Artykuł metodologiczny

Ustawianie udanego sortowania w celu izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

DOI:

10.3791/67232

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  , 
1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zawiera szczegółowy opis sortowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) uwalnianych przez mezenchymalne komórki zrębu. W szczególności koncentruje się na ustawieniu urządzeń i optymalizacji warunków sortowania. Celem jest sortowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy jednoczesnym zachowaniu ich cech.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) uwalniane przez mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zawierają zestaw mikroRNA pełniących funkcje regeneracyjne i przeciwzapalne. W związku z tym oczyszczone MSC-EV są postrzegane jako opcja terapeutyczna nowej generacji dla szerokiego spektrum chorób. W tym protokole przedstawiamy strategię skutecznego sortowania EV od supernatantu MSCs pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC), często stosowanych w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej w ortopedii.

Najpierw opisaliśmy przygotowanie próbki, skupiając się na etapach izolacji EV i znakowania estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylu (CFSE) do wykrywania fluorescencji; następnie szczegółowo opisaliśmy proces sortowania, który stanowi główną część protokołu.

Oprócz zasad określonych w wytycznych MISEV 2023 i MIFlowCyt EV, zastosowaliśmy specyficzne warunki eksperymentalne dotyczące rozmiaru dyszy, częstotliwości i ciśnienia w osłonie. Parametry morfologiczne ustala się za pomocą koralików o średnicach dobranych tak, aby pokrywały teoretyczny zakres wielkości EV. Po sortowaniu ASC-EVs przeprowadziliśmy kontrolę czystości posortowanej frakcji, ponownie analizując ją za pomocą sortera i weryfikując rozkład wielkości EV za pomocą techniki analizy śledzenia nanocząstek.

Ze względu na rosnące znaczenie pojazdów elektrycznych, posiadanie czystej populacji do zbadania i scharakteryzowania staje się kluczowe. W tym miejscu przedstawiamy zwycięską strategię, aby skonfigurować sortowanie, aby osiągnąć ten cel.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to niejednorodna grupa pęcherzyków o strukturze błonowej, uwalnianych przez prawie wszystkie komórki, oddzielonych dwuwarstwą lipidową, niezdolnych do samodzielnej replikacji1. Można je znaleźć w kilku płynach biologicznych, takich jak osocze krwi, surowica, ślina, mleko matki, mocz, płyn z płukania oskrzeli, płyn owodniowy, płyn mózgowo-rdzeniowy i wodobrzusze złośliwe2. Jedną z głównych funkcji EV jest transport różnych cząsteczek, w tym kwasów nukleinowych, białek, lipidów i węglowodanów, między komórką dawcy a biorcą. Może się to zdarzyć poprzez różne mechanizmy, takie jak bezpośrednia fuzja błony, interakcja receptor-ligand, endocytoza i fagocytoza3,4. Z tego powodu wykazano, że odgrywają one ważną rolę w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych i są bardzo obiecujące jako nowe biomarkery choroby, jako nośniki dostarczania leków i jako środki terapeutyczne5,6.

Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) to komórki multipotencjalne, które można wyizolować z wielu tkanek, w tym tkanki tłuszczowej, miazgi zębowej, krwi pępowinowej, łożyska, płynu owodniowego, galaretki Whartona, a nawet mózgu, płuc, grasicy, trzustki, śledziony, wątroby i nerek. W ostatnich latach wzbudziły one spore zainteresowanie medycyną regeneracyjną7. Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) mogą być pobierane z tkanki tłuszczowej za pomocą mniej inwazyjnej procedury w porównaniu z innymi źródłami, takimi jak szpik kostny, co skutkuje niższym ryzykiem poważnych powikłań i unikaniem problemów etycznych8.

Dodatkowo, tkanka tłuszczowa zawiera znacznie wyższe stężenie MSCs niż szpik kostny (1% w porównaniu do >0,01%) i inne źródła, takie jak skóra właściwa, miazga zębowa, pępowina i łożysko. MSCs odgrywają kluczową rolę w regeneracji uszkodzonych tkanek i komórek ze względu na ich zdolność do różnicowania i wydzielania szerokiego repertuaru czynników wzrostu, chemokin i cytokin; Te korzyści terapeutyczne wynikają z ich zdolności różnicowania, ale także z faktu, że wydzielają szeroki repertuar czynników wzrostu, chemokin i cytokin. Uderzającym przykładem jest potencjał terapeutyczny MSCs w przypadku schorzeń ortopedycznych, przy czym termin "choroby układu mięśniowo-szkieletowego" ma większą liczbę zarejestrowanych badań klinicznych w ramach clinicaltrials.gov (dostęp 13 maja 2024 r.).>

Ponadto, MSC mogą również wydzielać EVs, które biorą udział w regeneracji tkanek poprzez przekazywanie informacji do uszkodzonych komórek lub tkanek i wywierają aktywność biologiczną podobną do komórek macierzystych9,10. Z tego powodu MSC-EVs mogą być cennym substytutem terapii komórkowej w celu osiągnięcia podejścia bezkomórkowego11, z dwoma badaniami klinicznymi z udziałem MSC-EV w schorzeniach ortopedycznych (NCT05261360 i NCT04998058). Nadal jednak istnieje kilka wyzwań związanych z klinicznymi zastosowaniami pojazdów elektrycznych. Na przykład istnieją pewne obawy dotyczące technik izolacji pojazdów elektrycznych: większość z nich nie gwarantuje czystości ani integralności pęcherzyków. Co więcej, niektóre techniki izolacji są złożone, czasochłonne i mają niską powtarzalność, co czyni je nieodpowiednimi do użytku klinicznego12.

Sortowanie komórek, z drugiej strony, jest powszechnie stosowaną metodą, która pozwala na izolację pojedynczych komórek od heterogenicznych zawiesin komórkowych przy użyciu specyficznych markerów fluorescencyjnych13. Może być używany do wielu zastosowań i dostosowany do różnych typów próbek. Jednakże, chociaż sortowanie komórek jest dobrze ugruntowaną i szeroko stosowaną technologią, sortowanie EV jest nadal bardzo trudne, ponieważ większość EV znajduje się poniżej minimalnego progu wykrywalności nawet dla najbardziej czułych cytometrów przepływowych. Istnieje kilka cech, które sprawiają, że sorter jest bardziej odpowiedni do tego celu. Po pierwsze, zastosowanie systemu Jet-in-air, w którym strumień zawieszający cząstki jest badany przez lasery w powietrzu, a nie w komorze przepływowej; System ten zachowuje próbkę poprzez zmniejszenie naprężeń, którym jest poddawana. Drugim ważnym punktem jest obecność paska "zaciemniającego" między strumieniem a soczewką zbierającą, która zmniejsza szum optyczny tła instrumentu. Chociaż jest niski, szum tła nie jest całkowicie wyeliminowany i stanowi odniesienie, które zapewnia częściowy wgląd w zdarzenia, które mieszczą się w progu: jest to bardzo ważne dla analizy zdarzeń, które są bliskie "granicy wykrywalności" instrumentu14. Wreszcie, sortownik jest wyposażony w dwuścieżkowe rozproszenie do przodu (FSC) z dwiema różnymi maskami, które pozwalają na lepszą dyskryminację małych i dużych cząstek w próbce.

Na tej podstawie opracowaliśmy protokół mający na celu oddzielenie estrów sukcynimidylowych karboksyfluoresceiny (CFSE) oznaczonych MSC-EV za pomocą sortera komórek o wysokiej czułości. Aby zminimalizować manipulację pojazdami elektrycznymi oraz zachować ich integralność i ilość, uniknęliśmy etapów ultrawirowania podczas przygotowywania próbki. Ponadto dostosowano warunki sortowania w celu zminimalizowania naprężeń pęcherzyków, w tym dalszej optymalizacji naszego urządzenia poprzez zmniejszenie ciśnienia sortowania związanego z rozmiarem dyszy (dysza 70 μm przy ciśnieniu 35 psi).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół składa się z czterech części: (1) Przygotowanie próbki, (2) charakterystyka ASC-EVs, (3) sortowanie ASC-EVs, oraz (4) analiza sortowania końcowego. Schemat przedstawiający przepływ pracy jest pokazany w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat blokowy protokołu. Schemat blokowy przedstawia kroki związane z protokołem. (1) przygotowanie próbki, (2) charakterystyka pęcherzyków przed sortowaniem, (3) sortowanie i (4) analiza pęcherzyków po sortowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbki

  1. Kolekcja supernatantów wzbogacona w pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV)
    1. Rozmrozić lub zebrać MSCs tkanki tłuszczowej (ASC), które były hodowane w pasażu przed pobraniem EV (zwykle pasaż od 1 do 5) i wysiewać na każdy ASC, izolować identyczną ilość komórek (np. 1 milion komórek na 175cm2 powierzchni kolby daje około 60%-70% konfluencji).
    2. Hoduj ASC w odpowiedniej pożywce hodowlanej (DMEM-F12 dla tego protokołu) uzupełnionej wolną od EV płodową surowicą bydlęcą (FBS) lub ludzkim lizatem płytkowym (hPL), zgodnie z żądanym protokołem, przez 48-72 godziny.
      1. Aby uzyskać FBS lub hPL wolne od EV, należy ultraodwirować przy 120 000 x g przez noc w temperaturze 4 °C i użyć supernatantu.
        UWAGA: Od tego momentu wskazana siła odśrodkowa jest zawsze rozumiana jako średnia dla używanego instrumentu, wirnika i rur. Należy pamiętać, że różne wirniki lub rury mogą mieć zmienną siłę g na prędkość obrotową i współczynnik k. Aby w łatwy sposób porównać wirniki i dostosować przeciążenie i prędkość, zapoznaj się z jedną z dostępnych tabel przeliczeniowych https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator.
    3. Przy 90% zbiegu komórek odłącz i policz ASC, a następnie zawieś w odpowiedniej objętości pożywki wolnej od surowicy, najlepiej 1 ml na 1 x 106 ASC. Wysiewaj ASC w zawiesinie na płytkach 24-dołkowych po 1 ml na studzienkę. Bez surowicy komórki pozostaną w zawiesinie i utworzą sferoidę. Po 96 godzinach zebrać supernatant.
    4. Usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia przez seryjne wirowanie w temperaturze 4 °C: 400 x g przez 10 min, 1.000 x g przez 10 min, 2.000 x g przez 10 min i dwukrotnie 4.000 x g przez 10 min.
    5. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm, aby usunąć pozostałe cząstki większe niż 220 nm.
      UWAGA: Zużyć natychmiast do dalszych zastosowań lub przechowywać maksymalnie przez jedną noc w temperaturze 4 °C lub zamrozić w temperaturze -80 °C, jeśli dalsze kroki nie zostaną wykonane w ciągu 24 godzin.
  2. Barwienie EV do sortowania
    1. Przygotować 5 mM roztwór estru N-sukcynimidylu dioctanu 5(6)-karboksyfluoresceiny (CFSE). Używaj go świeżo przygotowanego lub zamroź w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem.
    2. Postępować bezpośrednio od kroku 1.1.1-1.1.5 (w ciągu 24 godzin) lub rozmrozić w temperaturze -80 °C przechowywane supernatanty zawierające EV w temperaturze 4 °C.
    3. Przed barwieniem podgrzać supernatanty w temperaturze 37 °C i dodać CFSE do uzyskania końcowego stężenia 10 μM (500-krotne rozcieńczenie). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności.
    4. Podczas inkubacji dodać 2 ml PBS do koncentratora odśrodkowego (membrana z regenerowanej celulozy, MWCO 100 kDa), nasadki i wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym. Usunąć niefiltrowany PBS z dolnej części urządzenia filtrującego i zassać filtrat z probówki zbiorczej.
      UWAGA: Przedstawiony protokół ultrafiltracji odśrodkowej opiera się na przetwarzaniu do 15 ml próbki (maksymalna objętość).
    5. Dodać do 15 ml próbki do koncentratora odśrodkowego i zakryć urządzenie. Wirować przy 4 000 x g do 30 min.
      UWAGA: W ten sposób otrzymamy końcową próbkę o średniej wielkości 500 μl. Jednak w zależności od takich czynników, jak rodzaj próbki i natężenie przepływu, czas wirowania wymagany do osiągnięcia pożądanego stężenia może się różnić.
    6. Wyjmij urządzenie z wirówki i opróżnij probówkę zbiorczą. Dodać 14 ml PBS do urządzenia filtrującego. Wirować przy 4 000 x g przez maksymalnie 30 min.
    7. Powtórz krok 1.2.6.
    8. Odzyskać skoncentrowaną próbkę EV zabarwioną CFSE z urządzenia filtrującego, około 500 μl, i przechowywać 100 μl w temperaturze 4 °C w ciemności, przystępując do sortowania pozostałej próbki.

2. Charakterystyka ASC-EVs

  1. Analiza Western blot markerów EV
    1. Osady ASC (1 x 106) w ilości 376 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i zawiesić w odpowiednim buforze do lizy uzupełnionym inhibitorami proteazy. Przeprowadzić kwantyfikację białka za pomocą wybranego testu.
      UWAGA: Jak ma doświadczenie w tym badaniu, najlepsze wyniki kwantyfikacji uzyskuje się za pomocą techniki testu kwasu bicunchoninowego.
    2. Oznaczyć ilościowo supernatant o stężeniu ASCs odpowiadający 1 x 106 ASC za pomocą techniki Bradforda lub granulki EV odpowiadające 1 x 106 ASC przy 100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę i zawiesić w odpowiednim buforze do lizy uzupełnionym inhibitorami proteazy. Przeprowadzić kwantyfikację białka za pomocą wybranego testu.
      UWAGA: Jak doświadczono w tym badaniu, najlepsze wyniki kwantyfikacji dla granulek EV uzyskuje się za pomocą techniki oznaczania kwasu bicunchoninowego.
    3. Jeżeli zamiast oczyszczonych EV stosuje się stężony supernatant, próbki poddać lizie w 5% 2-merkaptoetanolu i 2x buforze Laemmli.
      UWAGA: Jak doświadczono w tym badaniu, zarówno skoncentrowany supernatant, jak i oczyszczony EV dają porównywalne wyniki dla dodatnich i ujemnych markerów EV.
    4. Załadować i oddzielić próbki (1-10 μg) w 10% żelu poliakrylamidowym pod napięciem 110 V przez 90 minut.
    5. Przenieść do membrany nitrocelulozowej pod ciśnieniem 250 mA przez 120 min.
    6. Membrana barwiąca z Pąskiem S do wizualizacji próbek i przenoszenia drabiny. Usuń Ponceau S z PBS delikatnie wstrząsając.
    7. Blokuj membrany z 5% beztłuszczowego mleka w proszku i 0,1% Tween w PBS przez 60 min.
    8. Sondować błony odpowiednimi przeciwciałami w rozcieńczeniach roboczych, w tym dodatnimi (np. w tej pracy CD9, CD81, TSG101 i Flotillin) i ujemnymi (np. w tej pracy Calnexin) markerami EV, w temperaturze 4 °C przez noc.
    9. Przemyć 0,1% Tween w PBS i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą przez 45 minut w temperaturze pokojowej przed ujawnieniem pasma za pomocą wybranego systemu ECL. Uzyskuj obrazy za pomocą dostępnego systemu obrazowania (Rysunek 2A).
  2. Analiza cytometrii przepływowej markerów EV: barwienie powierzchni
    1. Przed użyciem odwirować każde przeciwciało monoklonalne (mAb) w temperaturze 15 000-17 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu wyeliminowania agregatów, które mogą powodować fałszywie dodatnie sygnały. Następnie przefiltrować mAb do oddzielnych odśrodkowych probówek filtracyjnych o wielkości 0,22 μm przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C, aż cała mieszanina przejdzie przez filtr i na powierzchni filtra nie pozostanie płynne przeciwciało. Przechowywać przeciwciała monoklonalne w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować rozcieńczenie EV zabarwionych CFSE w stosunku 1:10 (patrz kroki 1.2.1-1.2.8) w PBS z filtrem 0,22 μm.
    3. Inkubować 100 μl próbek lub PBS z filtrem 0,22 μm, z lub bez specyficznych dla EV mAb (anty-CD9/63/81) lub mAb specyficznych dla MSC (anty-CD44), uprzednio miareczkowanych. Przeprowadzić inkubację w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 min.
      UWAGA: Ten protokół, opracowany do wykrywania typowych EV i markerów linii MSC, może zostać rozszerzony na wszystkie inne markery powierzchniowe specyficzne dla linii komórkowej lub podtypu EVs. Nie należy używać fluorochromów wpadających do kanału izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), aby uniknąć nakładania się na siebie barwienia CFSE EV. Wykonaj pojedyncze barwienie, używając każdego mAb sprzężonego z jednym fluorochromem, na przykład allofikocyjaniną (APC). Barwienie wielobarwne jest możliwe, ale należy uwzględnić kontrole, aby rozwiązać potencjalne problemy z przeszkodą steryczną przeciwciał. Konieczne jest przetestowanie poszczególnych przeciwciał pojedynczo lub w mieszance i upewnienie się, że sygnał jest porównywalny. Ponadto do kontroli należy włączyć FMO.
    4. Skonfiguruj kalibrację punktową zgodnie z opisem w kroku 3.2.
    5. Utwórz wykres punktowy skali logarytmicznej bocznego rozproszenia (SSC) w porównaniu ze skalą logarytmiczną FITC i uruchom probówkę z filtrem 0,22 μm PBS lub niebarwionymi EV; ustaw próg na kanale FITC i dostosuj go do najwyższych wartości, które wykluczają większość szumów tła. Narysuj region identyfikujący pozytywne zdarzenia CFSE.
    6. Utwórz wykres histogramu APC z bramkowaniem w obszarze dodatnich zdarzeń CFSE i uruchom probówkę z filtrem 0,22 μm PBS lub niebarwionymi EVs.
      UWAGA: W przypadku wzmocnienia APC należy użyć wzmocnienia ustalonego za pomocą kontroli jakości instrumentu, chociaż zaleca się wykonanie określonego wzmocnienia w celu optymalizacji wydajności instrumentu.
    7. Dodać 200 μl PBS z filtrem 0,22 μm do barwionych próbek i uzyskać. Używaj niskiego natężenia przepływu (10 μl na minutę) do akwizycji i nagrywania. Jeśli to możliwe, zarejestruj co najmniej 5 000 zdarzeń w dodatniej bramce FITC.
    8. Użyj kontroli PBS barwionej mAb, aby wykryć możliwe specyficzne sygnały mAb. Odczytaj wszystkie probówki z próbkami przy tym samym natężeniu przepływu, aby zapewnić spójność między cyklami.
    9. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbki, należy przelać detergent na 10 s między każdą analizowaną probówką, a następnie na 10 s z wodą dejonizowaną (DI) (Rysunek 2B).
      UWAGA: Aby uniknąć niestabilności instrumentu fluidycznego, pobieraj próbkę przez 10 sekund, a następnie rozpocznij nagrywanie.
  3. Analiza cytometrii przepływowej markera EV: barwienie wewnątrzkomórkowe
    UWAGA: Do barwienia wewnątrzkomórkowego użyj specjalnego zestawu zawierającego odczynniki do utrwalania i permeabilizacji. MAb anty-kaweolinowy jest sprzężony z Alexa 488. Barwienie IC zostało przeprowadzone przy braku CFSE.
    1. Przed użyciem odwirować mAb zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 2.2.1).
    2. W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego postępuj zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 2C).
  4. Charakterystyka stężenia i wielkości EV za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Dokonać odpowiednich rozcieńczeń próbek, aby uzyskać 20-120 zdarzeń w ramce view wyświetlacza przyrządu NTA.
    2. Wstrzyknąć próbki do komory na próbki instrumentu NTA za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml.
    3. Ustaw oprogramowanie NTA do nagrywania w następujący sposób: 5 standardowych pomiarów, 60 s każdy, i pompa przepływu ustawiona na 30.
    4. Ustaw natężenie światła na odpowiednią wartość, która pozwoli na wyraźne odróżnienie cząstek od tła i uruchom skrypt przechwytywania w oprogramowaniu NTA.
      UWAGA: Ustawienie poziomu kamery może mieć wpływ na wykrywanie cząstek. Jeśli wartość jest zbyt wysoka, pojawia się mleczne tło i silne rozpraszanie światła cząstek, które pokrywają większość sygnałów cząstek. Jeśli wartość jest zbyt niska, mimo że uzyskuje się ciemniejsze tło, możliwe jest, że większość mniej jasnych zdarzeń zostanie pominięta. Każda próbka powinna być monitorowana w celu optymalnego ustawienia.
    5. Dostosuj współczynnik rozcieńczenia, jeśli cząstki na klatkę są mniejsze niż 20 lub większe niż 80.
    6. Ustaw próg na 4, aby przeanalizować średnią wielkość modalną i stężenie cząstek supernatantu. Uwzględnij początkowe współczynniki rozcieńczenia.
    7. Po każdej próbce należy oczyścić komorę instrumentu wodą dejonizowaną, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    8. Otwórz oprogramowanie analityczne NTA i przeprowadź analizę pobranych próbek, biorąc pod uwagę współczynnik rozcieńczenia (Rysunek 2D).
  5. Charakterystyka morfologii EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)
    1. Zebrać supernatant o stężeniu ASC lub wyizolować EV przez ultrawirowanie (100 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę), a następnie zawiesinę osadów w tej samej objętości PBS.
    2. Pozostawić 5 μl stężonego supernatantu lub EV do wchłonięcia na siatkach pokrytych węglem przez 10 minut. Nadmiar kropli cieczy osuszyć bibułą filtracyjną.
    3. Wykonać barwienie ujemne 2% octanem uranylu w zawiesinie wodnej przez 10 minut, używając identycznej objętości kropli próbki (5 μl). Usunąć nadmiar octanu uranylu, dotykając siatki bibułą filtracyjną.
    4. Wysuszyć siatkę w temperaturze pokojowej (RT) i zbadać ją za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy napięciu 120 kV (Rysunek 2E).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Charakterystyka ASC-EVs. (A) Reprezentatywny Western blot dodatnich (CD9, CD81, TSG101 i Flotillin) i ujemnych (Calnexin) markerów. Podano odpowiednie masy cząsteczkowe, a jako kontrolę zastosowano lizaty ASC. (B) Analiza markerów EV za pomocą cytometrii przepływowej. Analizowano ekspresję markerów: CD9, CD63, CD81 i CD44. Tylko dodatnie CFSE ASC-EV zostały przeanalizowane pod kątem ekspresji markera. Histogramy reprezentują niebarwione (czerwone histogramy) i barwione (niebieskie histogramy) ASC-EV. (C) Cytometria przepływowa, analiza wewnątrzkomórkowa markera EVs kaweoliny. Histogramy reprezentują niebarwione (szary histogram) i barwione (niebieskie histogramy) ASC-EV. (d) Charakterystyka ASC-EV przez NTA. Histogramy reprezentują stężenie (cząstki/ml)/wielkość (nm) próbki. (e) Wizualizacja ASC-EV przez TEM. Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Sortowanie ASC-EVs

  1. Konfiguracja sortera komórek
    UWAGA: Sortownik komórek to cytometr przepływowy, który umożliwia wyizolowanie czystej populacji z niejednorodnej próbki wyjściowej. Sortownik komórek oddziela cząstki docelowe poprzez oscylację strumienia za pomocą piezoelektryka o wysokiej częstotliwości w celu wygenerowania kropli zawierających zdarzenie. Krople, które zawierały interesujące cząstki, takie jak komórki lub pęcherzyki, są ładowane i odchylane przez metalowe płytki odchylające. Posortowana frakcja służy do przeprowadzenia dalszej analizy.
    1. Otwórz przewód ciśnieniowy i odkurz.
      UWAGA: Niektóre sortery mają automatyczne uruchamianie, podczas gdy inne mają uruchamianie ręczne. Preferowany jest sortownik z ręcznym uruchamianiem, ponieważ umożliwia optymalizację niektórych funkcji technicznych, takich jak częstotliwość, ciśnienie i wybór końcówki dyszy. W szczególności zaleca się pracę z częstotliwością 66 000 Hz, ciśnieniem 35 psi i dyszą 70 μm.
    2. Włącz urządzenie, otwórz szafę bezpieczeństwa biologicznego i uruchom oprogramowanie sortownika.
    3. Zwiększ ciśnienie w fluidyce, a następnie włącz system fluidyki.
    4. Aktywuj Drop Drive, piezoelektryczny kryształ w dyszy, który wibruje, aby mieć kropelki.
    5. Wykonaj procedurę usuwania bąbelków, aby wyeliminować obecność pęcherzyków w układzie, a następnie uruchom probówkę o pojemności 5 ml roztworu czyszczącego przez 5 minut przy wysokiej różnicy ciśnień i probówkę o pojemności 5 ml wody DI przez 5 minut.
    6. Wykonaj procedurę ręcznego uruchamiania.
      1. Na karcie Laser Control (Sterowanie laserem) naciśnij przycisk Laser Power (Zasilanie lasera), aby włączyć moc lasera.
        UWAGA: Powtórz tę procedurę dla wszystkich laserów: niebieskiego 488 nm, żółto-zielonego 561 nm, fioletowego 405 nm i czerwonego 640 nm.
      2. Sprawdź wyrównanie strumienia w pionie.
        UWAGA: W razie potrzeby przesuń etap montażu dyszy, w szczególności mikrometr przedni i tylny, mikrometr lewy i prawy oraz gimbal, aby wyregulować wyrównanie w pionie i sprawdzić strumień pionowy za pomocą mikrometru w górę iw dół; Aby uzyskać najlepsze wyrównanie, strumień musi być pionowy na każdym laserze. Jeśli po raz pierwszy używasz określonej dyszy, należy wykonać opóźnienie lasera. Na panelu ekranu dotykowego, na karcie Laser and Stream Intercept (Przechwycenie lasera i strumienia), wybierz odpowiedni rozmiar dyszy, naciśnij przycisk Laser Delay (Opóźnienie lasera) i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi opóźnienia lasera, aby wykonać procedurę opóźnienia laserowego. Ogólnie rzecz biorąc, przy zmianie ciśnienia w osłonie, a co za tym idzie, końcówki dyszy, określenie opóźnienia lasera jest wykonywane przed znalezieniem wyrównania. Pod koniec procedury opóźnienia lasera sugeruje się, aby procedurę odejmowania obrazu tła wykonać zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby zminimalizować sygnał tła.
      3. Wykonaj oznaczanie plamki lasera, naciskając zakładkę Laser Stream Intercept (Przechwytywanie strumienia laserowego), przycisk zielonej strzałki i postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na monitorze dotykowym.
    7. Zainicjuj funkcję Intellisort. Ustaw częstotliwość napędu upuszczania i domyślną wartość amplitudy, która powoduje, że strumień tworzy kroplę.
      1. Po wykonaniu tego kroku załaduj zapisaną konfigurację. Aby załadować zapisaną konfigurację ustawień, wybierz opcję Załaduj ustawienie sortowania na pasku narzędzi oprogramowania sortującego. Po sprawdzeniu różnych częstotliwości i amplitud wybierz najlepszą, która zapewnia najlepszą stabilność upadku. Praca z częstotliwością 66 000 Hz i amplitudą około 40-45 V.
    8. Wykonaj procedurę precyzyjnego wyrównania laserowego.
      1. Załadować do próbnika probówkę o pojemności 5 ml z koralikami wyrównującymi QC i uruchomić ją; wybrać na karcie Dokładne wyrównanie żądany parametr na osiach X i Y, aby uwidocznić dobrze zagęszczone i skolimowane kulki. W obszarze wyświetlania danych wybierz najpierw 488 - 513/26-H dla parametru osi Y i 488-FSC1-H dla parametru osi X. Następnie, aby dostroić wszystkie lasery, wybierz 405-488/59-H dla parametru osi Y i 640-795/70-H dla parametru osi X.
        UWAGA: Wybrane parametry zależą od konfiguracji lasera sortera. Sugestia instrukcji obsługi przyrządu to wybór laserów, które mają największą separację przestrzenną na pasku otworkowym. W tym celu należy użyć lasera fioletowego (405 nm) i czerwonego lasera (640 nm).
      2. Po sprawdzeniu ręcznego wyrównania przez specjalistę sortownika, należy przeprowadzić automatyczną kontrolę jakości. Wybierz średnicę koralików QC: średnica 3 μm.
        UWAGA: Na końcu tej procedury wynik może być następujący: QC nie przeszło lub QC przeszło. W przypadku niepowodzenia kontroli jakości konieczne jest ręczne zoptymalizowanie wyrównania.
      3. Zapisz akwizycję QC w protokole wyrównania oprogramowania.
    9. Finalizowanie procedury Intellisort
      1. Umieść płytki odchylające we właściwej pozycji w sorterze i włącz napięcie (zalecane jest ładowanie płytkami odchylającymi 3 000 V).
      2. Wybierz 6 Uchwyt probówki sortuj wyjście, włącz strumienie, wybierając je na wskaźniku strumienia i wykonaj strumień testowy.
        UWAGA: Jeśli strumienie nie są wyraźnie oddzielone i zdefiniowane, wyreguluj fazę ładowania, defanację lub zmodyfikuj inne parametry, aby uzyskać wyraźnie zdefiniowany i nie oscylujący strumień.
      3. Włącz przycisk Intellisort Automatic Drop Delay Determination (Automatyczne określanie opóźnienia upuszczania) Intellisort. Ten krok pozwala na ustawienie prawidłowego opóźnienia upuszczania. Po wykonaniu tego kroku ponownie zweryfikuj strumienie.
      4. Aktywuj tryb obsługi Intellisort. Ręcznie sprawdź opóźnienie upuszczania.
      5. Załaduj ręczny protokół Drop Delay do oprogramowania sortera. Zdobądź fluorescencyjne koraliki kontrolne.
      6. Włóż odpowiedni uchwyt do prowadnic. W oprogramowaniu do sortowania wybierz opcję Sortuj > Kreator opóźnienia upuszczania. Wybierz pozycję Sortuj logikę.
      7. Sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym obecność 97% koralików fluorescencyjnych na piątej kałuży.
  2. Konfiguracja instrumentu: Kalibracja rozproszenia
    UWAGA: Kalibracja rozproszenia jest wykonywana przy użyciu koralików Verity Shells (zwanych dalej pustymi koralikami krzemionkowymi organo). Te kulki krzemionkowe charakteryzują się rozkładem współczynnika załamania światła i właściwościami rozpraszania światła bliższymi EV niż kulki polistyrenowe, co pozwala na ustawienie napięcia SSC i FSC w celu lepszego rozróżnienia zdarzeń podobnych do EV i szumu elektronicznego. Kulki krzemionkowe składają się z dwóch fiolek z mieszaninami kulek, VER01A (kulki 189 nm) i VER01B (kulki 374 nm). Każda fiolka zawiera mieszaninę pustych w środku kulek krzemionki organicznej i zielonych kulek fluorescencyjnych o długości fali 380 nm, zwanych kulkami referencyjnymi. Stężenie pustych w środku kulek krzemionkowych wynosi 1 x 108 kulek/ml.
    1. Przygotować próbkę kulek VER01A i VER01B, rozcieńczając jedną kroplę (50 μl) każdego z nich w 1 ml PBS przefiltrowanego przez 0,22 μm o końcowym stężeniu 5 000 kulek/μL,
      UWAGA: Wiruj koraliki przez 5 sekund przed użyciem.
    2. Utwórz wykres punktowy skali logarytmicznej SSC w porównaniu ze skalą logarytmiczną FITC.
    3. Zdobądź koraliki VER01B i dostosuj napięcie, aby dobrze rozróżnić koraliki odniesienia w prawej górnej części wykresu punktowego SSC/FITC (Rysunek 3A).
    4. Ustaw region wokół tej populacji koralików.
    5. Utwórz wykres punktowy skali logarytmu SSC w porównaniu ze skalą logarytmiczną FSC. Zidentyfikuj koraliki referencyjne i populację koralików VER01B. Ustaw region wokół populacji koralików VER01B (Rysunek 3B).
    6. Zdobądź koraliki VER01A i utwórz region wokół tej populacji koralików (Rysunek 3C).
      UWAGA: Ta populacja koralików częściowo pokrywa się z szumem tła instrumentu.
    7. Zdobądź PBS z filtrem 0,22 μm i dostosuj próg, aby zmniejszyć szum tła instrumentu bez utraty wizualizacji najmniejszych koralików.
      UWAGA: Kalibrację rozproszenia można przeprowadzić za pomocą kulek FSC Megamix (zwanych dalej koralikami polistyrenowymi FSC), mieszanki koralików fluorescencyjnych o następujących średnicach: 100 nm, 300 nm, 500 nm i 900 nm. Stosowanie pustych w środku kulek krzemionkowych organo musi być preferowane w stosunku do kulek polistyrenowych FSC, ponieważ mają one rozkład współczynnika załamania światła i właściwości rozpraszania światła podobne do EV. Populacja kulek polistyrenowych FSC o długości fali 300 nm pokrywa się z odniesieniem do pustych w środku kulek krzemionkowych organoorganicznych. Dlatego bramka oparta na pustych kulkach krzemionki organicznej wybiera EV o podobnej wielkości na cytometrze przepływowym.
  3. Pobieranie próbek
    1. Utwórz wykres punktowy skali logarytmu SSC w stosunku do skali logarytmu FITC, uzyskaj PBS z filtrem 0,22 μm i zdefiniuj referencyjny szum tła (Rysunek 4A).
      UWAGA: Ustaw natężenie przepływu cytometru na Niskie i kontroluj natężenie przepływu. Liczba zdarzeń nie może przekraczać 2 000 zdarzeń/s. Natężenie przepływu Niskie oznacza niską różnicę ciśnień.
    2. Pobrać próbkę kontrolną (niebarwione pojazdy elektryczne) i sprawdzić natężenie przepływu. Upewnij się, że liczba zdarzeń/s wynosi około 5 000 zdarzeń/s.
      UWAGA: Jeśli liczba zdarzeń przekracza sugerowaną, rozcieńczyć próbkę.
    3. Zdobądź PBS wybarwiony i potraktowany jako próbka CFSE i sprawdź, czy nie są widoczne żadne pozytywne zdarzenia (Rysunek 4B).
    4. Pobrać próbkę barwioną CFSE. Rozcieńczyć go w zależności od natężenia przepływu. Narysuj region identyfikujący pozytywne zdarzenia CFSE i jeden identyfikujący negatywne zdarzenia CFSE. Użyj niebarwionej próbki jako kontroli (Rysunek 5A, B). To są regiony sortowania.
  4. Sortowanie próbek
    1. W oprogramowaniu sortującym otwórz nowy protokół (na pasku narzędzi wybierz Plik > Protokół > Nowy).
    2. W oprogramowaniu sortującym kliknij Ustawienia akwizycji danych, a w oknie Parametr akwizycji wybierz interesujące Cię kanały i wyłącz pozostałe. Dla tego konkretnego panelu obsługiwane sygnały to: 488-FSC1, 488-FSC2, 488-SSC i 488-513/26 (dla sygnału CFSE).
    3. Umieścić na próbniku probówkę o pojemności 5 ml z próbką. Na ekranie dotykowym kliknij przycisk Załaduj, a następnie na pasku narzędzi oprogramowania sortującego wybierz opcję Pobieranie > Start (lub naciśnij przycisk F2). Pojawi się okno z przykładowymi właściwościami; Wstaw nazwę przykładu i kliknij przycisk OK.
    4. Utwórz panel z interesującą Cię działką i stwórz strategię bramkowania.
      1. Na pasku narzędzi oprogramowania do sortowania wybierz opcję Histogram > Utwórz histogram.
      2. W obszarze roboczym utwórz trzy wykresy kropkowe, pierwszy z parametrem Height-Log na osi x 488-FSC1 i osią y 488-SSC Height-Log, drugi z parametrem Height-Log na osi x 488-FSC2 i osią y 488-SSC Height-Log, trzeci z parametrem 488-513/26 CFSE Height-Log na osi x i osią y 488-SSC Height-Log.
    5. Na karcie Sortowanie zidentyfikuj regiony do sortowania. W oprogramowaniu do sortowania kliknij opcję Sort Setting (Ustawienia sortowania). W oknie Sortuj logikę i statystykę wybierz region do sortowania w kreatorze logiki.
      UWAGA: Aby podjąć decyzję o sortowaniu, należy wziąć pod uwagę różne ustawienia: Logika sortowania, Tryb sortowania i Koperta upuszczania. Logika sortowania odnosi się do strategii bramkowania. Zdarzenia, które znajdują się poza wybraną bramą, nie są sortowane. Tryb sortowania jest powiązany z końcowym wyjściem. Pracuj w trybie oczyszczania, w ten sposób wszystkie posortowane krople zawierają tylko pożądane pozytywne zdarzenia. Koperta zrzutu określa, ile kropli zostanie naładowanych i posortowanych w zależności od lokalizacji w zrzucie pozytywnego zdarzenia: wybierz 1-2 krople, aby mieć pewność, że wszystkie pozytywne zdarzenia zostaną posortowane.
    6. Gdy natężenie przepływu jest stabilne, zatrzymaj akwizycję (na pasku narzędzi oprogramowania sortującego wybierz Akwizycja > Zatrzymaj lub ponownie naciśnij przycisk F2). Rozpocznij sortowanie (na pasku narzędzi oprogramowania sortującego wybierz Sortuj > Start lub naciśnij przycisk F4).
      UWAGA: Przed rozpoczęciem sortowania sprawdź >strumień testowy. Sprawdź, czy posortowana frakcja prawidłowo wpada do probówki zbiorczej.
    7. Zapisz ustawienie sortowania. Na pasku narzędzi oprogramowania do sortowania wybierz opcję Sortuj > Zapisz ustawienia sortowania.
  5. Kontrola czystości posortowanej populacji
    1. Umyj instrument, pobierając probówkę o pojemności 5 ml roztworu czyszczącego przez 10 minut przy wysokiej różnicy ciśnień i probówkę o pojemności 5 ml z wodą demineralizowaną przez 10 minut.
    2. Zdobądź PBS z filtrem 0,22 μm i sprawdź, czy nie występują żadne zdarzenia CFSE-dodatnie.
    3. Rozcieńczyć 5 μl posortowanej próbki w 100 μl PBS przefiltrowanego przez 0,22 μm.
    4. Zbierz i zapisz wszystkie objętości próbek (Rysunek 5C, D).
      UWAGA: Zgłaszana jest ponowna analiza zarówno pozytywnych, jak i ujemnych posortowanych EV CFSE.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ustawienie parametrów fizycznych za pomocą pustych koralików krzemionkowych organo. (A) Wykres punktowy SSC/FITC: do ustawienia parametru SSC użyto referencyjnego zielonego, fluorescencyjnego koralika. Wykres punktowy SSC/FSC koralików (B) VER01B i (C) VER01A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Referencyjny szum tła. (A) Wykres punktowy SSC/CFSE próbki PBS. (B) Wykres punktowy SSC/CFSE próbki PBS + CFSE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Sortowanie ASC-EV z plamami CFSE. (A) wykres punktowy SSC/CFSE niebarwionych EV, (B) EV poplamionych CFSE, (C) dodatnich EV CFSE po sortowaniu, oraz (D) dodatnich EV CFSE po sortowaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Analizy sortowania postów

UWAGA: Ze względu na ograniczoną ilość materiału po sortowaniu, wykonanie wszystkich analiz może nie być możliwe. Z uzyskaną ilością wykonywane są następujące czynności.

  1. Charakterystyka EV za pomocą cytometrii przepływowej: barwienie powierzchni (patrz krok 2.2)
    UWAGA: Jak opisano wcześniej dla próbek do wstępnego sortowania, z wyjątkiem przygotowania próbki. Próbki po sortowaniu mogą być używane w postaci nierozcieńczonej.
    1. Użyć nierozcieńczonych posortowanych próbek i postępować zgodnie z krokiem 2.2.3. (Rysunek 6A)
  2. Charakterystyka stężenia i wielkości EV za pomocą NTA (patrz krok 2.4)
    UWAGA: Jak opisano wcześniej dla próbek do wstępnego sortowania, z wyjątkiem przygotowania próbki. Próbki po sortowaniu mogą być używane w postaci nierozcieńczonej.
    1. Użyć nierozcieńczonych, posortowanych próbek i postępować zgodnie z krokiem 2.4.2. (Rysunek 6B)
  3. Charakterystyka morfologii EV za pomocą TEM (patrz krok 2.5)
    UWAGA: Jak opisano wcześniej dla próbek do wstępnego sortowania, z wyjątkiem przygotowania próbki.
    1. Dodać 2 ml PBS do koncentratora odśrodkowego (membrana z regenerowanej celulozy, MWCO 100 kDa), nasadki i wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym. Usuń niefiltrowany PBS ze spodu urządzenia filtrującego.
    2. Odessać filtrat z probówki zbiorczej. Przedstawiony protokół ultrafiltracji odśrodkowej opiera się na przetwarzaniu do 15 ml próbek (maksymalna objętość).
    3. Dodaj do 15 ml próbki do filtra AU-15 i zakryj urządzenie. Wirować przy 4 000 x g przez maksymalnie 30 min. Skoncentruj do minimalnej objętości dozwolonej przez urządzenie, około 100-150 μL.
    4. Odzyskaj skoncentrowaną, posortowaną próbkę EV z urządzenia filtrującego i postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem dla próbek do wstępnego sortowania próbek TEM (krok 2.5.2) ( Rysunek 6C).

figure-protocol-6
Rysunek 6: Charakterystyka posortowanych ASC-EVs. Analiza markerów EV za pomocą cytometrii przepływowej. Analizowano ekspresję markerów: CD9, CD63, CD81 i CD44. Tylko dodatnie CFSE ASC-EV zostały przeanalizowane pod kątem ekspresji markera. (A) Histogramy reprezentują niebarwione (czerwone histogramy) i barwione (niebieskie histogramy) ASC-EV. (b) Charakterystyka ASC-EV przez NTA. Histogramy reprezentują stężenie (cząstki/ml)/wielkość (nm) próbek z sortowania wstępnego (po lewej) i końcowego (po prawej). (C) Wizualizacja ASC-EV za pomocą TEM próbki do sortowania wstępnego (po lewej) i po sortowaniu (po prawej). Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koraliki z polistyrenu FSC zostały posortowane w celu sprawdzenia warunków konfiguracji i sortowania instrumentu. Koraliki polistyrenowe FSC są mieszanką kulek fluorescencyjnych o długości fali od 100 nm, 300 nm, 500 nm i 900 nm i są widoczne na kanale FITC. Rysunek 7A pokazuje skalę logarytmiczną SSC w porównaniu z wykresem punktowym skali logarytmicznej FITC z czterema populacjami koralików przed sortowaniem. Populacje fluorescencyjne o długości fali 100 nm, 300 nm i 500 nm zostały bramkowane i posortowane. Posortowane koraliki zostały przeanalizowane pod kątem czystości i wzbogacenia jako wstępny dowód koncepcji (Rysunek 7B). Wszystkie populacje były czyste po sortowaniu. Szum tła odniesienia jest zawsze widoczny na wykresach punktowych przed i po sortowaniu.

Aby spełnić wymagania wymienione w MISEV2018/2023 oraz zademonstrować naturę pęcherzyków i ich stopień czystości, przeprowadzono eksperymenty mające na celu analizę markerów obecnych lub nieobecnych na EV. EV są dodatnie dla niektórych określonych znaczników powierzchni15: CD9, CD63, CD81 i CD44. CD9, CD63 i CD81 należą do rodziny białek błonowych tetraspanin i są najczęstszymi markerami do identyfikacji egzosomów16. CD44 jest markerem o wysokiej ekspresji przez MSCs i ASCs17.

EVs są również dodatnie dla cytozolowego białka Caveolin, jak wykazano w eksperymencie z cytometrią przepływu wewnątrzkomórkowego. Dodatkowo, western blot potwierdza dodatniość dla CD9, CD81, TSG101, Flotyliny i negatywność dla Calnexin (Rysunek 2).

Następnie, ASC-EV oznaczone przez CFSE zostały posortowane zgodnie z raportem w protokole. Tę procedurę sortowania powtórzono czterokrotnie, zachowując dokładnie te same warunki przygotowania, barwienia i sortowania próbki (Tabela 1). W ten sposób wykazano powtarzalność protokołu.

Przeprowadzono zestaw eksperymentów w celu przeanalizowania populacji ASC-EVs posortowanych przez CFSE i wykazania, że ich cechy nie zmieniły się podczas sortowania. W szczególności wyrażenie CD9, CD63, CD81 i CD44 nie zmienia się po sortowaniu (Rysunek 6A).

Kolejny krytyczny punkt dotyczy wymiarów pojazdów elektrycznych i tego, jak mogą się one zmieniać po procedurze sortowania z powodu naprężeń wywołanych ciśnieniem. Analiza po sortowaniu była trudna do przeprowadzenia ze względu na małą ilość próbki, ale analiza śledzenia nanocząstek pokazuje, że rozkład dwóch próbek ASC-EVs (sortowanie przed i po sortowaniu) był taki sam (Rysunek 6B). Wreszcie, analiza EV za pomocą TEM pokazuje, że ich morfologia nie wydaje się znacząco zmieniona po sortowaniu (Rysunek 6C).

Warto zauważyć, że zgodnie z wytycznymi ramowymi MIFlowCyt-EV18, zaobserwowano zmniejszenie ilości CFSE-dodatnich EV po potraktowaniu 0,1% próbki Triton X-100, co potwierdza ich pęcherzykowe pochodzenie (Rysunek 8).

figure-results-1
Rysunek 7: Sortowanie kulek z polistyrenu FSC. (A) Wykres punktowy SSC/FITC koralików przed sortowaniem. Wykres punktowy SSC/FITC ponownie przeanalizowanych koralików po sortowaniu: (B) posortowane koraliki 100 nm, (C) posortowane koraliki 300 nm i (D) posortowane koraliki 500 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 8: Degradacja membrany EV w obecności Tritona X-100. Triton X-100 w stężeniu 0,1% dodano do próbki na 15 min w temperaturze pokojowej. Podano reprezentatywne wykresy punktowe z trzech niezależnych eksperymentów z próbkami niepoddanymi działaniu substancji (po lewej) i poddanymi działaniu środka (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt. Rozdział Rozdział szt.
eksperymentLiczba posortowanych pojazdów elektrycznych Liczba pojazdów elektrycznych posortowanych według CFSE+Ciśnienie (psi)Dysza mmCzęstotliwość (Hz)
1Wymiary: 74 x 1064,8 x 106357066000
cyfra arabskaWymiary: 44 x 1067 x 106357066000
3Wymiary: 38 x 1063 x 106357066000
4Wymiary: 16 x 1062 x 106357066000

Tabela 1: Powtarzalność procedury sortowania

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza i sortowanie EV jest trudne ze względu na ich niewielkie rozmiary i fakt, że znajdują się one w pobliżu granicy wykrywalności większości cytometrów przepływowych. Naszym celem było opracowanie protokołu izolacji pojazdów elektrycznych pochodzących z AMSC oznaczonych CFSE. CFSE została wybrana jako metoda barwienia ze względu na zgłoszoną wysoką skuteczność znakowania EV (≥90%), bez tworzenia się niepożądanych cząstek, takich jak agregaty białkowe wydzielane przez przeciwciała. Niemniej jednak możliwe jest, że niewiele EV bez esterazy może zostać pominiętych i konieczne będą przyszłe badania w celu zidentyfikowania metod barwienia zdolnych do oznaczania tych cząstek do protokołów sortowania19.

Naszym celem było stworzenie warunków sortowania, które pozwolą na zbieranie czystych pojazdów elektrycznych bez zmiany ich właściwości fizycznych. Udało się to osiągnąć dzięki wykorzystaniu możliwości technicznych zastosowanego sortera i wdrożeniu określonych środków, takich jak zmniejszenie standardowego ciśnienia sortowania w zależności od rozmiaru dyszy. Ustaliliśmy i zwalidowaliśmy te warunki sortowania za pomocą kulek polistyrenowych FSC. Następnie zastosowaliśmy ten protokół do pojazdów elektrycznych ASC, powtarzając eksperyment cztery razy i konsekwentnie osiągając podobne wyniki, potwierdzając w ten sposób powtarzalność naszego protokołu.

Należy jednak zwrócić uwagę na kilka krytycznych aspektów i ograniczeń, które tutaj przedstawiamy. (i) Czystość posortowanej próbki: trudno jest jednoznacznie udowodnić czystość posortowanych EV z dodatnim wynikiem CFSE, ponieważ szum tła przyrządu zawsze pojawia się podczas ponownej analizy. Możemy jednak założyć, że wzbogaciliśmy populację CFSE-dodatnią. Brak zdarzeń CFSE dodatnich w populacji CFSE ujemnej wskazuje, że nasz proces sortowania zakończył się sukcesem, pośrednio wykazując czystość posortowanej próbki. (ii) Potencjalne zanieczyszczenie posortowanej próbki: nie możemy wykluczyć możliwości, że posortowana frakcja może zawierać małe pęcherzyki, które są niewykrywalne przez przyrząd i mogą zostać przypadkowo włączone do kropli sortujących. (iii) Integralność EV po sortowaniu: Zdajemy sobie sprawę, że nacisk wywierany przez przyrząd może potencjalnie uszkodzić pęcherzyki. Aby temu zapobiec, zastosowaliśmy dyszę 70 μm o niższym ciśnieniu 35 psi zamiast standardowych 60 psi. Dodatkowo starannie przygotowaliśmy próbki, unikając etapów ultrawirowania, które mogłyby zmienić właściwości fizyczne pojazdów elektrycznych. Pomimo tych środków ostrożności nie możemy zagwarantować, że posortowane pojazdy elektryczne pozostaną nienaruszone i niezmienione. Dlatego zalecamy włączenie analizy po sortowaniu oraz, jeśli to możliwe, testów funkcjonalnych w celu oceny stanu pojazdów elektrycznych.

Oto kilka możliwych modyfikacji i rozwiązywania problemów z protokołem. Protokół ten został ustalony za pomocą przyrządu, który umożliwia zmianę ciśnień; jednak w przypadku instrumentów o bardziej rygorystycznych ustawieniach zaleca się użycie dyszy 100 μm, aby uzyskać niższe ciśnienie, aby w jak największym stopniu zachować integralność pojazdów elektrycznych.

Pomimo tych rozważań twierdzimy, że nasz protokół oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi metodami separacji EV. Po pierwsze, pozwala na izolację określonych populacji pojazdów elektrycznych. Chociaż zdecydowaliśmy się na barwienie pęcherzyków za pomocą CFSE - barwnika fluorescencyjnego, który identyfikuje struktury z nienaruszonymi błonami komórkowymi - możliwe jest również sortowanie określonych populacji EV za pomocą przeciwciał monoklonalnych. W takich przypadkach niezbędne są dodatkowe kontrole barwienia. Międzynarodowe Towarzystwo Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV), Międzynarodowe Towarzystwo Postępu Cytometrii (ISAC) oraz Międzynarodowe Towarzystwo Zakrzepicy i Hemostazy (ISTH) zapewniają kompleksowe wytyczne dotyczące przeprowadzania powtarzalnych eksperymentów z cytometrią przepływową. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w wytycznych MISEV 20231 i MIFlowCyt -EV18. Po drugie, procedura ta jest mniej czasochłonna niż inne metody, które obejmują wiele etapów ultrawirowania.

Naszym zdaniem protokół ten może być skuteczną strategią separacji i zbierania określonej populacji pojazdów elektrycznych, która może być potencjalnie przydatna do celów terapeutycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Emanuele Canonico za wsparcie techniczne. Część tych prac została przeprowadzona w ALEMBIC, zaawansowanym laboratorium mikroskopowym założonym przez IRCCS Ospedale San Raffaele i Università Vita-Salute San Raffaele. Prace Enrico Ragni i Laury de Girolamo były wspierane przez włoskie Ministerstwo Zdrowia "Ricerca Corrente".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dioctan 5(6)-karboksyfluoresceiny  Ester N-sukcynimidylowyMerck150347-59-4
Mezenchymalne komórki zrębu tłuszczowegoWepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Gré goire, FrancjaKomórki użyte w tym badaniu
Alexa 488 anty-kaweolinaR& D SystemsIC5736GPrzeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD44BioLegend338805Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD63BioLegend353007Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD81 (TAPA-1)BioLegend349509Przeciwciało do cytometrii przepływowej
APC anty-ludzkie CD9BioLegend312107Cytometria przepływowa przeciwciało
BC CytoFLEX SBeckman CoulterBC CytoFLEX S wyposażone w 3 lasery, niebieski, czerwony i fioletowy
Flow-Check Pro FluorospheresBeckman CoulterA63493Fluorescencyjne kulki kontrolne do MoFLO Astrios EQ
Oprogramowanie FlowJo (wersja 10.8.1)BDwersja 10.8.1Oprogramowanie analityczne
Zestaw IntraSureBD Biosciences641776Utrwalanie i przepuszczalność do barwienia wewnątrzkomórkowego
Megamix-Plus FSCBioCytex7802Koraliki polistyrenowe FSC 
MoFLO Astrios EQBeckman CoulterMoFLO Astrios EQ wyposażony w 4 lasery, niebieski, żółty - zielony, fioletowy i czerwony
Mysz przeciwciało anty-FLOT1Laboratoria Transdukcji BD610820Przeciwciało Western Blot
NanoSight NS300MalvernNS300
Królicze przeciwciało anty-CalnexinOrigeneTA336279Western Blot
Przeciwciało królicze anty-CD9 i CD81 (zestaw przeciwciał ExoAb)System BiosciencesEXOAB-KIT-1Przeciwciała Western Blot
Przeciwciało królika anty-TSG101 MerckHPA006161Przeciwciało Western Blot
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Rainbow Fluorescencyjne cząstkiSpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Verity ShellsExometryOrgano kulki krzemionkowe do kalibracji rozproszenia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application. J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  3. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  4. Witwer, K. W., Wolfram, J. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).
  5. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  6. Du, S., et al. Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).
  7. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  8. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).
  9. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  10. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).
  11. Galipeau, J., Sensébé, L. Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  12. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  13. Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining. BMC Cell Biol. 7, 25(2006).
  14. Morales-Kastresana, A., et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).
  15. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).
  16. Andreu, Z., Yanez-Mo, M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 5, 442(2014).
  17. Mildmay-White, A., Khan, W. Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).
  18. Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments. Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).
  19. Maia, J., et al. Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control. Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular Vesicle IsolationMesenchymal Stromal CellsEV SortingFlow CytometryAdipose Derived MSCsNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopyCFSE LabelingGating StrategyEV Purity Check

Powiązane artykuły