Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Podsumowanie

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Streszczenie

Obszerna charakterystyka mineralizacji tkanek w kontekście regeneracji kości stanowi poważne wyzwanie, biorąc pod uwagę liczne modalności, które są obecnie dostępne do analizy. W tym miejscu proponujemy przepływ pracy w celu kompleksowej oceny tworzenia się nowych kości przy użyciu odpowiedniego eksplantatu kostnego ex vivo dla dużych zwierząt. Ubytek kostny (średnica = 3,75 mm; głębokość = 5,0 mm) powstaje w eksplantowanej głowie kości udowej owcy i wstrzykuje się mu makroporowaty substytut kości obciążony proosteogennym czynnikiem wzrostu (białko morfogenetyczne kości 2 - BMP2). Następnie eksplant jest utrzymywany w kulturze przez okres 28 dni, co umożliwia kolonizację komórkową i późniejsze tworzenie kości. Aby ocenić jakość i strukturę nowo zmineralizowanej tkanki, stosuje się następujące następujące metody: (i) Charakterystyka i obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości całego eksplantatu za pomocą mikro-CT, a następnie analizy obrazów głębokiego uczenia w celu zwiększenia dyskryminacji zmineralizowanych tkanek; (ii) nanowgłębienie w celu określenia właściwości mechanicznych nowo powstałej tkanki; (iii) badania histologiczne, takie jak hematoksylina/eozyna/szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata w celu zapewnienia jakościowej oceny zmineralizowanej tkanki, szczególnie w odniesieniu do wizualizacji bariery kostnej i obecności komórek kostnych; (iv) Mapowanie skaningowej mikroskopii elektronowej z rozpraszaniem wstecznym (SEM) z wewnętrznym odniesieniem w celu ilościowego określenia stopnia mineralizacji i dostarczenia szczegółowych informacji na temat morfologii powierzchni, składu mineralnego i granicy faz kość-biomateriał; (v) Spektroskopia Ramana w celu scharakteryzowania składu molekularnego zmineralizowanej matrycy i uzyskania wglądu w trwałość BMP2 w cemencie poprzez wykrycie wiązań peptydowych. Ta multimodalna analiza zapewni skuteczną ocenę nowo powstałych kości oraz kompleksowe jakościowe i ilościowe informacje na temat zmineralizowanych tkanek. Poprzez standaryzację tych protokołów dążymy do ułatwienia porównań między badaniami oraz poprawy trafności i wiarygodności wyników badań.

Wprowadzenie

Wady kości, czy to spowodowane urazem, resekcją guza, wrodzonymi anomaliami czy infekcją, stanowią główne wyzwanie dla medycyny regeneracyjnej. Zmiany te zagrażają integralności strukturalnej układu kostnego, prowadząc do dyskomfortu, upośledzenia funkcjonalnego i obniżenia jakości życia pacjentów.

Aby sprostać tym wyzwaniom, pojawiły się innowacyjne strategie naprawy kości, koncentrujące się na poprawie osteogenezy i regeneracji tkanki kostnej. Podejścia te obejmują stosowanie wszczepialnych, wstrzykiwanych lub drukowanych w 3D substytutów kości, które mogą być pochodzenia naturalnego (np. makrocząsteczki pochodzenia biologicznego, hydroksyapatyt pochodzenia zwierzęcego) lub syntetycznego (np. bioszkła, fosforany wapnia)¹. Aby zwiększyć ich niską wrodzoną zdolność do kierowania i stymulowania regeneracji kości, substytuty kości mogą być ładowane czynnikami osteoindukcyjnymi, takimi jak białka morfogenetyczne kości (BMP), w celu promowania osteogennego różnicowania komórek progenitorowych i poprawy tworzenia kości².

Tworzenie kości opiera się na początkowym tworzeniu matrycy kolagenowej, która jest następnie mineralizowana przez kryształy hydroksyapatytu, wzmacniając w ten sposób strukturę kości³. Proces ten nadaje kości określoną sztywność i wytrzymałość. Jakość zmineralizowanej tkanki jest ściśle regulowana przez jej cechy mikrostrukturalne i stopień mineralizacji⁴. Ta cecha odgrywa kluczową rolę w gojeniu kości i funkcjonalności zregenerowanej kości⁵. Jednak charakterystyka mineralizacji kości pozostaje trudnym zadaniem ze względu na nieodłączną zmienność w badaniach wielowymiarowych^6,7,8.

Ponadto, wstępne oceny biokompatybilności, cytokompatybilności i potencjału różnicowania substytutów przeszczepów kostnych są zazwyczaj przeprowadzane in vitro. Rozbieżności metodologiczne utrudniają jednak bezproblemowe porównywanie wyników. Co więcej, te badania in vitro nie oddają w pełni interakcji wielokomórkowych i złożonego dialogu między populacjami komórek, w tym komórkami szpiku kostnego, które są niezbędne do regulacji procesu regeneracji kości⁹. Ten brak dokładnego odwzorowania mikrośrodowiska kości może zagrozić dokładności kolejnych badań przedklinicznych¹⁰.

Chociaż oceny in vivo dostarczają dokładniejszego odwzorowania kontekstów fizjologicznych, są one ograniczone względami etycznymi, logistycznymi i finansowymi. W związku z tym oceny ex vivo odgrywają kluczową rolę jako interfejs między badaniami in vitro i in vivo, służąc jako niezbędny etap pośredni przed przejściem do eksperymentów na żywych obiektach^11,12,13.

W tym kontekście, potrzebne jest wdrożenie kompleksowych metodologii charakteryzacji, aby ocenić jakość zregenerowanej tkanki kostnej i zapewnić adekwatność strategii przed przejściem do modelu przedklinicznego. W związku z tym proponujemy protokół oparty na analizie modelu eksplantacji z wykorzystaniem tkanki stawu kolanowego owcy. Ta innowacyjna metodologia polega na wszczepieniu cementu obciążonego BMP2 do eksplantatów i przeprowadzeniu szczegółowej analizy mineralizacji tkanek po 28 dniach hodowli.

Podejścia techniczne zastosowane w tym badaniu są zróżnicowane i komplementarne, łącznie zapewniając kompleksowe podejście do oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej (Rysunek 1). Obrazowanie mikrotomografią komputerową o wysokiej rozdzielczości umożliwia szczegółową wizualizację 3D struktury kości, dostarczając cennych informacji na temat gęstości mineralnej, morfologii i integralności nowo powstałej tkanki. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla oceny skuteczności regeneracji kości i monitorowania postępu mineralizacji w czasie. Nanotwardość to precyzyjne podejście do określania właściwości mechanicznych tkanki, takich jak jej twardość i wytrzymałość. Mierząc reakcję materiału na przyłożoną siłę w skali nanometrycznej, metoda ta umożliwia ocenę wytrzymałości i jakości zmineralizowanej tkanki. Badania histologiczne z użyciem powszechnych barwień, takich jak hematoksylina / eozyna / szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata dostarczają bezcennych informacji na temat struktury i składu tkanek. Barwienia te umożliwiają różnicowanie różnych składników tkanki, w tym komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i złogów mineralnych, umożliwiając w ten sposób kompleksową ocenę jakościową procesu regeneracji kości. Mapowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z rozproszeniem wstecznym (SEM) zapewnia wizualizację powierzchni próbek w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając szczegółową analizę stopnia mineralizacji macierzy kostnej, a także interfejsów między wszczepionym materiałem a tkanką gospodarza. Wreszcie, spektroskopia Ramana dostarcza informacji na temat składu molekularnego tkanki, w szczególności poprzez identyfikację określonych składników, takich jak białka, lipidy i minerały. Takie podejście umożliwia scharakteryzowanie zmineralizowanej matrycy i wykrycie czynników wzrostu, takich jak BMP2, dostarczając tym samym kluczowych informacji na temat utrzymywania się bodźców proosteogennych w pożywce regeneracyjnej.

Korzystając z multidyscyplinarnego podejścia, integrując różne techniki analityczne, nasze badanie ma na celu dostarczenie dokładnej i wszechstronnej oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej, zapewniając tym samym solidną podstawę do oceny substytutów przeszczepów kostnych i ich potencjalnego zastosowania klinicznego.

Protokół

To badanie zostało zatwierdzone przez komisję etyki i dobrostanu zwierząt oraz przez Francuską Krajową Administrację Weterynaryjną i Żywnościową pod numerem G44171.

1. Przygotowanie i hodowla eksplantatów kostno-chrzęstnych

1. Zbieraj próbki stawów owczych od świeżo uśpionych zwierząt w aseptycznym środowisku. Ułóż owcę w pozycji leżącej na plecach i ogol lewą tylną kończynę. Przygotuj przez dezynfekcję alkoholem wokół stawu kolanowego. Użyj bocznej artrotomii przyrzepkowej, aby odsłonić więzadła krzyżowe przednie i tylne, a następnie zwichnięcie rzepki, aby odsłonić bloczek kości udowej.
   1. Po pobraniu tkanek należy utworzyć ubytek o średnicy 4,75 mm w kłykciu bocznym za pomocą systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego.
2. Za pomocą młotka ortopedycznego utwórz ubytek o głębokości 10 mm i wyjmij eksplant z kłykcia. Następnie należy wykonać drugi defekt o średnicy 8 mm, wyśrodkowany wokół pierwszego, za pomocą systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego. W ten sposób powstają eksplantaty kostno-chrzęstne o wymiarach 8 mm x 10 mm, zawierające centralny ubytek o wymiarach 4,75 mm x 10,0 mm.
3. Jeśli jest to wymagane ze względów logistycznych, należy transportować eksplantaty w roztworze soli Hanka (hBSS) uzupełnionym 1% penicyliną-streptomycyną i przechowywać w temperaturze 4 °C.
4. Przepłukać eksplantaty 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie wstrzyknąć ubytek o wymiarach 4,75 mm x 10,0 mm za pomocą cementu fosforanowo-wapniowego uzupełnionego 40 μg/ml BMP2. Przygotuj cement zgodnie z poniższym opisem.
   1. Wytwarzać fosforan α-triwapniowy (α-TCP) poprzez obróbkę cieplną apatytycznych prętów fosforanu trójwapniowego (prasowanie izostatyczne w temperaturze 120 MPa) w temperaturze 1364 °C przez co najmniej 12 godzin, a następnie hartowanie powietrzem¹⁴.
   2. Zmiel pręty α-TCP w absolutnym etanolu za pomocą kuli młyna planetarnego 2x przez 5 minut przy 500 obr./min, aby uzyskać drobny proszek o wielkości 13,1 ± 1,7 μm (mierzony za pomocą dyfrakcji laserowej, jak opisano wcześniej¹⁴).
   3. Wysterylizować proszek α-TCP, ogrzewając go na sucho w temperaturze 180 °C przez 45 min. Przygotować cement fosforanowo-wapniowy, mieszając proszek α-TCP z 2,5% (w/v) Na₂HPO₄ 0,22 μm przefiltrowanym roztworem (stosunek ciecz/proszek 0,35) przez 1 min.
   4. Przed wstrzyknięciem należy załadować pastę cementową do strzykawki o pojemności 3 ml za pomocą igły 18 G.
5. Po 10 minutach w temperaturze pokojowej (RT) przenieś eksplantaty do kolby o powierzchni 25 cm² i delikatnie dodaj 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej składającej się z pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.
6. Eksplantaty należy utrzymywać do 28 dni w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i wymieniać kompletną pożywkę hodowlaną co 2 dni pod okapem z przepływem laminarnym.
7. Opłucz eksplantaty 3x PBS. Przenieś je do probówek o pojemności 50 ml, dodaj 20 ml 4% paraformaldehydu (PFA) i utrzymuj w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Następnie przepłucz eksplantaty PBS i przechowuj je w 70% etanolu przed kolejnymi analizami.

2. Analiza mikrotomografii komputerowej

1. Przeprowadzanie analiz mikrotomografii z wykorzystaniem promieniowania rentgenowskiego mikro-CT. Uzyskuj projekcje rentgenowskie w rozdzielczości 10,7 μm, z czasem naświetlania 1200 ms i filtrem aluminiowym 1 mm (80 kV i 125 μA). Uśredniaj trzy obrazy na każdy przyrost obrotu o 0,45°, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
2. Rekonstrukcja obrazów trójwymiarowych (3D) za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji producenta po wyrównaniu X/Y ze skanem referencyjnym, o następujących parametrach - Wygładzanie: 0, Artefakt pierścieniowy: 3, Hartowanie wiązki: 35%. Oczyść stosy obrazów za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i obserwuj za pomocą narzędzi do wizualizacji dwuwymiarowej (2D) i 3D.

3. Analiza obrazu metodą głębokiego uczenia

1. Przeprowadzaj segmentację obrazów za pomocą dedykowanego specjalistycznego oprogramowania. Użyj Kreatora zintegrowanej segmentacji, aby wytrenować model uczenia głębokiego pod kątem dyskryminacji kości i cementu.
2. Z zrekonstruowanych obrazów mikrotomografii komputerowej należy wybrać reprezentatywną strefę (tj. ramkę) zawierającą kość, cement i tło. Podziel tę pierwszą klatkę na segmenty ręcznie, korzystając z prostych (np. próg) lub potężnych narzędzi (np. propagacji) dostarczonych przez oprogramowanie.
3. Wygeneruj model głębokiego uczenia na karcie Model i wybierz opcję 3D-Unet Routine z menu rozwijanego. Zdefiniuj jego parametry eksperymentalne w adequation z obrazami do analizy, klikając prawym przyciskiem myszy wygenerowany model; tutaj: głębokość 5, rozmiar łaty 32 x 32, algorytm Adadetla, współczynnik kroku 0,25, rozszerzenie danych x10.
4. Użyj segmentowanej ramki, aby wytrenować procedurę głębokiego uczenia (kliknij przycisk Trenuj), która jest uznawana za istotną ze względu na jej szybkie i dokładne możliwości segmentacji obrazu^3,15. Po zakończeniu szkolenia zdefiniuj drugą strefę roboczą (ramkę) i automatycznie segmentuj ją za pomocą funkcji przewidywania.
   1. W razie potrzeby zastosuj ręczną korektę, aby wygenerować dokładniejsze dane treningowe. Trenuj rutynę po raz kolejny. Powtarzaj proces, aż do uzyskania zadowalającego wyniku; Liczba rozszerzeń danych stopniowo maleje wraz ze wzrostem liczby ramek treningowych.
      UWAGA: Indeks DICE dostarczony podczas trenowania modelu daje wskazówkę co do dokładności modelu (w porównaniu z informacjami wejściowymi), ale nie jest wystarczający. Potwierdzenie adekwatności modelu powinno zostać przeprowadzone poprzez walidację automatycznie segmentowanych danych przez 3 niezależnych, doświadczonych badaczy.
5. Opublikuj model, klikając przycisk Eksportuj i zastosuj go do całego zestawu danych micro -CT, klikając Segment > Exported Model > Segment Full Dataset.

4. Osadzanie

1. Odwodnić eksplantaty kostne, umieszczając je w szklanej fiolce o pojemności 40 ml zawierającej 25 ml roztworu odwadniającego składającego się z 70% acetonu i 30% ksylenu. Umieść szklaną fiolkę na obracającym się kole na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok 3 razy.
2. Zastąp roztwór odwadniający 25 ml ksylenu i umieść szklaną fiolkę na obracającym się kole na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Zastąp roztwór ksylenu 25 ml metakrylanu metylu (MMA) wzbogaconym 10% nadtlenkiem benzoilu (BPO) i 10% ftalanem dibutylu (DBP). Umieść go na obracającym się kole na 1 godzinę w temperaturze RT. Powtórz ten krok 2x.
4. Zastąp roztwór MMA 25 ml MMA wzbogaconym o 10% BPO, 10% DBP i 450 μl N, N dimetyloaniliny rozcieńczonej w stosunku 1:20 w propan-2-olu. Umieścić szklaną fiolkę w temperaturze -20 °C na noc. Roztwór staje się żółtawy.
5. Umieść eksplant w średniej wielkości formie do zatapiania i wlej do formy anilinę MMA-BPO-DBP-N, N. Umieść formę w plastikowym pudełku i wietrz strumieniem azotu przez 5 minut. Zamknąć hermetycznie pudełko i umieścić je w temperaturze 4 °C na 48 godzin w celu polimeryzacji i utwardzenia MMA.
6. Usunąć żywicę zawierającą eksplant z formy i przechowywać ją w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia do późniejszej analizy.

5. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) - ilościowe obrazowanie elektronów wstecznie rozproszonych (qBEI)

1. Przeciąć blok pMMA zawierający eksplantat piłą diamentową wzdłuż jego długiej osi. Zachowaj pierwszą połowę bloku do analizy histologicznej. Przytnij drugą połowę dalej, aby uzyskać przekrój o grubości 1,5 mm. Cięcie należy wykonywać z prędkością 3000 obr./min z prędkością 3 mm/min.
2. Przeszlifuj sekcję papierem z węglika krzemu o rosnących liczbach odpowiadających dolnej wielkości ziarna: SiC 320 przez 10 s, SiC 1000 przez 15 s, SiC 2000 przez 30 s i SiC 4000 przez 30 s.
3. Wypoleruj sekcję pastą diamentową i specjalnymi ubraniami: ściereczką polerską z 3 μm roztworem diamentu Mol B3 przez 1 minutę i ściereczką z włókniny z 1 μm roztworem diamentu Nap B1 przez 1 min.
4. Opłucz sekcję pod podwójnie destylowaną wodą i oczyść cząsteczki diamentu wacikiem. Wysuszyć sekcję pod gazowym azotem.
5. Gruby odcinek należy pokryć węglem (grubość filmu węglowego 10 nm) i zamontować na aluminiowym króćcu pokrytym srebrną farbą. Wykonaj srebrny mostek malarski między górną częścią sekcji a króćcem, aby umożliwić ewakuację ładunku elektronowego do ziemi.
6. Umieść kod pośredniczący na stole montażowym SEM. Obok próbki włóż króciec kontrolny składający się z kubka Faradaya z wzorcami węglowymi, aluminiowymi i krzemowymi do komory SEM. Zostanie to wykorzystane do kalibracji wiązki elektronów i przeliczenia poziomów szarości na procenty Ca. Zamknij komorę SEM i odkurz.
7. Włącz wiązkę elektronów i dostosuj parametry SEM, aby działały w trybie elektronów wstecznie rozproszonych. Na obrazach rozproszonych wstecznie poziom szarości standardu węglowego wynosi 25, standardu aluminium wynosi 225, a standardu krzemu 253. Jako wskazówkę, w zastosowanym układzie parametry SEM to napięcie przyspieszenia 20 keV, prąd sondy mierzony kubkiem Faradaya: 250 pA, odległość robocza: 15 mm, przysłona: 30 μm, rozdzielczość obrazu: 1024 x 768 pikseli, podciśnienie: < ^4,10-4 Pa, czas przebywania 100 μs/piksel, jasność ~38 i kontrast ~72.
8. Gdy SEM zostanie skalibrowany ze wzorcami, uzyskaj obrazy próbki w trybie elektronów wstecznie rozproszonych.
9. Użyj obrazu elektronów wstecznie rozproszonych próbki, aby przeliczyć poziomy szarości na zawartość wapnia, zgodnie z opisem w Roschger et al.¹⁶. Zrób to za pomocą dowolnego oprogramowania do analizy obrazu.
10. Wykreślić rozkład zawartości wapnia. Rozkład zawartości wapnia wykazuje rozkład Gaussa. Obliczane są trzy główne interesujące parametry:_średnia Ca jako średnia zawartość wapnia na obrazie,_szczyt Ca jako najczęstsze stężenie wapnia występujące na obrazie_{oraz szerokość Ca} jako pełna szerokość przy połowie maksymalnego rozkładu zawartości wapnia.
    UWAGA: Odtwarzalność qBEi została zbadana poprzez obrazowanie tego samego obszaru zainteresowania przez 5 kolejnych dni (jedna akwizycja dziennie). Oznacza to, że wiązka elektronów była włączana i wyłączana między sesjami. Procent błędu w_średniej Ca,_szczycie Ca i Cawidth oszacowano odpowiednio na 0,5%, 0,7% i 1,2%. Zawartość wapnia badano również za pomocą analizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDS). Ustalono bardzo dobrą zależność liniową między_średnią Ca a zawartością wapnia oszacowaną przez EDS o wartości R² 0,99, podobnie jak dane uzyskane przez Roschgera i wsp. before¹⁷.

6. Histologia

1. Dla każdej próbki należy wyciąć odcinki o grubości 7 μm za pomocą mikrotomu z tkankami twardymi z wolframowym ostrzem ^18,19. Bejcowanie skrawków za pomocą bejcy Goldner, HES i MOVAT za pomocą automatycznego systemu barwienia.
2. W celu deplastyfikacji należy moczyć próbki kolejno w acetonie przez 5 minut i powtórzyć 2 razy. Przepłukać próbki w wodzie destylowanej przez 5 minut i powtórzyć 2 razy.
3. Wykonaj koloryzację Goldner Trichrome zgodnie z poniższym opisem.
   1. Umieść próbki w hematoksylinie żelazowej Weigert na 20 minut. Umyj wodą z kranu. Zanurzyć próbki w 0,5% kwaśnym alkoholu na 30 s-1 min. Myć wodą z kranu przez 20 minut.
   2. Umieścić próbki w roztworze Ponceau/kwasu fuksynowego/azofloksyny na 5 minut. Zanurzyć w 1% kwasie octowym na 1 minutę.
   3. Barwienie roztworem kwasu fosfomolibdenowego/pomarańczy G na 20 min. Zanurzyć w 1% kwasie octowym na 1 min.
   4. Plamić szybkim zielonym roztworem przez 15 minut w temperaturze pokojowej lub 8 minut w temperaturze 60 °C. Dokładnie spłukać wodą z kranu; powtórzyć 3x.
4. Wykonaj barwienie Movat Pentachrome zgodnie z poniższym opisem.
   1. Barwienie Alcian Blue: zanurzyć próbki w roztworze Alcian Blue na 30 minut. Próbki płukać w wodzie z kranu przez 5 minut. Umieścić próbki w alkalicznym etanolu na 60 minut. Płukać próbki w wodzie z kranu przez 10 minut. Wykonać końcowe płukanie wodą destylowaną.
   2. Barwienie hematoksyliną Weigerta: umieścić próbki w hematoksylinie żelazowej Weigerta na 20-30 minut. Płukać próbki w wodzie z kranu przez 15 minut. Ponownie spłukać wodą destylowaną.
   3. Barwienie kwasem Crocein Brilliant/fuksinowym: zanurzyć próbki w roztworze Crocein Brilliant/Acid Fuchsin na 10 minut. Spłukać 0,5% kwasem octowym. Zanurzyć próbki w 5% roztworze kwasu fosfowolframowego na 20 minut. Płukać 0,5% kwasem octowym przez 2 min. Wykonaj trzy kolejne płukania 100% etanolem, każde trwające 5 minut.
   4. Barwienie za pomocą Safran du Gatinais: umieścić próbki w Safran du Gatinais na 15 minut. Wykonać końcowe płukanie wodą z kranu.
5. Wykonaj barwienie HES zgodnie z poniższym opisem.
   1. Barwienie hematoksyliną Weigerta: zanurzyć próbki w hematoksylinie Weigerta na 30 minut. Płukać wodą z kranu przez 2 minuty.
   2. Odbarwianie: zanurz próbki w alkoholu kwasu solnego na 10 s. Płucz wodą z kranu przez 2 min.
   3. Neutralizacja: zanurzyć próbki w roztworze węglanu litu na 1 min. Płukać wodą z kranu przez 2 min. Wykonać końcowe płukanie wodą destylowaną przez 1 min.
   4. Barwienie Eozyną-Erytrozyną: umieścić próbki w roztworze Eozyny-Erytrozyny na 3 minuty. Płukać wodą z kranu przez 10 s.
   5. Odwodnienie: Zanurz próbki w 95% alkoholu na 15 s. Przenieś do 100% alkoholu na 15 s. Powtórz zanurzenie w 100% alkoholu przez 30 s.
   6. Końcowe barwienie alkoholową safraniną: zanurzyć próbki w alkoholowej safraninie na 10 minut. Wykonać końcowe płukanie wodą z kranu.
6. Wykonaj montaż ślizgowy zgodnie z poniższym opisem.
   1. Przepłucz próbki w 95% etanolu, następnie w 100% etanolu, a następnie w metylocykloheksanie i powtórz to 3 razy dla każdego etapu.
   2. Zamontuj próbki za pomocą zestawu montażowego i dodaj szkiełko nakrywkowe. Zeskanuj obrazy za pomocą cyfrowego skanera slajdów.

7. Mikrospektroskopia Ramana

1. Użyj tej samej sekcji, która jest używana do analizy Ramanowskiej, co SEM. Krótko zmielić i wypolerować sekcję zgodnie z opisem w krokach 5.2 - 5.3, aby usunąć cienką warstwę węgla dodaną do SEM, która pogarsza rozpraszanie ciepła z próbki.
2. Umieść sekcję na stoliku mikrospektrometru Ramana. Skalibruj liczbę falową, aby zapewnić dokładność i wyrównaj laser przed pomiarem. Ponieważ takie procedury są specyficzne dla każdego instrumentu, nie zostaną one opisane w tym artykule.
3. Zlokalizuj interesujące obszary w tkance, które należy przeanalizować. Umieść strefę do analizy w środku narzędzia wideo i zbierz widma Ramana o następujących parametrach: laser 785 nm użyty przy 30 mW, czas integracji: 20 s powtórzony 3 razy, zakres widmowy: 350-1800 ^cm-1, siatka 1200 linii/mm.
4. Zbierz 10 widm żywicy osadzającej przy tych samych ustawieniach Ramana i uśrednij je. Użyj tego, aby odjąć udział żywicy w kroku 7.6.
5. Wstępnie przetworzyć widma w następujący sposób, aby usunąć wpływ fluorescencji, szumu i żywicy: korekcja linii podstawowej za pomocą pięciorzędowego dopasowania wielomianowego, filtr Savitzky'ego-Golaya o stopniu 4 i rozmiar okna składający się z zakresu od 17 do 21, cyfrowe odejmowanie żywicy przy użyciu piku żywicy ~812 ^cm-1. Takie wstępne przetwarzanie można przeprowadzić za pomocą różnego oprogramowania przeznaczonego do analizy i wizualizacji danych.
6. Dalsza analiza wstępnie przetworzonych widm w celu wyodrębnienia cennych parametrów poprzez racjonowanie szczytowej intensywności drgań będących przedmiotem zainteresowania ze szczytową intensywnością drgań odniesienia. Na przykład w przypadku analizy kości należy użyć następujących parametrów, aby ją obliczyć.
   1. Proporcje minerałów do matrycy: podziel szczytową intensywność drgań v1PO4 na ~960 ^cm-1 przez szczytową intensywność wibracji Amidu I (~1668 ^cm-1), amidu III (~1250 ^cm-1), CH2-wag (~1450 ^cm-1) lub sumę modów drgań proliny (~854 ^cm-1) i hydroksyproliny (Hyp, ~872 ^cm-1). V2PO4, umieszczony na ~430 ^cm-1, lub v4PO4, umieszczony na ~600 ^cm-1, może być również używany i współczynnikowany z Amide III vibration²⁰. Parametry te reprezentują stopień mineralizacji fazy organicznej macierzy kostnej.
   2. Węglan/fosforan: podzielić szczytową intensywność v1CO₃, znajdującą się na ~1070 ^cm-1, przez v1PO4. Reprezentuje to ilość podstawienia węglanów typu B w sieci apatytowej. Hyp/Pro, reprezentuje zawartość hydroksyproliny, ~1375 ^cm-1/Amid III, reprezentuje zawartość proteoglikanu, ~1150 ^cm-1/CH2-wag i ~1495 ^cm-1/CH2-wag, reprezentuje ilość zaawansowanych produktów końcowych glikacji karboksymetylizyny i pentozydyny, 1670 ^cm-1/1690 ^cm-1 i 1670 ^cm-1/1640 ^cm-1 reprezentują odpowiednio nieuporządkowaną drugorzędową strukturę kolagenu, znaną również jako dojrzałość kolagenu, oraz uporządkowane struktury w postaci α-helisy w kolagenie typu I.
7. Oceń odtwarzalność pomiarów Ramana, badając ten sam obszar zainteresowania w 5 kolejnych akwizycjach (jedna akwizycja dziennie). Dla każdego analizowanego parametru wariancja wynosiła poniżej 0,2% wartości parametru, co potwierdza dobrą odtwarzalność. Specyfika każdego badanego piku została obszernie omówiona w terenie, a przegląd został przedstawiony w niedawnym przeglądzie Unal²¹.

8. Nanowcięcie

UWAGA: Ze względu na destrukcyjną naturę nanowgłębienia, jest ono zwykle wykonywane na końcu procedury analizy próbki. Posiadany przez nas system nanoindentacji wyposażony jest w piramidalny diamentowy wgłębnik Berkovitch. Istnieje jednak kilka kształtów wgłębników, a w literaturze nie ustalono konsensusu co do próbek kości lub biomateriałów.

1. Uwodnić osadzoną próbkę kości w soli fizjologicznej przez 16 godzin w temperaturze pokojowej przed testem nanotwardości.
2. Skalibruj system nanotwardości za pomocą stopionej krzemionki i zapisz wynikowy moduł wgniecenia. W przypadku stopionej krzemionki moduł wgniecenia wynosi około 72 GPa przy współczynniku Poissona 0,17.
3. Po skalibrowaniu systemu nanotwardości umieść próbkę używaną do analiz Ramana w układzie optycznym urządzenia do nanotwardości, aby wskazać miejsca, w których zostanie wykonana nanotwardość.
   UWAGA: Ta modalność różni się w zależności od sprzętu; Nie podajemy szczegółów, jak działa system i oprogramowanie NanoIndentation, ale udzielamy ogólnych porad na temat różnych kroków, które należy wykonać.
4. Po wybraniu miejsca nanoindentacji przenieś próbkę pod urządzenie do wgłębiania i wykonaj wgłębienie. Nanotwardość należy wykonać na stałej głębokości 900 nm, z prędkością załadunku/rozładunku 40 mm/min i 15-sekundową przerwą między załadunkiem a rozładunkiem. Ustaw współczynnik Poissona dla tkanki kostnej na 0,3.
5. Pobierz różne parametry z krzywych nanowgłębienia i oblicz je zgodnie z teorią Olivera i Pharra²².
   1. Moduł wgniecenia (E_IT) jest uzyskiwany na podstawie znanych właściwości końcówki wgłębienia i modułu zredukowanego i łączy lokalny moduł sprężystości próbki. Oblicz wcięcie jako:
      
      Przy czym v_s, v_i, E_i i E_r reprezentują współczynnik Poissona próbki, przy założeniu, że wynosi 0,3 dla kości, współczynnik Poissona wgłębnika diamentowego, przy założeniu, że wynosi 0,07, moduł sprężystości wgłębnika diamentowego, ustalony na 1140 GPa, a moduł zredukowany, obliczony jako:
      
      Gdzie S oznacza nachylenie segmentu rozładunkowego, a Ap jest rzutowanym obszarem i jest obliczane jako:
      
   2. Twardość (H_IT): odpowiadająca odporności kości na inicjację i propagację pęknięć. Innymi słowy, jest to wskaźnik wytrzymałości kości. Obliczenia H_IT jako:
      
   3. Szybkość pełzania wgłębień (C_IT): Odzwierciedla deformację kości w czasie przy stałym obciążeniu, wskazując na właściwości lepkosprężyste próbki, oblicza się jako:
      
   4. Maksymalne obciążenie (L_m): Odpowiada to przeciwstawnemu obciążeniu niezbędnemu do wniknięcia na wskazaną głębokość w zmineralizowaną macierz kostną.
   5. Praca wgłębienia (W_plast): Odpowiada to obszarowi pod krzywą odkształcenia obciążenia/odciążenia. Jest to bezpośrednie odbicie energii rozpraszanej w celu wywołania odkształcenia plastycznego.
      UWAGA: Odtwarzalność nanotwardości jest trudniejsza do oceny na próbkach kości ze względu na destrukcyjny charakter tej metodologii. Niemniej jednak oszacowaliśmy odtwarzalność standardowej i jednolitej próbki stopionej krzemionki. Dla wszystkich powyższych parametrów wariancja została oszacowana poniżej 0,26% (5 kolejnych pomiarów w 5 oddzielnych dniach), co potwierdza bardzo dobrą odtwarzalność. Z drugiej strony, ze względu na anizotropowy charakter próbek kości, trudniej jest ocenić ich odtwarzalność.

Wyniki

Obraz eksplantatu wykonany za pomocą mikro-tomografii komputerowej jest pokazany w Rysunek 2. Zastosowanie segmentacji ręcznej nie pozwala na optymalne oddzielenie kości od cementu znajdującego się w kanale centralnym przy użyciu globalnego progowania. Aby poprawić rozpoznawanie kości beleczkowej i cementu, proponujemy zastosowanie uczenia głębokiego. Głębokie uczenie jest skuteczne w rozpoznawaniu cech biomateriałów i pomaga poprawić separację między kością a cementem, umożliwiając lepszą ocenę interakcji cement-kość. Ma to ogromne znaczenie, aby dokładnie określić ilościowo ilość kości utworzonej na styku z cementem i nie uwzględniać w tych obliczeniach fałszywych pikseli.

Jednak samo określenie ilościowe kości na granicy nie wystarcza do scharakteryzowania nowo powstałej kości. Potrzebne jest bardziej dogłębne badanie jakości macierzy kostnej i składu komórkowego, aby lepiej zrozumieć wytrzymałość nowej kości i mechanizmy komórkowe, które doprowadziły do powstania tej nowej matrycy. Macierz kostną można scharakteryzować za pomocą dwóch uzupełniających się podejść: qBEI i mikrospektroskopii Ramana. Przykład obrazu qBEI przedstawiono w Rysunek 3. Dzięki qBEI każdy piksel zakodowany w skali szarości jest przekształcany w stężenie wapnia. Jest to warunek wstępny do oceny rozkładu zawartości wapnia w kości beleczkowej oraz do zrozumienia (i) stopnia mineralizacji nowo powstałej kości na styku z cementem oraz (ii) tego, czy obecność cementu zaburza mineralizację kości beleczkowej. Zaletą qBEI jest możliwość uzyskania obrazu o wysokiej rozdzielczości w bardzo krótkim czasie, w przeciwieństwie do mikrospektroskopii Ramanowskiej, która wymaga dłuższego czasu akwizycji. Parametry qBEI, takie jak_średnia Ca,_pik Ca i_szerokość Ca, można następnie wyprowadzić z rozkładu wapnia i wykorzystać do porównania odpowiedzi między dwoma cementami lub biomateriałami.

Z drugiej strony, qBEI nie dostarcza żadnych informacji na temat jakości fazy organicznej macierzy kostnej na styku z biomateriałem. Dodatkowe informacje dotyczące właściwości materiałowych fazy organicznej pochodzą z mikrospektroskopii Ramana. Mikrospektroskopię Ramana wykonuje się na tej samej próbce, która jest używana do qBEI, po szybkim szlifowaniu i polerowaniu powierzchni w celu usunięcia przewodzącej warstwy węgla. W mikrospektroskopii Ramana widma są uzyskiwane w każdym miejscu piksela. Przykłady surowych, nieprzetworzonych i przetworzonych widm Ramana znajdują się w Rysunek 4. Każde widmo zawiera informacje o składzie analizowanego piksela i obejmuje piki związane z żywicą zatapiającą, w tym przypadku pMMA, fazą mineralną, pikami v1PO4 i v1CO3 oraz fazą organiczną, pikami Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. oraz Amid I. W przykładzie w Rysunek 4, nieobrobione widmo pokazuje udział żywicy powlekającej na ~812 ^cm-1 i niezerową zakrzywioną linię bazową spowodowaną fluorescencją, chociaż używany jest czerwony laser w bliskiej podczerwieni. Przetwarzanie widma jest warunkiem wstępnym dla zapewnienia dokładnych obliczeń różnych parametrów Ramana, w szczególności eliminacji fluorescencji tła. Podczas pozyskiwania danych użytkownik powinien zadbać zarówno o dokładne pozycjonowanie, jak i unikanie nasycenia detektora w celu potwierdzenia obecności piku v1PO4 zlokalizowanego w odległości ~960 ^cm-1. Po przetwarzaniu końcowym współczynniki intensywności szczytowej są obliczane zgodnie z lokalizacją charakterystycznego trybu wibracyjnego.

Wątpliwe jest jednak, czy zmiany w składzie materiału doprowadziły do zmian w reakcji biomechanicznej. Aby zebrać informacje na temat biomechaniki nowo powstałej kości, systematycznie przeprowadzamy badania nanotwardości na tej samej próbce, która służy do mikrospektroskopii Ramana. Informacje mechaniczne o tkankach uzyskuje się z krzywych nanowgłębienia reprezentowanych przez krzywe obciążenia w funkcji głębokości (Rysunek 5). Warto zauważyć, że głębokość nie wraca do zera pod koniec testu, co reprezentuje odkształcenie plastyczne i trwałe uszkodzenie materiału. Szybkość pełzania wgłębień jest wyprowadzana z krzywej głębokości w funkcji czasu.

Na koniec, barwienie histologiczne służy do oceny odpowiedzi tkanek na biomateriał na poziomie komórkowym (Rysunek 6). Zaproponowane barwienia histologiczne pozwalają na określenie obecności tkanki osteoidowej, ale także identyfikację komórek (makrofagów, wielojądrowych komórek olbrzymich, osteoklastów, osteoblastów) oraz ewentualnej obecności torebki włóknistej na granicy faz z biomateriałem. Jest to bardzo ważne dla zrozumienia biokompatybilności biomateriału, ale także trwałości nowej kości po degradacji biomateriału.

Ogólnie rzecz biorąc, podejście oparte na wielu metodach umożliwia dogłębne badanie procesu tworzenia kości, jakości nowo powstałej kości i składu komórkowego. W przypadku przeprowadzenia w proponowanej kolejności sekwencyjnej wszystkie badania mogą być przeprowadzone na tej samej próbce, co zmniejsza koszty i czas przetwarzania.

Rysunek 1: Streszczenie graficzne. Podsumowanie kroków protokołu znajduje się tutaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analizy mikro-CT i głębokiego uczenia. (A) Rekonstrukcja 3D obrazów mikro-CT. (B) Segmentacja kości i cementu: porównanie segmentacji ręcznej z uczeniem głębokim. Podziałka = 5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ilościowe obrazowanie elektronów wstecznie rozproszonych do określania zawartości wapnia. (A) Obraz rozproszony wstecznie złożony z poziomów szarości uzyskanych w skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) jest przekształcany przez oprogramowanie do analizy obrazu na (B) mapę wapnia przedstawiającą gorące punkty próbki kości. (C) Wykreśla się rozkład zawartości wapnia w stosunku do powierzchni kości i oblicza trzy główne parametry qBEI, Camean, Capeak i_{Ca width}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przykład widm Ramana. (A) Surowe nieprzetworzone widmo Ramana uzyskane w zakresie widmowym 800 - 1800 ^cm-1. Tło fluorescencyjne jest wyraźnie widoczne, ponieważ widma nie zaczynają się od 0. Wkład żywicy (pMMA) jest wyraźnie widoczny na poziomie ~812 ^cm-1. (B) Widmo przetworzone. Położenie różnych interesujących nas trybów wibracyjnych jest wskazane w spektrum. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Badanie właściwości mechanicznych tkanek za pomocą nanowcięcia. (A) Urządzenie do nanoindentacji składa się z części optycznej używanej do określenia lokalizacji obszaru zainteresowania na powierzchni bloku próbki, a następnie blok jest przesuwany pod częścią wgłębienia. (B) Obciążenie w funkcji czasu i głębokość w funkcji czasu są wykreślane podczas testu wgłębienia i są używane do generowania (C) obciążenie a krzywa głębokości. W tym przykładzie wybrana głębokość została ustalona na 400 nm. Maksymalne obciążenie (L_m), głębokość na końcu załadunku (h_l), głębokość po okresie przerwy (h_m), nachylenie segmentu rozładowczego (S) oraz powierzchnia znajdująca się w fazie załadunku i rozładunku badania (W_plast) są wyprowadzane z krzywej obciążenia w funkcji głębokości i są wykorzystywane do obliczenia różnych parametrów nanotwardości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza histologiczna eksplantatów kostno-chrzęstnych potraktowanych cementem po 28 dniach hodowli. (A) Barwienie Movat pokazuje strukturę tkanki, w tym kości i cementu wypełniającego ubytek. (B) Barwienie HES ilustruje integrację tkanek i odpowiedź komórkową wokół cementu. Pasek skali: 2,5 mm. (C) Powiększenie podświetlonego obszaru w (B), który szczegółowo opisuje granicę faz między cementem a otaczającą tkanką, gdzie można zaobserwować komórki atakujące cement. Pasek skali: 500 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Naprawa ubytków kostnych jest głównym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej mającym na celu przywrócenie mobilności, zmniejszenie bólu i poprawę jakości życia osób dotkniętych chorobą. Stosowanie modeli eksplantatów oferuje szereg korzyści w porównaniu z badaniami in vivo w zakresie badania naprawy ubytków kostnych. Oprócz względów etycznych, model ten pozwala na rygorystyczną kontrolę warunków eksperymentalnych i zmniejszenie zmienności biologicznej, ułatwiając w ten sposób generowanie dokładniejszych i bardziej powtarzalnych wyników. Ponadto właściwości mechaniczne i biologiczne kości owcy są ściśle zbliżone do właściwości kości ludzkiej w porównaniu z innymi zwierzętami^23,24. To sprawia, że model eksplantatu owiec jest szczególnie istotnym wyborem dla badań przedklinicznych i reprezentatywnym modelem warunków klinicznych u ludzi.

Wraz z rozwojem metodologii obrazowania i nauk o materiałach, opisany tutaj model eksplantatu stanowi dobry model do badania wpływu medycyny regeneracyjnej na tkanki szkieletowe w kontrolowanym środowisku, zmniejszając błąd systematyczny eksperymentu. Wymiary i morfologia eksplantatu są optymalne do szczegółowej analizy neoosteogenezy i właściwości materiału, umożliwiając kompleksową ocenę i charakterystykę²⁵. Wyniki te podkreślają potencjał modelu w zakresie przekładu klinicznego, oferując solidne ramy do oceny substytutów przeszczepów kostnych i zwiększając prawdopodobieństwo pomyślnych wyników klinicznych w terapiach regeneracji kości. Co więcej, model ułatwia precyzyjną ocenę osteointegracji i wydajności biomateriału, które są kluczowymi czynnikami w opracowywaniu skutecznych strategii naprawy kości.

Aby zapewnić powodzenie badania, bardzo ważne jest skrupulatne przestrzeganie kluczowych kroków protokołu. Jednym z najważniejszych aspektów jest upewnienie się, że próbka jest całkowicie odwodniona podczas procesu zatapiania. Pozostała wilgoć może utrudniać prawidłowe osadzanie żywicy, prowadząc do rozmytej i nieprzezroczystej żywicy, co może zagrozić jasności i dokładności wyników, a także może spowodować podczas sekcji histologicznej. Ta staranna dbałość o szczegóły jest niezbędna do uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Aby zapewnić dokładną konwersję poziomów szarości na mapę zawartości wapnia, konieczne jest zastosowanie kalibracji przy użyciu kubka Faradaya oraz wzorców C, Al i Si do analizy SEM. Kluczowe znaczenie ma zapewnienie spójności w stosowaniu tego samego SEM dla wszystkich próbek, ponieważ różnice w detektorach elektronów wstecznie rozproszonych mogą prowadzić do zmienności wyników. W spektroskopii Ramana kalibracja liczby falowej i dokładna korekta linii podstawowej są niezbędne do wykluczenia tła fluorescencji i rozróżnienia pików z żywicy zatapiającej i próbki. W przypadku nanotwardości uzyskanie idealnie gładkiej powierzchni ma kluczowe znaczenie, biorąc pod uwagę limity przemieszczenia wgłębników, a kalibracja za pomocą znanego wzorca, takiego jak stopiona krzemionka, jest niezbędna do zapewnienia wiarygodnych pomiarów.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów związanych z tymi technikami często dotyczą anizotropowej natury materiału kostnego, która może potencjalnie wpływać na spójność pomiarów. Dla przykładu, w spektroskopii Ramana polaryzacja padającego lasera może mieć znaczący wpływ na rejestrowaną intensywność. Użycie obiektywu 20x z małą aperturą numeryczną może pomóc w złagodzeniu tego problemu. Niezwykle ważne jest również zapewnienie spójnych warunków kalibracji i pomiarów we wszystkich próbkach w celu utrzymania integralności danych. Nieodłączna anizotropia kości stanowi ograniczenie tych metodologii, ponieważ może wpływać na jednolitość pomiarów, szczególnie w technikach takich jak spektroskopia Ramana. Co więcej, konieczność precyzyjnej kalibracji i kontroli środowiskowej może ograniczyć ogólne zastosowanie, jeśli aspekty te nie są skrupulatnie zarządzane.

Potencjalne zastosowanie tych podejść w znacznym stopniu obejmuje ocenę nowych biomateriałów i strategii terapeutycznych w zakresie naprawy kości. Zdolność modelu do ścisłego naśladowania fizjologii kości człowieka stanowi solidną platformę do badań przedklinicznych, umożliwiając dokładną ocenę bezpieczeństwa i skuteczności nowych metod leczenia w kontrolowanych warunkach. Użyteczność tego modelu jest szczególnie istotna dla przyspieszenia ścieżki translacyjnej od badań laboratoryjnych do praktyki klinicznej, ułatwiając wczesną identyfikację obiecujących kandydatów do terapii regeneracji kości. Zapewniając wiarygodną i powtarzalną metodę oceny materiałów do naprawy kości, technika ta wspiera postęp medycyny regeneracyjnej i opracowywanie klinicznie opłacalnych rozwiązań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtry 0,20	VWR	28145-501
Igła 18 G (1,2x40 mm)		Strzykawka Sterican
3 ml	HENKE-JECT	8300005762
37% kwas solny	Firma VWR	1.00317.1000
Kwas octowy (lodowaty)	Sigma	A6283
Aceton	Firma VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR
Wodorotlenek amonu	VWR
Apatytyczny fosforan trójwapniowy	Centrum Inżynierii Biomedycznej i Opieki Zdrowotnej (Mines Saint Etienne, Francja)	TV26U
Azofloksyna	Sigma
Nadtlenek benzoilu	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1,5 mg/ml
Brillant crocein	Aldrich
CTVox	Bruker-DataViewer
	Skyscan-Diamond
blade	Struers	MOD13
Piła diamentowa	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 roztwór diamentowy	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 roztwór diamentowy	Struers	40600373
Dwuzasadowy fosforan sodu (Na2HPO4)	Sigma
Phtalan dibutylu	Chimie-Plus Laboratoires	28656
Oprogramowanie DragonFly	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX(TM), pirogronian	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eozyna Y- Surgipath	Sigma
Erytrozyna B	Sigma
Absolutny etanol	VWR
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 ml	Sarstedt	62.547.254
Sześciowodny chlorek żelaza (FeCl3, 6H2O)	Firma Merck	1.03943.0250
Surowica bydlęca płodu (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
Kwas fuksynowy	Merck	1.05231.0025
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)	Biosura	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
Prasa izostatyczna	Nova Suisse	Pmax 1500 prętów
Granulometria dyfrakcji laserowej	Malvern	Mastersizer 3000
Jasnozielony	Prolabo
Węglan litu	Sigma	A13149
Ściereczka polerska MD-Mol	Struers	40500077
Metylocykloheksan	VWR	8.06147.1000
Metylocykloheksan	Firma VWR	8.06147.1000
Metylocykloheksan	Firma VWR	8.06147.1000
Metakrylan metylu	Sigma	8.00590.2500
Mikrotomografia komputerowa, mikroskaner	Bruker	Skyscan 1272
Jednozasadowy fosforan sodu (NAH2PO4)	Sigma	71496
Moździerz	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
Stacja nanotwardości	Anton Paar	NHT2
ND-Nap	Struers	40500080
Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego, 4,75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego OATS, 8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
Pomarańczowy G	Ral	M15
Paraformaldehyd (PFA)Sigma		P6148
Jednorazowe formy do obsadzania	Polysciences, Inc	18646C-1
Penicylina/Streptomycyna (P/S)	ThermoFisher Scientific	15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023
Kwas fosfomolibdenowy	Sigma	221856-100 g
Kwas fosfotynowy	Aldrich	Numer katalogowy: 12863-5
Maszyna do	polerowania Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
Mikrospektrometr Ramana	Renishaw	InVia Qontor
Safran du Gâ tinais	Labonord
Skaningowy mikroskop elektronowy	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
Folie SiC/Bibułki szlifierskie	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Farba srebrna	Mikroskopia elektronowa nauki	12686-15
Standardowy króciec z kubkiem Faradaya, wzorcami węglowymi, aluminiowymi i silikonowymi	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
Kolba T25	Corning	430639
Ksylen	VWR	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1