Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67235

⸱

27 września 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nantes Université, Univ Angers, Oniris, CHU Nantes, INSERM, Regenerative Medicine and Skeleton, RMeS, UMR 1229, 2CHU Angers, Departement pathologie cellulaire et tissulaire

W tym artykule

Podsumowanie

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Streszczenie

Obszerna charakterystyka mineralizacji tkanek w kontekście regeneracji kości stanowi poważne wyzwanie, biorąc pod uwagę liczne modalności, które są obecnie dostępne do analizy. W tym miejscu proponujemy przepływ pracy w celu kompleksowej oceny tworzenia się nowych kości przy użyciu odpowiedniego eksplantatu kostnego ex vivo dla dużych zwierząt. Ubytek kostny (średnica = 3,75 mm; głębokość = 5,0 mm) powstaje w eksplantowanej głowie kości udowej owcy i wstrzykuje się mu makroporowaty substytut kości obciążony proosteogennym czynnikiem wzrostu (białko morfogenetyczne kości 2 - BMP2). Następnie eksplant jest utrzymywany w kulturze przez okres 28 dni, co umożliwia kolonizację komórkową i późniejsze tworzenie kości. Aby ocenić jakość i strukturę nowo zmineralizowanej tkanki, stosuje się następujące następujące metody: (i) Charakterystyka i obrazy 3D o wysokiej rozdzielczości całego eksplantatu za pomocą mikro-CT, a następnie analizy obrazów głębokiego uczenia w celu zwiększenia dyskryminacji zmineralizowanych tkanek; (ii) nanowgłębienie w celu określenia właściwości mechanicznych nowo powstałej tkanki; (iii) badania histologiczne, takie jak hematoksylina/eozyna/szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata w celu zapewnienia jakościowej oceny zmineralizowanej tkanki, szczególnie w odniesieniu do wizualizacji bariery kostnej i obecności komórek kostnych; (iv) Mapowanie skaningowej mikroskopii elektronowej z rozpraszaniem wstecznym (SEM) z wewnętrznym odniesieniem w celu ilościowego określenia stopnia mineralizacji i dostarczenia szczegółowych informacji na temat morfologii powierzchni, składu mineralnego i granicy faz kość-biomateriał; (v) Spektroskopia Ramana w celu scharakteryzowania składu molekularnego zmineralizowanej matrycy i uzyskania wglądu w trwałość BMP2 w cemencie poprzez wykrycie wiązań peptydowych. Ta multimodalna analiza zapewni skuteczną ocenę nowo powstałych kości oraz kompleksowe jakościowe i ilościowe informacje na temat zmineralizowanych tkanek. Poprzez standaryzację tych protokołów dążymy do ułatwienia porównań między badaniami oraz poprawy trafności i wiarygodności wyników badań.

Wprowadzenie

Wady kości, czy to spowodowane urazem, resekcją guza, wrodzonymi anomaliami czy infekcją, stanowią główne wyzwanie dla medycyny regeneracyjnej. Zmiany te zagrażają integralności strukturalnej układu kostnego, prowadząc do dyskomfortu, upośledzenia funkcjonalnego i obniżenia jakości życia pacjentów.

Aby sprostać tym wyzwaniom, pojawiły się innowacyjne strategie naprawy kości, koncentrujące się na poprawie osteogenezy i regeneracji tkanki kostnej. Podejścia te obejmują stosowanie wszczepialnych, wstrzykiwanych lub drukowanych w 3D substytutów kości, które mogą być pochodzenia naturalnego (np. makrocząsteczki pochodzenia biologicznego, hydroksyapatyt pochodzenia zwierzęcego) lub syntetycznego (np. bioszkła, fosforany wapnia)1. Aby zwiększyć ich niską wrodzoną zdolność do kierowania i stymulowania regeneracji kości, substytuty kości mogą być ładowane czynnikami osteoindukcyjnymi, takimi jak białka morfogenetyczne kości (BMP), w celu promowania osteogennego różnicowania komórek progenitorowych i poprawy tworzenia kości2.

Tworzenie kości opiera się na początkowym tworzeniu matrycy kolagenowej, która jest następnie mineralizowana przez kryształy hydroksyapatytu, wzmacniając w ten sposób strukturę kości3. Proces ten nadaje kości określoną sztywność i wytrzymałość. Jakość zmineralizowanej tkanki jest ściśle regulowana przez jej cechy mikrostrukturalne i stopień mineralizacji4. Ta cecha odgrywa kluczową rolę w gojeniu kości i funkcjonalności zregenerowanej kości5. Jednak charakterystyka mineralizacji kości pozostaje trudnym zadaniem ze względu na nieodłączną zmienność w badaniach wielowymiarowych6,7,8.

Ponadto, wstępne oceny biokompatybilności, cytokompatybilności i potencjału różnicowania substytutów przeszczepów kostnych są zazwyczaj przeprowadzane in vitro. Rozbieżności metodologiczne utrudniają jednak bezproblemowe porównywanie wyników. Co więcej, te badania in vitro nie oddają w pełni interakcji wielokomórkowych i złożonego dialogu między populacjami komórek, w tym komórkami szpiku kostnego, które są niezbędne do regulacji procesu regeneracji kości9. Ten brak dokładnego odwzorowania mikrośrodowiska kości może zagrozić dokładności kolejnych badań przedklinicznych10.

Chociaż oceny in vivo dostarczają dokładniejszego odwzorowania kontekstów fizjologicznych, są one ograniczone względami etycznymi, logistycznymi i finansowymi. W związku z tym oceny ex vivo odgrywają kluczową rolę jako interfejs między badaniami in vitro i in vivo, służąc jako niezbędny etap pośredni przed przejściem do eksperymentów na żywych obiektach11,12,13.

W tym kontekście, potrzebne jest wdrożenie kompleksowych metodologii charakteryzacji, aby ocenić jakość zregenerowanej tkanki kostnej i zapewnić adekwatność strategii przed przejściem do modelu przedklinicznego. W związku z tym proponujemy protokół oparty na analizie modelu eksplantacji z wykorzystaniem tkanki stawu kolanowego owcy. Ta innowacyjna metodologia polega na wszczepieniu cementu obciążonego BMP2 do eksplantatów i przeprowadzeniu szczegółowej analizy mineralizacji tkanek po 28 dniach hodowli.

Podejścia techniczne zastosowane w tym badaniu są zróżnicowane i komplementarne, łącznie zapewniając kompleksowe podejście do oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej (Rysunek 1). Obrazowanie mikrotomografią komputerową o wysokiej rozdzielczości umożliwia szczegółową wizualizację 3D struktury kości, dostarczając cennych informacji na temat gęstości mineralnej, morfologii i integralności nowo powstałej tkanki. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla oceny skuteczności regeneracji kości i monitorowania postępu mineralizacji w czasie. Nanotwardość to precyzyjne podejście do określania właściwości mechanicznych tkanki, takich jak jej twardość i wytrzymałość. Mierząc reakcję materiału na przyłożoną siłę w skali nanometrycznej, metoda ta umożliwia ocenę wytrzymałości i jakości zmineralizowanej tkanki. Badania histologiczne z użyciem powszechnych barwień, takich jak hematoksylina / eozyna / szafran (HES), trichrom Goldnera i pentachrom Movata dostarczają bezcennych informacji na temat struktury i składu tkanek. Barwienia te umożliwiają różnicowanie różnych składników tkanki, w tym komórek, macierzy zewnątrzkomórkowej i złogów mineralnych, umożliwiając w ten sposób kompleksową ocenę jakościową procesu regeneracji kości. Mapowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z rozproszeniem wstecznym (SEM) zapewnia wizualizację powierzchni próbek w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając szczegółową analizę stopnia mineralizacji macierzy kostnej, a także interfejsów między wszczepionym materiałem a tkanką gospodarza. Wreszcie, spektroskopia Ramana dostarcza informacji na temat składu molekularnego tkanki, w szczególności poprzez identyfikację określonych składników, takich jak białka, lipidy i minerały. Takie podejście umożliwia scharakteryzowanie zmineralizowanej matrycy i wykrycie czynników wzrostu, takich jak BMP2, dostarczając tym samym kluczowych informacji na temat utrzymywania się bodźców proosteogennych w pożywce regeneracyjnej.

Korzystając z multidyscyplinarnego podejścia, integrując różne techniki analityczne, nasze badanie ma na celu dostarczenie dokładnej i wszechstronnej oceny jakości zregenerowanej tkanki kostnej, zapewniając tym samym solidną podstawę do oceny substytutów przeszczepów kostnych i ich potencjalnego zastosowania klinicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez komisję ds. etyki i dobrostanu zwierząt oraz przez francuską Krajową Agencję Bezpieczeństwa Żywności, Weterynarii i Fitosanitarnej pod numerem G44171.

1. Przygotowanie i hodowla eksplantów kostno-chrzęstnych

  1. Pobrać próbki stawów owczych od świeżo uśpionych zwierząt w warunkach aseptycznych. Umieścić owcę w pozycji na plecach i ogolić lewą kończynę tylną. Przygotować pole poprzez dezynfekcję alkoholem wokół stawu kolanowego. Wykonać boczną artrotomię przyrzepkową, aby odsłonić więzadła krzyżowe przednie i tylne, a następnie dokonać zwichnięcia rzepki, aby odsłonić bloczek kości udowej.
    1. Po pobraniu tkanki stworzyć ubytek o średnicy 4,75 mm w kłykciu bocznym, korzystając z systemu transferu autograftu kostno-chrzęstnego.
  2. Za pomocą młotka ortopedycznego stworzyć ubytek o głębokości 10 mm i pobrać eksplant z kłykcia. Następnie wykonać drugi ubytek o średnicy 8 mm, wyśrodkowany wokół pierwszego, korzystając z systemu transferu autograftu kostno-chrzęstnego. W ten sposób otrzymuje się eksplanty kostno-chrzęstne o wymiarach 8 mm x 10 mm, zawierające centralny ubytek o wymiarach 4,75 mm x 10,0 mm.
  3. Jeśli jest to wymagane z przyczyn logistycznych, transportować eksplanty w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (hBSS) uzupełnionym o 1% penicyliny-streptomycyny i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przepłukać eksplanty 3x fosforanem soli buforowanych (PBS), a następnie wstrzyknąć w ubytek o wymiarach 4,75 mm x 10,0 mm cement fosforanowo-wapniowy uzupełniony o 40 µg/mL BMP2. Przygotować cement zgodnie z opisem poniżej.
    1. Wytworzyć α-fosforan trójwapniowy (α-TCP) poprzez obróbkę cieplną prętów z apatytowego fosforanu trójwapniowego (prasowanie izostatyczne przy 120 MPa) w temperaturze 1364 °C przez minimum 12 h, a następnie gwałtowne schłodzenie powietrzem14.
    2. Zmielić pręty α-TCP w etanolu bezwodnym w młynie planetarnym z kulami 2x przez 5 min przy 500 rpm, aby uzyskać drobny proszek o wielkości cząstek 13,1 ± 1,7 µm (zmierzonej metodą dyfrakcji laserowej, jak opisano wcześniej14).
    3. Sterylizować proszek α-TCP poprzez ogrzewanie na sucho w temperaturze 180 °C przez 45 min. Przygotować cement fosforanowo-wapniowy, mieszając proszek α-TCP z 2,5% (w/v) roztworem Na2HPO4 filtrowanym przez membranę 0,22 µm (stosunek ciecz/proszek wynoszący 0,35) przez 1 min.
    4. Przenieść pastę cementową do strzykawki 3 mL przed wstrzyknięciem za pomocą igły 18 G.
  5. Po 10 min w temperaturze pokojowej (RT) przenieść eksplanty do kolby 25 cm² i delikatnie dodać 10 mL pełnej pożywki hodowlanej składającej się z DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.
  6. Utrzymywać eksplanty do 28 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wymieniać pełną pożywkę hodowlaną co 2 dni w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
  7. Przepłukać eksplanty 3x PBS. Przenieść je do probówek 50 mL, dodać 20 mL 4% paraformaldehydu (PFA) i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Następnie przepłukać eksplanty PBS i przechowywać w 70% etanolu przed kolejnymi analizami.

2. Analiza mikro-CT

  1. Przeprowadź analizy mikrotomograficzne przy użyciu mikro-CT. Wykonaj projekcje rentgenowskie z rozdzielczością 10,7 µm, czasem ekspozycji 1200 ms i filtrem aluminiowym 1 mm (80 kV i 125 µA). Wyciągnij średnią z trzech obrazów dla każdego przyrostu rotacji o 0,45°, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.
  2. Zrekonstruuj obrazy trójwymiarowe (3D) za pomocą oprogramowania rekonstrukcyjnego producenta po wyrównaniu osi X/Y względem skanu referencyjnego, stosując następujące parametry: Wygładzanie (Smoothing): 0, Artefakty pierścieniowe (Ring Artefact): 3, Utwardzanie wiązki (Beam Hardening): 35%. Oczyść stosy obrazów za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu i poddaj analizie przy użyciu narzędzi do wizualizacji dwuwymiarowej (2D) i 3D.

3. Analiza obrazów metodą głębokiego uczenia

  1. Przeprowadź segmentację obrazu za pomocą dedykowanego specjalistycznego oprogramowania. Użyj zintegrowanego kreatora segmentacji, aby wytrenować model uczenia głębokiego do rozróżniania kości i cementu.
  2. Wybierz reprezentatywną strefę (tzn. klatkę) zawierającą kość, cement i tło z zrekonstruowanych obrazów mikro-CT. Segmentuj tę pierwszą klatkę ręcznie, korzystając z prostych narzędzi (np. progowania) lub zaawansowanych narzędzi (np. propagacji) dostarczonych przez oprogramowanie.
  3. Wygeneruj model uczenia głębokiego w zakładce Model i wybierz 3D-Unet Routine z menu rozwijanego. Zdefiniuj parametry eksperymentalne dostosowane do analizowanych obrazów, klikając prawym przyciskiem myszy na wygenerowany model; w tym przypadku: głębokość 5, rozmiar patcha 32 x 32, algorytm Adadetla, stosunek kroku (stride ratio) 0,25, augmentacja danych x10.
  4. Użyj zsegmentowanej klatki do wytrenowania procedury uczenia głębokiego (kliknij przycisk Train Button), która jest uznawana za odpowiednią ze względu na możliwości szybkiej i dokładnej segmentacji obrazu3,15. Po zakończeniu trenowania zdefiniuj drugą strefę roboczą (klatkę) i przeprowadź automatyczną segmentację za pomocą funkcji przewidywania (predict).
    1. W razie potrzeby zastosuj korektę ręczną, aby uzyskać dokładniejsze dane treningowe. Ponownie wytrenuj procedurę. Powtarzaj ten proces do uzyskania satysfakcjonującego wyniku; liczba augmentacji danych sukcesywnie maleje wraz ze zwiększaniem liczby klatek treningowych.
      UWAGA: Indeks DICE podawany podczas trenowania modelu daje wskazówkę co do dokładności modelu (w porównaniu z informacjami wejściowymi), ale nie jest on wystarczający. Potwierdzenie trafności modelu powinno zostać przeprowadzone poprzez walidację automatycznie zsegmentowanych danych przez 3 niezależnych, doświadczonych badaczy.
  5. Opublikuj model, klikając przycisk Export, a następnie zastosuj go do całego zestawu danych mikro-CT, klikając Segment > Exported Model > Segment Full Dataset.

4. Zatapianie

  1. Odwodnij eksplanty kostne, umieszczając je w szklanej fiolce o pojemności 40 mL zawierającej 25 mL roztworu do odwodnienia składającego się z 70% acetonu i 30% ksylenu. Umieść szklaną fiolkę na obrotowym mieszadle na 1 h w RT. Powtórz ten krok 3x.
  2. Zastąp roztwór do odwodnienia 25 mL ksylenu i umieść szklaną fiolkę na obrotowym mieszadle na 1 h w RT.
  3. Zastąp roztwór ksylenu 25 mL metakrylanu metylu (MMA) wzbogaconego o 10% nadtlenku benzoilu (BPO) i 10% ftalanu dibutylu (DBP). Umieść go na obrotowym mieszadle na 1 h w RT. Powtórz ten krok 2x.
  4. Zastąp roztwór MMA 25 mL MMA wzbogaconego o 10% BPO, 10% DBP oraz 450 µL N, N-dimetyloaniliny rozcieńczonej 1:20 w propan-2-olu. Umieść szklaną fiolkę w temperaturze -20 °C na noc. Roztwór stanie się żółtawy.
  5. Umieść eksplant w średniej wielkości formie do zatapiania i wlej do formy mieszaninę MMA-BPO-DBP-N, N-anilina. Umieść formę w plastikowym pudełku i wentyluj strumieniem azotu przez 5 min. Zamknij pudełko hermetycznie i przechowuj w temperaturze 4 °C przez 48 h w celu polimeryzacji i utwardzenia MMA.
  6. Wyjmij żywicę zawierającą eksplant z formy i przechowuj ją w temperaturze 4 °C do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.

5. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) - ilościowe obrazowanie elektronów wstecznie rozproszonych (qBEI)

  1. Przeciąć blok pMMA zawierający eksplant wzdłuż jego długiej osi za pomocą piły diamentowej. Pierwszą połowę bloku zachować do analizy histologicznej. Drugą połowę przeciąć ponownie, aby uzyskać przekrój o grubości 1,5 mm. Cięcie wykonać przy 3000 obr./min z prędkością 3 mm/min.
  2. Szlifuj przekrój papierem ściernym z węglika krzemu o rosnącej numeracji odpowiadającej mniejszej ziarnistości: SiC 320 przez 10 s, SiC 1000 przez 15 s, SiC 2000 przez 30 s oraz SiC 4000 przez 30 s.
  3. Poleruj sekcję za pomocą pasty diamentowej i specjalnych tkanin: ściereczki do polerowania z 3 µm roztwór Mol B3 z diamentami przez 1 min, a następnie ściereczka z polaru z 1 µm Namaczanie w roztworze diamentu B1 przez 1 min.
  4. Opłucz przekrój wodą dwukrotnie destylowaną i usuń cząsteczki diamentu za pomocą patyczka kosmetycznego. Osusz przekrój strumieniem gazu azotowego.
  5. Nanieś powłokę węglową na gruby przekrój (grubość filmu węglowego 10 nm) i zamocuj go na aluminiowym wsporniku za pomocą farby srebrowej. Utwórz mostek z farby srebrowej pomiędzy górną częścią przekroju a wspornikiem, aby umożliwić odprowadzenie ładunków elektronowych do uziemienia.
  6. Umieść stub na stole SEM. Obok próbki wprowadź do komory SEM stub kontrolny składający się z pucharu Faradaya ze standardami węgla, glinu i krzemu. Posłuży on do kalibracji wiązki elektronów i przeliczenia poziomów szarości na wartości procentowe Ca. Zamknij komorę SEM i wytwórz próżnię.
  7. Włącz wiązkę elektronową i dostosuj parametry SEM do pracy w trybie elektronów wstecznie rozproszonych. Na obrazach z elektronów wstecznie rozproszonych poziom szarości wzorca węglowego wynosi 25, wzorca glinowego 225, a wzorca krzemowego 253. Przykładowo, w wykorzystanym systemie parametry SEM to: napięcie przyspieszające 20 keV, prąd sondy mierzony kubkiem Faradaya: 250 pA, odległość robocza: 15 mm, apertura: 30 µm, rozdzielczość obrazu: 1024 x 768 pikseli, próżnia: < 4.10-4 Pa, czas przebywania 100 µs/pixel, jasność ~38 i kontrast ~72.
  8. Po skalibrowaniu SEM za pomocą wzorców, należy uzyskać obrazy preparatu w trybie elektronów wstecznie rozproszonych.
  9. Należy wykorzystać obraz elektronów wstecznie rozproszonych preparatu, aby przekształcić poziomy szarości w zawartość wapnia, zgodnie z opisem w pracy Roschger i wsp.16Wykonaj tę czynność przy użyciu dowolnego oprogramowania do analizy obrazów.
  10. Narysuj rozkład zawartości wapnia. Rozkład zawartości wapnia wykazuje rozkład Gaussa. Obliczono trzy główne interesujące parametry: Caśrednia, jako średnia zawartość wapnia na obrazie, Capik jako najczęstsze stężenie wapnia występujące na obrazie oraz Caszerokość jako pełną szerokość w połowie maksimum rozkładu zawartości wapnia.
    UWAGA: Powtarzalność qBEi została zbadana poprzez obrazowanie tego samego obszaru zainteresowania przez 5 kolejnych dni (jedna akwizycja dziennie). Oznacza to, że wiązka elektronów była włączana i wyłączana pomiędzy sesjami. Procent błędu w Caśrednia, Capik, a wartości Cawidth oszacowano odpowiednio na 0,5%, 0,7% i 1,2%. Zawartość wapnia zbadano również za pomocą analizy rentgenowskiej z dyspersją energetyczną (EDS). Ustalono bardzo dobrą liniową zależność pomiędzy Caśrednia a zawartość wapnia oszacowana metodą EDS z wartością R² wynoszącą 0,99, co jest zbliżone do danych uzyskanych wcześniej przez Roschgera i współpracowników17.

6. Histologia

  1. Dla każdej próbki należy wykonać skrawki o grubości 7 µm przy użyciu mikrotomu do tkanek twardych z nożem wolframowym 18,19. Skrawki należy barwić metodą trichrome Goldnera, HES oraz barwieniem MOVAT, korzystając z automatycznego systemu barwienia.
  2. W celu deplastyfikacji próbki należy kolejno moczyć w acetonie przez 5 min (powtórzyć 2x). Następnie próbki należy płukać w wodzie destylowanej przez 5 min (powtórzyć 2x).
  3. Wykonać barwienie trichrome Goldnera zgodnie z poniższym opisem:
    1. Umieścić próbki w hematoksylinie żelazistej Weigerta na 20 min. Przemyć wodą z kranu. Zanurzyć próbki w 0,5% alkoholowym roztworze kwasu przez 30 s–1 min. Przemyć wodą z kranu przez 20 min.
    2. Umieścić próbki w roztworze Ponceau/kwasowej fuksyny/azofloksyny na 5 min. Zanurzyć w 1% kwasie octowym na 1 min.
    3. Barwić roztworem kwasu fosfomolibdowego/Orange G przez 20 min. Zanurzyć w 1% kwasie octowym na 1 min.
    4. Barwić roztworem fast green przez 15 min w temperaturze pokojowej lub 8 min w 60 °C. Dokładnie wypłukać wodą z kranu; powtórzyć 3x.
  4. Wykonać barwienie pentachrome Movat zgodnie z poniższym opisem:
    1. Barwienie błękitem Alcian: zanurzyć próbki w roztworze błękitu Alcian na 30 min. Płukać próbki w wodzie z kranu przez 5 min. Umieścić próbki w etanolu alkalicznym na 60 min. Płukać próbki w wodzie z kranu przez 10 min. Wykonać końcowe płukanie wodą destylowaną.
    2. Barwienie hematoksyliną Weigerta: umieścić próbki w hematoksylinie żelazistej Weigerta na 20–30 min. Płukać próbki w wodzie z kranu przez 15 min. Ponownie wypłukać wodą destylowaną.
    3. Barwienie Crocein Brilliant/kwasową fuksyną: zanurzyć próbki w roztworze Crocein Brilliant/kwasowej fuksyny na 10 min. Płukać 0,5% kwasem octowym. Zanurzyć próbki w 5% roztworze kwasu fosfotungstowego na 20 min. Płukać 0,5% kwasem octowym przez 2 min. Wykonać trzy kolejne płukania w 100% etanolu, każde po 5 min.
    4. Barwienie Safran du Gatinais: umieścić próbki w Safran du Gatinais na 15 min. Wykonać końcowe płukanie wodą z kranu.
  5. Wykonać barwienie HES zgodnie z poniższym opisem:
    1. Barwienie hematoksyliną Weigerta: zanurzyć próbki w hematoksylinie Weigerta na 30 min. Płukać wodą z kranu przez 2 min.
    2. Odbarwianie: zanurzyć próbki w alkoholowym roztworze kwasu solnego na 10 s. Płukać wodą z kranu przez 2 min.
    3. Neutralizacja: zanurzyć próbki w roztworze węglanu litu na 1 min. Płukać wodą z kranu przez 2 min. Wykonać końcowe płukanie wodą destylowaną przez 1 min.
    4. Barwienie eozyną-erytrozyną: umieścić próbki w roztworze eozyny-erytrozyny na 3 min. Płukać wodą z kranu przez 10 s.
    5. Odwadnianie: zanurzyć próbki w 95% alkoholu na 15 s. Przenieść do 100% alkoholu na 15 s. Powtórzyć zanurzenie w 100% alkoholu przez 30 s.
    6. Końcowe barwienie alkoholową safraniną: zanurzyć próbki w alkoholowej safraninie na 10 min. Wykonać końcowe płukanie wodą z kranu.
  6. Wykonać montowanie na szkiełkach zgodnie z poniższym opisem:
    1. Płukać próbki w 95% etanolu, następnie w 100% etanolu, a potem w metylocykloheksanie, powtarzając każdy z tych etapów 3x.
    2. Zamontować próbki przy użyciu zestawu do montowania i nałożyć szkiełko nakrywkowe. Przeskanować obrazy za pomocą cyfrowego skanera preparatów.

7. Mikrospektroskopia ramanowska

  1. Użyj tego samego przekroju, który był wykorzystywany do analizy SEM, do analizy Ramanowskiej. Krótko zeszlifuj i wypoleruj przekrój zgodnie z opisem w krokach 5.2 - 5.3, aby usunąć cienką warstwę węgla naniesioną na potrzeby SEM, która upośledza odprowadzanie ciepła z próbki.
  2. Umieść przekrój na stoliku mikrospektrometru Ramanowskiego. Przed pomiarem skalibruj liczbę falową, aby zapewnić dokładność, oraz ustaw wiązkę lasera. Ponieważ procedury te są specyficzne dla każdego urządzenia, nie zostaną one opisane w niniejszym artykule.
  3. Zlokalizuj w tkance obszary zainteresowania wymagające analizy. Ustaw analizowaną strefę w centrum narzędzia wideo i zarejestruj widma Ramanowskie z następującymi parametrami: laser 785 nm o mocy 30 mW, czas integracji: 20 s powtórzony 3 krotnie, zakres widmowy: 350-1800 cm-1, siatka dyfrakcyjna 1200 linii/mm.
  4. Zarejestruj 10 widm żywicy zatapiającej przy tych samych ustawieniach spektrometru Ramanowskiego i wyciągnij z nich średnią. Wykorzystaj to do odjęcia wkładu żywicy w kroku 7.6.
  5. Przeprowadź wstępne przetwarzanie widm w celu usunięcia wkładu fluorescencji, szumu i żywicy w następujący sposób: korekcja linii bazowej za pomocą dopasowania wielomianowego piątego stopnia, filtr Savitzky-Golay o stopniu 4 i rozmiarze okna od 17 do 21, cyfrowe odjęcie żywicy przy użyciu piku żywicy przy ~812 cm-1. Takie wstępne przetwarzanie można przeprowadzić przy użyciu różnych programów przeznaczonych do analizy i wizualizacji danych.
  6. Przeprowadź dalszą analizę przetworzonych widm w celu wyodrębnienia istotnych parametrów poprzez obliczenie stosunku intensywności piku drgań interesującego nas pasma do intensywności piku drgań referencyjnych. W przypadku analizy kości należy użyć następujących parametrów do obliczeń:
    1. Stosunki minerałów do macierzy: podziel intensywność piku drgań v1PO4 przy ~960 cm-1 przez intensywność piku Amidu I (~1668 cm-1), amidu III (~1250 cm-1), drgań CH2-wag (~1450 cm-1) lub sumę modów drgań proliny (~854 cm-1) i hydroksyproliny (Hyp, ~872 cm-1). Można również wykorzystać drgania v2PO4, zlokalizowane przy ~430 cm-1, lub v4PO4, zlokalizowane przy ~600 cm-1, i obliczyć ich stosunek do drgań Amidu III20. Parametry te reprezentują stopień mineralizacji organicznej fazy macierzy kostnej.
    2. Węglany/Fosforany: podziel intensywność piku v1CO3, zlokalizowanego przy ~1070 cm-1, przez v1PO4. Reprezentuje to ilość substytucji węglanowej typu B w sieci apatytu. Stosunek Hyp/Pro reprezentuje zawartość hydroksyproliny, ~1375 cm-1/Amid III reprezentuje zawartość proteoglikanów, ~1150 cm-1/CH2-wag oraz ~1495 cm-1/CH2-wag reprezentują ilość zaawansowanych produktów glikacji: karboksymetylolizyny i pentozydyny, natomiast 1670 cm-1/1690 cm-1 oraz 1670 cm-1/1640 cm-1 reprezentują odpowiednio nieuporządkowaną strukturę drugorzędową kolagenu, znaną jako dojrzałość kolagenu, oraz struktury uporządkowane w formie α-helisy w kolagenie typu I.
  7. Oceń powtarzalność pomiarów Ramanowskich, badając ten sam obszar zainteresowania w 5 kolejnych akwizycjach (jedna akwizycja dziennie). Dla każdego analizowanego parametru wariancja wynosiła poniżej 0,2% wartości parametru, co potwierdza dobrą powtarzalność. Specyfika każdego badanego piku była szeroko omawiana w literaturze, a przegląd przedstawiono w niedawnym opracowaniu Unal21.

8. Nanoindentacja

UWAGA: Ze względu na niszczący charakter nanoindentacji, jest ona zazwyczaj przeprowadzana na końcowym etapie rutynowej analizy próbki. Posiadany przez nas system nanoindentacji jest wyposażony w piramidalny diamentowy indenter Berkovitcha. Istnieje jednak kilka kształtów indenterów i w literaturze nie wypracowano konsensusu w kwestii wyboru odpowiedniego dla próbek kości lub biomateriałów.

  1. Nawodnij zatopioną próbkę kości w soli fizjologicznej przez 16 h w RT przed przeprowadzeniem testów nanoindentacji.
  2. Kalisz system nanoindentacji za pomocą kwarcowego szkła topionego i zapisz uzyskany moduł indentacji. Dla szkła topionego moduł indentacji wynosi około 72 GPa przy zastosowaniu współczynnika Poissona równego 0,17.
  3. Po skalibrowaniu systemu nanoindentacji umieść próbkę wykorzystywaną do analiz Raman w układzie optycznym urządzenia do nanoindentacji, aby wyznaczyć miejsca, w których zostanie przeprowadzona nanoindentacja.
    UWAGA: Sposób realizacji tego etapu różni się w zależności od urządzenia; nie opisujemy szczegółowo działania systemu i oprogramowania do nanoindentacji, lecz podajemy ogólne zalecenia dotyczące poszczególnych kroków, które należy wykonać.
  4. Po wybraniu miejsca nanoindentacji przesuń próbkę pod urządzenie do indentacji i wykonaj wciśnięcie. Przeprowadź nanoindentację na stałej głębokości 900 nm, przy prędkości obciążania/odciążania 40 mm/min i 15 s przerwy między obciążaniem a odciążaniem. Ustaw współczynnik Poissona dla tkanki kostnej na 0,3.
  5. Pobierz poszczególne parametry z krzywych nanoindentacji i oblicz je zgodnie z teorią Olivera i Pharra22.
    1. Moduł indentacji (EIT) jest wyprowadzany ze znanych właściwości wierzchołka indentora oraz modułu zredukowanego i łączy w sobie lokalny moduł sprężystości próbki. Oblicz indentację jako:
      Równanie sprężystości, E_IT, wzór dla analizy naprężenie-odkształcenie.
      gdzie vs, vi, Ei, oraz Er reprezentują odpowiednio współczynnik Poissona próbki (przyjęty dla kości jako 0,3), współczynnik Poissona diamentowego indentora (przyjęty jako 0,07), moduł sprężystości diamentowego indentora (ustalony na 1140 GPa) oraz moduł zredukowany, obliczany jako:
      Równanie równowagi statycznej, Er=0,857(S/√Ap), schemat wzoru, referencja edukacyjna.
      ​gdzie S oznacza nachylenie odcinka odciążania, a Ap jest powierzchnią rzutowaną, obliczaną jako:
      Równanie równowagi statycznej; Ap = 24,5 × hm - 0,7 × (Lm/S); wzór procesu mechanicznego.
    2. Twardość (HIT): odpowiada odporności kości na inicjację i propagację pęknięć. Innymi słowy, jest to wskaźnik odporności kości. Oblicz HIT jako:
      Wzór termodynamiczny, HIT= Lm/Ap, schemat ilustrujący obliczanie sprawności cieplnej.
    3. Szybkość pełzania przy indentacji (CIT): odzwierciedla odkształcenie kości w czasie przy stałym obciążeniu, co wskazuje na właściwości wiskoelastyczne próbki; oblicz jako:
      Równanie do obliczania sprawności, Cv = 100 × (hm - hl) / hl, reprezentacja wzoru.
    4. Obciążenie maksymalne (Lm): odpowiada przeciwstawnej sile obciążenia niezbędnej do penetracji zmineralizowanej macierzy kostnej na wskazaną głębokość.
    5. Praca indentacji (Wplast): odpowiada polu pod krzywą odkształcenia obciążenie/odciążenie. Jest to bezpośrednie odzwierciedlenie energii rozproszonej w celu wywołania odkształcenia plastycznego.
      UWAGA: Powtarzalność nanoindentacji jest trudniejsza do oceny w próbkach kostnych ze względu na niszczący charakter tej metody. Niemniej jednak oszacowaliśmy powtarzalność dla standardowej i jednorodnej próbki szkła topionego. Dla wszystkich powyższych parametrów wariancja została oszacowana poniżej 0,26% (5 kolejnych pomiarów w 5 osobnych dniach), co potwierdza bardzo dobrą powtarzalność. Z drugiej strony, ze względu na anizotropową naturę próbek kostnych, trudniej jest ocenić ich powtarzalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obraz mikro-TK eksplantu przedstawiono na Rysunku 2. Przy zastosowaniu segmentacji ręcznej nie można optymalnie oddzielić kości od cementu znajdującego się w kanale centralnym przy użyciu globalizacji progu. Aby poprawić rozpoznawanie kości beleczkowej i cementu, proponujemy zastosowanie uczenia głębokiego. Uczenie głębokie jest skuteczne w rozpoznawaniu charakterystyk biomateriałów i pomaga usprawnić oddzielenie kości od cementu, co umożliwia lepszą ocenę oddziaływań na styku cement-kość. J...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Naprawa ubytków kostnych jest głównym wyzwaniem w medycynie regeneracyjnej mającym na celu przywrócenie mobilności, zmniejszenie bólu i poprawę jakości życia osób dotkniętych chorobą. Stosowanie modeli eksplantatów oferuje szereg korzyści w porównaniu z badaniami in vivo w zakresie badania naprawy ubytków kostnych. Oprócz względów etycznych, model ten pozwala na rygorystyczną kontrolę warunków eksperymentalnych i zmniejszenie zmienności biologicznej, ułatwiając w ten sposób generowanie dokładniejszych i bardziej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcemy podziękować obiektom technicznym zaangażowanym w zbieranie i przetwarzanie okazów, w tym SC3M (SFR Francois Bonamy (UMS 016), University of Nantes), SFR ICAT (University of Angers), BIO3, HiMolA i SC4BIO. Inserm UMR_S 1229 RMeS jest wspierany przez dotacje rządu francuskiego za pośrednictwem instytucji Inserm, Nantes Université, Univ Angers i Oniris VetAgroBio. CL jest również wdzięczny HTL Biotechnology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry 0,20VWR 28145-501
Igła 18 G (1,2x40 mm)Strzykawka Sterican
3 mlHENKE-JECT8300005762
37% kwas solny Firma VWR 1.00317.1000 
Kwas octowy (lodowaty) Sigma A6283 
Aceton Firma VWR 20063-365 
Alcian Blue 8GXVWR 
Wodorotlenek amonuVWR 
Apatytyczny fosforan trójwapniowy Centrum Inżynierii Biomedycznej i Opieki Zdrowotnej (Mines Saint Etienne, Francja)TV26U 
AzofloksynaSigma 
Nadtlenek benzoiluSigma 8.01641.0250
BMP2Medtronic InductOs 1,5 mg/ml
Brillant crocein Aldrich 
CTVox Bruker-DataViewer
 Skyscan-Diamond
bladeStruersMOD13
Piła diamentowaStruersAccutom-50
DiaPro Mol B3 roztwór diamentowyStruers40600379
DiaPro Nap B1 roztwór diamentowyStruers40600373
Dwuzasadowy fosforan sodu (Na2HPO4)Sigma 
Phtalan dibutyluChimie-Plus Laboratoires28656
Oprogramowanie DragonFly ORS2022.1.0.1231. 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, GlutaMAX(TM), pirogronianThermoFisher Scientific31966-021
Eozyna Y- Surgipath Sigma 
Erytrozyna BSigma 
Absolutny etanolVWR 
Eukitt Dutscher6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mlSarstedt62.547.254
Sześciowodny chlorek żelaza (FeCl3, 6H2O) Firma Merck 1.03943.0250
Surowica bydlęca płodu (FBS) EurobioCVFSVF00
Kwas fuksynowyMerck 1.05231.0025 
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)BiosuraMS01NG100J
HematoxylinSigma 86.118.9 
Prasa izostatycznaNova SuissePmax 1500 prętów
Granulometria dyfrakcji laserowej  MalvernMastersizer 3000
JasnozielonyProlabo 
Węglan lituSigma A13149 
Ściereczka polerska MD-MolStruers40500077
MetylocykloheksanVWR 8.06147.1000 
Metylocykloheksan Firma VWR 8.06147.1000 
Metylocykloheksan Firma VWR 8.06147.1000 
Metakrylan metyluSigma 8.00590.2500
Mikrotomografia komputerowa, mikroskaner BrukerSkyscan 1272
Jednozasadowy fosforan sodu (NAH2PO4)Sigma 71496
MoździerzFritsch Pulverisette 6
N,N, DimethylanilinSigma 803060
Stacja nanotwardościAnton PaarNHT2
ND-NapStruers40500080
Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego, 4,75 mmArthrexAR-1981-04S
Zestaw systemu transferu autoprzeszczepu kostno-chrzęstnego OATS, 8 mmArthrexAR-1981-08S
Pomarańczowy GRalM15
Paraformaldehyd (PFA)Sigma P6148
Jednorazowe formy do obsadzaniaPolysciences, Inc18646C-1
Penicylina/Streptomycyna (P/S)ThermoFisher Scientific15140122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Kwas fosfomolibdenowy Sigma 221856-100 g
Kwas fosfotynowyAldrich Numer katalogowy: 12863-5 
Maszyna dopolerowania SturersDap V
PoupinelMEMMERTTV26U 
Mikrospektrometr RamanaRenishawInVia Qontor
Safran du Gâ tinais Labonord 
Skaningowy mikroskop elektronowyCarl ZeissEvo LS 10
SEMZeissCarl Zeiss Evo LS10
Folie SiC/Bibułki szlifierskieStruers40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
Farba srebrnaMikroskopia elektronowa nauki12686-15
Standardowy króciec z kubkiem Faradaya, wzorcami węglowymi, aluminiowymi i silikonowymiMicro-Analysis Consultants Ltd8602
Kolba T25Corning430639
KsylenVWR 28975.325
Xylidine PonceauAldrich 19.976-1 
4665120 361186318612210633210750710240459810028301051021410572082036228947135 Ściereczka polerska 11507737

Bibliografia

  1. Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications. Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).
  2. Tsuji, K., et al. BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing. Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).
  3. Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. Boneremodeling. Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).
  4. Boivin, G., Meunier, P. J. The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography. Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).
  5. Boivin, G., et al. Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue. Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).
  6. Zanghellini, B., et al. Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone. J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).
  7. Trento, G., et al. formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation. Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).
  8. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  9. Budán, F., et al. Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging. PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).
  10. Hulsart-Billström, G., et al. A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis. Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).
  11. Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation. Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).
  12. Chan, M. E., et al. A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology. Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).
  13. Doke, S. K., Dhawale, S. C. Alternatives to animal testing: A review. Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).
  14. Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. SSRN. , (2024).
  15. Paré, A., et al. Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept. Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).
  16. Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies. Bone. 23 (4), 319-326 (1998).
  17. Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities. Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).
  18. Porter, A., et al. Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses. Sci Rep. 7, 42505(2017).
  19. Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707(2010).
  20. Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition. J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).
  21. Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy. Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).
  22. Oliver, W. C., Pharr, G. M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments. J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).
  23. Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. A comparative anatomical study of the human knee and six animal species. Knee. 19 (4), 493-499 (2012).
  24. Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep. Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).
  25. Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Regeneracja kościobrazowanie mikro-TKanaliza głębokiego uczeniananoindentacjabadanie histologiczneskaningowa mikroskopia elektronowaspektroskopia Ramanowskasubstytut kości
Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.