Artykuł metodologiczny

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

DOI:

10.3791/67246

⸱

16 września 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glikokaliks śródbłonka (GCX), bogata w węglowodany warstwa pokrywająca powierzchnię światła komórek śródbłonka, odgrywa kluczową rolę w regulacji odpowiedzi komórkowych na bodźce. Składa się z białek transbłonowych służących jako mechanoprzetworniki odpowiedzi komórkowych. Chociaż naturalnie zachowuje swoją strukturę i stabilność w warunkach homeostazy, narażenie na naprężenia ścinające może wywołać uszkodzenia z licznymi konsekwencjami. Zbadano ogólny wpływ naprężeń ścinających na komórki śródbłonka, ale zakres i wpływ naprężeń ścinających na układy naczyniowe, w szczególności po pneumonektomii, nie został dobrze zbadany. Aby to zbadać, podjęto kompleksowe podejście, polegające na stworzeniu modelu CAD unaczynienia płuc przed i po pneumonektomii. Wykorzystując obliczeniową symulację płynów, zidentyfikowano kluczowe obszary podwyższonego naprężenia ścinającego i ciśnienia oraz odtworzono je w systemie organ-on-chip (OOC). Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HLMVECs) wysiewano na formę w kształcie wybranych skrawków w celu scharakteryzowania skutków podwyższonego naprężenia ścinającego in vitro. Po eksperymentach HLMVEC poddano barwieniu immunologicznemu w celu jakościowej oceny stanu zdrowia GCX przy normalnych i zwiększonych stresach wywołanych pneumonektomią. Integracja modelowania komputerowego i analizy eksperymentalnej zwiększa nasze zrozumienie, w jaki sposób zmiany naprężeń ścinających wpływają na GCX, wyjaśniając ich wpływ na funkcję naczyń krwionośnych i powikłania pooperacyjne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pneumonektomia to inwazyjna interwencja chirurgiczna wysokiego ryzyka wykonywana w celu usunięcia prawego lub lewego płuca1. Ta procedura jest zwykle stosowana jako opcja leczenia różnych poważnych dolegliwości, takich jak rak płuc, gruźlica płuc i urazowe urazy płuc2. Chociaż procedura jest obiecująca, wiąże się ze znacznym ryzykiem, na co wskazuje zwiększona liczba powikłań pooperacyjnych, od arytmii po obrzęki płuc1.

Pneumonektomia ma ogromny wpływ na dynamikę układu sercowo-naczyniowego, kierując cały rzut serca do pozostałego płuca3. Wiadomo, że to przekierowanie przepływu krwi zwiększa ciśnienie i naprężenia ścinające w pozostałym układzie naczyniowympłuc 4. Przy tych ogromnych zmianach we wzorcach przepływu krwi, glikokalix śródbłonka (GCX) odgrywa kluczową rolę w wyczuwaniu tych zmian we wzorcach przepływu krwi5.

GCX jest warstwą podobną do żelu, która reguluje aktywność biochemiczną w odpowiedzi na zmiany w swoim środowisku 6,7. Wykazano, że jego ekspresja wzrasta wraz z długotrwałym narażeniem na jednorodny przepływ i zmniejsza się wraz z ekspozycją na zakłócony przepływw porównaniu z kulturą statyczną 8,9. GCX wykazuje zmienną grubość w zakresie od 0,1 do 1 μm w całym układzie naczyniowym i działa jako niezbędna warstwa mechanotransdukcji pokrywająca komórki śródbłonka naczyń krwionośnych10. Sieć składa się z gęstej warstwy cukrów, lipidów i białek, jak pokazano na rysunku 1. Cukry te wiążą się, tworząc glikany, które mogą swobodnie występować w krwiobiegu lub być przyłączone do białek lub lipidów, co powoduje tworzenie proteoglikanów, glikoprotein lub glikolipidów 7,11. Proteoglikany składają się z łańcuchów glikozaminoglikanu (GAG), które wiążą się z błoną komórkową poprzez białka osocza lub receptory. Te GAG obejmują siarczan heparanu (HS), kwas hialuronowy (HA), siarczan chondroityny (CS), siarczan dermatanu i siarczan keratyny12. Siarczan heparanu jest dominującym GAG, stanowiącym ponad 50% wszystkich GAG znajdujących się w GCX. Te łańcuchy boczne mogą przyłączać się do osadzonych białek rdzeniowych, które obejmują glipicany (zakotwiczone przez glikozylofosfatydyloinozytol) i syndekany (z domeną obejmującą błonę), a także CD44 (receptor adhezji powierzchniowej). Opisane powyżej kompleksy odgrywają kluczową rolę w regulacji czynników wzrostu, reakcjach przeciwzapalnych, ułatwianiu rozszerzania naczyń krwionośnych i kontrolowaniu przepuszczalności naczyńkrwionośnych 13.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Diagram składowych GCX. Schemat przedstawiający składniki glikokaliksu śródbłonka. Ten schemat przedstawia wierzchołkowy glikokaliks, który znajduje się w świetle naczynia, pokazując jego proteoglikany i glikoproteiny związane z błoną. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Chociaż dokładny związek między pneumonektomią a uszkodzeniem GCX nie jest dobrze zbadany, istnieje prawdopodobna korelacja między zmienionymi wzorcami przepływu krwi wywołanymi przez pneumonektomię a integralnością GCX. Wiadomo, że zaburzony przepływ krwi w naczyniach krwionośnych powoduje uszkodzenie GCX6. Postawiliśmy hipotezę, że zwiększony zaburzony przepływ i zmiany naprężeń ścinających w pozostałym układzie naczyniowym po pneumonektomii mogą z czasem spowodować uszkodzenie GCX. To przyspieszone pogorszenie może katalizować powikłania pooperacyjne i choroby, zwiększając w ten sposób nieodłączne ryzyko dla ogólnego stanu zdrowia pacjenta13.

Protokół ten miał na celu modelowanie unaczynienia płuc po pneumonektomii, zgodnie z ogólną procedurą opisaną na rysunku 2. Symulacje płynów przeprowadzono na wspomaganym komputerowo modelu projektowym odwzorowującym ludzkie unaczynienie płuc z pneumonektomią i bez niej. Modele pneumonektomii zostały stworzone poprzez zaprojektowanie 3D układu naczyniowego płuc w oprogramowaniu do modelowania 3D, w oparciu o wymiary pochodzące ze skanów CT i danych literaturowych, a następnie dalsze uproszczenie ich do symulacji przepływu w oprogramowaniu do obliczeniowej dynamiki płynów (CFD). Symulacje pozwoliły zidentyfikować konkretne obszary zainteresowania, wybrane przez obszary, w których naprężenie ścinające było zwiększone w modelach pneumonektomii w porównaniu z kontrolą. Te obszary zainteresowania zostały wybrane do powielenia w celu zbudowania modelu in vitro . W modelu in vitro wykorzystano konstrukcję komory fluidalnej do symulacji wielu odcinków naczyń krwionośnych z normalną geometrią oraz geometrii pneumonektomii w celu symulacji różnicy w warunkach przepływu.

Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HLMVEC) hodowano na podłożach z polidimetylosiloksanu pokrytych fibronektyną (PDMS), ukształtowanych tak, aby naśladować wybrany region bifurkacji. Pożywkę do hodowli komórek śródbłonka mikronaczyniowego przepuszczono przez system za pomocą pompy perystaltycznej. Na koniec komórki i GCX utrwalono, wybarwiono immunologicznie przeciwciałem barwiącym GCX i uwidoczniono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu oceny ich stanu po ekspozycji na przepływ płynu. Ogólny harmonogram protokołu można znaleźć w tabeli 1.

figure-introduction-2
Rysunek 2: Sekwencja rozwoju OOC. Sekwencja opracowywania nowego systemu OOC do badania skutków pneumonektomii płuc (1) tomografia komputerowa ludzkiego układu krążenia płuc. (2) Geometria tomografii komputerowej używana do identyfikacji obszarów zainteresowania dla modelu CAD 3D. (3) Symulacje przepływu płynów w celu wyznaczenia geometrii będących przedmiotem zainteresowania dla modelu in vitro . (4) Modelowana forma PDMS zawierająca obszary zainteresowania na podstawie wyników symulacji (5) Forma włożona do akrylowej obudowy w celu zamocowania formy do perfuzji (6) Kompletna konfiguracja komory przepływowej (7) Kompletna konfiguracja komory przepływowej przeniesiona do inkubatora (8) Jasne pole i obrazy fluorescencyjne wykonane po wystawieniu na naprężenia ścinające. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Tabela 1: Ogólny harmonogram protokołu. Ogólna sekwencja wykonywania kroków w ramach protokołu ze średnim czasem trwania (h) każdego kroku. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu wykorzystano dane obrazowania tomografii komputerowej (CT) z poprzedniej literatury14 , które zostały zebrane zgodnie z instytucjonalnymi i federalnymi standardami etycznymi. Wszystkie dane obrazowe, do których się odniesiono, uzyskały świadomą zgodę uczestników, po zatwierdzeniu przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) w celu zapewnienia ochrony praw i prywatności uczestników.

1. Modelowanie unaczynienia płuc w oprogramowaniu CAD

  1. Zbadaj geometrię fizjologiczną naczyń pierwotnych, które mają być modelowane.
  2. Skorzystaj z obrazów tomografii komputerowej naczyń krwionośnych, które mają być modelowane, aby wybrać określone geometrie do replikacji, pokazane na rysunku 2.
    UWAGA: W tym protokole wykorzystano skany CT płuc w stanie klinicznym z poprzedniej literatury14. Protokół ten pozwala również na wykorzystanie dowolnych danych z tomografii komputerowej do generowania modeli in vitro .
    1. Otwórz przeglądarkę DICOM i zaimportuj obrazy CT. Poruszaj się po plasterkach, aby zidentyfikować interesujące Cię naczynia. Zapisz odpowiednie obrazy do dalszej analizy.
      UWAGA: Naczyniem replikowanym dla tego protokołu było unaczynienie płuc, ponieważ zastosowanie tego protokołu polega na modelowaniu glikokaliksu śródbłonka w stanach zdrowych i po pneumonektomii. Inne lokalizacje mogą być używane do różnych zastosowań.
  3. Korzystając z aparatu ImageJ FIJI v1.54f15, zmierz średnice naczyń na podstawie obrazów CT lub wartości literatury.
    1. Otwierać ImageJ FIJI i Importuj zapisane obrazy CT: wybierz Plik > Otwórz.
    2. Wybierz narzędzie Linia z paska narzędzi, aby narysować linię rozciągającą się na całej długości podziałki liniowej na obrazie CT.
    3. Następnie wybierz pozycję Analizuj > ustaw skalę. Wprowadź znaną odległość (np. jeśli podziałka liniowa na obrazie wynosi 10 mm, wprowadź 10 jako znaną odległość). Wprowadź jednostkę długości (np. mm). Kliknij przycisk OK.
  4. Użyj narzędzia Linia, aby zmierzyć średnice. Aby to zrobić, wybierz narzędzie Linia z paska narzędzi i narysuj linię rozciągającą się na średnicy naczynia. Następnie wybierz opcję Analizuj > Zmierz, aby uzyskać wartość średnicy.
  5. Powtórzyć kroki 1.3 i 1.4 dla wszystkich zbiorników będących przedmiotem zainteresowania i zapisać pomiary.
  6. Kompiluj pomiary statków w typy segmentów, aby ułatwić modelowanie.
    1. Utwórz arkusz kalkulacyjny, aby skategoryzować wymiary naczynia i oznaczyć każdy wiersz nazwą naczynia, pomiarem i typem segmentu (np. tętnica, żyła).
  7. Utwórz tabelę referencyjną dla długości i średnic segmentów naczyniowych na podstawie literatury i pomiarów radiograficznych.
  8. Wygeneruj model 3D za pomocą oprogramowania do modelowania 3D, aby odtworzyć geometrię i wymiary obrazów CT.
    1. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy plik części: wybierz Plik > Nowy > Część i wybierz Szkic > Utwórz szkic i narysuj profil, korzystając z wymiarów z ImageJ.
    2. Wykorzystaj przeciągnięcia powierzchni i wyciągnięcia po profilach dla geometrii 3D: dla wyciągnięć po ścieżce wybierz Elementy > Wyciągnięte po ścieżce dośrodkowanie/podstawę. W przypadku wyciągnięć złożonych wybierz Operacje > Dodano/podstawę wyciągnięcia złożonego.
    3. Udoskonal model, aby dopasować go do dokładnych wymiarów.
  9. Zidentyfikuj warianty modelu, które mają zostać opracowane, takie jak model kontrolny i model pneumonektomii.
    1. Przedstaw różne stany (np. normalna a pneumonektomia) i wymień zmiany strukturalne potrzebne dla każdej odmiany.
  10. Zduplikuj oryginalny model w celu modyfikacji, aby utworzyć modele eksperymentalne zgodnie z własnymi parametrami (tj. pneumonektomia prawa i lewa).
    1. Zapisz oryginalny model, a następnie wybierz opcję Plik > Zapisz jako kopię , aby utworzyć kopie dla każdego warunku eksperymentalnego.
    2. Zmodyfikuj każdą kopię zgodnie ze zdefiniowanymi parametrami (np. pneumonektomia prawa i lewa).
  11. Przekonwertuj model z pliku części na plik Parasolid na potrzeby symulacji obliczeniowej dynamiki płynów (CFD).
    1. Wybierz pozycję Plik > Zapisz jako. Wybierz Parasolid (*.x_t) z listy rozwijanej typu pliku, a następnie zapisz plik w żądanym katalogu.

2. Symulacja przepływu płynu

UWAGA: Ten krok jest pomocny w lokalizowaniu obszarów zmodyfikowanego naprężenia ścinającego po pneumonektomii w celu wybrania geometrii naczyń do powtórzenia w systemie in vitro . Ponadto licencja na oprogramowanie musi obsługiwać moduł importu.

  1. Skonfiguruj nowe badanie przepływu laminarnego w stanie ustalonym.
    1. Wybierz Kreatora modelu > 3D (wymiar przestrzenny) > przepływ płynu > przepływ jednofazowy > przepływ laminarny (spf) > wybierz opcję Dodaj , aby dodać interfejs fizyki przepływu laminarnego > wybierz opcję Badanie , > wybierz opcję Stacjonarny w obszarze Badanie ogólne > wybierz opcję Gotowe.
  2. Dodaj geometrię z modelu CAD.
    1. Importuj plik Parasolid. Wybierz opcję Powierzchnie pokrywy, a następnie w oknie Grafika wybierz obwód wewnętrznej ścianki naczynia przy każdym otwartym wlocie i wylocie. Będą to krawędzie ograniczające powierzchni zaślepki. Wybierz opcję Utwórz sumę i Zbuduj wszystko.
    2. Wybierz pozycję Usuń szczegóły i upewnij się, że wszystkie opcje są zaznaczone w obszarze Szczegóły do usunięcia, a następnie wybierz pozycję Kompiluj wszystko , aby usunąć niepotrzebną geometrię.
  3. Tworzenie siatki 1 (siatka ściana naczynia + siatka domeny płynów).
    1. Ustaw rozmiar na wstępnie zdefiniowany: bardzo dokładny, skalibruj pod kątem dynamiki płynów.
    2. Ustaw Rozmiar 1 na wstępnie zdefiniowany: bardzo dokładny, kalibruj dla dynamiki płynów, dla wyboru elementu geometrycznego, określ Granicę i Ręcznie. W oknie Grafika wybierz wszystkie widoczne powierzchnie zewnętrzne domeny ściany naczynia, w tym powierzchnię przypominającą pierścień wokół powierzchni zwieńczenia. Nie wybieraj powierzchni nasadki na wlocie i wylocie.
      UWAGA: Wybierz powierzchnię nasadki na końcu usuniętej sekcji po prawej i lewej stronie modeli pneumonektomii, ponieważ są one uważane za granice geometryczne po pneumonektomii.
    3. W obszarze Uściślanie narożnika wybierz pozycję Domena i ręcznie. W oknie Grafika wybierz opcje [Domena] 1 (ściana naczynia) i [Domena] 2 (płynna).
    4. W obszarze Wybór obwiedni upewnij się, że granice są takie same, jak określono w "Wyborze elementu geometrycznego" z "Rozmiaru 1".
    5. W obszarze Czworościan swobodny 1 wybierz opcję Pozostałe dla poziomu elementu geometrycznego w obszarze Wybór domeny.
    6. W polach Warstwy graniczne 1 i Wybór elementu geometrycznego określ Domena i wybierz opcję Ręcznie, w oknie Grafika [Domena] 1 i [Domena] 2. Właściwości warstwy granicznej będą takie same, jak określone w Rozmiarze 1.
    7. Zbuduj siatkę, wybierając opcję Zbuduj wszystko w obszarze Siatka 1.
  4. Tworzenie siatki 2 (tylko domena płynna z siatką).
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy Mesh 1, wybierz Importuj , aby utworzyć "Mesh 2" i usuń Import 2.
    2. W obszarze Importuj 1 wybierz opcję Sekwencja siatki , aby automatycznie wybrać opcję Siatka 1. Upewnij się, że zaznaczono opcję Zbuduj siatkę źródłową automatycznie, Importuj elementy domeny i Importuj domeny bez siatki , a następnie wybierz pozycję Importuj. Wszystkie ustawienia zdefiniowane w siatce 1 zostaną przeniesione do siatki 2.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy Siatka 2 i wybierz Usuń elementy. W polu Usuń elementy 1 w obszarze Wybór elementu geometrycznego wybierz opcję Domena, wybierz opcję Ręcznie, w oknie Grafika wybierz opcję [Domena] 1 (ściana naczynia), a następnie wybierz opcję Zbuduj wszystko , aby pozostawić tylko geometrię płynu, ponieważ powierzchnia siatki domeny płynów będzie znajdować się na granicy między przepływem płynu a wewnętrzną ścianą zbiorników.
  5. Dodaj materiał przepływowy: Stwórz nowy materiał, korzystając z właściwości krwi z literatury. Kliknij prawym przyciskiem myszy Materiały i wybierz Pusty materiał. Wybierz opcję Domena w wyborze na poziomie jednostki geometrycznej, wybierz opcję Wszystkie domeny. Wybierz opcję Nonsolid (Niestały ) w polu Typ materiału dodaj właściwości materiału krwi, w tym lepkość i gęstość.
  6. Skonfiguruj warunki brzegowe i parametry badania przepływu laminarnego.
    1. Wybierz pozycję Przepływ laminarny (spf), w obszarze Wybór domeny wybierz pozycję Wszystkie domeny. Na liście zostanie wyświetlona tylko domena [Domena] 1. Domeną 1 w tym przypadku jest geometria płynu, a nie ściana naczynia. Pole Właściwości płynu 1 jest automatycznie wypełniane z materiału zdefiniowanego w kroku 5.
    2. Ustaw ciśnienie Wartości początkowe 1 na fizjologiczne ciśnienie krwi. Ustaw warunek brzegowy dla Ściana 1 na brak poślizgu.
    3. Wybierz opcję Wlot 1 w oknie graficznym i ustaw warunek brzegowy na W pełni rozwinięty przepływ. Upewnij się, że zaznaczono opcję Zastosuj warunek dla każdego rozłącznego wyboru osobno .
    4. W obszarze Fully Developed Flow (W pełni rozwinięty przepływ) wybierz opcję Flow rate (Natężenie przepływu ) i wprowadź prędkość.
    5. Dla Wyjścia 1 wybierz wszystkie wyjścia w oknie graficznym i upewnij się, że Warunek brzegowy jest ustawiony na Ciśnienie.
    6. W obszarze Warunki ciśnienia wybierz opcję Suma i wprowadź ciśnienie. Wybierz opcję Średnia i Pomiń przepływ wsteczny.
  7. Przygotowanie i przeprowadzenie badania.
    1. W przypadku Kroku 1: Stacjonarny w trakcie badania upewnij się, że sekcja Fizyka i zmienne jest zgodna z zamierzonym badaniem, a komponent Wybór siatki 1 jest ustawiony jako Siatka 2. Wybierz pozycję Obliczenia.
  8. Analizuj wyniki naprężeń ścinających.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy Ciśnienie (spf) i wybierz Duplikuj. Zmień nazwę na Naprężenie ścinające.
    2. W obszarze Naprężenie ścinające wybrać Powierzchnia i zmienić zestaw danych na Badanie 1/Rozwiązanie 1 (sol1).
    3. W polu Wyrażenie wpisz spf.sr*spf.mu i ustaw jednostki na Pa.
      UWAGA: Oznacza to "szybkość ścinania przepływu jednofazowego * lepkość przepływu jednofazowego".
    4. Następnie wybierz Wykres i kliknij prawym przyciskiem myszy Przezroczystość 1 i wybierz Wyłącz.
    5. Kliknij prawym przyciskiem myszy Naprężenie ścinające i wybierz Objętość, aby zmienić zestaw danych na Badanie 1/Rozwiązanie 1 (sol1).
    6. W polu Wyrażenie wpisz spf.sr*spf.mu i ustaw jednostki na Pa.
    7. Wybierz opcję Wykres, kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Powierzchnia i wybierz opcję Wyłącz , aby wizualnie przeanalizować "Tom 1" w celu określenia obszarów zainteresowania statku do zbadania w modelu OOC

3. Przygotowanie form PDMS

  1. Korzystając z wyników symulacji płynów, wybierz geometrie do kontroli i pneumonektomii, wybierając obszary, które wykazują znaczące różnice w naprężeniu ścinającym między modelami kontrolnymi i pneumonektomicznymi i replikuj je jako formy ujemne w CAD. Wymiary modeli CAD unaczynienia kontrolnego i pneumonektomii pokazano na rysunkach 3 i 4.
  2. Dodatkowo zaprojektuj zaślepki do wlotu i wylotu formy, aby zapobiec wyciekom podczas wysiewu komórek.
  3. Za pomocą drukarki 3D wydrukuj formy i zatyczki za pomocą filamentu PLA.
  4. Uzyskaj formy kwasu polimlekowego (PLA), które zostały wydrukowane w 3D (kontrola + pneumonektomia) (ryc. 5A).
  5. Zważ 10 części bazy z elastomeru silikonowego i 1 część utwardzacza z elastomeru silikonowego, aby uzyskać łącznie 30 ml mieszaniny (stosunek masy do masy 10:1), aby wypełnić formy do grubości 3 mm (rysunek 5B).
    UWAGA: Nie mieszaj roztworów podstawowych podczas procesu ważenia. Dla każdego odczynnika należy używać oddzielnych materiałów do ważenia.
  6. Wlej do siebie bazę elastomerową i utwardzacz i dokładnie wymieszaj
    UWAGA: Można to zrobić w łodzi do ważenia.
  7. Wlej dobrze wymieszany roztwór do foremek (około 15 ml na połowę pleśni) (Rysunek 5C).
  8. Odgazuj PDMS, umieszczając go w komorze próżniowej na 30 - 60 minut lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne pęcherzyki (rysunek 5D).
  9. Wyjąć PDMS z komory próżniowej i utwardzać w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.
    UWAGA: Do utwardzania nie używano pieca ze względu na pojemność cieplną form PLA.
  10. Wyciągnij PDMS z formy PLA.
  11. Opłucz obficie formę PLA wodą DI, aby upewnić się, że żadne zanieczyszczenia nie pozostały na jej powierzchni, aby można było jej ponownie użyć.

figure-protocol-1
Rysunek 3: Rysunek 3D CAD kontrolnej naczyń krwionośnych. Wymiary, w mm, kontrolnego modelu unaczynienia w widoku z góry i z boku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-2
Rysunek 4: Rysunek CAD 3D naczyń krwionośnych do pneumonektomii. Wymiary, w mm, modelu unaczynienia po pneumonektomii w widoku z góry i z boku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 5: Tworzenie form PDMS. Tworzenie form PDMS. (A) Drukowane w 3D formy PLA do eksperymentów kontrolnych (pomarańczowy) i pneumonektomii (zielony). (B) Waga z materiałami wytwarzającymi PDMS. (C) Wlanie mieszaniny PDMS (baza 10:1 + utwardzacz) do form wydrukowanych w 3D. (D) Odgazowanie PDMS w komorze próżniowej. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

4. Hodowla komórkowa i wysiew

  1. Stosuj odpowiednią technikę aseptyczną zgodnie z lokalnymi protokołami laboratoryjnymi.
  2. Spryskaj 70% etanolem i wprowadź wszystkie niezbędne materiały i komponenty do szafy bezpieczeństwa biologicznego (BSC) (Rysunek 6A), w tym kawałki PDMS i cztery kawałki taśmy dwustronnej.
  3. Umieść dwa kawałki taśmy dwustronnej na każdej płytce do hodowli komórkowej (Rysunek 6B).
  4. Umieść każdą połówkę układu krwionośnego PDMS w osobnym naczyniu do hodowli komórkowych na wierzchu taśmy dwustronnej (Rysunek 6C).
  5. Następnie sterylizuj wszystkie elementy poprzez wystawienie na działanie światła UV przez 20 minut w BSC.
  6. W razie potrzeby rozmrozić trypsynę, pożywkę hodowlaną HLMVEC i 20 μg/ml fibronektyny w temperaturze 37 °C.
  7. Umieść kilka 30 μl kropli 20 μg/ml fibronektyny wzdłuż układu krwionośnego PDMS za pomocą mikropipety. Przechylając PDMS W razie potrzeby użyj końcówki pipety, aby równomiernie pokryć PDMS (Rysunek 7A).
  8. Inkubuj kawałki PDMS przez 30 minut w BSC.
  9. Po inkubacji odessać roztwór fibronektyny i pozostawić kawałki PDMS do wyschnięcia w BSC (ryc. 7B).
  10. Wprowadzić zlewającą się kolbę komórek HLMVEC z inkubatora (37 °C, 5% CO2) do BSC.
  11. Odessać pożywkę hodowlaną HLMVEC z kolby hodowlanej. Spłucz krótko trypsyną lub sterylnym PBS.
  12. Odessać popłuczynę i dodać 3 ml trypsyny do kolby. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut. Obserwować komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są odłączone od kolby.
  13. Dodać 9 ml kompletnej pożywki hodowlanej HLMVEC, aby zatrzymać działanie trypsyny.
  14. Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie przepłukać kolbę 10 ml pożywki hodowlanej HLMVEC w celu zebrania pozostałych komórek.
  15. Przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować komórki przy 220 x g przez 5 min.
  16. Po zakończeniu potwierdź wizualnie osad komórek na dnie probówki. Spryskaj probówkę 70% etanolem i wnieś ją do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Zassać supernatant, pozostawiając osad.
  17. Delikatnie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej HLMVEC i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz całkowitą liczbę komórek, korzystając z poniższych równań, gdzie A-H to liczba komórek zliczonych na kwadrat hemocytometru. Utrzymuj komórki na lodzie.
    figure-protocol-4
  18. Doprowadzić stężenie komórek do 2 x 106 komórek/ml za pomocą pożywki hodowlanej HLMVEC.
  19. Umieść wydrukowane w 3D zatyczki na końcach każdej połówki układu krwionośnego, aby wyeliminować wyciek zawiesiny komórek z formy PDMS, jak pokazano na rysunku 5 (łącznie 4 zatyczki, 2 na sztukę PDMS) (Rysunek 7C).
  20. Wysiewaj 300 μl zawiesiny komórek HLMVEC (600 tys. komórek) za pomocą mikropipety do każdego elementu PDMS (ryc. 7D).
  21. Delikatnie przenieś kawałki PDMS zawierające komórki HLMVEC do inkubatora (37 °C, 5% CO2) na 1-2 godziny w celu przyłączenia (Rysunek 7E).
  22. Sprawdź pod mikroskopem, aby wizualnie potwierdzić pomyślne przymocowanie HLMVEC do substratów PDMS.
  23. Zwróć połówki układu naczyniowego PDMS do BSC.
  24. Usuń cztery zatyczki, dodaj tyle pożywki hodowlanej HLMVEC, aby zanurzyć połówki naczyń krwionośnych PDMS, a następnie włóż płytki hodowlane zawierające naczynia krwionośne PDMS do inkubatora (ryc. 7F).
  25. 6-10 godzin po wysiewie ręcznie odpipetować pożywkę hodowlaną HLMVEC otaczającą PDMS do układu krwionośnego, aby odświeżyć pożywkę znajdującą się najbliżej komórek.

figure-protocol-5
Rysunek 6: Mocowanie form PDMS do płyt. Podstawowe kroki w mocowaniu układu naczyniowego PDMS do płytek do hodowli komórkowych. (A) Materiały wymagane do umieszczenia połówek układu krwionośnego PDMS na płytkach hodowlanych. (B) Dwa kawałki dwustronnej taśmy klejącej umieszcza się po przekątnej na każdej sterylnej płytce hodowlanej. (C) Połówki układu krwionośnego PDMS zamontowane na wierzchu dwustronnego kleju. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-protocol-6
Rysunek 7: Wysiewanie HLMVEC do form PDMS. Etapy wysiewu HLMVEC w unaczynieniu PDMS. (A) Napełnij naczynia krwionośne 150-300 μl 20 μg/ml fibronektyny. (B) Odessać nadmiar fibronektyny za pomocą techniki kranu uchylnego. (C) Zatkaj końce połowy układu naczyniowego PDMS zatyczkami wydrukowanymi w 3D. (D) Wysiewaj 500-600 tys. komórek w pożywce 300 μl do każdej połowy układu krwionośnego. (E) Umieść połówki PDMS w inkubatorze na 1-2 godziny, aby ułatwić przyczepienie komórek. (F) Przykryj połówki PDMS nośnikiem i wyjmij wtyczki. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

5. Montaż i uruchomienie systemu przepływu

  1. Wykonaj procedurę przepływu, gdy komórki w połówkach naczyń krwionośnych PDMS są w pełni zlewne, jak określono na podstawie oględzin pod mikroskopem.
  2. Przed wykonaniem eksperymentu należy skalibrować pompę perystaltyczną zgodnie z protokołem producenta.
  3. Autoklawuj wszystkie elementy, które można sterylizować w autoklawie, w tym rurkę przepływową, złącza przewodów, zbiornik strzykawki i gumowy korek.
  4. Zanurz akrylowe bloki,, zaślepki, 16 rurek Masterflex L/S 16 i pokrywkę płytki szalki Petriego o średnicy 15 mm w 70% etanolu na 15 minut i w osłonie UV na 20 minut, przewracając w połowie.
  5. Po wysterylizowaniu całego innego sprzętu i materiałów należy wprowadzić połówki układu krwionośnego PDMS do BSC.
  6. Odessać pożywkę HLMVEC z płytki Petriego zawierającej połówki układu krwionośnego (ryc. 8A,B).
  7. Umieść połówki PDMS w dwóch blokach poliwęglanu, upewniając się, że są wyrównane (Rysunek 8C).
  8. Nałóż uszczelniacz silikonowy na końce układu naczyniowego, gdzie rurka zostanie przymocowana do połówek PDMS, i umieść rurkę o długości cala na dwóch końcach dolnej części naczynia krwionośnego (ryc. 8D).
  9. Odwróć górny blok akrylowy (zawierający górną połowę układu naczyniowego PDMS) na dolny blok akrylowy (zawierający dolną połowę układu naczyniowego PDMS) (Rysunek 8E).
  10. Przykręć bloki akrylowe razem z gwintowanym blokiem na spodzie i zatkaj wolne końce rurek o długości cala za pomocą zaślepek wydrukowanych w 3D (Rysunek 8F).
  11. Wyjmij jedną zatyczkę i delikatnie wstrzyknij 500 μl pożywki hodowlanej HLMVEC do układu krwionośnego, przechylając ją, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, a następnie załóż zatyczkę.
  12. Umieść cały zmontowany chip w inkubatorze, aby silikon mógł utwardzić się przez 1-2 godziny.
  13. Przenieś zmontowany chip i wszystkie inne sterylne materiały do BSC i podłącz wszystko, aby skonfigurować system przepływu zgodnie z rysunkiem 9. Upewnij się, że rurka biegnąca przez pompę perystaltyczną do wlotu naczyń krwionośnych jest przymocowana do dna zbiornika strzykawki. Umożliwi to grawitacyjne zasilanie przewodów i zmniejszenie pęcherzyków powietrza w systemie.
  14. Delikatnie zalać system przepływu mediami HLMVEC. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml wstrzyknąć 30 ml pożywki do górnej części zbiornika strzykawki (Rysunek 10B). Uruchom pompę perystaltyczną przy niskim natężeniu przepływu, aby napełnić rurkę. Kontynuuj dodawanie pożywki do zbiornika, aż system zostanie całkowicie zalany, a wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte.
    UWAGA: Pęcherzyki powietrza mogą ścinać komórki podczas eksperymentu przepływu.
  15. Przymocuj rurkę do wlotu zbiornika (od wylotu formy naczyniowej) za pomocą złączki przymocowanej do gumowego korka umieszczonego w górnej części zbiornika (Rysunek 10C).
  16. Odłącz system przepływu od pompy perystaltycznej i umieść go na metalowej misce. Delikatnie przetransportować cały zestaw z BSC do inkubatora (37 °C, 5% CO2 ). Wprowadzić rurkę do pompy perystaltycznej przez tylną część inkubatora.
  17. Ponownie podłącz pompę perystaltyczną i ustaw żądane natężenie przepływu, aby naśladować natężenie przepływu krwi przez model naczyniowy.
  18. Uruchom pompę i upewnij się, że nie ma wycieków. Pozwól systemowi działać przez 24 godziny lub żądany czas. Okresowo sprawdzaj, czy nie ma wycieków.

figure-protocol-7
Rysunek 8: Konstruowanie układu przepływowego. Konstruowanie układu przepływowego. (A) Odessać pożywkę z płytki do hodowli komórkowej. (B) PDMS zmniejsza się o połowę po zassaniu pożywki. (C) Usuń połówki PDMS z płyty wraz z innymi materiałami potrzebnymi do budowy chipa (wtyczka, filtr strzykawkowy, kawałki rurki 1/2", uszczelniacz silikonowy, 10x i bloki akrylowe). (D) Umieść połówki PDMS w blokach akrylowych i nałóż uszczelniacz silikonowy w miejscach oznaczonych na czerwono. (E) Umieść rurkę w odpowiednich wycięciach. (F) Podłącz połówki komory przepływowej i podłącz korek oraz filtr strzykawkowy. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-protocol-8
Rysunek 9: Konfiguracja systemu przepływu. Konfiguracja systemu przepływu. Kompletny system przepływu jest zbudowany z rurek, łączników rurek, pompy perystaltycznej, zbiornika strzykawki, stojaka podporowego i chipa przepływowego. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-protocol-9
Rysunek 10: Zalewanie systemu przepływowego. Zalewanie układu przepływowego mediami. (A) Prosta konfiguracja systemu przepływu bez mediów. (B) Gumowy korek wyjęty ze zbiornika strzykawki, a pożywka jest dodawana w sposób ciągły, aż rurka zostanie napełniona, a w zbiorniku pozostanie 20-30 ml nadmiaru pożywki. (C) System przepływu zagruntowany mediami HLMVEC. Utworzony za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

6. Mocowanie i barwienie

  1. Umyj każdą połówkę układu krwionośnego PDMS w PBS przez 5 minut. Dodaj tyle, aby zanurzyć cały odcinek naczyniowy.
  2. Zassać PBS z układu krwionośnego, przechylając płytkę i pozwalając PBS spłynąć, a następnie odessać spływak próżniowo.
  3. Dodaj 600 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS do każdej połówki naczynia krwionośnego i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
  4. Zassać roztwór PFA do odpowiedniego pojemnika na odpady, stosując metodę opisaną w kroku 2.
  5. Myj stałe komórki 3x w PBS przez 5 minut każda, stosując procedurę opisaną w kroku 2.
    UWAGA: Każde z tych płynów do płukania należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady na formaldehyd.
  6. Zatkaj końce połówek układu krwionośnego PDMS czystymi zatyczkami wydrukowanymi w 3D.
  7. Przygotować 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do blokowania.
  8. Napełnij połówki naczyń krwionośnych 600 μl roztworu blokującego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Usuń zatyczki i zasysaj roztwór blokujący.
  10. Przygotować lektynę aglutyniny z kiełków pszenicy (WGA) w rozcieńczeniu 1:200 ze sprzężoną biotyną (przeciwciałem pierwszorzędowym) w 3% roztworze BSA, aby zabarwić GCX9.
  11. Zwróć zatyczki, aby zatkać końce układu krwionośnego i dodać 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdej połówki naczynia.
  12. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  13. Delikatnie odessać przeciwciało pierwszorzędowe, postępując zgodnie z poprzednio zastosowaną techniką.
  14. Umyj 3 razy PBS przez 5 minut każde.
  15. Przygotować rozcieńczenie 1:500 koniugatu streptawidyny WGA (przeciwciało drugorzędowe) w 3% roztworze BSA.
  16. Zwróć zatyczki, aby zatkać końce układu krwionośnego i dodać 500 μl roztworu przeciwciał wtórnych do każdej połówki naczynia.
  17. Powtórz kroki 6.12-6.14.
  18. Dodaj pożywkę montażową DAPI do powierzchni naczyń krwionośnych, dozując 30 μl kropli w odstępach czasu, aby całkowicie wypełnić naczynia krwionośne.
  19. Umieść szklane szkiełka nakrywkowe na PDMS, aby zakryć kanały naczyniowe.
  20. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym lakierem do paznokci.
  21. Przykryć płyty folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania obrazu.

7. Obrazowanie

  1. Włącz mikroskop i otwórz aplikację do przeglądania na podłączonym komputerze.
  2. Otwórz mikroskop i podnieś światło. Przymocuj odpowiednią platformę, aby pasowała do próbek (uniwersalny uchwyt na szalkę Petriego).
  3. Umieść próbkę na uchwycie naczynia w mikroskopie tak, aby obszar zainteresowania był wyśrodkowany nad obiektywem.
  4. Zmniejsz światło i zamknij pokrywę mikroskopu.
  5. W oprogramowaniu mikroskopu wybierz opcję Przechwyć zdjęcie .
  6. Wybierz typ próbki, użyj wszechstronnego.
  7. Wybierz odpowiedni obiektyw w sekcji obiektywów, aby uzyskać najlepszą wizualizację.
  8. W oprogramowaniu mikroskopu dostosuj położenie obiektywu, aby wyrównać go z obszarem zainteresowania (ROI).
  9. Wybierz autofokus, a komórki powinny z grubsza ustawić ostrość.
  10. Ręcznie dostosuj ostrość, aby w pełni wyklarować obraz.
  11. Dostosuj jasność i ekspozycję, aby wyraźniej wizualizować komórki.
  12. Włącz wielokolorowość i kolor w oprogramowaniu.
  13. W ustawieniach CH włącz CH1 Floor DAPI i CH2 Floor GFP.
  14. Dostosuj jasność każdego kanału osobno, aby wyraźnie zobaczyć obrazy.
  15. Wybierz Z-Stack w oprogramowaniu mikroskopu.
  16. Dostosuj ostrość do najwyższej płaszczyzny obrazu i wybierz ustaw, aby ustawić górny limit
  17. Dostosuj ostrość do najniższej płaszczyzny obrazu i wybierz ustaw, aby ustawić dolną granicę
  18. Wybierz odpowiednią grubość plastra i naciśnij przycisk Rozpocznij przechwytywanie , aby zrobić zdjęcie.
    UWAGA: Obrazy te zostaną również przesłane do oprogramowania do analizy mikroskopowej w celu dalszej modyfikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki badania stanu ustalonego przepływu laminarnego symulacji płynów wykazały wzrost naprężeń ścinających w niektórych rozwidleniach w modelach pneumonektomii w porównaniu z modelem kontrolnym, pokazanym na rysunku 11. Wizualizowane w kroku 2.8 protokołu, czerwone obszary oznaczają obszary o dużym naprężeniu ścinającym, podczas gdy niebieskie obszary pokazują obszary o niskim naprężeniu ścinającym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modelowanie naczyń krwionośnych to ważna nowa dziedzina do eksploracji. Pomyślne stworzenie dokładnego modelu naczyniowego jest bardzo obiecujące dla postępu w dziedzinie inżynierii tkankowej i opracowywania leków. W tym artykule przedstawiono nowatorską metodę generowania układu naczyniowego OOC, który można wykorzystać do naśladowania pneumonektomii lub dowolnego innego układu naczyniowego lub geometrii w celu zbadania potencjalnego związku między upośledzeniem GCX a powikłaniami po pneumonektomii. W szerszej skali met...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną wyrazić naszą najgłębszą wdzięczność Wydziałowi Inżynierii Biomedycznej Instytutu Politechniki w Worcester za wsparcie i wskazówki. Chcielibyśmy złożyć specjalne podziękowania Megan Ouellette, Johnowi Martelowi i Sudish Vengat za ich wspólne wysiłki i innowacyjne pomysły, które znacznie poprawiły jakość i rentowność tych badań. Ponadto chcielibyśmy podziękować Samancie Cocchiaro i Udai Rattan za ich wkład w laboratorium oraz ich niezbędne wsparcie i pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
# 8-32 x 3/4 cala Combo Śruba maszynowa z okrągłym ocynkowana (8 sztuk)Everbilt204274613-
0,25% EDTA-trypsynaThermoFisher Naukowy25200056 -
15 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkoweThermo Scientific12-565-269-
Talerz 35x10mm, nunclon DeltaThermo Scientific153066-
50 ml stożkowe sterylne polipropylenowe probówki wirówkoweThermo Scientific12-565-271-
Różne gumowe stoperyMarka rybacka14-132
Kolby poddane hodowli komórkowej BioLite (25cm^2)Thermo Scientific12-556-009-
Kolby poddane hodowli komórkowej BioLite (75cm^2)Thermo Scientific12-556-010-
COMSOL MultifizykaCOMSOLN/A-
Klej dwustronny 3 mln16758005-
Epredia Richard-Allan Naukowa szklana osłona Thermo Scientific22-050-218-
Surowica bydlęca płoduThermoFisher Naukowy A5256701 -
FibronektynaThermoFisher Naukowy 33016015 20 μ rozcieńczenie g/ml
Wanny wodne Fisherbrand Isotemp ze sterowaniem cyfrowym: Model 210Marka rybacka15-462-10Q-
Sterylna strzykawka Fisherbrand (60 ml)Marka rybacka14-955-461-
Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płucSigma Aldrich540-05A -
Mikroskop fluorescencyjny Keyence BZX810KluczN/A-
Zestaw elastometru silikonowego Krayden Dow Sylgard 184. Przezroczysty, (1,1LB)Dow4019862-
Marga Cipta odlew akrylowy o grubości 1/2 ', 48x96'Marga CiptaN/A-
Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load IITechnologia MasterFlex77200-50
Rurka pompy precyzyjnej Masterflex L/S, silikon utwardzany platyną, L/S 16; 25 stópTechnologia MasterFlex96410-16-
Standardowa pompa perystaltyczna Masterflex L/STechnologia Masterflex07522-20
Mikropipeta 0,2 do 2 μ LMarka rybackaFBE00002-
Mikropipety od 10 do 100 μ LMarka rybackaFBE00100-
Mikropipeta od 100 do 1000 μ LMarka rybackaFBE01000-
Mikropipeta od 5 do 50 μn; LMarka rybackaFBE00050-
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka mikronaczyniowego (500ml)Sigma - Aldrich111-500-
Sterylne filtry strzykawkowe NalgeneThermo Scientific725-2520-
Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipse TS-100NikonNI-TS100
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS, 10X), formuła DulbeccoThermo ScientificJ61917. Zobacz materiał K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy Black 1kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Mikroskop hybrydowy Rebel, pionowy i odwrócony, Discover EchoECHO76376-746-
Uszczelniacz silikonowy Loctite908570-
SolidWorks (SolidWorks)Dassault SystemesN/A
Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym (10 ml)Marka rybacka13-678-11E-
Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym (25 ml)Marka rybacka13-678-11-
Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym (50 ml)Marka rybacka13-678-11F-
Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym (5 ml)Marka rybacka13-678-11D-
Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488Invitrogen S32354 powiedział:
Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488InvitrogenS32354 powiedział:-
Resevoir strzykawki BD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT Albumina, Bydlęca, Frakcja V, 35% roztworu, Klasa odczynnika, Bez kwasów tłuszczowych, z azydkiem jako konserwantemThermo ScientificN12H004-
Łączniki ruroweMarka rybacka01-000-161-
VECTASHIELD Medium montażowe Antifade z DAPI Vectashield (Tarcza Vectashield)H-1200-10-
Inkubator CO2 firmy VWR z płaszczem wodnymAvantar 10810-744 -
Przeciwciało biotynylowane WGAWektorZobacz materiał B-1025-

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sharma, S., Beshara, M., Bora, V. Pneumonectomy. , StatPearls Publishing LLC. (2024).
  2. Grapatsas, K., et al. Pneumonectomy for primary lung tumors and pulmonary metastases: a comprehensive study of postoperative morbidity, early mortality, and preoperative clinical prognostic factors. Curr. Oncol. 30 (11), 9458-9474 (2023).
  3. Lucas, G. F. N., James, M. I., David, R. J., Victor, E. L. Chapter 24. Topics in thoracic surgery. Guerreiro Cardoso, P. F. , IntechOpen. (2012).
  4. Sentenac, P., et al. Pulmonary hypertension after pneumonectomy: a preclinical model in rats and human pulmonary endothelial cells. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 59 (1), 147-154 (2020).
  5. Russo, T. A., Banuth, A. M. M., Nader, H. B., Dreyfuss, J. L. Altered shear stress on endothelial cells leads to remodeling of extracellular matrix and induction of angiogenesis. PLoS One. 15 (11), e0241040(2020).
  6. Milusev, A., Rieben, R., Sorvillo, N. The endothelial glycocalyx: a possible therapeutic target in cardiovascular disorders. Front. Cardiovasc. Med. 9, e897087(2022).
  7. Vittum, Z., Cocchiaro, S., Mensah, S. A. Basal endothelial glycocalyx's response to shear stress: a review of structure, function, and clinical implications. Front. Cell Dev. Biol. 12, e1371769(2024).
  8. Villalba, N., Baby, S., Yuan, S. Y. The endothelial glycocalyx as a double-edged sword in microvascular homeostasis and pathogenesis. Front. Cell Dev. Biol. 9, e711003(2021).
  9. Harding, I. C., et al. Endothelial barrier reinforcement relies on flow-regulated glycocalyx, a potential therapeutic target. Biorheology. 56 (2-3), 131-149 (2019).
  10. Alphonsus, C. S., Rodseth, R. N. The endothelial glycocalyx: a review of the vascular barrier. Anaesthesia. 69 (7), 777-784 (2014).
  11. Möckl, L. The emerging role of the mammalian glycocalyx in functional membrane organization and immune system regulation. Front. Cell Dev. Biol. 8, e00253(2020).
  12. Nian, K., Harding, I. C., Herman, I. M., Ebong, E. E. Blood-brain barrier damage in ischemic stroke and its regulation by endothelial mechanotransduction. Front. Physiol. 11, 605398(2020).
  13. Dietz, N. M. Pathophysiology of postpneumonectomy pulmonary edema. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 4 (1), 31-35 (2000).
  14. Bozlar, U., et al. Pulmonary artery diameters measured by multidetector-row computed tomography in healthy adults. Acta Radiol. 48 (10), 1086-1091 (2007).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Kataoka, H., et al. Fluorescent imaging of endothelial glycocalyx layer with wheat germ agglutinin using intravital microscopy. Microsc. Res. Tech. 79, 31-37 (2016).
  17. Wood, K. M., Stone, G. M., Peppas, N. A. Wheat germ agglutinin functionalized complexation hydrogels for oral insulin delivery. Biomacromolecules. 9 (4), 1293-1298 (2008).
  18. Tarnowski, B. I., Spinale, F. G., Nicholson, J. H. DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotech. Histochem. 66 (6), 297-302 (1991).
  19. Emde, B., Heinen, A., Gödecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. Eur. J. Histochem. 58 (4), 2448(2014).
  20. Hu, Z., Cano, I., D'Amore, P. A. Update on the role of the endothelial glycocalyx in angiogenesis and vascular inflammation. Front. Cell Dev. Biol. 9, e734276(2021).
  21. Choi, J., Lee, E. J., Jang, W. B., Kwon, S. M. Development of biocompatible 3D-printed artificial blood vessels through multidimensional approaches. J. Funct. Biomater. 14 (10), e14100497(2023).
  22. Fallon, M. E., Mathews, R., Hinds, M. T. In vitro flow chamber design for the study of endothelial cell (patho)physiology. J. Biomech. Eng. 144 (2), e4051765(2021).
  23. Basehore, S., Garcia, J., Clyne, A. M. The science, etiology and mechanobiology of diabetes and its complications. Gefen, A. , Acad. Press. 291-312 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Napr enie cinaj cemodelowanie naczyniowenaczynia p ucnesymulacja przep ywu cieczykom rki HLMVECnaczynia z PDMSimmunobarwieniepompa perystaltyczna

Powiązane artykuły