Artykuł metodologiczny

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

DOI:

10.3791/67234

⸱

20 września 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy (Exo) to dwuwarstwowe struktury lipidowe wydzielane przez różne komórki, w tym komórki zwierząt, roślin i prokariontów. Wcześniejsze badania wykazały, że egzo pochodzące z humoralu lub supernatantu komórkowego są obiecującymi celami dla nowych biomarkerów diagnostycznych lub prognostycznych, co podkreśla ich znaczącą rolę w patogenezie choroby. Egzo pochodzenia tkankowego (Ti-Exo) przyciąga coraz większą uwagę ze względu na jego zdolność do dokładnego odzwierciedlania specyfiki tkankowej i mikrośrodowiska. Ti-Exo, obecne w przestrzeni śródmiąższowej, odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej i sygnalizacji międzynarządowej. Pomimo uznanej wartości w wyjaśnianiu mechanizmów chorobowych, izolowanie Ti-Exo pozostaje wyzwaniem ze względu na złożoność matryc tkankowych i zmienność metod ekstrakcji. W tym badaniu opracowaliśmy praktyczny protokół izolowania egzosomów z tkanki śledziony myszy, zapewniając powtarzalną technikę późniejszej analizy identyfikacyjnej i badań funkcjonalnych. Zastosowaliśmy trawienie kolagenazy typu I w połączeniu z ultrawirowaniem różnicowym, aby wyizolować Exo pochodzące ze śledziony. Charakterystykę wyizolowanego egzoenzymu określono za pomocą mikroskopii elektronowej, cytometru nanoprzepływowego i western blot. Wyizolowany Exo pochodzący ze śledziony wykazywał typową morfologię dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych, o rozmiarach cząstek od 30 nm do 150 nm. Ponadto profil ekspresji markerów egzosomów potwierdził obecność i czystość egzosomów. Podsumowując, udało nam się opracować praktyczny protokół izolowania egzo pochodzącego ze śledziony u myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzosomy (Exo) to podgrupa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), o rozmiarach od 30 do 150 nm, obejmująca różnorodny wachlarz biomolekuł, w tym białka, kwasy nukleinowe i lipidy1. Te biomolekuły pochodzą z komórek rodzicielskich i są uwalniane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Exo ułatwia wymianę informacji biomolekularnych między komórkami i otaczającym je mikrośrodowiskiem, odgrywając rolę zarówno w systemach prokariotycznych, jak i eukariotycznych2. Cechy egzosomów, takie jak zawartość, rozmiar, składniki błony i pochodzenie komórkowe, są bardzo zmienne i zależy od typu komórki źródłowej, stanu komórkowego i warunków środowiskowych.

Egzosomy są zwykle klasyfikowane do trzech kategorii w zależności od ich źródła: pochodzące z hodowli komórek, pochodzące z płynów ustrojowych i pochodzące z tkanek (Ti-Exo). Podczas gdy egzosomy pochodzące z hodowli komórkowych były szeroko badane ze względu na ich dostępność i stałą wydajność, ich zastosowanie jest ograniczone przez potencjalne zmiany w charakterystyce komórek po długotrwałej hodowli, które mogą błędnie przedstawiać ich funkcje biologiczne3,4,5. Co więcej, większość kultur komórkowych jest utrzymywana w dwuwymiarowych środowiskach, które nie naśladują złożonych interakcji międzykomórkowych in vivo, co może mieć wpływ na interpretację danych6. I odwrotnie, egzosomy wyizolowane z płynów biologicznych oferują minimalnie inwazyjną opcję monitorowania postępu choroby w czasie rzeczywistym7. Jednak próbki te często zawierają mieszaninę egzosomów różnego pochodzenia, co komplikuje dokładną identyfikację ich pierwotnego źródła8. Biorąc pod uwagę te wyzwania, rośnie zainteresowanie Ti-Exo, które znajdują się w śródmiąższu zewnątrzkomórkowym i są kluczowymi mediatorami sygnalizacji międzykomórkowej.

Śledziona odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu układu odpornościowego i utrzymaniu wewnętrznej homeostazy. Pomimo istniejących protokołów izolowania Ti-Exo z narządów takich jak mózg, wątroba i nowotwory, praktyczne metody egzosomów pochodzących ze śledziony są ograniczone do raportowania9,10. Badanie to miało na celu ustanowienie praktycznego protokołu izolowania egzosomów z tkanki śledziony u myszy zmodyfikowanych w stosunku do poprzedniego raportu11. Szczegółowo opisujemy metodę polegającą na trawieniu kolagenazy, a następnie ultrawirowaniu, co minimalizuje przerwanie błony komórkowej i zapewnia wysoką czystość i wydajność Exo pochodzącego ze śledziony. Charakterystyka wyizolowanego egzo przy użyciu tego ustalonego protokołu została zwalidowana za pomocą mikroskopii elektronowej (TEM), cytometru nanoprzepływowego (Nano-FCM) i western blot, potwierdzając skuteczność protokołu w dalszych badaniach eksperymentalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki zostały pobrane od myszy, za zgodą etyczną udzieloną przez Komitet Etyki Uniwersytetu Medycznego w Guangdong. Szczegółowe opisy materiałów, sprzętu i oprogramowania wykorzystanego w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów. Szczegóły przygotowania przed ekstrakcją są zilustrowane w Rysunek 1, natomiast proces ekstrakcji i wzbogacania Spleen-Exo jest opisany w Rysunek 2.

1. Przygotowanie

  1. Wstępnie schłodzić wirówki szybkoobrotowe i ultraszybkie do temperatury 4 °C i ustawić temperaturę wytrząsarki biurkowej na 37 °C.
  2. Przygotuj naczynia do hodowli komórkowych (figure-protocol-1100 mm), 50 ml sterylnych probówek wirówkowych, lód i sitko do sterylnych komórek (figure-protocol-270 μm), jak pokazano w Rysunek 1A, B.
  3. Wysterylizuj nożyczki i kleszcze za pomocą sprayu 75% alkoholu, a następnie sterylizuj w wysokiej temperaturze. Narzędzia te są pokazane w Rysunek 1C.
  4. Umieść tkankę śledziony w sterylnym figure-protocol-3100 mm szalka Petriego na lodzie i zmyj powierzchnię krwi 1x mrożonym sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS). Osuszyć tkanki śledziony sterylną gazą i zważyć je po wysuszeniu.
    UWAGA: Jeśli tkanka jest zamrożona, rozmrozić ją w naczyniu przez 15 minut na lodzie przed kontynuowaniem.
  5. Nawilż sitko komórkowe (figure-protocol-470 μm), wrzucając 1 ml sterylnego PBS do sitka za pomocą sterylnej pipety transferowej.
  6. Przygotować bufor trawienny (0,1% kolagenazy typu I) za pomocą 1x PBS z mieszalnikiem wirowym.
    UWAGA: Stosować 10 ml buforu trawiennego na każde 100 mg tkanki śledziony. Stężenie kolagenazy zostało wybrane w tym badaniu na podstawie instrukcji produktu. W przypadku innych typów tkanek naukowcy mogą być zmuszeni do dostosowania tych parametrów w oparciu o gęstość i skład tkanki. Zaleca się wstępne eksperymenty o różnych stężeniach i czasach trawienia w celu określenia optymalnych warunków dla każdego typu tkanki.

2. Trawienie tkankowe

  1. Pokrój tkankę na jednolite małe kawałki nożyczkami w naczyniu hodowlanym na lodzie (Rysunek 3A) i przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml ze sterylną pipetą do przenoszenia.
  2. Dodać bufor wytrawiający do probówki zgodnie z masą tkanki śledziony, jak wskazano powyżej (Rysunek 3B), a następnie wstrząsnąć probówką pod kątem 45° na poziomej wytrząsarce w temperaturze 37 °C. Monitoruj postęp trawienia i zatrzymaj trawienie, gdy kawałki tkanek rozproszą się, a większość z nich straci swój kształt. Czas trawienia powinien różnić się w zależności od tkanki. W warunkach eksperymentalnych w tym badaniu czas trawienia wynosi około 30 minut.
  3. Przetrawioną mieszaninę przenieść do sitka komórkowego (Ф70 μm) w temperaturze pokojowej (RT) w celu usunięcia włóknistych i większych resztek tkanek.
    UWAGA: Pełna filtracja natychmiast po strawieniu.
  4. Zebrać filtrat do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

3. Izolacja egzosomów przez wirowanie różnicowe

  1. Odwirowywać filtraty w temperaturze 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawierający szczątki komórek, szczątki komórkowe i jądra komórkowe można zobaczyć po odwirowaniu, jak pokazano na Rysunek 3C.
  2. Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 3000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawierający ciała apoptotyczne i mikrosomy można zobaczyć po odwirowaniu, jak pokazano na Rysunek 3D.
  3. Przenieść supernatant do nowej probówki i odwirować przy 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Osad zawierający mikropęcherzyki i błonę plazmatyczną można zobaczyć po odwirowaniu, jak pokazano na Rysunek 3E.
  4. Otrzymany supernatant należy odwirować ultra w temperaturze 120 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki po odwirowaniu można zobaczyć osad, jak pokazano na Rysunek 3F.
  5. Odrzucić supernatant, przemyć osad PBS i ponownie odwirować przy 120 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu uzyskania egzosomów. Na dnie probówki po odwirowaniu można zobaczyć osad, jak pokazano na Rysunek 3G.
  6. Rozpuść wyizolowane egzosomy za pomocą sterylnego PBS (200 μl na śledzionę) i przechowuj wyizolowane egzosomy w nowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml w temperaturze -80 °C.

4. Charakterystyka egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)

UWAGA: TEM został użyty do określenia, czy wyekstrahowany Exo wykazywał cechy pęcherzyków. Próbki egzo zidentyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej muszą być świeżymi próbkami lub przechowywane przez krótki czas w temperaturze 4 °C.

  1. Utrwal egzosomy (2-6 μg/μL) za pomocą paraformaldehydu klasy 2% do mikroskopii elektronowej (EM) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Umieścić 10 μl roztworu egzosomu na siatce miedzianej, inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, spłukać sterylną wodą destylowaną i osuszyć nadmiar płynu bibułą absorpcyjną.
  3. Miedzianą siatkę zabarwić 2% octanem uranylu przez 1 minutę, nadmiar płynu osuszyć bibułą filtracyjną i wysuszyć pod żarówką przez 2 minuty.
  4. Przygotować próbkę obserwować pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym pod napięciem 80 kV.

5. Rozkład wielkości i pomiar stężenia cząstek egzosomów

  1. Załadować standardowe nanocząstki polistyrenu (250 nm) do cytometru nanoprzepływowego.
  2. Zmierz stężenie białka w próbkach Exo za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA. Rozcieńczyć próbkę Exo PBS zgodnie z wynikami testu białkowego BCA (rozcieńczyć egzosomy do 1-10 ng / μL), a następnie załadować próbki Exo do nanoprzepływu w celu zmierzenia intensywności rozpraszania bocznego (SSI).
  3. Obliczać Stężenie egzo zgodnie ze stosunkiem SSI do stężenia cząstek w standardowych nanocząstkach polistyrenu.
    UWAGA: W celu pomiaru wielkości krzywa standardowa jest generowana przez załadowanie standardowych nanocząstek krzemionki o rozmiarach gradientu (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) do cytometru nanoprzepływowego. Ładowanie próbki Exo następuje po tym. Rozkład wielkości Exo został obliczony zgodnie ze standardowym lekarstwem.

6. Potwierdzenie lizy i immunoblot białek egzosomów

  1. Dodać 100 μl buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA) do osadu egzosomu w celu analizy białka.
  2. Wirować energicznie, przykryć parafilmem, bujać się przez 20 minut przy RT, a następnie ponownie wirować.
  3. Odwirować krótko przy 1000 x g przez 30-60 s w celu zebrania próbki, przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze od -20 °C do -80 °C do czasu analizy.
  4. W przypadku immunoblot wymieszaj próbki z buforem ładującym 5x, aby uzyskać stężenie 1x i przygotuj się do elektroforezy żelowej.
  5. Jeśli pożądane są kontrole homogenatu całej tkanki, należy użyć silnego buforu do lizy z inhibitorem proteazy w celu lizy tkanki, jak opisano powyżej. Następnie odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 10 minut i wyrzucić pozostałą macierz zewnątrzkomórkową, całe komórki lub nienaruszone resztki komórkowe.
  6. Gotować bufor próbki zawierający egzosomy lub homogenat tkankowy w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut. Załadować równe białko na linię do 10% żelu SDS-PAGE. Załaduj równe białko homogenatu tkankowego jako kontrolę.
  7. Kontynuować elektroforezę żelową pod napięciem 80 V przez około 2 godziny przy użyciu konwencjonalnego bufora do elektroforezy. Wykonaj analizę western blot, aby potwierdzić ekspresję białka Exo w oczyszczonych lizatach i porównać względną obfitość Exo we frakcjach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i oczyszczanie egzosomów pochodzących ze śledziony
Aby wyizolować egzosomy z tkanki śledziony myszy, zastosowaliśmy kombinację trawienia kolagenazy i różnicowego ultrawirowania (Ryc. 2). Początkowe kroki obejmowały wstępną obróbkę tkanki śledziony w celu usunięcia krwi powierzchniowej, a następnie trawienie kolagenazą typu I. Ta enzymatyczna obróbka ułatwiła rozkład składników macierzy zewnątrzkomórkowej, uwalniając w ten sposób egzosomy przy jednoczesnym zachowaniu ich integralności. Po trawieniu zastosowano szereg etapów wirowania w celu sekwencyjnego usunięcia resztek komórkowych, ciał apoptotycznych i większych pęcherzyków, czego kulminacją było ultrawirowanie supernatantu przy 120 000 x g w celu osadzenia egzosomów. Kolejne procedury izolacji dały rozpuszczalne w PBS granulki wzbogacone o Exo pochodzące ze śledziony, jak pokazano na Rysunek 3G.

Wyniki TEM
Morfologię izolowanych egzosomów zbadano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej, złotego standardu metody badania charakterystyki egzosomów. TEM jest powszechnie stosowany do walidacji obecności egzosomów, oceny jakości egzosomów i obserwacji morfologii egzosomów. Obrazy TEM (Ryc. 4A) ujawniły obecność pęcherzyków w kształcie miseczek, które są charakterystyczne dla egzosomów. Pęcherzyki te wykazywały wyraźną dwuwarstwową strukturę lipidową, co potwierdza udaną izolację egzosomów z tkanki śledziony.

Rozkład wielkości Spleen-Exo
Rozkład wielkości i stężenie egzosomów określono za pomocą cytometru nanoprzepływowego. Wyniki (Rysunek 4B) wskazały, że średnica izolowanych egzosomów wahała się od 30 do 150 nm, ze szczytowym stężeniem około 60 nm. Średnica izolowanych cząstek wynosiła głównie od 50 do 80 nm, przy średnim stężeniu cząstek 4,6 x 109 cząstek/ml. Ten zakres rozmiarów jest zgodny z wcześniej opisanymi cechami egzosomów, co dodatkowo potwierdza słuszność protokołu izolacji.

Analiza Western blot
Aby potwierdzić obecność markerów egzosomalnych, przeprowadziliśmy analizę western blot. Markery egzosomalne TSG101 i CD9 wykryto w próbkach Spleen-Exo, podczas gdy GM130, białko macierzy Golgiego stosowane jako kontrola ujemna, nie zostało wykryte (Figura 4C). Dla porównania, białko tych markerów ulegało ekspresji w tkankach śledziony myszy (Spleen-T). Świadczy to o wysokiej czystości wyizolowanych egzosomów, ponieważ były one pozbawione zanieczyszczeń komórkowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie dostaw. (A) 50 ml probówek wirówkowych, szalek hodowlanych, lodu i narzędzi chirurgicznych umieszczono w komorze bezpieczeństwa biologicznego. (B) Sterylne sitko komórkowe (figure-results-270 μm). (C) Sterylizowane narzędzia chirurgiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2: Procedura izolacji śledziony-egzo. Przygotuj tkankę śledziony i pokrój ją na małe kawałki w mrożonym PBS, a następnie wytrawij kolagenazą typu I i odwiruj zgodnie ze wskazaniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy izolacji Sśledziony-Exo. (A) Małe bloki śledziony gotowe do późniejszego trawienia. (B) Bloki tkanki śledziony z buforem trawiennym. (C) Granulki po odwirowaniu 500 x g. (D) Granulki po odwirowaniu 3,000 x g. (E) Granulki po odwirowaniu 10 000 x g. (F) Granulki po odwirowaniu 120 000 x g. (G) Granulki egzosomów po odwirowaniu 120 000 x g. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 4: Identyfikacja Spleen-Exo. (A) Wyniki TEM pokazujące izolowane cząstki jako okrągłe lub owalne błoniaste pęcherzyki o miseczkowatej morfologii. Podziałka = odpowiednio 200 nm i 50 nm. (B) Analiza rozkładu wielkości za pomocą Flow Nano Analyzer wykazała, że średnica Spleen-Exo wahała się dominująco od 50 nm do 80 nm, przy średnim stężeniu cząstek 4,6 × 109 cząstek/ml. (C) Analiza Western blot wykazująca ekspresję białek markerowych specyficznych dla egzosomów (TSG101 i CD9) w Spleen-Exo, z ujemną ekspresją GM130. Markery te były wykrywalne w próbkach białek wyekstrahowanych ze śledziony myszy (grupa Spleen-T). Pokazano reprezentatywne obrazy western blot (n = 6 tkanek). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania wykazały, że egzosomy pochodzące ze śledziony (Spleen-Exo) odgrywają kluczową rolę w leczeniu raka żołądka12. Aby dokładniej wyjaśnić funkcje Spleen-Exo, konieczne jest ustalenie powtarzalnej i optymalnej metody ich ekstrakcji z tkanki śledziony. Chociaż istnieją protokoły izolowania egzosomów z raka mózgu i wątroby13,14, metody dla innych tkanek pozostają słabo rozwinięte i wymagają dalszej walidacji. W tym badaniu przedstawiliśmy praktyczną metodę izolowania Exo z tkanki śledziony.

W ciągu ostatnich lat do ekstrakcji egzo w badaniach naukowych i zastosowaniach stosowano różne metody, w tym ultrawirowanie, wirowanie w gradiencie gęstości, immunoadsorpcję kulek magnetycznych, ultrafiltrację i wytrącanie polimerów15. Ultrawirowanie pozostaje złotym standardem w ekstrakcji egzo z różnych źródeł. Wcześniejsze badania koncentrowały się na rozbijaniu struktur tkankowych w celu uzyskania wyższych stężeń Exo, który składa się z wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych źródeł Exo16. Kolagenaza minimalizuje wpływ na integralność błony komórkowej, zapewniając czystość Ti-Exo3. Kolagenaza była stosowana do ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich przerzutowych czerniaków, tkanki tłuszczowej, raka jelita grubego i raka wątroby 5,10,13,17. Jednak stężenie i czas trawienia kolagenazy różnią się w zależności od tkanki.

Ustaliliśmy specjalny protokół izolowania Spleen-Exo przy użyciu kolagenazy typu I do trawienia, a następnie filtracji przez różnicowe ultrawirowanie, aby uzyskać wysokiej jakości Spleen-Exo. Ultrawirowanie może skutecznie usunąć resztki komórek, duże pęcherzyki, szczątki komórkowe i ciała apoptotyczne z próbek16. Crescitelli i in. zastosowali kolagenazę D i ultrawirowanie gradientowe w celu wyizolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych o średniej wielkości 75 nmśrednicy5. W porównaniu z ich protokołem, w naszym protokole wykorzystano kolagenazę typu I i dodatkowy etap ultrawirowania przy 120 000 x g, aby uzyskać optymalną czystość egzosomów. W przeciwieństwie do poprzednich doniesień wykorzystujących homogenizację tkanek w celu uzyskania zawiesiny tkankowej14,18, nasze podejście zachowuje integralność błony komórkowej w tkankach. Ponadto Vella i in. zastosowali wirowanie w gradionym spadku gęstości (potrójny gradient sacharozy) w celu wygenerowania trzech grup cząstek, co wymagało dodatkowego czasu na operację10. W wyniku tego podejścia powstały duże pęcherzyki o wielkości ponad 200 nm, niejednorodna populacja pęcherzyków o rozmiarach od 50 nm do 200 nm oraz małe pęcherzyki o wielkości około 20 nm. Protokół opisany w tym protokole badania obejmuje szereg etapów ultrawirowania w celu metodycznego eliminowania resztek komórek, szczątków komórkowych, ciał apoptotycznych i większych pęcherzyków, zwiększając w ten sposób czystość uzyskanego Exo. Kładziemy nacisk na ostrożne obchodzenie się z supernatantem, aby uniknąć naruszenia osadzonych granulek.

Oceniamy morfologię i czystość wyizolowanego Spleen-Exo za pomocą TEM i analizy śledzenia nanocząstek. Oba testy wykazały, że cząstki pochodzące ze śledziony wyizolowane za pomocą tego protokołu wykazywały dwuwarstwę lipidową i pęcherzyki w kształcie miseczki o rozmiarach od 30 nm do 150 nm, które są typowymi cechami egzosomów19. CD9 i TSG101 są markerami egzosomów19, a GM130, białko Golgiego, jest używane jako ujemny marker do identyfikacji egzosomów20. Wyniki wykazały, że Spleen-Exo były dodatnie dla CD9 i TSG101, podczas gdy GM130 nie został wykryty, co potwierdza udaną izolację wysokiej jakości Exo pochodzącego tkankowo ze śledziony.

Aby uzyskać wysokiej jakości Ti-Exo, niezbędny jest wybór odpowiedniego rodzaju enzymu, stężenia i czasu trawienia, a także prawidłowe przechowywanie w tkankach. Nie zaobserwowaliśmy znaczącej różnicy w stężeniach białek między Exo pochodzącym ze świeżych i mrożonych tkanek śledziony (dane nie pokazane), co wskazuje na możliwość przetwarzania dużych ilości zamrożonych tkanek w celu skrócenia przepływu pracy. Izolowanie Ti-Exo wymaga długiego czasu pracy ultrawirówki, co sprawia, że niepraktyczne jest wykonanie całego protokołu w odpowiednim czasie w przypadku stosowania świeżych tkanek w zastosowaniach klinicznych. Dlatego lepszym rozwiązaniem byłoby użycie zamrożonych tkanek do izolacji egzosomów. Rozmrażanie w temperaturze 37 °C nie jest odpowiednie dla zamrożonych tkanek ze względu na niepełną penetrację środków krioprotekcyjnych w tkankach. Doniesiono, że podczas izolacji egzosomów przy użyciu zamrożonych tkanek rozmrażających się na lodzie, wydajność egzosomów nie wykazała znaczenia w zawartości w porównaniu ze świeżymi tkankami21. W związku z tym rozmroziliśmy zamrożone tkanki śledziony na lodzie, aby przeprowadzić izolację egzosomów przy użyciu próbek do przechowywania w temperaturze -80 °C.

Jednak protokół opisany w tym badaniu ma kilka ograniczeń. Obszerne etapy związane z ekstrakcją i identyfikacją są czasochłonne. Biorąc pod uwagę ostateczny cel, jakim jest zastosowanie badań Exo w klinicznym leczeniu chorób, szybsze i bardziej opłacalne metody stają się coraz bardziej krytyczne. Ponadto, chociaż wyniki opierają się na próbkach tkanek myszy, zastosowanie do tkanek ludzkich pozostaje do ustalenia.

Podsumowując, protokół zapewnia metodę ekstrakcji wysoce czystego Exo z tkanki śledziony, odpowiednią do szczegółowej dalszej analizy. Egzo pochodzenia tkankowego dokładniej odzwierciedla mikrośrodowisko, z którego pochodzą, i ma znaczny potencjał w wyjaśnianiu procesów fizjologicznych i patologicznych zachodzących w organizmach żywych. Przyszłe badania mogą dostosować ten protokół do tkanek ludzkich, umożliwiając ekstrakcję klinicznie istotnych egzosomów do celów diagnostycznych i terapeutycznych. Technika ta może być szczególnie przydatna w badaniu roli egzosomów w odpowiedziach immunologicznych, biorąc pod uwagę krytyczną funkcję śledziony w układzie odpornościowym. Co więcej, protokół może zostać zmodyfikowany w celu wyizolowania egzosomów z innych tkanek, co potencjalnie pomoże w opracowaniu biomarkerów specyficznych dla tkanek i terapii celowanych. Pogłębiając naszą wiedzę na temat biologii egzosomów, protokół ten może przyczynić się do postępu w medycynie precyzyjnej i opracowania nowych strategii terapeutycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82370281, 81870222), Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong (2022A1515012103) oraz Naukę, Specjalny Fundusz Rozwoju Technologii Competitive Allocation Project of Zhanjiang City (2021A05086) oraz Fundację Startup z Drugiego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego Guangdong (23H03).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 &mikro; m Cell StrainerBiologix Group Co., Ltd.USA15-1070
Przeciwciało anty CD9Cell Signaling Technology, Inc (CST), USA983275
Przeciwciało anty GM130Proteintech Group, Inc.China 66662-1-lg
Przeciwciało anty TSG101Abcam Plc, Wielka Brytania125011
Naczynie do hodowli komórkowychWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chiny704001
Probówka wirówkowaWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chiny788211
Kolagenaza typu ISigma-Aldrich Corp., USAC2674
Wytrząsarkatermostatyczna na biurkoShanghai bluepard instruments Co., Ltd., ChinyTHZ-100
Bufor do elektroforezyWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chiny G2081-1L
Ulepszony zestaw do oznaczania białek BCAShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chiny P0010S
NanoAnalyzer przepływuNanoFCM Inc., ChinyN30E
 Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., ChinyGelView 6000Plus
HRP Koza anty-mysie IgGProteintech Group, Inc.Chiny 15014
HRP Koza anty-króliczaIgG Proteintech Group, Inc.Chiny 15015
czytnik mikropłytekMolecular Devices, USACMax Plus
MicroscissorsSzanghaj  Medyczne  Instrumenty (grupa) Co., Ltd.,ChinyWA1010
Pęseta mikroskopowaSzanghaj  Medyczne  Instrumenty (grupa) Co., Ltd., ChinyWA3010
Wirówka Multifuge X1R ProThermo Fisher Scientific, USA75009750
Nożyczki okulistyczneSzanghaj  Medyczne  Instrumenty (grupa) Co., Ltd.,ChinyY00030
Pęseta oftalmicznaSzanghaj  Medyczne  Instrumenty (Grupa) Co., Ltd., Chiny JD1060
Optima XPN-100 Wirówka ultrafiltracyjnaBeckman Coulter, USAA94469
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., ChinyP1003
Bufor do lizy RIPA (silny, bez inhibitorów)Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chiny P0013K
Linijkadeli  Produkcja  Firma, Chiny
SDS-PAGE Bufor ładowania próbki, 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chiny P0015
Pipet transferowyBiologix Group Co., Ltd.USA30-0238A1
Transmisyjny mikroskop elektronowyHitachi, JaponiaH-7650
Probówka do ultrawirowaniaBeckman Coulter, USA355618
Zachodni bufor transferowy Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chiny G2028-1L
System obrazowania fluorescencyjnego/chemiluminescencyjnego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spleen ExosomesExosome IsolationTissue Derived ExosomesDifferential UltracentrifugationType I CollagenaseTransmission Electron MicroscopyNano Flow CytometryExosome MarkersImmune ResponseMouse Spleen Tissue

Powiązane artykuły