Wyjaśnienie specyficznych dla tkanek i osocza zmian proteomicznych w zdrowiu i chorobie

Podsumowanie

Proteomika to wysokoprzepustowa ocena interakcji, funkcji, składu i struktur białek oraz ich aktywności komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny całkowitych zmian proteomicznych w różnych próbkach biologicznych, w tym w osoczu i tkankach. Przedstawiona w niniejszym dokumencie metodologia ma zastosowanie do wszystkich próbek biologicznych zawierających białka.

Streszczenie

Proteomika to zakrojone na szeroką skalę badanie ekspresji białek, koncentrujące się na ich strukturze, funkcji, interakcjach, obfitości i modyfikacjach potranslacyjnych w systemie biologicznym. Na przykład fosfoproteomika, istotny podzbiór całkowitej proteomiki, to badanie wzorców fosforylacji i zmian w białkach. Opisana tutaj metodologia ilustruje całościowe podejście proteomiczne do wyjaśnienia zmian w ogólnych profilach ekspresji białek, w tym wzorcach fosforylacji, w tkankach osocza, mózgu, płuc, śledziony i wątroby pobranych z badawczych modeli zwierzęcych (tj. fretek i myszy). Technika ta ma zastosowanie do innych typów tkanek, a także do prawie każdej próbki biologicznej zawierającej białka (np. Hodowane komórki). Po rozbiorzeniu, tkanki będące przedmiotem zainteresowania zostały błyskawicznie zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C. Tkanki następnie homogenizowano za pomocą moździerza i tłuczka z ciekłym azotem, aby zachować integralność białka i zmiany fosforylacji. Białko całkowite wyekstrahowano z homogenatów tkankowych za pomocą buforu do lizy z uniwersalną nukleazą i inhibitorami proteazy/fosfatazy. Białka wyekstrahowane z tkanki i równoważnego osocza przekształcono w peptydy całkowite poprzez kontrolowane trawienie proteazy przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowywania próbek spektrometru mas. Peptydy analizowano bezpośrednio za pomocą ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej/tandemowej spektrometrii mas Orbitrap-tribrid. Tożsamość białek składowych zrekonstruowano na podstawie danych spektralnych mas peptydów przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego proteomicznego, dopasowanego do biblioteki sekwencji aminokwasów specyficznej dla gatunku. W związku z tym analiza powinna obejmować ścisłe kryteria odcięcia, w szczególności przy użyciu wyłącznie identyfikacji białek o wysokim poziomie ufności. Statystycznie istotne różnice proteomiczne (>2-krotna zmiana; p < 0,05) można określić między grupą kontrolną a eksperymentalną.

Wprowadzenie

Proteomika, jako połączenie eksperymentów z proteomem i analizy danych, koncentruje się na identyfikacji i kwantyfikacji białek, charakteryzowaniu ich na podstawie składu, interakcji, modyfikacji przedtranslacyjnych i potranslacyjnych (np. fosforylacji), lokalizacji subkomórkowej i struktury w warunkach fizjologicznych¹. Proteomika ekspresji zajmuje się ilościowymi porównaniami białek, które różnią się pod wpływem zmieniających się warunków biologicznych². Ma również duże znaczenie w profilowaniu mapy złożonych, wzajemnie połączonych szlaków, sieci i systemów molekularnych, które bezpośrednio kontrolują główne funkcje biologiczne, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie, starzenie się i mechanizmy śmierci komórki. Wraz ze znacznym postępem technologii eksperymentalnej w ostatnich latach, metody proteomiczne ewoluowały od podejść konwencjonalnych - w tym immunohistochemii i testu immunoenzymatycznego - do technik wysokoprzepustowych, takich jak chromatografia cieczowa ^3,4. Podejścia oparte na proteomice nabierają rozpędu w określaniu unikalnych fenotypów i podtypów chorób, a także w identyfikowaniu nowych interakcji docelowych dla leków terapeutycznych (farmakoproteomika). Na przykład stratyfikacja pacjentów koncentrowała się przede wszystkim na podejściach genomicznych w celu zdefiniowania jednorodnych grup i ukierunkowania schematów leczenia. Sam status transkrypcji nie pozwala jednak przewidzieć losu białek uległych translacji w późniejszym czasie (np. stabilności lub modyfikacji); W związku z tym mechanizmy niegenomowe w większym stopniu przyczyniają się do rozwoju, progresji, ciężkości i oporności choroby^na terapie ^5,6,7.

Jednym z takich obszarów badawczych, który znacznie skorzystał na ilościowych porównaniach ekspresji i aktywności białek, jest odkrycie biomarkerów w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych i urazowego uszkodzenia mózgu (TBI). Podstawą do odkrycia biomarkerów jest opracowanie technik diagnostycznych, które ułatwiają wczesne wykrywanie i potencjalne cele interwencji. Proteomika ilościowa oparta na LC/MS-MS w połączeniu z bioinformatyką pomogła w odkryciu kluczowych biomarkerów białkowych, w tym kwaśnego białka fibrylarnego gleju (GFAP) i izoenzymu L1 hydrolazy karboksylowej ubikwityny (UCH-L1), o silnym wpływie lub penetrującym TBI ^8,9. Na przykład personel wojskowy często cierpi z powodu incydentów TBI podczas swoich misji, z powodu narażenia na wybuchy bomb (tj. blast-TBI). Jednak patobiologia leżąca u podstaw deficytów neurologicznych spowodowanych łagodnym TBI wywołanym przez blasty pozostaje niejasna. W związku z tym zrozumienie molekularnych i ultrastrukturalnych mechanizmów uszkodzenia mózgu wywołanego wybuchem wymaga lepszej identyfikacji specyficznych substytutów biomarkerów. Obserwując zmiany proteomiczne, badania wykazały możliwe mechanizmy stresu oksydacyjnego wywołanego blastami w mózgu, które mogą być związane z dysfunkcją mitochondriów, w tym upośledzoną dynamiką rozszczepienia-fuzji, zmniejszoną fosforylacją oksydacyjną i kompensowaną aktywnością enzymów istotnych dla oddychania¹⁰. Wgląd we wczesną patogenezę wywołanej blastami dysregulacji modyfikacji potranslacyjnych, takich jak acetylacja, nitrozylacja, deaminacja i fosforylacja, może również dostarczyć dalszej charakterystyki jej wpływu na funkcję białka związaną z uszkodzeniem aksonów, stanem zapalnym i zaburzeniem bariery krew-mózg^11,12. Wraz z postępem w dziedzinie biologii systemowej, mapowanie całkowitych informacji proteomu z mózgu i tkanek obwodowych u różnych gatunków zwierząt, w tym gryzoni i fretek, stało się kluczową procedurą w badaniach nad urazami postrzałowymi.

W tym artykule skupimy się na metodologii oceny ilościowych aspektów proteomiki ekspresji i jej modyfikacji potranslacyjnych, począwszy od tkanki lub osocza, która jest szeroko stosowana do monitorowania zarówno zjawisk fizjologicznych, jak i stanów patologicznych. Wykorzystanie poniższej metodologii pozwala na zapewnienie spójności i niezawodności w przygotowywaniu próbek i pozyskiwaniu danych. Dzięki tej ustandaryzowanej metodologii można dokonywać porównań w celu określenia zachowanych wzorców proteomicznych w różnych typach tkanek i wzorców fosforylacji unikalnych dla określonych tkanek. Oprócz tego można przeprowadzić analizę kilku przedklinicznych modeli zwierzęcych i ludzkich próbek klinicznych w celu uzyskania konserwatywnych wzorców fosforylacji, które mogą potencjalnie służyć jako biomarkery i dostosować schematy leczenia farmakologicznego.

Protokół

Badania przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem wykorzystania zwierząt w obiekcie akredytowanym przez AAALAC International z gwarancją dobrostanu zwierząt Publicznej Służby Zdrowia oraz zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt oraz innymi federalnymi ustawami i przepisami dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych. Wszystkie materiały eksploatacyjne wymagane do tej procedury są wymienione w Tabeli Materiałów. Procedura jest podzielona na siedem elementów.

OSTROŻNOŚĆ. Upewnij się, że podczas pracy z ciekłym azotem w celu homogenizacji tkanek przestrzegane są odpowiednie protokoły bezpieczeństwa. Personel laboratorium nosił rękawice do zamrażania, fartuch zamrażarki, chirurgiczną maskę na twarz i przyłbicę podczas homogenizacji zamrożonych tkanek. Ta technika homogenizacji może być stosowana do każdego rodzaju tkanki, w tym do bardzo twardych substancji, takich jak kości, po prostu odpowiednio dostosowując rozmiar moździerza i tłuczka. Zobacz rysunek 1A , aby zapoznać się z początkową konfiguracją stołu roboczego. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje na temat rozmiarów stosowanych podczas homogenizacji tkanek myszy i fretek.

1. Kriogeniczne mielenie tkanek za pomocą moździerza i tłuczka

1. Weź wagę pustej probówki zbiorczej i zapisz ją. W probówce pobranej zważ tkankę za pomocą wagi analitycznej i zapisz masę w zeszycie laboratoryjnym. Odejmij masę pustej probówki od tkanki plus wagę probówki, aby uzyskać mg użytej tkanki.
   UWAGA: Tkanki, które zostały ocenione pod kątem badań proteomicznych, obejmują mózg, płuca, wątrobę i śledzionę. Cała tkanka została zmielona kriogenicznie na postać sproszkowaną za pomocą moździerza i tłuczka.
2. Wlej ciekły azot do kriopoda, ale upewnij się, że jest on napełniony mniej niż do połowy.
3. Przenieść probówkę zawierającą próbkę i pustą, uprzednio autoklawowaną probówkę (probówki) do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na stojak na probówki znajdujący się w kriopodzie. Gwarantuje to, że próbka pozostaje zamrożona podczas schładzania moździerza i tłuczka, zapobiegając rozmrożeniu próbki podczas przenoszenia homogenizowanej tkanki do pustej probówki (probówek) do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
4. Wlej ciekły azot na moździerz i tłuczek, aby schłodzić te instrumenty przed użyciem. Moździerz i tłuczek znajdują się na zewnątrz kriopoda (rys. 1A,B).
5. Przenieść tkankę do schłodzonej zaprawy zawierającej ciekły azot (rysunek 1B).
6. Kilkakrotnie naciskaj na zamrożoną tkankę za pomocą tłuczka i wykonuj ruch obrotowy, mielący tłuczkiem o tkankę, aż tkanka zostanie zmielona na drobny proszek (Rysunek 1C).
   1. Upewnij się, że nie jest przykładana nadmierna siła, co grozi wylaniem próbek z zaprawy. Upewnij się, że masz ścisłą kontrolę nad tłuczkiem.
   2. Dodaj dodatkowy ciekły azot do zaprawy podczas homogenizacji dużych tkanek, aby zmniejszyć ryzyko rozmrożenia próbki podczas mielenia.
   3. Podczas mielenia chusteczki sprawdź, czy nie rozmraża się. Jeśli się rozmraża, umieść dodatkowy ciekły azot w moździerzu.
7. Zanurz końce metalowych szpatułek w ciekłym azocie, aby je schłodzić. Pomaga to w łatwym przeniesieniu homogenizowanej tkanki do probówki o pojemności 1,5 ml. Zapobiega to rozmrażaniu się tkanki i przywieraniu do szpatułki podczas transferu.
8. Gdy tkanka zostanie zhomogenizowana na drobny proszek, a metalowe szpatułki zostaną schłodzone, ostrożnie przenieś homogenizowany proszek tkankowy do nowych probówek o pojemności 1,5 ml.
   1. Podzielić próbkę na podwielokrotności w zależności od liczby testów, które mają zostać wykonane.
      UWAGA: Na przykład cztery testy miały zostać wykonane dla próbek w tym badaniu, więc homogenizowana tkanka została równo podzielona na cztery probówki o pojemności 1,5 ml.
   2. Przechowuj dodatkową homogenizowaną tkankę w autoklawowanej probówce zbiorczej typu snap-top o pojemności 5 ml.
9. Przechowywać poddane tkanki w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu przyszłej analizy, z realistycznym użyciem w ciągu 1 roku w celu zminimalizowania utleniania powietrza i światła.
10. Zważyć pustą probówkę zbiorczą.
11. Odjąć masę pustej probówki zbiorczej od początkowego pomiaru (probówka zbiorcza plus próbka), aby uzyskać masę próbki tkanki.

2. Liza tkanek w celu izolacji białek

1. Wlej suchy lód do pojemnika na miskę na lód.
2. Umieść stojak na probówki w suchym lodzie i pozwól mu ostygnąć.
3. Wyjąć homogenizowane próbki tkanek z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić w schłodzonym stojaku na probówki. Zapobiega to rozmrażaniu się próbek, co mogłoby powodować degradację białek i/lub zmiany fosforylacji podczas procesu ważenia.
   1. Upewnij się, że probówki o pojemności 1.5 ml zawierające próbkę pozostają zamrożone na stojaku na probówki w suchym lodzie.
4. Umieść nową probówkę kanoniczną o pojemności 50 ml w suchym lodzie.
5. Zdejmij nakrętkę z probówki kanonicznej o pojemności 50 ml i umieść jednorazowe plastikowe szpatułki w tubce kanonicznej o pojemności 50 ml, aby były chłodne. Zapobiega to przywieraniu próbki do szpatułek podczas ich przenoszenia do probówek homogenizacyjnych.
6. Do lizy tkanek i izolacji białek należy użyć probówek o pojemności 2 ml zawierających pięć kulek ceramicznych o średnicy 2,8 mm (zwanych w tym protokole probówkami homogenizującymi).
7. Oznaczyć nasadkę i bok probówki homogenizującej identyfikatorem próbki za pomocą pisaka do trwałego znakowania tuszem.
8. Umieść oznakowane, homogenizujące probówki w stojaku na probówki umieszczonym w suchym lodzie, aby utrzymać probówki w niskiej temperaturze i zapobiec rozmrażaniu próbki.
9. Umieścić jedną probówkę homogenizującą na wadze analitycznej i wytarować wagę.
10. Umieść probówkę homogenizującą z powrotem na stojaku na probówki na suchym lodzie.
11. Zdjąć pokrywkę z probówki homogenizacyjnej zawierającej kulki i za pomocą jednej ze schłodzonych plastikowych szpatułek przenieść od 5 mg do 10 mg sproszkowanej próbki tkanki do odpowiedniej probówki homogenizującej.
12. Umieść pokrywkę z powrotem na probówce homogenizującej.
13. Zważyć probówkę homogenizującą na wadze analitycznej i zapisać ilość próbki w probówce homogenizującej.
    1. Użyj tej masy, aby określić ilość buforu do lizy wymaganą do efektywnej ekstrakcji białka całkowitego.
14. Po zarejestrowaniu masy umieść probówkę homogenizującą zawierającą próbkę z powrotem w stojaku na probówki na suchym lodzie, aby była zimna.
15. Wyrzuć zużytą plastikową szpatułkę.
16. Do każdej przenoszonej i ważonej próbki należy używać nowej, czystej plastikowej szpatułki, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Powtórzyć kroki od 2.9 do 2.15 dla wszystkich próbek.
17. Po przeniesieniu wszystkich próbek do poszczególnych probówek homogenizujących należy obliczyć potrzebną ilość Protein Lysis Master Mix.
    1. Przygotuj wymaganą objętość Protein Lysis Master Mix, która jest obliczana na podstawie liczby próbek, które muszą zostać przetworzone, oraz masy każdej próbki w proszku. Do każdej probówki dodać 100 μl Protein Lysis Master Mix na 5 mg tkanki.
    2. Zapoznaj się z wytycznymi firmy dotyczącymi objętości odczynników do przygotowania Protein Lysis Master Mix (patrz Tabela materiałów).
18. Umieścić probówki homogenizujące zawierające homogenizowane, sproszkowane próbki w zimnym bloku o temperaturze 4 °C. Rurki homogenizujące nie mogą już pozostawać na suchym lodzie. Umieszczenie probówek homogenizujących na zimnym bloku zapobiega zamarzaniu roztworu do lizy.
19. Zdejmij pokrywkę z probówek homogenizujących i przenieś obliczoną ilość potrzebnej mieszanki Protein Lysis Master Mix do odpowiedniej probówki homogenizującej za pomocą pipety o odpowiedniej pojemności.
    1. Umieść pokrywkę z powrotem na probówkach homogenizujących i obracaj pokrywkami, aż będą szczelne.
20. Umieścić probówki z próbkami w homogenizatorze i włączyć program tkanek miękkich (prędkość 4500 obr./min, 2 x 30 s na cykl, 30 s przerwy) w temperaturze 4 °C w celu homogenizacji.
21. Po zakończeniu cyklu homogenizacji wyjmij probówki z urządzenia i umieść je z powrotem w zimnym bloku o temperaturze 4 °C.
    1. Sprawdź wzrokowo probówki z próbkami. Upewnij się, że żadna sproszkowana próbka nie jest nadal widoczna. Jeśli próbka jest nadal wizualizowana w całym Protein Lysis Master Mix, ponownie zakończ lizę tkanek na urządzeniu.
    2. Zoptymalizuj ustawienia pod kątem rodzaju wykorzystywanej tkanki. Na przykład sproszkowana tkanka pochodząca z narządów włóknistych (np. serca) może wymagać dodatkowych cykli lub wyższych obrotów na minutę.
22. Przenieść probówki homogenizujące do wirówki. Wprowadź następujące ustawienia w wirówce: 16 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i naciśnij Start na wirówce.
23. Po zakończeniu wirowania ostrożnie przenieść probówki homogenizujące z powrotem do zimnego bloku o temperaturze 4 °C.
24. Oznacz nowe probówki o pojemności 1,5 ml na pokrywie i z boku numerem identyfikacyjnym próbki i innymi istotnymi informacjami. Po oznaczeniu umieść te probówki o pojemności 1,5 ml w zimnym bloku o temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Probówki były oznaczone co najmniej następującymi informacjami: identyfikator zwierzęcia, punkt czasowy badania, typ zwierzęcia i typ tkanki.
25. Przenieść odpowiedni lizat białkowy z probówek homogenizujących do odpowiednich oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml umieszczonych w zimnym bloku o temperaturze 4 °C.
26. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy. Jest to bezpieczny punkt postoju.

3. Kwantyfikacja białka całkowitego

1. Wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmrozić je na mokrym lodzie w pojemniku na lód.
2. Po rozmrożeniu należy wirować wszystkie próbki i wzorce z zestawu do oznaczania ilościowego białek przez co najmniej 3 sekundy.
3. Dodać 10 μl każdej kontrpróby wzorca, próbek i odpowiednich prób ślepych do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania w oparciu o schematyczny układ (rysunek 2A).
   UWAGA: Dla każdej próbki tkanki w analizie białka stosuje się rozcieńczenie lizatu białkowego w stosunku 1:100 do najlepiej roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Schematyczny układ może być zmieniany w zależności od liczby próbek użytych w teście białka. Próbki, wzorce i odpowiednie próby ślepe są ładowane do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania w trzech egzemplarzach w celu oceny dokładności stężenia białka, ale jeśli wiele próbek musi zmieścić się na płytce, dopuszczalne są duplikaty.
   1. W przypadku próbek z małą ilością tkanki wyjściowej (tj. mniej niż 5 mg) do testu białka należy użyć tylko jednej kontrpróby lub duplikatów, aby zmaksymalizować ilość lizatu białkowego dostępnego do późniejszego trawienia białka.
   2. Upewnij się, że pipety są dokładnie pipetowane i kalibrowane.
4. Odwróć kilkakrotnie butelkę z odczynnikiem do oznaczania białek, aby dobrze wymieszać, a następnie wlej ją do 10 ml zbiornika odczynnika.
5. Używając pipety wielokanałowej o maksymalnej pojemności 200 μl, dodaj 150 μl odczynnika do oznaczania białek do kolumny 1.
6. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać odczynnik do oznaczania białek z 10 μl zawartości już znajdującej się w studzince, aby pomóc zmniejszyć ilość osadu w studzienkach.
7. Wyrzuć końcówki pipet i umieść nowe końcówki na pipecie wielokanałowej o maksymalnej pojemności 200 μl.
8. Powtarzaj kroki 3.5-3.7, aż odczynnik do oznaczania białek zostanie dodany do całej 96-dołkowej płytki.
   1. Używaj świeżych końcówek pipet do każdej kolumny studzienek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
   2. Upewnij się, że co najmniej jedna studzienka pozostaje pusta i nie dodaje się żadnych odczynników ani próbki do wykorzystania jako ślepa próba do oznaczania ilościowego białka.
9. Po dodaniu odczynnika do oznaczania białek do wszystkich niezbędnych studzienek, przykryj 96-dołkową płytkę uszczelką z folii aluminiowej.
10. Wirować 96-dołkową płytkę na instrumencie wirowym przez 1 minutę ze średnią prędkością, a następnie inkubować ją w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut przed odczytaniem płytki.
11. Sprawdź 96-dołkową płytkę i uszczelkę z folii aluminiowej. Jeśli odczynnik pozostaje przyklejony do uszczelki z folii aluminiowej, umieść go z odpowiednią wagą w wirówce.
    1. Naciśnij i przytrzymaj szybkie wirowanie, aż osiągnie około 200 g.
    2. Wyjmij 96-dołkową płytkę i sprawdź wzrokowo uszczelkę z folii aluminiowej, aby upewnić się, że na folii nie pozostał żaden płyn.
12. Powoli zdejmij uszczelkę z folii aluminiowej i umieść przezroczystą pokrywkę z powrotem na płytce 96-dołkowej (Rysunek 2B).
13. Odczytać 96-dołkową płytkę na spektrofotometrze przy długości fali 660 nm, po odczekaniu na rozwój reakcji kolorymetrycznej przez 5 minut.
    UWAGA: Odczyty absorbancji za pomocą spektrofotometru UV/widzialnego są mierzone w temperaturze pokojowej. Test białka 660 nm opiera się na wiązaniu zastrzeżonego kompleksu barwnik-metal z białkiem w warunkach kwaśnych, co powoduje zmianę maksimum wchłaniania barwnika, które mierzy się przy 660 nm.
14. Wykorzystać odczyty absorbancji znanych wzorców, aby utworzyć krzywą wzorcową za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów (rysunek 2C-E), które jest następnie stosowane do obliczania stężeń białek dla wszystkich próbek.

4. Trawienie białek

OSTROŻNOŚĆ. Upewnij się, że podczas pracy z niebezpiecznymi chemikaliami stosowanymi w poniższym protokole przestrzegane są odpowiednie protokoły bezpieczeństwa. Personel laboratorium nosił środki ochrony osobistej (PPE) i wykonywał te czynności w okapie oparów chemicznych. Review wszystkie karty charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tymi chemikaliami.

1. Oznacz nowy zestaw probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml identyfikatorami próbek na pokrywie i boku probówek trwałym atramentem. Dołącz wszelkie inne istotne informacje.
   1. Na podstawie równania krzywej standardowej, odczytów absorbancji próbki i współczynnika rozcieńczenia obliczyć stężenie białka w każdej próbce w mikrogramach na mikrolitr (μg/μl). Wartość tę należy wykorzystać do obliczenia wymaganej objętości lizatu próbki zawierającego 100 μg białka (rysunek 2C-E). Obliczoną objętość lizatu próbki przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
2. Uzupełnić końcową objętość do 100 μl za pomocą buforu do lizy; Jest to objętość początkowa potrzebna do protokołu trawienia.
   UWAGA: Ostateczna objętość próbki białka wraz z buforem do lizy powinna wynosić 100 μL.
3. Zgodnie z wcześniej opublikowanym piśmiennictwem do trawienia należy użyć 1,5 μl osocza, co w przybliżeniu odpowiada 100 μg białka.
4. Dodaj 50 μl roztworu redukującego (10 mM ditiotreitolu) do każdej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, zamknij pokrywki i krótko wiruj przez 3 s. Następnie dodaj 50 μl roztworu alkilacji (30 mM jodoacetamidu) do każdej próbki, zamknij wierzchołki i wiruj przez 3 s.
5. Próbki inkubować w temperaturze 95 °C, używając bloku grzewczego przez 11 minut w celu odpowiednio redukcji i alkilacji próbki białka. To rozszczepia wszystkie mostki dwusiarczkowe i pokrywa je grupą acetamidową, zapobiegając ich reformowaniu, a tym samym denaturuje białko do stanu w pełni rozwiniętego i maksymalizuje ekspozycję miejsc trawienia peptydów.
6. Po inkubacji wyjąć próbki z bloku grzewczego i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
7. Czekając, aż próbki ostygną, rozpuść liofilizowaną mieszaninę trypsyny/proteazy Lys-C (w stosunku 1:1, po 50 μg każdy) w roztworze do rekonstytucji enzymatycznej, dodając 515 μl cieczy do 1 fiolki odczynnika stałego, tj. 0,1 μg/μl każda. Unikaj bezpośredniego kontaktu skóry z roztworem proteazy i wszystkich późniejszych kroków, ponieważ trypsyna może być silnym czynnikiem drażniącym i alergenem.
8. Po schłodzeniu próbek do temperatury pokojowej dodać 50 μl odtworzonej mieszanki trypsyny/proteazy Lys-C (po 2,5 μg) do zredukowanego i alkilowanego roztworu próbki białka i krótko wirować.
9. Inkubować na termomieszalniku w temperaturze 37 °C i ustawić na 1000 obr./min przez 3 godziny w celu roztrawienia próbki białka.
   UWAGA: Proteaza Lys-C jest dołączona, aby pomóc rozszczepić wszelkie miejsca, które są oporne na trawienie przez trypsynę, z powodu fałdowania lub sekwencji aminokwasów (np. Wiązania Lys-Pro). To nie tylko redukuje każde białko do wielu znanych peptydów o rozsądnie małym rozmiarze i całkowitym ładunku, ale jest również wysoce powtarzalne, jeśli te same warunki trawienia są ściśle przestrzegane. Czas inkubacji wynoszący 3 godziny podczas trawienia to minimalny czas, który zalecamy, aby zapewnić całkowity rozkład wszystkich białek.
10. Po 3 godzinach inkubacji wyjąć z termomiksera za pomocą kleszczy, aby uniknąć oparzeń palców.
11. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego trawienie (6% kwasu trifluorooctowego lub kwasu mrówkowego w wodzie) do próbki i krótko przetrząsnąć.
    UWAGA: To hamuje reakcję, ponieważ dwie proteazy mają maksymalną aktywność przy neutralnym pH 7-8.
12. Przechowuj próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C, ponieważ to również zatrzymuje resztkową aktywność proteazy. Jest to bezpieczny punkt postoju.

5. Oczyszczanie, suszenie i ponowne zawieszenie peptydów

UWAGA: Ta procedura ma głównie na celu usunięcie odczynników do trawienia, zwłaszcza nielotnych soli, które mogą łatwo uszkodzić instrument LC / MS-MS, a także pomóc w wyizolowaniu i zagęszczeniu wytwarzanych peptydów. Oczyszczanie peptydów odbywa się za pomocą dostarczonych przez zestaw kolumn wirowych do odsalania, które są wstępnie wypełnione żywicą wykluczającą rozmiar (filtracja żelowa), która początkowo wychwytuje peptydy, a następnie umożliwia przemycie zwłaszcza soli. Całkowite przeniesienie odczynników z zestawu do kolumn wirujących w dygestorium chemicznym, ponieważ zawierają one toksyczne rozpuszczalniki organiczne.

OSTROŻNOŚĆ. Upewnij się, że podczas pracy z niebezpiecznymi chemikaliami w poniższym protokole przestrzegane są odpowiednie procedury bezpieczeństwa, w tym noszenie środków ochrony osobistej i przepisy dotyczące ograniczania rozprzestrzeniania się odpadów niebezpiecznych. Wykonaj te czynności w okapie oparowym chemikaliów i przejrzyj wszystkie karty charakterystyki przed rozpoczęciem pracy z tymi chemikaliami.

1. Wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozwolić, aby próbki dotarły do RT.
2. Zdejmij białą nasadkę na dole kolumny Peptide Clean-Up, poluzuj zieloną górną nasadkę i umieść ją w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
3. Umieść je w wirówce, zamknij pokrywę, naciśnij start i wiruj przy 3000 g przez 2 minuty, aby usunąć cały płyn kondycjonujący przed wysyłką.
4. Wyrzuć przepływowy płyn do pojemnika na odpady niebezpieczne i umieść kolumnę czyszczącą peptydy w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
5. Oznacz zielone pokrywki kolumny do czyszczenia peptydów identyfikatorami próbek, używając pisaka do znakowania atramentem.
6. Delikatnie przenieść preparat do trawienia białka o objętości około 300 μl do kolumny do czyszczenia suchych peptydów za pomocą pipety o pojemności 200 μl (np. 150 μl dwukrotnie).
   1. Upewnij się, że w górnej części żywicy kolumny wirującej nie obserwuje się pęcherzyków. W przypadku zaobserwowania pęcherzyków należy je usunąć, delikatnie stukając w kolumnę lub używając czystej końcówki do pipet o pojemności 10 μl, aby rozproszyć pęcherzyki.
      UWAGA: Uwięzione pęcherzyki powietrza mogą utrudniać płynne przejście próbki do żywicy, a tym samym negatywnie wpływać na skuteczność oczyszczania peptydów i wydajność.
7. Umieścić je w wirówce, zamknąć pokrywę, nacisnąć Start i odwirować przy 1 500 g przez 2 minuty.
8. Wyrzuć przepływowy płyn do pojemnika na odpady niebezpieczne i umieść kolumnę czyszczącą peptydy w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
9. Dodać 300 μl roztworu do przemywania A (woda, 0,1% kwas trifluorooctowy / TFA) na wierzch żywicy kolumny, ponownie za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
   1. Upewnij się, że w górnej części żywicy kolumny wirującej nie obserwuje się pęcherzyków. W przypadku zaobserwowania pęcherzyków należy je usunąć, delikatnie stukając w kolumnę lub użyć czystej końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby rozproszyć pęcherzyki.
10. Umieść je w wirówce, zamknij pokrywę, naciśnij Start i odwiruj przy 1 500 g przez 2 minuty.
11. Wyrzuć przepływowy płyn do pojemnika na odpady niebezpieczne i umieść kolumnę czyszczącą peptydy w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
12. Dodać 300 μl roztworu płuczącego B (5% metanolu, 0,1% TFA) na wierzch żywicy kolumny, ponownie za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
    1. Upewnij się, że w górnej części żywicy kolumny wirującej nie obserwuje się pęcherzyków. W przypadku zaobserwowania pęcherzyków powietrza, usuń je, delikatnie stukając w kolumnę lub użyj czystej końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby rozproszyć pęcherzyki.
13. Umieścić je w wirówce, zamknąć pokrywę, nacisnąć Start i odwirować przy 1 500 g przez 2 minuty.
14. Wyrzuć przepływowy płyn do pojemnika na odpady niebezpieczne i umieść kolumnę czyszczącą peptydy w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
15. Powtórzyć kroki 5.12-5.14 jeszcze raz, tak aby kolumna została dwukrotnie przemyta roztworem B.
16. Przenieść kolumnę do czyszczenia peptydów do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml.
    1. Upewnij się, że probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml użyte na tym etapie są dostarczonymi w zestawie probówkami do zbierania o niskim poziomie wiązania białka.
    2. Aby zachować dostępną ilość probówek do zbierania o niskim poziomie wiązania białek, do poprzednich etapów mycia należy użyć standardowych probówek laboratoryjnych.
17. Dodać 300 μl roztworu elucyjnego (50% acetonitrylu, 0,1% TFA) na wierzch żywicy kolumny, ponownie za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
    1. Upewnij się, że w górnej części żywicy kolumny wirującej nie obserwuje się pęcherzyków. W przypadku zaobserwowania pęcherzyków należy je usunąć, delikatnie stukając w kolumnę lub użyć czystej końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby rozproszyć pęcherzyki.
18. Umieść je w wirówce, zamknij pokrywę, naciśnij Start i odwiruj przy 1,500 g przez 3 minuty, aby zebrać czystą próbkę peptydu w nowej probówce o niskiej zawartości białka o pojemności 2 ml.
    1. W razie potrzeby przenieść 125 μl (około połowy) eluowanego czystego roztworu peptydu do szklanej fiolki o pojemności 1 ml za pomocą pipety o pojemności 200 μl i przechowywać w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: Ta podwielokrotność może być później wykorzystana do dodatkowych analiz, takich jak znakowanie peptydów za pomocą tandemowego znacznika masy (TMT), jak to ma miejsce za pomocą dostępnego na rynku zestawu, w celu bardziej precyzyjnego oznaczania ilościowego w próbkach, zwłaszcza w niezależnie przygotowanych zestawach.
19. Pozostałą próbkę, około 175 μl, w temperaturze -30 °C w probówkach o niskiej zawartości białka o niskiej zawartości białka do czasu, gdy będzie gotowa do suszenia i rozpuszczenia. Jest to bezpieczny punkt postoju.
20. Aby wysuszyć próbkę, należy rozmrozić próbkę peptydu z temperatury -30 °C do temperatury pokojowej. Jeśli przystępujesz do suszenia i rekonstytucji zaraz po oczyszczeniu peptydów, zignoruj ten krok.
21. Otwórz probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml i umieść je w koncentratorze wirówki próżniowej.
    1. Upewnij się, że koncentrator wirówki próżniowej jest zbalansowany, jeśli w tym samym czasie uruchamiana jest nieparzysta liczba próbek.
    2. Zamknij pokrywę koncentratora wirówki próżniowej i naciśnij Start.
    3. Pozostawić próbki na koncentratorze wirówki próżniowej przez 3 godziny, bez podgrzewania.
    4. Okresowo sprawdzaj probówki, aby upewnić się, że w środku nie pozostała żadna ciecz, ponieważ może to zakłócać wiązanie peptydów z kolumną separacyjną przyrządu LC/MS-MS.
    5. Jeśli ciecz jest nadal obserwowana, kontynuuj obracanie próbek przez dodatkowy czas.
    6. Sprawdź od 30 minut do 1 godziny, aby zobaczyć, czy w probówce pozostał płyn.
       UWAGA: Peptydy są bardzo stabilne podczas tego procesu, ponieważ znajdują się w warunkach próżni i nie ulegną zniszczeniu przez krótki okres suchości lub umiarkowane ciepło generowane przez samą pracę koncentratora wirówki próżniowej.
22. Po wyschnięciu natychmiast ponownie zawiesić próbkę w 50 μl 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie klasy MS (np. 5 μl 100% kwasu mrówkowego w 5 ml wody).
    1. Dodać 50 μl 0,1% kwasu mrówkowego na dno 2 ml probówki o niskiej zawartości białka zawierającej wysuszoną próbkę peptydu, używając pipety o pojemności 200 μl.
23. Zamknij nakrętki, a następnie wiruj przez 15 sekund.
24. Odtworzone próbki przenieść do odpowiednich szklanych fiolek o pojemności 1 ml za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
25. Przechowywać szklane fiolki zawierające odtworzone próbki w temperaturze -30 °C i jak najszybciej poddać je analizie metodą opartą na LC-MS/MS.
    UWAGA: Zamrożone próbki peptydów są stabilne w temperaturze -30 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania i -80 °C w przypadku dłuższego przechowywania.

6. Akwizycja danych próbek peptydów na urządzeniu UHPLC/MS-MS

OSTROŻNOŚĆ. Upewnij się, że przestrzegane są odpowiednie protokoły bezpieczeństwa podczas pracy z ultra wysokowydajnym systemem tandemowej chromatografii cieczowej/tribridowego spektrometru masowego Orbitrap. Personel laboratorium nosił środki ochrony osobistej i przeszedł formalne, praktyczne szkolenie z obsługi przyrządów zapewnione przez producenta UHPLC/MS-MS. Główne środki ostrożności to właściwe obchodzenie się z fazami ruchomymi kwaśnego i rozpuszczalnika organicznego dla UHPLC oraz źródło jonizacji wysokiego napięcia dla MS.

1. Wykonaj separacje peptydów przy użyciu systemu ultra wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC). Kolumna LC jest przystosowana do elektronatryskiwania C18 z odwróconą fazą i szybką separacją (RSLC), o wymiarach 2 μm, 100 A, 50 μm x 15 cm, umieszczona w linii za kolumną ochronną z tego samego materiału.
2. Stosować następujące fazy ruchome UHPLC: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie (rozpuszczalnik A), 0,1% kwas mrówkowy w acetonitrylu (rozpuszczalnik B) i 0,1% kwas mrówkowy w 90% wodzie i 10% metanolu (rozpuszczalnik C).
   UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki, a także kwas mrówkowy, używane do przygotowania faz ruchomych, są certyfikowane jako LC/MS i produkowane tylko w razie potrzeby. UHPLC posiada jednostkę filtracji i odgazowywania przed pompami, dzięki czemu fazy ruchome nie są ręcznie filtrowane i oczyszczane z powietrza.
3. Na początek należy ustawić zaprogramowane wstrzyknięcia całkowitej liczby peptydów przygotowanych dla próbek osocza i tkanek na poziomie 3 μl, co odpowiada ~ 3 μg materiału peptydowego określonemu przez początkową ilość użytego białka.
   UWAGA: Powinno to wytworzyć idealną intensywność sygnału MS dla maksymalnej identyfikacji białek. Objętość wtrysku można zwiększyć nawet do 15 μl, aby jeszcze bardziej zwiększyć moc wyjściową sygnału lub zmniejszyć do zaledwie 1 μl, jeśli widoczne jest przeciążenie.
4. Utrzymywać kolumnę i automatyczny podajnik próbek odpowiednio w temperaturze 40 °C i 10 °C.
5. Ustawić natężenie przepływu rozpuszczalnika dla akwizycji proteomicznej na stałym poziomie 0,3 μl/min, za pomocą nanopomp UHPLC, z liniowym gradientem separacji fazy ruchomej wody (A) do acetonitrylu (B).
6. Przepłukać strzykawkę iniekcyjną i pętlę próbki (pojemność 20 μl) przy użyciu fazy ruchomej wody i metanolu (C), przy początkowym ustawieniu pompy podawczej UHPLC na 5 μl/min.
7. Podczas rozdzielania próbek przez łącznie 80 minut należy ustawić gradient LC (krzywe liniowe) w następujący sposób: Początkowy - 5% B; 0-60 min - 32% B; 60-61 min - 95% B; 61-65 min - 95% B; 65-66 min - 2% B; i 66-80 min - 2% B. Podobnie uruchom pompę podawczą przy stałym 100% A, ale wyreguluj natężenie przepływu liniowo w następujący sposób: Początkowy - 5 μL/min; 0-5 min - 1 μL/min; 5-61 min - 5 μL/min; i 61-80 min - 5 μL/min (rysunek 3A).
8. Wstrzyknij nieznane próbki peptydów jako sekwencyjne zduplikowane przebiegi.
9. Aby zapobiec przeniesieniu, należy przeprowadzić co najmniej dwa sekwencyjne ślepe wstrzyknięcia 0,1% kwasu mrówkowego do wody między próbkami, używając ściętego gradientu LC (krzywe liniowe) w ciągu 35 minut, łącznie w następujący sposób: Początkowy - 5% B; 0-23 min - 32% B; 23-24 min - 95% B; 24-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; i 31-35 min - 2% B (ryc. 3B).
   1. Upewnij się, że ustawienia gradientu LC pompy ładującej pozostają niezmienione.
   2. W przypadku próbek peptydowych o wysokim poziomie zanieczyszczeń endogennych, takich jak wątroba (np. kwasy żółciowe), należy uwzględnić trzecią próbę ślepą co 3 do 5 próbek i na końcu serii, aby pomóc w oczyszczeniu kolumny LC. Polega to na wstrzyknięciu od 1 do 2 μl roztworu zawierającego po 25% acetonitrylu, izopropanolu, metanolu i wody.
   3. Alternatywnie lub w połączeniu z powyższym krokiem, wykonaj procentową zmianę zwiększonego gradientu LC (tj. huśtawki) w ciągu 35 minut łącznie jako wymywanie systemu w następujący sposób: Początkowy - 2% B; 0-3 min - 2% B; 3-4 min - 95% B; 4-10 min - 95% B; 10-11 min - 2% B; i 11-15 min - 2% B; 15-16 min - 95% B; 16-20 min - 95% B; 20-21 min - 2% B; 21-25 min - 2% B; 25-26 min - 95% B; 26-30 min - 95% B; 30-31 min - 2% B; i 31-35 min - 2% B (ryc. 3C).
10. Przeprowadzić detekcję peptydów, tj. odpowiadających im mas cząsteczkowych, w miarę jak są one oddzielane i eluowane z kolumny LC, przy użyciu układu Orbitrap i tandemowego kwadrupolowego spektrometru masowego z pułapką jonową (MS-MS).
    1. Przed wykonaniem próbnych przebiegów podłącz kolumnę LC bezpośrednio do powierzchni wymiennego źródła jonizacji nano spray (NSI) przyrządu MS, które znajduje się w lewym górnym rogu urządzenia.
       UWAGA: Spowoduje to odsłonięcie wbudowanej igły do elektrorozpylania kolumny LC, która dostarcza peptydy, zawieszone w naładowanych mikrokropelkach rozpuszczalnika fazy ruchomej LC, do wlotu rurki przesyłowej jonów detektora.
    2. Ponadto, aby poprawić wydajność ulatniania się elektrorozpylania, włącz wbudowany agregat grzewczy źródła NSI i ustaw go na 40 °C.
11. Ponadto, przed pobraniem próbki, należy sprawdzić, czy do przyrządu MS jest zadowalający dopływ sprężonego azotu i helu gazowego. Osiągnij to za pomocą stalowych butli o bardzo wysokiej czystości 300 zbiorników każdego gazu, które mają manometry regulatora ustawione na statyczne ciśnienie przepływu odpowiednio 60 i 40 psi.
12. Jeśli przyrząd MS wydaje ostrzeżenia o niestabilności dopływu azotu, należy podnieść ciśnienie do maksymalnie 100 psi. Upewnij się, że zbiorniki są wypełnione w co najmniej 10-20%, co jest odczytem górnego manometru zaworu ~ 250-500 psi; A jeśli nie, wymień je na świeże. Spadek poniżej 10% pełnej pojemności wiąże się z ryzykiem wciągnięcia zanieczyszczeń do przyrządu MS, które mogą osadzać się na dnie zbiorników gazu.
13. Wykonaj wcześniej metodę spektrometru mas, korzystając z dostarczonego szablonu oprogramowania sterującego, który jest przeznaczony do optymalnego wykrywania peptydów i ich modyfikacji potranslacyjnych (rysunek 3D-H) i wprowadź następujące warunki standardowe:
    1. Ustaw całkowity okres wykrywania na 80 minut.
    2. Ustaw ogólny tryb wykrywania na peptydy.
    3. Ustaw źródło NSI w tryb dodatni (tj. ładunek jonów peptydowych).
    4. Ustaw napięcie igły nano-spray na 2000 V i utrzymuj ją jako statyczną.
    5. Ustaw wejście azotu gazowego do NSI i ustaw detektory na statyczne.
    6. Ustaw temperaturę rurki jonowej na 275 °C.
    7. Wykryj masy całych peptydów (tj. jonów macierzystych; MS1), ustawiając zakres skanowania na 350-2000 m/z, obiektyw RF na 30%, maksymalny czas wstrzykiwania na Auto, a analizator masy orbitrap na rozdzielczość 120 000.
       UWAGA: Alternatywna funkcja pułapki jonowej przyrządu nie jest tutaj wykorzystywana do badania mas peptydów, ponieważ jest mniej czuła do monitorowania tego typu cząsteczki w porównaniu z orbitrapem.
    8. Ustaw filtry jonowe tak, aby rozróżniały peptydy o wielu stanach naładowania w zakresie 2-7. Dzięki temu instrument, podczas rejestrowania danych, automatycznie przekształca naturalnie wykryte proporcje masy do ładunku (m/z) cząsteczek na ich dokładne masy. Podobnie, peptyd z tylko pojedynczym stanem naładowania (m/z = 1) nie wymaga żadnego współczynnika konwersji, aby uzyskać swoją dokładną masę.
    9. Ustaw dynamiczne bramki wykluczające dla jonów na 1 przejście w czasie trwania 60 s, tolerancję masową ±10 ppm i usuń wszystkie cząsteczki z obecnymi naturalnymi atomami izotopowymi (np. ¹⁴C).
    10. Wykryj masy fragmentów potwierdzających tożsamość generowanych dla peptydów (tj. jonów potomnych; MS2), ustawiając instrument na akwizycję zależną od danych (tryb DDA).
    11. Wychwyć całe peptydy (tj. jony macierzyste) przez izolację kwadrupolową, stosując ustawienie okna tolerancji zmienności masy m/z = 1,6.
    12. Wykonaj fragmentację wychwyconych peptydów, ustawiając tryb uderzenia elektronów na HCD (tj. dysocjacja kolizyjna o wyższej energii przy użyciu azotu i helu jako czynnika przenoszącego elektrony), energię zderzenia do 30%, zakres skanowania na Auto, maksymalny czas wtrysku na Auto, a analizator masy Orbitrap na rozdzielczość 30 000.
    13. Uzyskaj dane końcowe (jony MS1 i MS2), ustawiając kształt piku sygnału na format centroidu.
14. Utrzymuj dokładne oznaczenia masy wykrytych peptydów poprzez rutynową kalibrację przyrządu, zwykle przed każdą serią próbki, jak opisano poniżej.
    1. Umieść przyrząd MS w stanie wyłączenia źródła jonów za pomocą oprogramowania sterującego i przełącz źródło NSI na alternatywne, wewnętrznie podgrzewane źródło jonizacji elektronatryskowej (HESI) urządzenia. Jest to źródło wykorzystywane do zastosowań, które mogą wymagać bardzo dużych objętości wstrzykiwania próbek i odpowiedniego wysokiego natężenia przepływu (1-2500 μl/min) dla pompy LC, np. w eksperymentach metabolomicznych i farmakokinetycznych leków.
    2. Wybierz opcję pełnego sprawdzenia kalibracji w oprogramowaniu sterującym.
    3. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 500 μl z tłokiem pokrytym teflonem i igłą ze stali nierdzewnej dostępnym w handlu roztworem wzorcowym MS, a następnie podłącz przewód rurki kapilarnej PTFE do źródła HSEI (gdy jest wyłączony).
       UWAGA: Zastosowana tutaj norma zawiera mieszaninę cząsteczek naturalnych i syntetycznych (łącznie 16, np. kofeina), które obejmują zakres mas m/z = 50-2800 i obejmują szeroki zakres możliwych typów wiązań chemicznych, zwłaszcza tych, które są związane z peptydami (np. grupami amidowymi).
    4. Rozpocznij ciągłą infuzję wzorca MS do źródła HSEI (przy włączonym zasilaniu), stosując szybkość 3-5 μl/min, tak jak robi się to za pomocą pompy strzykawkowej. Po odnotowaniu stabilnego wzorca standardowych pików w oknie podglądu na żywo oprogramowania sterującego, aktywuj automatyczną kontrolę kalibracji.
       UWAGA: Jeśli nie zostaną znalezione żadne problemy z czułością i dokładnością oznaczeń masy dla wzorca, pomyślna pełna kalibracja trwa zwykle < 40 minut. Podobnie, tylko wtedy, gdy urządzenie przejdzie wszystkie sprawdzane parametry sprzętowe MS, uważa się je za wiarygodne do uruchamiania próbek.
    5. Potwierdź powodzenie kalibracji, resetując źródło NSI i kolumnę LC, a następnie uruchamiając roztwór wzorcowy ludzkiego [Glu 1]-Fibrinopeptydu B (Glu-Fib) w całkowitych wstrzykniętych ilościach obejmujących 1-10 ng (np. 1, 2, 6 i 10 ng). Stosować te same metody separacji LC i wykrywania MS, jak te opisane powyżej dla nieznanych próbek.
    6. Sprawdź wzorzec Glu-Fib pod kątem odpowiedniego czasu retencji LC (~20 min), obecności jonów MS1 i MS2 (m/z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 i 175.12) oraz liniowości zwiększających się powierzchni pików wraz z wstrzykiwaną ilością.
    7. Następnie wygeneruj tabele sekwencji, korzystając z oprogramowania sterującego i przechwytującego dane, do uruchomienia nieznanego peptydu i próbek ślepych, które zawierają kolumny do wprowadzania typu próbki, nazwy pliku, identyfikatora próbki, ścieżki danych, metody przyrządu LC/MS, pozycji fiolki i objętości wstrzyknięcia (rysunek 3D-E).
    8. Zapisz wynikowe pliki danych MS (rozszerzenie: RAW; 500 - 800 GB każdy) w wyznaczonym folderze ścieżki na dysku twardym komputera instrumentu. Następnie przenieś te pliki do komputera stacji roboczej, który jest wystarczająco wydajny, aby sterować oprogramowaniem bioinformatycznym, jak opisano później, które przekształca niezwykle obszerne i złożone dane widma masowego peptydów (tj. sygnały MS1 i MS2) na odpowiednie profile całkowitego składu białek.

7. Konwersja surowych danych MS na reprezentatywne całkowite wyniki proteomu

UWAGA: Surowe dane MS zebrane dla próbek peptydów są przetwarzane na profile całkowitego składu białek (proteom) przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Krótko mówiąc, oprogramowanie bioinformatyczne rekonstruuje oryginalne białka w próbce, dopasowując surowe dane MS do ich znanych widm peptydów MS1 i MS2 znalezionych w internetowej bibliotece referencyjnej proteomu specyficznej dla danego gatunku, dzięki obszernemu i unikalnemu pokryciu sekwencji aminokwasów białka. Względna obfitość każdego zidentyfikowanego białka jest określana przez program przy użyciu intensywności sygnału MS1 dopasowanych unikalnych peptydów. Oznaczone obfitości można wiarygodnie porównać między próbkami, ale tylko wtedy, gdy są one prowadzone w tej samej partii przygotowawczej i przy użyciu identycznych ustawień LC i MS. W przeciwnym razie konieczne będzie zastosowanie wspomnianych wcześniej bezwzględnych technik ilościowych opartych na odzysku jonów we wzorcu wewnętrznym/reporterowym, takich jak selektywne znakowanie TMT peptydów w każdej próbce.

1. Pobierz na dysk twardy komputera stacji roboczej plik referencyjny proteomu z biblioteki internetowej.
   1. Znajdź to, korzystając z bazy danych znajdującej się na stronie internetowej Uniprot dla przykładowych gatunków będących przedmiotem zainteresowania (np. fretki / Mustela furo). Nazywa się to plikiem FASTA. Użyj narzędzia wyszukiwania Proteomes i widoku tabeli , aby zlokalizować, a następnie pobrać plik referencyjny proteomu.
   2. Aby zmaksymalizować możliwą liczbę wygenerowanych identyfikacji białek, podczas tworzenia pliku FASTA należy wybrać zarówno wpisy komitetu recenzowanego (Swiss-Prot), jak i nierecenzowane (TrEMBL) do bazy danych Uniprot. Podobnie, wybierz opcję uwzględnienia wszystkich recenzowanych izoform dla białek.
2. Otwórz oprogramowanie bioinformatyczne, tj. Proteome Discoverer, na zakładkę Start Page , a następnie wybierz zakładkę Administration .
3. Przejdź do podzakładki Maintain FASTA files (Utrzymuj pliki FAPSA ), a następnie pobierz do programu powyższy specyficzny dla gatunku plik FASTA wygenerowany na potrzeby Twoich eksperymentów.
4. Wróć do zakładki Strona początkowa i kliknij na Nowe badanie/Analizę, a następnie w oknie dialogowym wpisz nazwę badania w polu Nazwa badania i wybierz folder plików do zapisania badania w polu Katalog główny badania .
5. Pola Przepływ pracy przetwarzania i Przepływ pracy konsensusu pozostaw na razie puste, ponieważ zostaną one wybrane na później.
6. Kliknij przycisk OK , aby zapisać i opuścić okno dialogowe, w którym zostanie wyświetlona strona Definicja badania .
7. Przejdź do zakładki Definicja badania i wpisz szczegóły projektu w polu Opis badania znajdującym się w lewym środkowym rogu.
8. Przejdź do zakładki Pliki wejściowe i kliknij Dodaj pliki.
   1. Spowoduje to wyświetlenie okna dialogowego, w którym można wybrać wymagane pliki danych surowych do przetworzenia na wyniki profilu całkowitego składu białka (proteomu) i pobrać je z dysku twardego komputera.
9. Kliknij surowe pliki danych MS, które są teraz wymienione na karcie Pliki wejściowe , które można wybrać i podświetlić pojedynczo lub wszystkie naraz.
10. Przeciągnij je i upuść w sekcji Pliki do analizy w polu Analiza znajdującym się w prawym środkowym rogu jako część pola podrzędnego Krok przetwarzania .
11. Przejdź do zakładki Przepływy pracy i kliknij przycisk Edytuj, który znajduje się obok nagłówka Etap przetwarzania w polu Analiza znajdującym się w prawym środkowym rogu.
12. Kliknij Otwórz wspólne i z folderu ProcessingWF_Tribrid wybierz plik przepływu pracy przetwarzania, który jest przeznaczony specjalnie do identyfikacji pod-fosfoprotein, jak uzyskano w sekcji Wykrywanie MS oparte na fragmentacji HCD (Rysunek 4A).
    UWAGA: Diagram etapu przetwarzania zawierający edytowalne węzły pojawi się w polu Drzewo przepływu pracy . Będą dwa węzły, jak opisano poniżej, które są oznaczone wykrzyknikami wskazującymi, że użytkownik musi wprowadzić informacje specyficzne dla eksperymentu.
13. Na diagramie drzewa przepływu pracy przetwarzania kliknij i otwórz węzeł RC Spectrum Files .
    1. W kategorii RC Parameters of Spectrum Files (Parametry plików widma RC ) znajdź i wybierz w parametrze Protein Database (Baza danych białek ) plik FASTA, który został wcześniej wygenerowany przy użyciu strony internetowej Uniprot dla specyficznej dla gatunku biblioteki referencyjnej widm peptydów MS, które będą przeszukiwane w celu zidentyfikowania białek będących przedmiotem zainteresowania doświadczalnego.
14. Kliknij i otwórz węzeł Sequest HT i wprowadź następujące trzy zmiany:
    1. W parametrze Baza danych białek wybierz ten sam plik FASTA, zgodnie z powyższym opisem.
    2. W parametrze Nazwa enzymu wybierz Trypsyna (pełna) lub alternatywnie Lys-C, które są głównymi i zapasowymi proteazami używanymi do przygotowania oryginalnego trawienia peptydów.
    3. W parametrze Dynamic Modifications (Modyfikacje dynamiczne) upewnij się, że wybrano co najmniej Phospho / +79.966 Da (S, T, Y).
       1. Użyj tego ostatniego ustawienia, aby ujawnić peptydy związane z białkami, które są modyfikowane potranslacyjnie przez fosforylację, poprzez poszukiwanie odpowiednich strat widma MS grupy (grup) fosforanowej (m/z = 79,97).
       2. Znajdź miejsca aminokwasowe zajęte przez fosforany (tj. Serynę, Treoninę lub Tyrozynę) według oczekiwanych zmian w ich wzorcach fragmentacji MS2.
       3. W tym momencie dodaj inne potranslacyjne modyfikacje białek o rutynowym znaczeniu w ten sam sposób do węzła Sequest HT , np. metylację, acetylację, mirystylację, jeśli znana jest dokładna utrata masy powiązanych grup. Podobnie, rozszerz poszukiwania miejsc fosforylacji na inne, rzadziej zgłaszane aminokwasy, np. histydynę.
          UWAGA: Węzły RC i Sequest HT Spectrum Files drzewa przepływu pracy dla kroku przetwarzania są jedynymi dwoma, które wymagają dostosowania jakichkolwiek parametrów.
    4. Pozostaw resztę jako ustawienia domyślne, ponieważ zostały one już zoptymalizowane przez producenta, aby uzyskać największą liczbę wyznaczonych identyfikatorów białek, które Cię interesują. Podobnie dotyczy to wszystkich innych węzłów w drzewie przepływu pracy.
    5. Upewnij się, że węzły Percolator i IMP-ptmRS znajdują się na końcu drzewa przepływu pracy.
       UWAGA: Perkolator wykorzystuje dopasowanie powtarzalne, aby znacznie udoskonalić wyniki końcowe. IMP-ptmRS jest niezbędny do zgłaszania właściwej identyfikacji i lokalizacji wszystkich modyfikacji potranslacyjnych białek, w tym fosforylacji.
15. Wróć do zakładki Przepływy pracy i kliknij przycisk Edytuj znajdujący się obok nagłówka Krok konsensusu w polu Analiza znajdującym się w prawym górnym rogu. Spowoduje to wyświetlenie diagramu drzewa przepływu pracy dla kroku konsensusu.
16. Kliknij Otwórz wspólne i z folderu ConsensusWF wybierz plik przepływu pracy konsensusu, który wygeneruje żądany format wyjściowy dla wyników profilu składu białka (proteomu) (Rysunek 4B).
    UWAGA: Diagram kroków konsensusu zawierający edytowalne węzły otworzy się w polu Drzewo przepływu pracy . Diagram wykorzystywany do przetwarzania danych jest generowany przez modyfikację podstawowego przepływu pracy konsensusu, w którym wbudowane węzły Feature Mapper i Precursor Ions Quantifier zostały dodane jako rozgałęzienie od początkowego węzła MSF Files , aby ułatwić kwantyfikację względnej obfitości białek. Chociaż wszystkie węzły w przepływie pracy zawierają już zoptymalizowane parametry określone przez producenta, niektóre zawierają bardzo ważne wpisy, które należy dokładnie sprawdzić pod kątem prawidłowego wyboru, jak opisano poniżej.
17. Na diagramie drzewa przepływu pracy kliknij i otwórz węzeł Precursor Ions Quantifier (Kwantyfikator jonów prekursorowych ). Jest to węzeł, który jest niezbędny do ilościowego określenia względnej obfitości każdego zidentyfikowanego białka.
    1. W kategorii Ogólne ustawienia kwantyfikacji znajdź i wybierz w parametrze Peptydy do użycia opcję Unique + Razor .
       UWAGA: Unikalne peptydy to te, które zawierają sekwencje aminokwasów, które są wyłączne dla pojedynczego białka; a zatem służą do konkretnego określenia jego ilości na podstawie intensywności sygnału MS. Peptydy brzytwy to peptydy wspólne dla grup białek; i w ten sposób służą do uzgadniania obliczonych względnych obfitości.
    2. W kategorii Normalizacja i skalowanie zmień zarówno parametry Tryb normalizacji , jak i Tryb skalowania na opcję Brak , ponieważ ten typ regulacji jest zbyt ograniczony, aby można go było niezawodnie zastosować w całym proteomie.
       UWAGA: Ustawienia te są aktywowane tylko wtedy, gdy pożądane jest znormalizowanie obliczonej względnej obfitości wybranych białek będących przedmiotem zainteresowania w stosunku do tych, które są stabilnie nieodłączne od komórki, np. geny porządkowe, a następnie wyrażenie wynikowych wartości jako skalowanego stosunku.
    3. Następnie kliknij i otwórz węzeł Filtr peptydów i białek , a następnie w kategorii Filtry peptydowe zmień parametry Peptide Confidence At Least i Keep Lower Confident PSM na odpowiednio High i False . To sprawia, że dopasowania peptydów używane do identyfikacji białek osiągają najwyższy poziom znaczenia dopasowania (tj. ≥ 95%).
       UWAGA: Alternatywnie, pierwszy parametr można ustawić na Średni, aby złagodzić rygorystyczność dopasowań peptydowych, a tym samym znacznie zwiększyć wydajność trafień białka; Ale to z drugiej strony prowadzi do bardzo wysokiego ryzyka generowania wielu fałszywych identyfikacji. Podobnie, nigdy nie powinno być tak, że wartość "Niska" jest używana jako akceptowalna opcja dla obu parametrów.
    4. Są to jedyne węzły kroku konsensusu, które muszą mieć dostosowane parametry, resztę pozostaw przy użyciu ustawień domyślnych.
       UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, proces konsensusu obsługuje całą analizę post-hoc, tj. określenie względnej obfitości białka, pewność identyfikacji (tj. Wskaźniki fałszywych odkryć i wyniki dopasowania spektralnego peptydów) oraz zmapowane pokrycie peptydami. Statystyki wyników i rozkłady danych są również dostarczane w postaci tabel końcowych.
18. Po wykonaniu powyższych przepływów pracy przetwarzania i etapu konsensusu zapisz całe badanie, a następnie kliknij ikonę Uruchom (koła zębate) znajdującą się w górnej części pola Analiza . Jeśli jednocześnie przetwarzanych jest wiele plików surowych danych MS, przed rozpoczęciem przetwarzania kliknij i zaznacz pobliską ikonę Według pliku (kwadrat).
    UWAGA: Przetwarzanie jednego pliku surowych danych MS na plik wyników całkowitego proteomu zwykle zajmuje 20-40 minut, ale może dać listę wielu tysięcy identyfikacji białek, od niskich, średnich do wysokich dopasowań ufności (tj. z wagą w kierunku wysokich trafień), wraz z modyfikacjami fosforanów, które są obecne w każdej jednostce (Rysunek 4C). Głównymi parametrami wyjściowymi wyników dla zidentyfikowanych białek są FDR (ufność), Master (jeśli plik / wpis biblioteki FASTA został przejrzany), Akcesja #, Opis, Pokrycie%, Pokrycie sekwencji, Dopasowania spektralne peptydów (np. Liczba unikalnych peptydów), Cechy fizyczne (np. MW w kDa), Względne obfitości i Modyfikacje (tj. Grupy fosforylacji).
    1. Kolumna uporządkuje całkowite wyniki proteomu w porządku rosnącym lub malejącym lub całkowicie przefiltrowane, za pomocą ikony lejka na pasku narzędzi (rysunek 4C), zgodnie z zainteresowaniami badawczymi, np. pokaż tylko te o wysokim poziomie ufności identyfikacji (białko FDR) lub wysokim stopniu dopasowania peptydów (np. według % pokrycia i / lub liczby znalezionych unikatów).
    2. Jeśli informacje o modyfikacji potranslacyjnej są szczególnie pożądane, odfiltruj zidentyfikowane białka z fosforylacją do dalszej analizy.
    3. Zapisz przefiltrowane wyniki bez zmiany nazwy pliku, ponieważ można je przywrócić do oryginalnego wyniku, po prostu usuwając zastosowane filtry i odświeżając okno.

Wyniki

Wizualizacja całkowitych wyników proteomu poprzez opcjonalne przetwarzanie na wykresy wulkanów
Całkowite wyniki proteomu dla każdej próbki można łatwo przeszukać według akcesji # lub opisu dla określonych białek będących przedmiotem zainteresowania badawczego, a związane z tym względne obfitości są uśredniane, a następnie porównywane między grupami pod kątem istotnych różnic (np. jak na podstawie wartości p pochodzących z testu t). Alternatywnie, bardzo cenne może być poszukiwanie globalnych zmian w c...

Dyskusja

Powyższa metoda wykorzystywała tkanki, które zostały natychmiast zamrożone w ciekłym azocie, aby natychmiast zatrzymać całą aktywność biologiczną przed przeniesieniem do temperatury -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Po pobraniu wszystkich próbek nastąpiła homogenizacja tkanek. Podczas homogenizacji bardzo ważne jest, aby wszystkie tkanki i narzędzia były zimne, aby zapobiec reaktywacji lub degradacji białek. Ponadto, podczas początkowej ekstrakcji białka z homogenizowanej tkanki, próbki są utrzymywane w niskiej...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do oznaczania białek 660 nm	Pierce / Thermo Scientific	22662	Do BCA do oznaczania stężeń białek w próbkach, zawiera odczynnik do oznaczania białek Pierce 660nm i wstępnie rozcieńczone wzorce do oznaczania białek
Acetonitryl, gatunek Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	047138.K2	Ultraczysty acetonitryl stosowany do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas
Uszczelka z folii aluminiowej	Beckman Coulter	538619	Uszczelka używana podczas opracowywania płytki do oznaczania białek
Czytnik wielomodowy BioTek Synergy Neo2 / spektrometr UV-Vis	Agilent	https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195	Przyrząd do odczytu spektrofotometru/płytki testowej służy do wykonywania odczytów absorbancji 660 nm w celu określenia stężeń białek
ChromaCare LC-MS Roztwór do spłukiwania instrumentów	Thermo Fisher Naukowy	T111101000	Roztwór zawierający po 25% acetonitrylu, izopropranolu, metanolu i wody pomaga oczyścić układ LC po uruchomieniu próbek
Rurka Precellys CK28	Bertin Corp / Technologie	P000911LYSK0A.0	Homogenizowane tkanki umieszcza się w tych probówkach w celu lizy tkanek i izolacji białek za pomocą instrumentu Precellyis. Są to probówki używane przez nasze laboratorium, określane w protokole jako "probówki homogenizujące".
Kriopod	Brooks / Azenta Nauki Przyrodnicze	https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier	Pojemnik służący do przechowywania ciekłego azotu do schładzania zaprawy podczas homogenizacji tisuse
Zestaw do przygotowania próbek EasyPep Mini MS	Thermo Fisher Naukowy	A40006 powiedział:	Jeden zestaw może przetworzyć 20 próbek, zawartość obejmuje roztwór do lizy do ekstrakcji białek, uniwersalną nukleazę uzupełnioną w roztworze ekstrakcyjnym oraz substancje potrzebne do kroków 1.4 i 1.5
Kolumna EASY-Spray C18 LC (15 cm L, 50 & m Dia oraz 2 &mikro; m wielkość cząstek)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał ES901	Kolumna LC do elektrorozpylania stosowana do oddzielania peptydów przed wykryciem stwardnienia rozsianego
Roztwór kalibracyjny FlexMix	Pierce / Thermo Scientific	A39239 (A39239)	Mieszanina 16 standardowych cząsteczek używana do kalibracji dokładności i czułości detektora przyrządu MS przed serią próbek
Kwas mrówkowy, klasa LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	85178	Ultraczysty kwas mrówkowy stosowany do acyfikacji wszystkich roztworów i próbek LC w końcowym stężeniu 0,1% (v/v)
Zatrzymaj proteazę i Jednorazowy koktajl inhibitorów fosfotazy (100x)	Thermo Fisher Naukowy	78442	Uzupełniony buforem ekstrakcyjnym w celu zapobieżenia degradacji białek i fosfoprotein w próbce
Metanol klasy Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	047192.K2	Ultraczysty metanol stosowany do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas
Moździerz porcelanowy, 150 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961C (Zobacz materiał FB961C)	Pojemność 150 ml, używana do homogenizacji mniejszych tkanek fretki (np. mózgu)
Moździerz porcelanowy, 275 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961D	Pojemność 275 ml, stosowana do homogenizacji dużych tkanek fretki (tj. wątroby)
Moździerz porcelanowy, 50 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961A	Pojemność 50 ml, używana do homogenizacji tkanek myszy
Tłuczek porcelanowy, 50 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961K	Do stosowania z zaprawą o pojemności 50 ml
Tłuczki porcelanowe, 150 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961M	Do stosowania z moździerem o pojemności 150 ml
Tłuczki porcelanowe, 275 ml	Thermo Fisher Naukowy	FB961N	Do stosowania z zaprawą o pojemności 275 ml
Precellys powiedział:	Bertin Corp / Technologie	https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/	Przyrząd służący do homogenizacji próbek tkanek. Zastosowano następujące ustawienia: 4500 obr./min, 2 x 30 s na cykl, 30 s przerwy.
Odczynnik do oznaczania białek	Pierce / Thermo Scientific	22662	Odczynnik do oznaczania białek użyty w krokach 3.4– 3.8
Odkrywca proteomu	Thermo Fisher Naukowy	CSW0064764	Oprogramowanie bioinformatyczne do analizy danych proteomicznych/fosfoproteomicznych
Fiolki do wstrzykiwań LC z zakrętką SureSTART MSCERT (0,02– Pojemność 1,5 ml)	Thermo Fisher Naukowy	6PMCK39TR powiedział:	Certyfikowane do stosowania fiolki z zakrętką (PTFE, przegrody z nacięciem) z zakrętką używaną do przechowywania próbek do wstrzykiwań na instrumencie LC/MS
System Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS)	Thermo Fisher Naukowy	LC: ze zniżką / MS: FETD2-10002, na specjalne życzenie	Przyrząd do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o ultrawysokiej wydajności (LC/MS) używany do oddzielania, a następnie wykrywania peptydów w próbkach na podstawie masy cząsteczkowej
Uniwersalna nukleaza do lizy komórek, 100kU, 400 i mikro; L	Pierce / Thermo Scientific	88702	Zakupiono dodatkową nukleazę uniwersalną
Odkurzacz Plus	Eppendorf powiedział:	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748	Próżnia używana do suszenia próbek peptydów przed rozpuszczeniem.
Woda, klasa Optima LC/MS	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 047146.K2	Ultraczysta woda używana do chromatografii cieczowej/spektrometrii mas