Wyjaśnienie specyficznych dla tkanek i osocza zmian proteomicznych w zdrowiu i chorobie

Podsumowanie

Proteomika to wysokoprzepustowa ocena interakcji, funkcji, składu i struktur białek oraz ich aktywności komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny całkowitych zmian proteomicznych w różnych próbkach biologicznych, w tym w osoczu i tkankach. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metodologia ma zastosowanie do wszystkich próbek biologicznych zawierających białka.

Streszczenie

Proteomika to zakrojone na szeroką skalę badanie ekspresji białek, koncentrujące się na ich strukturze, funkcji, interakcjach, obfitości i modyfikacjach potranslacyjnych w systemie biologicznym. Na przykład fosfoproteomika, istotny podzbiór całkowitej proteomiki, to badanie wzorców fosforylacji i zmian w białkach. Opisana tutaj metodologia ilustruje całościowe podejście proteomiczne do wyjaśnienia zmian w ogólnych profilach ekspresji białek, w tym wzorcach fosforylacji, w tkankach osocza, mózgu, płuc, śledziony i wątroby pobranych z badawczych modeli zwierzęcych (tj. fretek i myszy). Technika ta ma zastosowanie do innych typów tkanek, a także do prawie każdej próbki biologicznej zawierającej białka (np. Hodowane komórki). Po rozbiorzeniu, tkanki będące przedmiotem zainteresowania zostały błyskawicznie zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C. Tkanki następnie homogenizowano za pomocą moździerza i tłuczka z ciekłym azotem, aby zachować integralność białka i zmiany fosforylacji. Białko całkowite wyekstrahowano z homogenatów tkankowych za pomocą buforu do lizy z uniwersalną nukleazą i inhibitorami proteazy/fosfatazy. Białka wyekstrahowane z tkanki i równoważnego osocza przekształcono w peptydy całkowite poprzez kontrolowane trawienie proteazy przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowywania próbek spektrometru mas. Peptydy analizowano bezpośrednio za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas Orbitrap-tribrid. Tożsamość białek składowych zrekonstruowano na podstawie danych spektralnych mas peptydów przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego proteomicznego, dopasowanego do biblioteki sekwencji aminokwasów specyficznej dla gatunku. W związku z tym analiza powinna obejmować ścisłe kryteria odcięcia, w szczególności przy użyciu wyłącznie identyfikacji białek o wysokim poziomie ufności. Statystycznie istotne różnice proteomiczne (>2-krotna zmiana; p < 0,05) można określić między grupą kontrolną a eksperymentalną.

Wprowadzenie

Proteomika, jako połączenie eksperymentów z proteomem i analizy danych, koncentruje się na identyfikacji i kwantyfikacji białek, charakteryzowaniu ich na podstawie składu, interakcji, modyfikacji przedtranslacyjnych i potranslacyjnych (np. fosforylacji), lokalizacji subkomórkowej i struktury w warunkach fizjologicznych¹. Proteomika ekspresji zajmuje się ilościowymi porównaniami białek, które różnią się pod wpływem zmieniających się warunków biologicznych². Ma również duże znaczenie w profilowaniu mapy złożonych, wzajemnie połączonych szlaków, sieci i systemów molekularnych, które bezpośrednio kontrolują główne funkcje bi....

Protokół

Badania przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem wykorzystania zwierząt w obiekcie akredytowanym przez AAALAC International z gwarancją dobrostanu zwierząt Publicznej Służby Zdrowia oraz zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt oraz innymi federalnymi ustawami i przepisami dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie materiały eksploatacyjne wymagane do tej procedury są wymienione w Tabeli Materiałów. Procedura jest podzielona na siedem elementów.

OSTROŻNOŚĆ. Upewnij się, że podczas pracy z ciekłym azotem w celu homogenizacji tkanek przestrzegane są odpowiednie protokoły bezpieczeństwa. Personel labor....

Wyniki

Wizualizacja całkowitych wyników proteomu poprzez opcjonalne przetwarzanie na wykresy wulkanów
Całkowite wyniki proteomu dla każdej próbki można łatwo przeszukać według akcesji # lub opisu dla określonych białek będących przedmiotem zainteresowania badawczego, a związane z tym względne obfitości są uśredniane, a następnie porównywane między grupami pod kątem istotnych różnic (np. jak na podstawie wartości p pochodzących z testu t). Alternatywnie, bardzo cenne może być poszukiwanie globalnych zmian w c.......

Dyskusja

Powyższa metoda wykorzystywała tkanki, które zostały natychmiast zamrożone w ciekłym azocie, aby natychmiast zatrzymać całą aktywność biologiczną przed przeniesieniem do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Po pobraniu wszystkich próbek nastąpiła homogenizacja tkanek. Podczas homogenizacji bardzo ważne jest, aby wszystkie tkanki i narzędzia były zimne, aby zapobiec reaktywacji lub degradacji białek. Ponadto, podczas początkowej ekstrakcji białka z homogenizowanej tkanki, próbki są utrzymywane w niskiej.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania białek 660 nm	Pierce / Thermo Scientific	22662	Do BCA do oznaczania stężeń białek w próbkach, zawiera odczynnik do oznaczania białek Pierce 660nm i wstępnie rozcieńczone wzorce do oznaczania białek
Acetonitryl, gatunek Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	047138.K2	Ultraczysty acetonitryl stosowany do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas
Uszczelka z folii aluminiowej	Beckman Coulter	538619	Uszczelka używana podczas opracowywania płytki do oznaczania białek
Czytnik wielomodowy BioTek Synergy Neo2 / spektrometr UV-Vis	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195	Przyrząd do odczytu spektrofotometru/płytki testowej służy do wykonywania odczytów absorbancji 660 nm w celu określenia stężeń białek
ChromaCare LC-MS Roztwór do spłukiwania instrumentów	Thermo Fisher Naukowy	T111101000	Roztwór zawierający po 25% acetonitrylu, izopropranolu, metanolu i wody pomaga oczyścić układ LC po uruchomieniu próbek
Rurka Precellys CK28	Bertin Corp / Technologie	P000911LYSK0A.0	Homogenizowane tkanki umieszcza się w tych probówkach w celu lizy tkanek i izolacji białek za pomocą instrumentu Precellyis. Są to probówki używane przez nasze laboratorium, określane w protokole jako "probówki homogenizujące".
Kriopod	Brooks / Azenta Nauki Przyrodnicze	https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier	Pojemnik służący do przechowywania ciekłego azotu do schładzania zaprawy podczas homogenizacji tisuse
Zestaw do przygotowania próbek EasyPep Mini MS	Thermo Fisher Naukowy	A40006 powiedział:	Jeden zestaw może przetworzyć 20 próbek, zawartość obejmuje roztwór do lizy do ekstrakcji białek, uniwersalną nukleazę uzupełnioną w roztworze ekstrakcyjnym oraz substancje potrzebne do kroków 1.4 i 1.5
Kolumna EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 & m Dia oraz 2 &mikro; m wielkość cząstek)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał ES901	Kolumna LC do elektrorozpylania stosowana do oddzielania peptydów przed wykryciem stwardnienia rozsianego
Roztwór kalibracyjny FlexMix	Pierce / Thermo Scientific	A39239 (A39239)	Mieszanina 16 standardowych cząsteczek używana do kalibracji dokładności i czułości detektora przyrządu MS przed serią próbek
Kwas mrówkowy, klasa LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	85178	Ultraczysty kwas mrówkowy stosowany do acyfikacji wszystkich roztworów i próbek LC w końcowym stężeniu 0,1% (v/v)
Zatrzymaj proteazę i Jednorazowy koktajl inhibitorów fosfotazy (100x)	Thermo Fisher Naukowy	78442	Uzupełniony buforem ekstrakcyjnym w celu zapobieżenia degradacji białek i fosfoprotein w próbce
Metanol klasy Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	047192.K2	Ultraczysty metanol stosowany do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas
Moździerz porcelanowy, 150 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961C (Zobacz materiał FB961C)	Pojemność 150 ml, używana do homogenizacji mniejszych tkanek fretki (np. mózgu)
Moździerz porcelanowy, 275 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961D	Pojemność 275 ml, stosowana do homogenizacji dużych tkanek fretki (tj. wątroby)
Moździerz porcelanowy, 50 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961A	Pojemność 50 ml, używana do homogenizacji tkanek myszy
Tłuczek porcelanowy, 50 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961K	Do stosowania z zaprawą o pojemności 50 ml
Tłuczki porcelanowe, 150 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961M	Do stosowania z moździerem o pojemności 150 ml
Tłuczki porcelanowe, 275 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961N	Do stosowania z zaprawą o pojemności 275 ml
Precellys powiedział:	Bertin Corp / Technologie	https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/	Przyrząd służący do homogenizacji próbek tkanek. Zastosowano następujące ustawienia: 4500 obr./min, 2 x 30 s na cykl, 30 s przerwy.
Odczynnik do oznaczania białek	Pierce / Thermo Scientific	22662	Odczynnik do oznaczania białek użyty w krokach 3.4– 3.8
Odkrywca proteomu	Thermo Fisher Naukowy	CSW0064764	Oprogramowanie bioinformatyczne do analizy danych proteomicznych/fosfoproteomicznych
Fiolki do wstrzykiwań LC z zakrętką SureSTART MSCERT (0,02– Pojemność 1,5 ml)	Thermo Fisher Naukowy	6PMCK39TR powiedział:	Certyfikowane do stosowania fiolki z zakrętką (PTFE, przegrody z nacięciem) z zakrętką używaną do przechowywania próbek do wstrzykiwań na instrumencie LC/MS
System Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)	Thermo Fisher Naukowy	LC: ze zniżką / MS: FETD2-10002, na specjalne życzenie	Przyrząd do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o ultrawysokiej wydajności (LC/MS) używany do oddzielania, a następnie wykrywania peptydów w próbkach na podstawie masy cząsteczkowej
Uniwersalna nukleaza do lizy komórek, 100kU, 400 i mikro; L	Pierce / Thermo Scientific	88702	Zakupiono dodatkową nukleazę uniwersalną
Odkurzacz Plus	Eppendorf powiedział:	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748	Próżnia używana do suszenia próbek peptydów przed rozpuszczeniem.
Woda, klasa Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 047146.K2	Ultraczysta woda używana do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas