek dobrze skupionych i skolimowanych. W obszarze Data Display Area wybierz przede wszystkim 48 - 513/26-H dla parametru osi Y oraz 48-FSC1-H dla parametru osi X. Następnie, aby precyzyjnie dostroić wszystkie lasery, wybierz 405-48/59-H dla parametru osi Y oraz 640-795/70-H dla parametru osi X.
        UWAGA: Wybrane parametry zależą od konfiguracji laserów sortera. Instrukcja urządzenia sugeruje wybór laserów o największej separacji przestrzennej na pasku pinhole. W tym celu należy użyć lasera fioletowego (405 nm) i czerwonego (640 nm).
      2. Po sprawdzeniu wyrównania ręcznego przez specjalistę od sortera wykonaj Automatic QC (automatyczną kontrolę jakości). Wybierz średnicę kulek QC: 3 µm.
        UWAGA: Na koniec tej procedury wynik może brzmieć QC did not pass (QC nie przeszło) lub QC passed (QC przeszło). W przypadku niepowodzenia QC konieczna jest ręczna optymalizacja wyrównania.
      3. Zapisz akwizycję QC w protokole wyrównania (Alignment protocol) w oprogramowaniu.
    9. Sfinalizuj procedurę Intellisort
      1. Ustaw płyty odchylające w odpowiedniej pozycji w sorterze i włącz napięcie (zalecany ładunek 3 0 V na płytach odchylających).
      2. Wybierz 6 Tube Holder sort output, aktywuj strumienie, wybierając je w Stream Indicator, i wykonaj Test Stream (test strumienia).
        UWAGA: Jeśli strumienie nie są wyraźnie oddzielone i zdefiniowane, dostosuj charge phase, defanning lub zmodyfikuj inne parametry, aby uzyskać wyraźnie zdefiniowany i nieoscylujący strumień.
      3. Aktywuj przycisk Intellisort Automatic Drop Delay Determination. Ten krok pozwala na ustawienie poprawnego opóźnienia kropli. Po tym kroku ponownie zweryfikuj strumienie.
      4. Aktywuj Intellisort Maintain Mode. Ręcznie zweryfikuj Drop Delay (opóźnienie kropli).
      5. Wczytaj ręczny protokół Drop Delay w oprogramowaniu sortera. Pozyskaj sygnał z fluorescencyjnych kulek kontrolnych.
      6. Włóż odpowiedni uchwyt do szkiełek. W oprogramowaniu sortera wybierz Sort > Drop Delay Wizard. Wybierz Sort Logic.
      7. Zweryfikuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obecność 97% fluorescencyjnych kulek w piątej kałuży.
  2. Konfiguracja urządzenia: kalibracja rozproszenia
    UWAGA: Kalibracja rozproszenia jest wykonywana przy użyciu kulek Verity Shells (dalej określanych jako puste kulki z krzemionki organicznej). Kulki te charakteryzują się rozkładem współczynnika załamania światła i właściwościami rozpraszania światła bliższymi do EV niż kulki polistyrenowe, co pozwala na ustawienie napięcia SSC i FSC w celu lepszego odróżnienia zdarzeń przypominających EV od szumu elektronicznego. Kulki z krzemionki organicznej składają się z dwóch fiolek z mieszaninami kulek: VER01A (kulki 189 nm) i VER01B (kulki 374 nm). Każda fiolka zawiera mieszaninę pustych kulek z krzemionki organicznej i zielonych fluorescencyjnych kulek 380 nm, nazywanych kulkami referencyjnymi. Stężenie pustych kulek z krzemionki organicznej wynosi 1 x 108 kulek/mL.
    1. Przygotuj próbkę kulek VER01A i VER01B, rozcieńczając jedną kroplę (50 μL) każda w 1 mL PBS filtrowanego przez 0,2 µm do końcowego stężenia 5 0 kulek/µL.
      UWAGA: Przed użyciem wymieszaj kulki w wortexie przez 5 s.
    2. Utwórz wykres kropkowy (dot plot) skali logarytmicznej SSC względem skali logarytmicznej FITC.
    3. Pozyskaj sygnał z kulek VER01B i dostosuj napięcie tak, aby dobrze odróżnić kulki referencyjne w górnej prawej części wykresu SSC/FITC (Rysunek 3A).
    4. Wyznacz obszar (region) wokół tej populacji kulek.
    5. Utwórz wykres kropkowy skali logarytmicznej SSC względem skali logarytmicznej FSC. Zidentyfikuj kulki referencyjne i populację kulek VER01B. Wyznacz obszar wokół populacji kulek VER01B (Rysunek 3B).
    6. Pozyskaj sygnał z kulek VER01A i wyznacz obszar wokół tej populacji kulek (Rysunek 3C).
      UWAGA: Populacja ta częściowo nakłada się na szum tła urządzenia.
    7. Pozyskaj sygnał z PBS filtrowanego przez 0,2 µm i dostosuj próg (threshold), aby zmniejszyć szum tła urządzenia bez utraty widoczności najmniejszych kulek.
      UWAGA: Kalibrację rozproszenia można przeprowadzić przy użyciu kulek FSC Megamix (dalej określanych jako polistyrenowe kulki FSC), będących mieszaniną kulek fluorescencyjnych o następujących średnicach: 10 nm, 300 nm, 50 nm i 90 nm. Użyciu pustych kulek z krzemionki organicznej należy przyznać pierwszeństwo przed polistyrenowymi kulkami FSC, ponieważ mają one rozkład współczynnika załamania i właściwości rozpraszania światła podobne do EV. Populacja polistyrenowych kulek FSC 30 nm nakłada się na referencję pustych kulek z krzemionki organicznej. Dlatego bramka oparta na pustych kulkach z krzemionki organicznej pozwala wybrać EV o podobnym rozmiarze w cytometrze przepływowym.
  3. Akwizycja próbki
    1. Utwórz wykres kropkowy skali logarytmicznej SSC względem skali logarytmicznej FITC, pozyskaj sygnał z PBS filtrowanego przez 0,22 µm i zdefiniuj referencyjny szum tła (Rysunek 4A).
      UWAGA: Ustaw szybkość przepływu cytometru na niską (Low) i kontroluj ją. Liczba zdarzeń/s nie może przekraczać 2 0 zdarzeń/s. Niska szybkość przepływu oznacza niskie ciśnienie różnicowe.
    2. Pozyskaj sygnał z próbki kontrolnej (niebarwione EV) i sprawdź szybkość przepływu. Upewnij się, że liczba zdarzeń wynosi około 5 0 zdarzeń/s.
      UWAGA: Jeśli liczba zdarzeń przekracza sugerowaną wartość, rozcieńcz próbkę.
    3. Pozyskaj sygnał z PBS barwionego i traktowanego jak próbka CFSE i sprawdź, czy nie są widoczne zdarzenia pozytywne (Rysunek 4B).
    4. Pozyskaj sygnał z próbki barwionej CFSE. Rozcieńcz ją w zależności od szybkości przepływu. Wyznacz obszar identyfikujący zdarzenia pozytywne CFSE oraz obszar identyfikujący zdarzenia negatywne CFSE. Jako kontrolę wykorzystaj próbkę niebarwioną (Rysunek 5A, B). Są to regiony sortowania.
  4. Sortowanie próbek
    1. W oprogramowaniu sortera otwórz nowy protokół (na pasku narzędzi wybierz File > Protocol > New).
    2. W oprogramowaniu sortera kliknij Data Acquisition Setting; w oknie Acquisition Parameter wybierz interesujące kanały i wyłącz pozostałe. Dla tego konkretnego panelu włączone sygnały to: 48-FSC1, 488-FSC2, 48-SSC oraz 48-513/26 (dla sygnału CFSE).
    3. Umieść w próbniku probówkę 5 mL z próbką. Na ekranie dotykowym kliknij przycisk Load, a na pasku narzędzi oprogramowania sortera wybierz Acquisition > Start (lub naciśnij przycisk F2). Pojawi się okno właściwości próbki; wpisz nazwę próbki i kliknij ok.
    4. Utwórz panel z interesującym wykresem i opracuj strategię bramkowania (gating).
      1. Na pasku narzędzi oprogramowania sortera wybierz Histogram > Create histogram.
      2. W obszarze roboczym utwórz trzy wykresy kropkowe: pierwszy z parametrem 48-FSC1 Height-Log na osi x i 48-SSC Height-Log na osi y, drugi z parametrem 48-FSC2 Height-Log na osi x i 48-SSC Height-Log na osi y, trzeci z parametrem 48-513/26 CFSE Height-Log na osi x i 48-SSC Height-Log na osi y.
    5. W zakładce Sort Tab zidentyfikuj region/regiony do posortowania. W oprogramowaniu sortera kliknij Sort Setting. W oknie Sort Logic and Statistic wybierz region do posortowania w kreatorze logiki (logic builder).
      UWAGA: Aby podjąć decyzję o sortowaniu, należy wziąć pod uwagę różne ustawienia: Sort Logic, Sort Mode i Drop Envelope. Sort Logic odnosi się do strategii bramkowania. Zdarzenia znajdujące się poza wybraną bramką nie są sortowane. Sort Mode wiąże się z końcowym wynikiem. Pracuj w trybie Purify Mode, dzięki czemu wszystkie posortowane krople zawierają tylko pożądane zdarzenia pozytywne. Drop Envelope definiuje, ile kropli zostanie naładowanych i posortowanych w zależności od lokalizacji zdarzenia pozytywnego w kropli: wybierz 1-2 krople, aby mieć pewność, że wszystkie zdarzenia pozytywne zostaną posortowane.
    6. Gdy szybkość przepływu będzie stabilna, zatrzymaj akwizycję (na pasku narzędzi oprogramowania sortera wybierz Acquisition > Stop lub ponownie naciśnij przycisk F2). Rozpocznij sortowanie (na pasku narzędzi oprogramowania sortera wybierz Sort > Start lub naciśnij przycisk F4).
      UWAGA: Przed rozpoczęciem sortowania sprawdź Test Stream. Zweryfikuj, czy posortowana frakcja wpada prawidłowo do probówki kolektora.
    7. Zapisz ustawienia sortowania. Na pasku narzędzi oprogramowania sortera wybierz Sort > Save Sort Settings.
  5. Kontrola czystości posortowanej populacji
    1. Przepłucz urządzenie, przepuszczając probówkę 5 mL z roztworem czyszczącym przez 10 min przy wysokim ciśnieniu różnicowym oraz probówkę 5 mL z wodą DI przez 10 min.
    2. Pozyskaj sygnał z PBS filtrowanego przez 0,2 µm i sprawdź, czy nie występują zdarzenia pozytywne dla CFSE.
    3. Rozcieńcz 5 μL posortowanej próbki w 10 µL PBS filtrowanego przez 0,2 µm.
    4. Pozyskaj i zarejestruj wszystkie objętości próbek (Rysunek 5C, D).
      ​UWAGA: Przedstawiono ponowną analizę zarówno dla pozytywnych, jak i negatywnych pod względem CFSE posortowanych EV.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ustawianie parametrów fizycznych przy użyciu pustych organokrzemionkowych kulek. (A) Wykres kropkowy SSC/FITC: do ustawienia parametru SSC użyto referencyjnych zielonych kulek fluorescencyjnych. Wykres kropkowy SSC/FSC kulek (B) VER01B oraz (C) VER01A. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Referencyjny szum tła. (A) Wykres kropkowy SSC/CFSE dla próbki PBS. (B) Wykres kropkowy SSC/CFSE dla próbki PBS + CFSE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rycina 5: Sortowanie ASC-EVs barwionych CFSE. (A) Wykres kropkowy SSC/CFSE dla niebarwionych EVs, (B) EVs barwionych CFSE, (C) EVs negatywne pod kątem CFSE po sortowaniu oraz (D) EVs pozytywne pod kątem CFSE po sortowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Analizy po sortowaniu

UWAGA: Ze względu na ograniczoną ilość materiału po sortowaniu, przeprowadzenie wszystkich analiz może nie być możliwe. Przy uzyskanym materiale wykonuje się następujące czynności.

  1. Charakterystyka EV za pomocą cytometrii przepływowej: barwienie powierzchniowe (patrz krok 2.2)
    UWAGA: Zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek przed sortowaniem, z wyjątkiem przygotowania próbek. Próbki po sortowaniu mogą być użyte bez rozcieńczania.
    1. Należy użyć nierozcieńczonych próbek posortowanych i postępować zgodnie z krokiem 2.2.3. (Rysunek 6A)
  2. Charakterystyka stężenia i wielkości EV za pomocą NTA (patrz krok 2.4)
    UWAGA: Zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek przed sortowaniem, z wyjątkiem przygotowania próbek. Próbki po sortowaniu mogą być użyte bez rozcieńczania.
    1. Należy użyć nierozcieńczonych próbek posortowanych i postępować zgodnie z krokiem 2.4.2. (Rysunek 6B)
  3. Charakterystyka morfologii EV za pomocą TEM (patrz krok 2.5)
    UWAGA: Zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek przed sortowaniem, z wyjątkiem przygotowania próbek.
    1. Do koncentratora odśrodkowego (membrana z regenerowanej celulozy, MWCO 100 kDa) należy dodać 2 mL PBS, zakręcić i wirować przy 4,0 x g przez 10 min w rotorze z koszykami wahadłowymi. Niefiltrowany PBS należy usunąć z dna urządzenia filtrującego.
    2. Należy odpompować filtrat z probówki zbiorczej. Opisany protokół ultrafiltracji odśrodkowej opiera się na przetwarzaniu próbek o objętości do 15 mL (objętość maksymalna).
    3. Do filtra AU-15 należy dodać do 15 mL próbki i zakręcić urządzenie. Wirować przy 4,0 x g przez maksymalnie 30 min. Skoncentrować do minimalnej objętości dopuszczalnej przez urządzenie, około 10-150 µL.
    4. Odzyskać skoncentrowaną posortowaną próbkę EV z urządzenia filtrującego i postępować zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek przed sortowaniem TEM (krok 2.5.2) ( Rysunek 6C).

figure-protocol-6
Rysunek 6: Charakterystyka posortowanych ASC-EVs. Analiza markerów EV metodą cytometrii przepływowej. Analizie ekspresji poddano następujące markery: CD9, CD63, CD81 oraz CD4. Pod kątem ekspresji markerów analizowano wyłącznie ASC-EVs wykazujące pozytywny wynik dla CFSE. (A) Histogramy przedstawiają ASC-EVs niebarwione (histogramy czerwone) i barwione (histogramy niebieskie). (B) Charakterystyka ASC-EVs za pomocą NTA. Histogramy przedstawiają stężenie (cząsteczki/mL)/rozmiar (nm) próbek przed sortowaniem (lewo) i po sortowaniu (prawo). (C) Wizualizacja ASC-EVs za pomocą TEM próbki przed sortowaniem (lewo) i po sortowaniu (prawo). Paski skali = 10 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Kulek polistyrenowych FSC poddano sortowaniu w celu walidacji konfiguracji instrumentu oraz warunków sortowania. Kulki polistyrenowe FSC stanowią mieszaninę kulek fluorescencyjnych o rozmiarach 10 nm, 30 nm, 50 nm i 90 nm, które są widoczne w kanale FITC. Rysunek 7A przedstawia wykres kropkowy w skali logarytmicznej SSC względem skali logarytmicznej FITC z czterema populacjami kulek przed sortowaniem. Populacje fluorescencyjne o rozmiarach 10 nm, 30 nm i 50 nm zostały wyznaczone za pomocą bramek i posortowane. Posortowane kulki przeanalizowano pod kątem czystości i wzbogacenia jako wstępny dowód koncepcji (Rysunek 7B). Wszystkie populacje były czyste po sortowaniu. Referencyjny szum tła jest zawsze widoczny na wykresach kropkowych przed i po sortowaniu.

Aby spełnić wymagania określone w wytycznych MISEV2018/2023 oraz wykazać naturę pęcherzyków i stopień ich czystości, przeprowadzono eksperymenty w celu analizy markerów obecnych lub nieobecnych na EV. Pęcherzyki EV wykazują obecność niektórych specyficznych markerów powierzchniowych15: CD9, CD63, CD81 oraz CD44. CD9, CD63 i CD81 należą do rodziny tetraspanin wśród białek błonowych i są najczęstszymi markerami służącymi do identyfikacji egzosomów16. CD4 jest markerem silnie ekspresowanym przez MSC i ASC17.

EVs wykazują również obecność białka cytozolowego Caveolin, co zostało wykazane w eksperymencie z wykorzystaniem cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowej. Dodatkowo, analiza western blot potwierdza obecność CD9, CD81, TSG101 i Flotillin oraz brak obecności Calnexin (Rycina 2).

Następnie ASC-EVs znakowane CFSE zostały poddane sortowaniu zgodnie z opisem w protokole. Procedurę sortowania powtórzono czterokrotnie, zachowując dokładnie te same warunki przygotowania próbek, barwienia i sortowania (Tabela 1). W ten sposób wykazano powtarzalność protokołu.

Przeprowadzono zestaw eksperymentów w celu analizy populacji ASC-EV wykupionych przy użyciu CFSE oraz wykazania, że ich charakterystyka nie uległa zmianie w wyniku sortowania. W szczególności ekspresja CD9, CD63, CD81 oraz CD4 nie zmienia się po sortowaniu (Rysunek 6A).

Kolejnym krytycznym punktem jest kwestia wymiarów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVs) oraz tego, jak mogą one ulec zmianie po procedurze sortowania z powodu stresu wywołanego przez ciśnienie. Analiza po sortowaniu była trudna do przeprowadzenia ze względu na niewielką ilość próbki, jednak analiza śledzenia nanocząsteczek (NTA) wykazuje, że rozkład dwóch próbek ASC-EVs (przed i po sortowaniu) był taki sam (Rycina 6B). Wreszcie analiza EVs za pomocą TEM wykazuje, że ich morfologia nie uległa znaczącej zmianie po sortowaniu (Rycina 6C).

Warto zauważyć, że zgodnie z wytycznymi ramowymi MIFlowCyt-EV18, po potraktowaniu próbek 0,1% Triton X-100 zaobserwowano zmniejszenie liczby EVs dodatnich dla CFSE, co potwierdza ich pęcherzykowe pochodzenie (Rycina 8).

figure-results-1
Rycina 7: Sortowanie polistyrenowych kulek. (A) Wykres kropkowy SSC/FITC kulek przed sortowaniem. Wykresy kropkowe SSC/FITC kulek po ponownej analizie po sortowaniu: (B) posortowane kulki 10 nm, (C) posortowane kulki 30 nm oraz (D) posortowane kulki 50 nm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-2
Rycina 8: Degradacja błony EV w obecności Triton X-10. Do próbki dodano Triton X-10 w stężeniu 0,1% na 15 min w temperaturze pokojowej. Przedstawiono reprezentatywne wykresy rozproszone z trzech niezależnych eksperymentów dla próbek niepoddanych działaniu odczynnika (lewo) i poddanych działaniu odczynnika (prawo). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

EksperymentLiczba wyseparowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) Liczba CFSE+ posortowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs)Ciśnienie (psi)Dysza mmCzęstotliwość (Hz)
174 x 1064,8 x 106357066000
24 x 1067 x 106357066000
338 x 1063 x 106357066000
416 x 1062 x 106357066000

Tabela 1: Powtarzalność procedury sortowania

Dyskusja

Analiza i sortowanie EV jest trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary i fakt, że znajdują się one w pobliżu granicy wykrywalności większości cytometrów przepływowych. Naszym celem było opracowanie protokołu izolacji pojazdów elektrycznych pochodzących z AMSC oznaczonych CFSE. CFSE została wybrana jako metoda barwienia ze względu na zgłoszoną wysoką skuteczność znakowania EV (≥90%), bez tworzenia się niepożądanych cząstek, takich jak agregaty białkowe wydzielane przez przeciwciała. Niemniej jednak możliwe jest, że niewiele EV bez esterazy może zostać pominiętych i konieczne będą przyszłe badania w celu zidentyfikowania metod barwienia zdolnych do oznaczania tych cząstek do protokołów sortowania19.

Naszym celem było stworzenie warunków sortowania, które pozwolą na zbieranie czystych pojazdów elektrycznych bez zmiany ich właściwości fizycznych. Udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu możliwości technicznych zastosowanego sortera i wdrożeniu określonych środków, takich jak zmniejszenie standardowego ciśnienia sortowania w zależności od rozmiaru dyszy. Ustaliliśmy i zwalidowaliśmy te warunki sortowania za pomocą kulek polistyrenowych FSC. Następnie zastosowaliśmy ten protokół do pojazdów elektrycznych ASC, powtarzając eksperyment cztery razy i konsekwentnie osiągając podobne wyniki, potwierdzając w ten sposób powtarzalność naszego protokołu.

Należy jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych aspektów i ograniczeń, które tutaj przedstawiamy. (i) Czystość posortowanej próbki: trudno jest jednoznacznie udowodnić czystość posortowanych EV z dodatnim wynikiem CFSE, ponieważ szum tła przyrządu zawsze pojawia się podczas ponownej analizy. Możemy jednak założyć, że wzbogaciliśmy populację CFSE-dodatnią. Brak zdarzeń CFSE dodatnich w populacji CFSE ujemnej wskazuje, że nasz proces sortowania zakończył się sukcesem, pośrednio wykazując czystość posortowanej próbki. (ii) Potencjalne zanieczyszczenie posortowanej próbki: nie możemy wykluczyć możliwości, że posortowana frakcja może zawierać małe pęcherzyki, które są niewykrywalne przez przyrząd i mogą zostać przypadkowo włączone do kropli sortujących. (iii) Integralność EV po sortowaniu: Zdajemy sobie sprawę, że nacisk wywierany przez przyrząd może potencjalnie uszkodzić pęcherzyki. Aby temu zapobiec, zastosowaliśmy dyszę 70 μm o niższym ciśnieniu 35 psi zamiast standardowych 60 psi. Dodatkowo starannie przygotowaliśmy próbki, unikając etapów ultrawirowania, które mogłyby zmienić właściwości fizyczne pojazdów elektrycznych. Pomimo tych środków ostrożności nie możemy zagwarantować, że posortowane pojazdy elektryczne pozostaną nienaruszone i niezmienione. Dlatego zalecamy włączenie analizy po sortowaniu oraz, jeśli to możliwe, testów funkcjonalnych w celu oceny stanu pojazdów elektrycznych.

Oto kilka możliwych modyfikacji i rozwiązywania problemów z protokołem. Protokół ten został ustalony za pomocą przyrządu, który umożliwia zmianę ciśnień; jednak w przypadku instrumentów o bardziej rygorystycznych ustawieniach zaleca się użycie dyszy 100 μm, aby uzyskać niższe ciśnienie, aby w jak największym stopniu zachować integralność pojazdów elektrycznych.

Pomimo tych rozważań twierdzimy, że nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami separacji EV. Po pierwsze, pozwala na izolację określonych populacji pojazdów elektrycznych. Chociaż zdecydowaliśmy się na barwienie pęcherzyków za pomocą CFSE - barwnika fluorescencyjnego, który identyfikuje struktury z nienaruszonymi błonami komórkowymi - możliwe jest również sortowanie określonych populacji EV za pomocą przeciwciał monoklonalnych. W takich przypadkach niezbędne są dodatkowe kontrole barwienia. Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV), Międzynarodowe Towarzystwo Postępu Cytometrii (ISAC) oraz Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH) zapewniają kompleksowe wytyczne dotyczące przeprowadzania powtarzalnych eksperymentów z cytometrią przepływową. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w wytycznych MISEV 20231 i MIFlowCyt -EV18. Po drugie, procedura ta jest mniej czasochłonna niż inne metody, które obejmują wiele etapów ultrawirowania.

Naszym zdaniem protokół ten może być skuteczną strategią separacji i zbierania określonej populacji pojazdów elektrycznych, która może być potencjalnie przydatna do celów terapeutycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Emanuele Canonico za wsparcie techniczne. Część tych prac została przeprowadzona w ALEMBIC, zaawansowanym laboratorium mikroskopowym założonym przez IRCCS Ospedale San Raffaele i Università Vita-Salute San Raffaele. Prace Enrico Ragni i Laury de Girolamo były wspierane przez włoskie Ministerstwo Zdrowia "Ricerca Corrente".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dioctan 5(6)-karboksyfluoresceiny  Ester N-sukcynimidylowyMerck150347-59-4
Mezenchymalne komórki zrębu tłuszczowegoWepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gré goire, FrancjaKomórki użyte w tym badaniu
Alexa 488 anty-kaweolinaR& D SystemsIC5736GPrzeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD44BioLegend338805Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD63BioLegend353007Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD81 (TAPA-1)BioLegend349509Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD9BioLegend312107Cytometria przepływowa przeciwciało
BC CytoFLEX SBeckman CoulterBC CytoFLEX S wyposażone w 3 lasery, niebieski, czerwony i fioletowy
Flow-Check Pro FluorospheresBeckman CoulterA63493Fluorescencyjne kulki kontrolne do MoFLO Astrios EQ
Oprogramowanie FlowJo (wersja 10.8.1)BDwersja 10.8.1Oprogramowanie analityczne
Zestaw IntraSureBD Biosciences641776Utrwalanie i przepuszczalność do barwienia wewnątrzkomórkowego
Megamix-Plus FSCBioCytex7802Koraliki polistyrenowe FSC 
MoFLO Astrios EQBeckman CoulterMoFLO Astrios EQ wyposażony w 4 lasery, niebieski, żółty - zielony, fioletowy i czerwony
Mysz przeciwciało anty-FLOT1Laboratoria Transdukcji BD610820Przeciwciało Western Blot
NanoSight NS300MalvernNS300
Królicze przeciwciało anty-CalnexinOrigeneTA336279Western Blot
Przeciwciało królicze anty-CD9 i CD81 (zestaw przeciwciał ExoAb)System BiosciencesEXOAB-KIT-1Przeciwciała Western Blot
Przeciwciało królika anty-TSG101 MerckHPA006161Przeciwciało Western Blot
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Rainbow Fluorescencyjne cząstkiSpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Verity ShellsExometryOrgano kulki krzemionkowe do kalibracji rozproszenia

Bibliografia

  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application. J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  3. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  4. Witwer, K. W., Wolfram, J. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).
  5. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  6. Du, S., et al. Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).
  7. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  8. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).
  9. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  10. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).
  11. Galipeau, J., Sensébé, L. Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  12. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  13. Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining. BMC Cell Biol. 7, 25(2006).
  14. Morales-Kastresana, A., et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).
  15. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).
  16. Andreu, Z., Yanez-Mo, M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 5, 442(2014).
  17. Mildmay-White, A., Khan, W. Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).
  18. Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments. Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).
  19. Maia, J., et al. Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control. Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mezenchymalne komórki macierzystesortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowychcytometria przepływowaMSC pochodzące z tkanki tłuszczowejśledzenie nanocząsteczektransmisyjna mikroskopia elektronowaznakowanie CFSEstrategia bramkowaniakontrola czystości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.