Method Article

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

DOI:

10.3791/67251

⸱

August 30th, 2024

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery, struktury ochronne na końcach chromosomów, są kluczowe dla utrzymania długowieczności komórek i stabilności genomu. Ich prawidłowe funkcjonowanie zależy od ściśle regulowanych procesów replikacji, wydłużania i odpowiedzi na uszkodzenia. Kompleks schroniny, zwłaszcza czynnik wiążący telomery 1 (TRF1) i TRF2, odgrywają kluczową rolę w ochronie telomerów i stały się potencjalnym celem badań przeciwnowotworowych nad lekami. Białka te wiążą się z powtarzającym się telomerowym motywem DNA TTAGGG, ułatwiając tworzenie struktur ochronnych i rekrutację innych białek telomerowych. Metody strukturalne i zaawansowane techniki obrazowania dostarczyły informacji na temat interakcji białko-DNA telomerowe, ale badanie dynamicznych procesów wymaga podejścia opartego na pojedynczych cząsteczkach. Narzędzia takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i mikroskopia sił atomowych (AFM) zostały wykorzystane do zbadania interakcji telomerowych białko-DNA, ujawniając ważne szczegóły, takie jak zniekształcenie DNA zależne od TRF2 i kataliza telomerazy. Jednak przygotowanie konstruktów jednocząsteczkowych z powtarzalnymi motywami telomerowymi nadal stanowi trudne zadanie, potencjalnie ograniczając zakres badań wykorzystujących jednocząsteczkowe metody mechaniczne. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy metodę badania interakcji przy użyciu pełnowymiarowego ludzkiego telomerowego DNA za pomocą pęsety magnetycznej. Protokół ten opisuje, jak wyrażać i oczyszczać TRF2, przygotowywać telomerowe DNA, konfigurować testy mechaniczne pojedynczych cząsteczek i analizować dane. Ten szczegółowy przewodnik przyniesie korzyści naukowcom zajmującym się biologią telomerów i odkrywaniem leków ukierunkowanych na telomery.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Telomery to struktury ochronne na końcach chromosomów1,2,3. Erozja telomerów podczas podziału komórki prowadzi do starzenia się i starzenia komórek, podczas gdy nieprawidłowe wydłużanie telomerów przyczynia się do raka4,5. Aby telomery działały prawidłowo, ich replikacja, wydłużanie i reakcje na uszkodzenia muszą być ściśle regulowane6,7,8. Shelterin, składający się z sześciu podjednostek, odgrywa kluczową rolę w ochronie telomerów9,10,11. Głębsze zrozumienie telomerów dostarczy cennych informacji na temat biologii telomerów.

TRF1 i TRF2, podstawowe podjednostki shelteryny, są telomerowymi białkami wiążącymi12,13. Zarówno TRF1, jak i TRF2 wiążą się z powtarzającym się motywem DNA TTAGGG w telomerach za pośrednictwem swoich domen Myb14. Tworzą dimery poprzez wspólne domeny TRFH, które pozwalają im otaczać telomerowe dwuniciowe DNA i rekrutować białka telomeryczne15,16,17,18,19. TRF2 jest szczególnie ważny dla tworzenia telomerowych pętli D i pętli T20,21. Ze względu na ich kluczową rolę w ochronie telomerów, TRF1 i TRF2 stały się potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych22,23,24,25.

Podjęto znaczące wysiłki w celu zbadania interakcji białko-DNA w telomerach. Metody biochemiczne, takie jak test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR), zostały wykorzystane do zbadania powinowactwa wiązań20,26. Liczne struktury białek wiążących telomery skompleksowane z DNA zostały wyjaśnione za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), krystalografii rentgenowskiej i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR)27,28,29. Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), ujawniły zależne od TRF2 tworzenie pętli T21. Ostatnio opracowano sekwencjonowanie nanoporowe w celu profilowania sekwencji telomerowych4,30,31. Te strukturalne spostrzeżenia znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat telomerowych interakcji białko-DNA. Aby dokładniej zbadać dynamikę telomerowych interakcji białko-DNA, niezbędne jest opracowanie nowych technologii.

Narzędzia do jednocząsteczkowych to potężne techniki badania interakcji białko-DNA w telomerze32,33,34. Jednocząsteczkowe metody mechaniczne, takie jak pęseta magnetyczna, pęseta optyczna i AFM, zostały wykorzystane między innymi do zbadania zniekształceń DNA zależnych od TRF2, ujawnienia kolumnowego układania ludzkiej chromatyny telomerowej za pośrednictwem TRF2 i obserwacji procesyjnej katalizy telomerazy35,36,37,38,39,40. Metody te są szczególnie przydatne do badania konformacji topologicznych oraz kinetyki asocjacji i dysocjacji białko-DNA.

Jednak przygotowanie jednocząsteczkowych konstruktów z telomerowymi powtarzającymi się motywami nadal stanowi wyzwanie, co ogranicza badania przy użyciu jednocząsteczkowych metod mechanicznych. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy jednocząsteczkową metodę mechaniczną do badania globalnych interakcji białko-DNA na pełnowymiarowych ludzkich telomerach41. Metoda ta bezpośrednio ekstrahuje telomeryczne DNA z komórek ludzkich, omijając pracochłonne przygotowanie sztucznego telomerycznego DNA. Ułatwia badanie procesów kinetycznych zachodzących na długich natywnych telomerach o długości kilku kilozasad.

W tym protokole podajemy szczegółowy opis kroków do badania telomerowych interakcji białko-DNA za pomocą pęsety magnetycznej, popularnego mechanicznego narzędzia do pojedynczych cząsteczek42,43,44. Pokazujemy, jak wyrażać i oczyszczać białka telomeryczne, na przykładzie TRF2, oraz jak przygotować telomerowe DNA z komórek ludzkich. Dodatkowo pokazujemy, jak skonfigurować test pojedynczej cząsteczki na pęsetach magnetycznych w celu zbadania interakcji telomerowych białko-DNA, a także omówimy późniejszą analizę danych z eksperymentów jednocząsteczkowych. Protokół ten przyniesie korzyści naukowcom zajmującym się biologią telomerów i odkrywaniem leków ukierunkowanych na telomery.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólne materiały i metody

  1. Zapoznaj się z plikiem Tabela materiałów, aby uzyskać informacje o solach, chemikaliach, antybiotykach, enzymach, przeciwciałach i materiałach żywicznych używanych w tym protokole.
  2. Przygotuj płynną pożywkę Luria-Bertani (LB), płytki agarowe LB, bufor HEPES, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (SDS-PAGE), bufor soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), bufor Tris-EDTA (TE) zgodnie z recepturami z protokołów portu w zimnym źródle45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. Pozyskaj wektor pET28a (Addgene), prokariotyczne i eukariotyczne linie komórkowe (ATCC) ze źródeł komercyjnych. Następnie kontynuuj hodowlę i pasaż je w laboratorium.
  4. W przypadku dużych objętości cieczy sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut. W przypadku małych objętości należy użyć sterylnego filtra o wielkości porów 0,22 μm.
  5. Dostosuj pH roztworów do pożądanego poziomu za pomocą HCl lub NaOH przed doprowadzeniem ich do ostatecznych objętości.
    UWAGA: Pęseta magnetyczna jest budowana na zamówienie i działa w środowisku LabVIEW 2017, podczas gdy analiza danych pojedynczych cząsteczek jest wykonywana w MATLAB 20172,54,55.
  6. Ze względów bezpieczeństwa należy nosić fartuchy laboratoryjne z długimi rękawami, rękawice nitrylowe (lub rękawice wykonane z materiału, który jest nieprzepuszczalny i odporny na działanie substancji), okulary lub gogle ochronne oraz obuwie z zakrytymi palcami.

2. Ekspresja białek i oczyszczanie telomerowych białek wiążących DNA

  1. Wykonaj hodowlę komórkową i indukuj ekspresję białka.
    1. Wstaw sekwencję kodującą dla telomerowych białek wiążących DNA (Figura 1A), TRF2 jako przykład w tym przypadku, do wektora pET28a przez trawienie enzymatyczne i ligację, z SUMO zastosowanym jako znacznik fuzyjny. Wstaw między miejsca restrykcyjne BamHI i HindIII, uzyskując plazmid pET28a-SUMO-TRF2 (Rysunek 1B).
    2. Przekształć komórki BL21(DE3) za pomocą plazmidu pET28a-SUMO-TRF2.
      1. Rozmrozić 50 μl podwielokrotności kompetentnych komórek BL21(DE3) na lodzie.
      2. Dodać 1 μl DNA plazmidu pET28a-SUMO-TRF2 (zawierającego 50 ng DNA) do właściwych komórek. Delikatnie zamieszać, aby wymieszać bez pipetowania w górę i w dół.
        UWAGA: Nie wirować.
      3. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut.
      4. W przypadku szoku cieplnego należy podgrzać mieszaninę komórek w temperaturze 42 °C dokładnie przez 45 s w łaźni wodnej. Natychmiast umieść komórki w lodzie na 2 minuty, aby ustabilizować przekształcone komórki.
      5. Dodaj 950 μl pożywki LB o temperaturze pokojowej (RT) do komórek, aby ułatwić regenerację.
      6. Inkubować przekształcone komórki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
      7. Rozprowadzić 100 μl mieszaniny transformacyjnej na płytce agarowej LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny (85,8 μM).
      8. Inkubować posiane komórki przez noc w temperaturze 37 °C. Po inkubacji wybierz odrębne kolonie do wykorzystania w inokulacji kultur starterowych.
        UWAGA: Kolonie na płytkach można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
    3. Zebrać kolonię przekształconych komórek BL21(DE3) i wyhodować ją w 5 ml pożywki LB uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny (85,8 μM). Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
    4. Aby zwiększyć skalę, przenieś 2 ml hodowli przez noc do 200 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny (85,8 μM). Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD 600) osiągnie 0,6-0,8.
    5. Pobrać 1 ml kultury jako nieindukowaną próbkę kontrolną.
    6. Indukować pozostałą kulturę za pomocą izopropylo-β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i inkubować w temperaturze 20 °C przez 17 godzin w celu pobudzenia ekspresji białka.
    7. Wykonaj SDS-PAGE przy użyciu 5% żelu do układania w stos i 10% żelu separacyjnego. Załaduj próbki za pomocą bufora ładującego SDS-PAGE i uruchom SDS-PAGE początkowo pod napięciem 100 V przez 30 minut, a następnie 120 V przez 50 minut w buforze Tris-Glycine. Barwienie na niebiesko Coomassie w celu wizualizacji ekspresji białka (patrz przepisy w tabeli uzupełniającej 1) ( Rysunek 1C).
      UWAGA: Zobacz Dyskusja, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów, jeśli wyrażenie nie jest przestrzegane.
  2. Oczyść białko.
    1. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 °C, 8500 x g przez 10 minut. Odrzucić sklarowany osad i przemyć osad w 200 ml PBS. Ponownie odwirować, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 25 ml buforu do lizy (20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% glicerolu, 0,5 mM DTT, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu [PMSF]).
      UWAGA: PMSF jest i toksyczny oraz powoduje oparzenia. Nosić odpowiednią odzież ochronną, rękawice i ochronę oczu/twarzy.
      UWAGA: Zamrozić w temperaturze -80 °C, jeśli nie nastąpi to natychmiast.
    2. Dodać 5 μl lizozymu 100 mg/mL, 5 μl 1 U/μL DNazy I i 5 μl 10 mg/ml RNazy A do zawieszonych komórek.
    3. Wykonaj sonikację na lodzie, z 1-sekundowymi seriami o mocy 250 W, po których następuje 2-sekundowa przerwa, w sumie 30 minut.
    4. Wirować w temperaturze 38 000 x g, 4 °C przez 40 minut (dopuszczalne jest 30-60 min) i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
    5. Przygotować 500 ml buforu wiążącego kolumnę nikli, rozpuszczając 8,76 g NaCl (stężenie końcowe 300 mM) i 0,68 g imidazolu (stężenie końcowe 20 mM) w 20 mM HEPES (pH 8,0). Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm.
      UWAGA: Imidazol jest niebezpieczny i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Może również zaszkodzić nienarodzonemu dziecku. Unikaj kontaktu z oczami, skórą i odzieżą. Nie spożywać ani nie wdychać. Nosić środki ochrony osobistej, w tym ochronę twarzy.
    6. Przygotować elucyjne w kolumnie niklowo-niklowej (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl) ze zwiększającymi się stężeniami imidazolu (100 mM, 200 mM, 300 mM i 500 mM) do stopniowej elucji, upewniając się, że wszystkie są odpowiednio przefiltrowane.
    7. Załadować przefiltrowany supernatant na wstępnie zrównoważoną kolumnę niklu w buforze wiążącym (20 mM HEPES (pH 8,0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu). Przemyć buforem wiążącym i wymyć białko przygotowanym gradientem imidazolu, zbierając 12 frakcji, każda o objętości 1 ml (Rysunek 1C). Połącz frakcje o czystości >95%.
    8. Zmierzyć stężenie eluowanego białka fuzyjnego 6xHis-sumo-TRF2 przez A280 w spektrofotometrze.
    9. W przypadku białka stosowanego w testach jednocząsteczkowych należy dodać proteazę sumo zgodnie z instrukcjami producenta (zwykle 0,125 U proteazy na 2 μg białka fuzyjnego) i pozostawić na nocne trawienie w temperaturze 4 °C.
    10. Po leczeniu proteazą sumo załaduj mieszaninę z powrotem na kolumnę Ni, aby związać niestrawione białko fuzyjne i sumo znakowane Hisem, umożliwiając przepływ białka TRF2 bez znaczników. Zbierz przepływ.
  3. Określ stężenie białka i przechowuj białko.
    1. Zagęścić oczyszczone białko TRF2 za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o masie 30 kDa i wymienić je na bufor magazynujący zawierający 20 mM HEPES (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT, w celu zmniejszenia stężenia imidazolu poniżej 150 mM.
    2. Powtarzaj proces zatężania, aż objętość zmniejszy się do mniej niż 1 ml.
    3. Analizuj próbki z każdego etapu oczyszczania za pomocą SDS-PAGE, aby ocenić czystość i integralność białka (Rysunek 1C).
      UWAGA: Chromatografia powinowactwa służy do oczyszczania białek, zbierania i mycia eluowanych próbek oraz przeprowadzania SDS-PAGE w celu oceny integralności białka i zapewnienia kontroli jakości. Gdy sama chromatografia powinowactwa nie spełnia wymagań czystości, stosuje się chromatografię wykluczania wielkości w celu dalszego zwiększenia czystości białka. Krzywe absorbancji UV pomagają ocenić frakcje elucyjne, a SDS-PAGE weryfikuje integralność białek, zapewniając rygorystyczną kontrolę jakości w całym procesie.
    4. Dodać glicerol do końcowego stężenia 50% do zagęszczonego i wymienionego buforowo białka do przechowywania.
    5. Przechowywać białko w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie ludzkich fragmentów restrykcyjnych telomerów

  1. Ekstrakcja genomowego DNA.
    1. Postępując zgodnie ze schematem blokowym (Rysunek 2A), odwiruj 1 x 107 komórek przy 1000 x g przez 3 minuty i odrzuć supernatant. Do przemywania ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS, ponownie odwirować przy 1000 x g przez 3 minuty i wyrzucić supernatant.
    2. Dodać 760 μl buforu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA i 1% SDS do probówki zawierającej 1 x 107 komórek i delikatnie zawiesić ponownie przez pipetowanie, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Nie wirować.
    3. W celu wytrawienia białek i eliminacji DNaz i RNaz w próbce, dodać proteinazę K do końcowego stężenia 0,5 mg/ml, co odpowiada 40 μl roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml. Postukaj w spód tuby, aby wymieszać (nie wirować).
    4. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 265 μl 5,4 M NaCl. Mieszaj przez 5 minut, odwracając rurkę pięć razy co minutę, a następnie umieść na lodzie na 20 minut.
    6. Wirować z maksymalną prędkością (np. 16 900 x g) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieść sklarowany osad do probówki wirówkowej i dodać równą objętość izopropanolu (około 750 μl), unikając unoszących się lipidów lub osadu. DNA znajduje się w supernatancie.
    8. Odwróć rurkę pięć razy, aby wymieszać. Wizualnie potwierdź obecność osadu DNA wytrącającego się w probówce wirówkowej.
    9. Wirować przy RT z maksymalną prędkością przez 10 min.
    10. Odrzucić supernatant. Przemyć osad DNA 500 μl 70% etanolu, pięciokrotnie odwracając probówkę wirówkową.
      UWAGA: Osad to DNA.
    11. Wirować przy RT z maksymalną prędkością (np. 16 900 x g) przez 10 minut.
    12. Ostrożnie usuń cały supernatant, pozostawiając osad DNA. Pozostaw pellet do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      UWAGA: Unikaj przesuszenia, ponieważ genomowe DNA może stać się trudne do rozpuszczenia.
    13. Zawiesić osad DNA w 475 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA). Delikatnie wymieszaj, stukając w spód tubki. W celu wytrawienia RNA podczas przygotowywania DNA dodać 25 μl 10 mg/ml RNazy A (końcowe stężenie 0,5 mg/ml) i mieszać, delikatnie stukając, aż do całkowitego rozpuszczenia się osadu DNA.
      UWAGA: Unikaj wirowania, aby zapobiec ścinaniu DNA.
    14. Inkubować próbkę DNA w temperaturze 4 °C przez noc.
    15. Przeprowadzić ekstrakcję fenolem o równej objętości: dodać 500 μl fenolu do probówki wirówkowej, delikatnie wymieszać pipetą i odwirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Narażenie na fenol może powodować podrażnienie skóry, oczu, nosa, gardła i układu nerwowego. Unikaj kontaktu z oczami, skórą i odzieżą. Nie spożywać ani nie wdychać. Stosować środki ochrony osobistej, w tym ochronę twarzy.
      UWAGA: DNA znajduje się w górnej fazie wodnej, białka są w interfazie, a faza organiczna znajduje się na dole.
    16. Powtórz trzy razy. Weź supernatant DNA (około 280 μl).
    17. W zależności od objętości próbki DNA dodać 1/10 objętości (28 μl) 3 M octanu sodu (stężenie końcowe 0,3 M, pH 5,2) i 2 objętości (616 μl) zimnego 100% etanolu. Umieścić probówkę wirówkową w temperaturze -80 °C na 2-3 godziny.
    18. Wirować z maksymalną prędkością (np. 16 900 x g) przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozmrozić roztwór na lodzie, jeśli jest zamrożony przed odwirowaniem.
    19. Wyrzucić supernatant i przemyć 3-4 razy 70% etanolem, odwracając probówkę wirówkową. Wirować z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    20. Usuń etanol i pozostaw granulki do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    21. Dodać 100 μl buforu TE, postukać w probówkę do wymieszania i pozostawić w temperaturze 4 °C na 2 godziny do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: Zbadaj integralność genomowego DNA na 1% żelu agarozowym (Rysunek 2B).
    22. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C w zamrażarce. Pozostanie stabilny przez co najmniej 1 rok.
  2. Wykonaj trawienie i modyfikację genomowego DNA.
    1. Pobrać 4 μg genomowego DNA i połączyć je z 1 μl CviAII (10 j.), 2 μl 10-krotnego buforu do wytrawiania (przepisy znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 1) i dodać wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 20 μL. Inkubować mieszaninę w temperaturze 25 °C przez 12 h.
      UWAGA: FatI może zastąpić CviAII, który jest obecnie wycofany przez NEB.
    2. Dodać 1 μl NdeI (20 j.), 1 μl MseI (10 j.) i 1 μl BfaI (10 j.) do tej samej probówki zawierającej poprzednią mieszaninę (20 μl). Dodać również 2 μl 10x buforu wytrawiającego i 15 μl wody, aby uzyskać całkowitą objętość 40 μl. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, a następnie inaktywować termicznie wszystkie enzymy w temperaturze 80 °C przez 20 min.
      UWAGA: Trawienie genomowego DNA można zbadać za pomocą metody Terminal Restriction Fragment (TRF) (Rysunek 2C). Połączenie czterech enzymów restrykcyjnych (CviAII, NdeI, MseI i BfaI) trawi genomowe DNA na fragmenty o wielkości około 800 pz i daje TRF przy minimalnym subtelomerowym zanieczyszczeniu DNA.
    3. Do modyfikacji digoksygeniny należy pobrać 40 μl strawionego genomowego DNA i dodać 4 μl 1 mM dATP (stężenie końcowe 0,08 mM), 4 μl 1 mM digoksygeniny-11-dUTP (stężenie końcowe 0,08 mM), 1 μl fragmentu Klenowa (5 U), 0,5 μl 100 mM DTT (stężenie końcowe 1 mM) i 1 μl 10x buforu wytrawiającego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin, a następnie ogrzewać w temperaturze 75 °C przez 20 minut w celu dezaktywacji fragmentu Klenowa.
    4. Do znakowania biotyny weź 12,5 μl genomowego DNA zmodyfikowanego digoksygeniną (1 μg) i dodaj 1 μl biotynylowanej sondy telomerowej 1 μM (tj. 1 pmol), które są komplementarne do telomerowego jednoniciowego zwisu. Dodać 611,5 μl buforu TE Li (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl), aby rozcieńczyć jony 50 mM K do 1 mM, uzyskując całkowitą objętość 625 μL, którą można podzielić na 16 probówek po 39 μl każda.
    5. Podgrzewać w temperaturze 75 °C przez 3 minuty w termocyklerze, a następnie zmniejszać temperaturę o 0,1 °C co 30 s, aż do osiągnięcia 25 °C.
    6. Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej rok.

4. Ustawianie komórki przepływowej dla próbki telomerowego DNA na pęsetie magnetycznej

  1. Wykonaj komórkę przepływową do testów jednocząsteczkowych.
    1. Za pomocą szlifierki elektrycznej wywiercić otwory jako wlot i wylot na górnych szkiełkach nakrywkowych (# 2 szkło nakrywkowe o grubości 0.2 mm).
    2. Szkiełka nakrywkowe czyścić w detergencie metodą sonikacji przez 30 minut.
    3. Umyj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą 3 razy.
    4. Szkiełka nakrywkowe należy czyścić w izopropanolu metodą sonikacji przez 30 minut.
    5. Umyj szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą 3 razy.
    6. Szkiełka nakrywkowe należy czyścić w ultraczystej czystości za pomocą sonikacji przez 15-30 minut.
    7. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe azotem.
      UWAGA: W tym miejscu można zatrzymać protokół, a oczyszczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać do późniejszego wykorzystania.
    8. Pokryj dolne szkiełka nakrywkowe (bez otworów) 20 μl 0,1% nitrocelulozy i dodaj kulki referencyjne (20x rozcieńczenie, średnica 3 μm). Piec w temperaturze 100 °C przez 4 minuty.
    9. Za pomocą skalpela wyciąć dwuwarstwowe przekładki parafilmowe zgodnie z metalową formą. Forma jest prostokątnym kawałkiem ze stopu aluminium o takich samych wymiarach jak szkiełko nakrywkowe, z wydrążonym środkiem ułatwiającym cięcie kanałów.
    10. Zmontuj kanapkę z komórką przepływową (Rysunek 3A). Podgrzej w temperaturze 85 °C i użyj dwóch wacików do masażu, aż parafilm uszczelni kanał.
    11. Pokryj komórkę przepływową przeciwciałem. Wstrzyknąć 70 μl przeciwciała anty-digoksygeniny (0,1 mg/ml) bezpośrednio do celi przepływowej. Pozostaw w RT na 1 godzinę.
    12. Pasywować komórkę przepływową. Wstrzyknąć 70 μl 10 mg/ml BSA w celu wyparcia przeciwciała anty-digoksygeniny. Wyjazd w RT na 12 godzin. Niezwiązane przeciwciała anty-digoksygeniny zostaną wypłukane w następujących krokach z rygorystycznym płukaniem.
      UWAGA: Przechowuj komorę przepływową w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.
    13. Przeprowadzić test na niespecyficzne wiązanie przez przepłukanie 5 μl przemytych kulek MyOne (10 mg/mL) (lub 5 μl przemytych kulek M270 (10 mg/ml)) bez DNA do komory przepływowej. Pozostaw na 10 minut, a następnie spłucz kulki za pomocą działającego buforu (20 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Policz liczbę koralików przyklejonych do powierzchni w jednym polu view. Dobrze obrobiona powierzchnia powinna pokazywać zero lub tylko kilka koralików.
  2. Wyizoluj i unieruchomij telomeryczne więzy DNA w komórce przepływowej.
    1. Weź 10 μl kulek M270 (10 mg/ml) lub 5 μl 10 mg/ml MyOne i przemyj je pięciokrotnie 50 μl buforu roboczego (20 mM HEPES [pH 7,5], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) za pomocą magnesu.
    2. Weź 500 ng strawionego genomowego DNA i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać wszystkie kulki (50 μl) na wierzch próbki DNA.
    3. Bez pipetowania delikatnie przesunąć kilka razy probówkę wirówkową, aby wymieszać kulki i próbkę DNA. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 1 godzinę. Przemyć 500 μl buforu roboczego trzykrotnie za pomocą magnesu, aby pociągnąć kulki w dół, w 10-minutowych odstępach między praniami.
    4. Zawiesić próbkę za pomocą 30 μl buforu roboczego i załadować mieszaninę do komory przepływowej. Pozostaw na 30 min. Płaskie niezwiązane koraliki magnetyczne.
      UWAGA: Telomerowe DNA jest uwiązane między dolnym szkiełkiem nakrywkowym a kulką magnetyczną poprzez interakcje powinowactwa, w których pośredniczy przeciwciało digoksygeniny i biotyna-streptawidyna (Figura 3B).
  3. Ustawianie komórki przepływowej na pęsetach magnetycznych
    1. Oczyść komorę przepływową 70% etanolem i osusz powierzchnię za pomocą chusteczki do soczewek. Umieść oczyszczoną celę przepływową na dolnym uchwycie na próbkę i delikatnie zamontuj górny stojak na próbki za pomocą śrubokręta.
    2. Nałóż kroplę oleju do soczewek na dolną powierzchnię komory przepływowej, gdzie wyrównuje się z soczewką obiektywu. Następnie umieść uchwyt na próbkę na soczewce obiektywu i zabezpiecz go śrubokrętem.
    3. Wybierz parę magnesów sześciennych o średnicy 5 mm ułożonych w konfiguracji pionowej. Wyrównaj uchwyt magnesu z osią X ścieżki światła pęsety magnetycznej w celu obrazowania.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Kierunek pola magnetycznego jest wyrównany, a tym samym określany przez orientację uchwytu magnesu.
    4. Uruchom graficzne oprogramowanie do programowania i podłącz sterowniki pęsety magnetycznej. Dostosuj pole view, aby zlokalizować koralik odniesienia na dole komory przepływowej i nieznacznie wyreguluj soczewkę obiektywu, tak aby koralik odniesienia pokazywał wyraźne pierścienie dyfrakcyjne.
    5. Przesuń magnesy w dół na górę komory przepływowej.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Nagłe zmiany we wzorze dyfrakcji perełkowej wskazują, że magnesy właśnie dotknęły powierzchni komory przepływowej. Ta pozycja jest uważana za przesunięcie punktu zerowego pomiaru.
      UWAGA: Ostrożnie opuść magnesy, zaczynając od większych stopni i stopniowo przechodząc do mniejszych. Poruszaj się w krokach co 0,1 mm, aby uniknąć uszkodzenia komory przepływowej podczas zbliżania się do komory przepływowej.
    6. Podnieś magnesy do najwyższej pozycji i wyjmij uchwyt magnesu.
    7. Włącz pompę perystaltyczną podłączoną do butelki na odpady i wylej płyn. Dodać 100 μl buforu roboczego do wlotu i ustawić natężenie przepływu pompy perystaltycznej na 100 μl/min, aby napełnić komorę przepływową buforem.

5. Pomiary telomeru za pomocą pęsety magnetycznej jednocząsteczkowej

  1. Skonfiguruj kamerę.
    1. Ustaw skalę szarości kamery z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (CMOS) z regulacją jasności na 150 poziomów.
    2. Zdefiniuj rozmiar obszaru zainteresowania (ROI).
    3. Ustaw częstotliwość odświeżania na 200 Hz z czasem naświetlania 5000 μs.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Upewnij się, że czas martwy migawki jest ustawiony na zero.
    4. Przesuń pozycję magnesu na 3 cm (około 8 pN) i wyreguluj ostrość obiektywu na koralikach.
  2. Ustanów tabelę przeglądową (LUT).
    1. Przesuń magnesy do pozycji odpowiadającej 8 pN, aby mocno rozciągnąć koralik magnetyczny na uwięzi DNA.
    2. Ustaw LUT na 200 kroków z rozmiarem kroku 0,05 μm.
    3. Użyj kamery CMOS, aby uchwycić profile kulek magnetycznych w różnych pozycjach, aby ustalić LUT.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Kulki polistyrenowe zamocowane w komorze przepływowej służą jako kulki referencyjne w celu wyeliminowania dryftu dla interesujących kulek.
  3. Zaprojektuj eksperyment mechaniczny z pojedynczą cząsteczką.
    1. Napisz skrypt w MATLAB, aby kontrolować ruchy motoryczne dla testów rampy siły lub skoku siły.
      UWAGA: Jest to krytyczny krok. Ten skrypt koduje polecenia dotyczące ruchów magnesu. Szybkość obciążenia siłą jest ustawiana na tym etapie dla testu z rampą siły. Poziomy i czas trwania testów skoku siły są również określone tutaj (Rysunek 4, Plik uzupełniający 1, Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3).
    2. Zaimportuj skrypt do graficznego oprogramowania programistycznego, aby przetestować eksperymenty z pojedynczą cząsteczką.
    3. Sprawdź łączną liczbę klatek wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu z pojedynczą cząsteczką i upewnij się, że dostępna pamięć przekracza to wymaganie.
      UWAGA: Dane zostaną utracone, jeśli przydzielona pamięć będzie mniejsza niż wymagana, ponieważ zapisywanie danych zajmuje dużo czasu.
    4. Sprawdź maksymalną prędkość obrazowania, aby określić maksymalną liczbę kulek, które można monitorować jednocześnie.
      UWAGA: Eksperyment zostanie przerwany, jeśli zostanie przekroczony limit prędkości obrazowania.
    5. Używając jako przykładu testu skoku siły, uruchom eksperyment mechaniczny z pojedynczą cząsteczką. Siły są gwałtownie przykładane do kulki magnetycznej, która przenosi te siły na cząsteczkę DNA, natychmiast rozciągając ją w górę.

6. Pomiary TRF1/2 na telomorze za pomocą pęsety magnetycznej

  1. Test narastania siły
    1. Na przykładzie TRF1 załaduj 200 μl 10 nM TRF1 do komory przepływowej z wolnym natężeniem przepływu (np. 30 μL/min). Odczekaj 30 minut, aby TRF1 związał się z telomerowym DNA.
    2. Wybierz skrypt do eksperymentu z rampą siły ze współczynnikiem obciążenia ±1 pN/s.
    3. Nazwij odpowiednio pliki danych i uruchom eksperyment. Dane zostaną zapisane w określonym miejscu docelowym do analizy (Rysunek 5).
      UWAGA: Podczas tego eksperymentu siła jest liniowo zwiększana i zmniejszana w zakresie od 0 pN do 17 pN, co rozciąga i rozluźnia telomerowe DNA oraz przerywa pętle DNA, w których pośredniczy TRF1/2.
  2. Test Force Jump
    1. Wybierz skrypt, aby uruchomić test skoku siły.
      UWAGA: Do rozciągnięcia telomerowego DNA przykładane są różne siły, na przykład "Siła spoczynkowa" (Frest) przy 0 pN przez 40 s, "Siła testowa" (Ftest) w zakresie od 2 do 8 pN przez 60 s, "Duża siła" (Fhigh) przy 10 pN przez 30 s i "Maksymalna siła" (Fmax) przy 20 pN przez 30 s.
    2. Nazwij odpowiednio pliki danych i uruchom eksperyment. Dane zostaną zapisane w określonym miejscu docelowym do analizy (Rysunek 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1A ilustruje schematyczne domeny i struktury TRF1 i TRF2, składające się odpowiednio z 439 i 542 aminokwasów, które mogą być wyrażane w komórkach prokariotycznych. Przygotowanie TRF1 zostało już wcześniej opisane w literaturze41. W tym miejscu przedstawiamy wyczerpujący opis i reprezentatywne wyniki preparatu TRF2. Rysunek 1B pokazuje mapę plazmidu używaną do ekspresji TRF2 w E. coli. Oceniliśmy ekspresję TRF2 przed i po indukcji u E. coli, jak pokazano na Rysunek 1B. Procesy oczyszczania i rozszczepiania znaczników zostały również przeanalizowane za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 1C). Zgodnie z tym protokołem, oba telomerowe białka wiążące, TRF1 i TRF2, zostały z powodzeniem wyrażone w E. coli.

Telomerowe DNA, w postaci końcowych fragmentów restrykcyjnych (TRF), jest generowane z ludzkich genomów przy użyciu kombinacji czterech enzymów restrykcyjnych. Postępując zgodnie ze schematem blokowym pokazanym w Rysunek 2A, wyodrębniliśmy genomy z ludzkich komórek. Enzymy selektywnie trawią genomowe DNA, pozostawiając nienaruszone telomerowe DNA o pełnej długości, dostarczając w ten sposób materiału do testów jednocząsteczkowych. Przeprowadziliśmy szeroko zakrojone testy preparatu TRF DNA przy użyciu różnych linii komórek ludzkich. Integralność genomowego DNA zbadano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, jak pokazano na rysunku Rysunek 2B. TRF zostały następnie przeanalizowane za pomocą Southern bloting, przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji powtórzeń telomerowych TTAGGG (Rysunek 2C), zgodnie z metodą opisaną gdzie indziej41,56. Średnio długość ludzkich TRF wynosi około kilku kilozasad.

Testy pojedynczych cząsteczek odbywają się w komórce przepływowej złożonej zgodnie z opisem w Rysunek 3A. Powłoka nitrocelulozowa pokrywa ujemnie naładowaną powierzchnię szkła, zapewniając hydrofilową matrycę do adsorpcji przeciwciał. Pasywacja BSA blokuje obszary matrycy nitrocelulozowej, które nie są związane przez przeciwciała anty-digoksygeninowe. Koraliki polistyrenowe, które nie zawierają nanocząsteczek żelaza, służą jako kulki referencyjne. Pęta TRF powstają w wyniku oddziaływań powinowactwa między przeciwciałem digoksygeniny na matrycy nitrocelulozowej a biotyną-streptawidyną na powierzchni kulki magnetycznej (Rysunek 3B). TRF1 lub TRF2 są wprowadzane do komórki przepływowej, wiążąc się z pętami DNA TRF poprzez swobodną dyfuzję. Pęseta magnetyczna służy do modulowania pola magnetycznego, generując siły działające na kulki magnetyczne w celu rozciągnięcia i rozluźnienia uwięzi TRF, umożliwiając w ten sposób sondowanie interakcji białko-DNA.

Jednocząsteczkowy test mechaniczny jest projektowany poprzez opracowanie skryptu do kontrolowania ruchów silników pęsety magnetycznej. Schemat blokowy zapewnia ustrukturyzowane podejście do tworzenia tego skryptu w MatLab dla testu pojedynczej cząsteczki przy użyciu pęsety magnetycznej (Rysunek 4A). Magnesy poruszają się wzdłuż osi z w zakresie 0-25 mm. Siły są obliczane na podstawie położenia magnesu, zgodnie z konfiguracją magnesu, przy użyciu równań opisanych w literaturze54. Dla określonej szybkości obciążenia siłą, pozycje magnesu i prędkości ruchu są projektowane i programowane w MatLab tak, aby osiągnąć pożądany profil manipulacji siłą, jak pokazano w przykładzie testu rampy siły (Rysunek 4B-D).

Używając TRF1 jako przykładu, badaliśmy telomeryczne interakcje DNA-białko za pomocą jednocząsteczkowych pęset magnetycznych. Układ eksperymentalny można skonfigurować jako test narastania siły, jak pokazano na Rysunek 5A, gdzie krzywe siły-wydłużenia wykazują cechy zygzakowate podczas rozciągania z powodu zerwania interakcji białko-DNA i gładkie ślady podczas relaksacji, odzwierciedlając włókno DNA bez pętli za pośrednictwem białka. Konfiguracja może być również skonfigurowana jako test skoku siły, jak pokazano w Rysunek 5B,C, co pozwala nam mierzyć zmiany w rozciągłości i czasie trwania interakcji białko-DNA pod wpływem określonych sił. Kinetykę dysocjacji telomerowych kompleksów DNA-białko można wyprowadzić z tych pomiarów (Rysunek 5D). Dodatkowo, tworzenie pętli w kompleksach DNA-białko może być ujawnione przez zmiany w rozciągłości (Ryc. 5E). Co więcej, stężenie białka można miareczkować w tej eksperymentalnej konfiguracji telomerowego DNA. Co więcej, niejednorodność długości telomerowego DNA z komórek ludzkich pozwala nam zbadać mechanizm tworzenia pętli w telomerach o różnej długości (Rysunek 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Wyrażenie i oczyszczanie TRF1/2. (A) Architektura domeny TRF1 i TRF2. (B) Mapa plazmidowa pET28a-SUMO-TRF2 do ekspresji TRF2 w E. coli. (C) Analiza SDS-PAGE próbek otrzymanych na różnych etapach wyrażania i oczyszczania. Tor 1: Niewywołany przez IPTG. Tor 2: Osad indukowany przez IPTG uzyskany w procesie lizy komórek. Tor 3: Supernatant indukowany IPTG otrzymany po lizie komórek. Tor 4: Przepływ przez kolumnę Ni. Tor 5: Przemyć buforem o niskiej zawartości imidazolu w celu usunięcia zanieczyszczeń białkowych. Tor 6: Elucja 6xHis-SUMO-TRF2 z buforem zawierającym 300 mM imidazolu. Tor 7: Trawienie znaczników SUMO przez enzym proteazę SUMO. Tor 8: Ponowne oczyszczanie za pomocą kolumny Ni i elucja TRF2 (usunięto znaczniki 6xHis i SUMO) z buforem zawierającym 20 mM imidazolu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przygotowanie końcowych fragmentów restrykcyjnych (TRF). (A) Schemat blokowy do przygotowania TRF z komórek ludzkich. (B) Badanie integralności genomowego DNA przy użyciu 1% żelu agarozowego dla 5 linii komórek ludzkich. (C) Analiza TRF przeprowadzona metodą Southern blotting dla 5 ludzkich linii komórkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przygotowanie jednocząsteczkowych testów mechanicznych. (A) Schemat blokowy przedstawiający przygotowanie komórki przepływowej do jednocząsteczkowych testów mechanicznych. (B) Schematyczne przedstawienie jednocząsteczkowych testów mechanicznych za pomocą pęsety magnetycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Projekt testu mechanicznego dla pojedynczej cząsteczki. (A) Schemat blokowy do generowania skryptu do wykonania testu narastania siły. (B) Profil ruchu magnesów wzdłuż osi z. (C) Profil siły odpowiadający ruchowi magnesu. (D) Korelacja między położeniem magnesu a wynikającymi z niego siłami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Telomeryczne interakcje DNA-białko badane za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej. (A) Interakcje TRF1-telomery badano w testach rampy siły (N = 10) w buforze zawierającym 20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA i 100 mM NaCl w temperaturze 23 °C. Stężenie TRF1 wynosiło 10 nM, przy natężeniu obciążenia siłą ±1 pN/s. (B) Uwięź TRF była rozciągana i rozluźniana w testach skoku siły. Protokół zastosowanej siły wynosił Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN i Fmax = 20 pN. Warunki buforowe i temperaturowe były takie same jak w (A). Liczba klatek na sekundę = 200 Hz. (C) Interakcje TRF1-telomery badano w testach skoku siły ze stężeniem TRF1 wynoszącym 10 nM. (D) Kinetyka dysocjacji kompleksów TRF1-telomerów. Logarytm szybkości dysocjacji przy badanych siłach (średnia ± SD, n = 206) jest zgodny z modelem Kramera-Bella-Evansa (czerwona krzywa i równanie legendy). Wstawka pokazuje średni czas dysocjacji (<τ>) w Ftest. (E) Rozkład zmian rozciągłości (ΔL) po zerwaniu kompleksów TRF1-telomerów. Czarne i czerwone krzywe reprezentują łączniki Gaussa. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Li et al.41. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Liczba i rozmiary pętli DNA utworzonych przez TRF1 w telomerze. (A) Zależność długości telomerów od rozmiarów pętli DNA (ΔL) przy [TRF1] = 20 nM. Krzywe reprezentują łączniki Gaussa. (B) Zależność długości telomerów od ΔL przy [TRF1] = 40 nM. (C) Korelacja między ΔL a liczbą przypadków pęknięcia na telomer, N. Korelacja zerowego rzędu wynosi r = -0,20, przy czym p < 0,001 (wielkość próby = 1496). (D) Rysunek ilustrujący możliwy mechanizm wyjaśniający ujemną korelację między ΔL i N, sugerujący, że TRF1 może skompresować pojedynczy telomer z pierwotnymi domenami pętli w topologię wyższego rzędu. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Li et al.41. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kod MatLab do generowania skryptów.m Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Skrypt dla assay.txt o stałej sile. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Skrypt dla assay.txt rampy siłowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Przepisy Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wykorzystuje pęsetę magnetyczną do manipulacji TRF na poziomie pojedynczej cząsteczki 57,58,59. Wykorzystujemy kulki magnetyczne do oddzielania TRF od fragmentów genomowego DNA. Po trawieniu restrykcyjnym TRF wiążą się z kulkami magnetycznymi, umożliwiając ich łatwe oddzielenie od fragmentów genomowego DNA. Takie podejście pozwala na manipulację za pomocą pęsety magnetycznej, która może skutecznie zatrzymywać kulki magnetyczne, w przeciwieństwie do pęsety optycznej, która jest ograniczona przez problemy z przezroczystością. Co więcej, chociaż AFM może być używany do manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, wymagane są dodatkowe kroki, aby oddzielić TRF od kulek magnetycznych i unieruchomić je między powierzchnią miki a końcówką wspornikową. W przeciwieństwie do tego, pęseta magnetyczna oferuje prostszą i wydajniejszą metodę manipulacji pojedynczymi cząsteczkami TRF, eliminując potrzebę wykonywania tych dodatkowych kroków41.

Utrzymanie integralności genomowego DNA i TRF ma kluczowe znaczenie, ponieważ manipulacja pojedynczymi cząsteczkami zależy od nienaruszonych TRF. Za pomocą pęsety magnetycznej rozciągamy i rozluźniamy TRF, przytrzymując ich dwa końce, aby zbadać interakcje białko-DNA. Dokładny pomiar siły na kulkach magnetycznych ma fundamentalne znaczenie dla testów mechanicznych pojedynczych cząsteczek54. W związku z tym magnesy w kształcie sześciennym powinny być ustawione równolegle lub prostopadle do ścieżki światła kamery w pęsetach magnetycznych (UWAGA poniżej kroku 4.3.3), zapewniając precyzyjny trójwymiarowy zapis pozycji koralików zgodnie z ustalonymi równaniami54,60. Przesunięcie magnesu ma kluczowe znaczenie dla określenia ich położenia i wynikających z nich sił działających na kulki magnetyczne. Używamy szkła nakrywkowego #2 o grubości około 0,2 mm w celu uzyskania spójności lub dostosowujemy przesunięcie w równaniu dla różnych szkieł nakrywkowych54. Liczba klatek na sekundę ma kluczowe znaczenie dla uchwycenia dynamiki interakcji białko-DNA, co wymaga zerowego czasu martwego migawki dla pełnych danych o ruchu kulek. Ruchy motoryczne, kodowane przez skrypt, mają kluczowe znaczenie dla projektowania jednocząsteczkowych testów mechanicznych. Parametry krytyczne, takie jak szybkość obciążenia siłą, siły i czas trwania, powinny być ustawiane i optymalizowane iteracyjnie. Stężenia białek stosowane w testach jednocząsteczkowych wymagają intensywnego miareczkowania w celu określenia optymalnego poziomu do badania interakcji białko-DNA. Początkowe testy siły można przeprowadzić za pomocą testów narastania siły ze spektroskopią sił, podczas gdy testy skoku siły oceniają siły będące przedmiotem zainteresowania na stałym poziomie.

Podczas adaptacji tego protokołu można napotkać kilka wyzwań. Jeśli TRF1 lub TRF2 nie ulega ekspresji w E. coli, zacznij od badania na małą skalę, lizy komórek i analizuj białka za pomocą SDS-PAGE i barwienia, potwierdzając Western Blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla tagu. Należy zweryfikować konstrukt i plazmid, aby zapewnić prawidłowe klonowanie bez mutacji, przesunięć ramki odczytu lub przedwczesnych kodonów stop, a także sprawdzić przydatność promotora dla E. coli. Ekspresja powinna być zoptymalizowana poprzez testowanie różnych szczepów E. coli (np. BL21(DE3), Rosetta), dostosowanie temperatury wzrostu (15-25 °C), czasu indukcji (2-16 godzin) i stężenia IPTG (0,1-1 mM). Ciałami inkluzyjnymi należy się zająć, analizując osady komórkowe przed i po sonikacji. Należy zająć się stronniczością kodonów ze szczepami dostarczającymi rzadkie tRNA lub optymalizacją kodonów. Wypróbuj różne podłoża wzrostowe (LB, TB, autoindukcja) i popraw napowietrzenie, dostosowując prędkość wytrząsania i objętość hodowli. W przypadku problemów z toksycznością należy użyć ściśle regulowanych promotorów lub wektorów o niższej liczbie kopii i dodać glukozę (0,2%), aby stłumić nieszczelną ekspresję promotora lac. Utrzymuj integralność plazmidu dzięki odpowiedniemu doborowi antybiotyków i zapewnij całkowite uwalnianie białka poprzez optymalizację metody lizy komórek61,62.

Jeśli w testach jednocząsteczkowych nie zostaną znalezione uwięzi TRF, jedną z możliwości jest to, że nie użyto wystarczającej ilości początkowego genomowego DNA. Spróbuj użyć 500 ng odpowiednika TRF genomowego DNA, aby skonfigurować test mechaniczny pojedynczej cząsteczki. Uporczywe problemy ze znalezieniem uwięzi TRF w pęsetach magnetycznych mogą wynikać ze zbyt długiego czasu trawienia genomowego DNA. Utrzymuj procedurę trawienia poniżej 12 godzin, aby uniknąć aktywności gwiazdy. Dodatkowo, tworzenie G-kwadrupleksów na jednoniciowym zwisie telomerowego DNA może hamować wyżarzanie oligonukleotydów znakowanych biotyną w celu wiązania się z kulkami magnetycznymi. Aby temu zapobiec, utrzymuj stężenie jonów potasu lub sodu poniżej 1 mM, aby uniknąć tworzenia się G-quadruplex i zwiększyć prawdopodobieństwo tworzenia się uwięzi TRF w układzie jednocząsteczkowym. Dodatkowo, zwiększenie temperatury ogrzewania na etapie wyżarzania (krok 3.2.5) pomaga destabilizować G-kwadrupleksy i ułatwia wiązanie oligonukleotydów znakowanych biotyną z TRF.

W obecności białek TRF1 lub TRF2 uwięzi DNA TRF mogą stać się mocno zagęszczone i zbyt trudne do rozciągnięcia w pęsetach magnetycznych ze względu na obfitość miejsc wiązania tych białek na telomerach. Miareczkowanie stężeń białek może pomóc w określeniu optymalnych poziomów dla jednocząsteczkowych testów mechanicznych. Powinowactwo wiązania białko-DNA można ocenić za pomocą testów EMSA lub SPR w celu określenia stałej dysocjacji (Kd), która może następnie informować o odpowiednich stężeniach do testów jednocząsteczkowych.

Ograniczona ilość TRF generowanych z genomowego DNA może ograniczać skuteczność testów jednocząsteczkowych. W związku z tym zbieranie danych o pojedynczych cząsteczkach może zająć więcej czasu w porównaniu z użyciem sztucznie zsyntetyzowanych konstruktów telomerowego DNA. Jednak stosowanie telomerów pochodzących bezpośrednio z ludzkiego genomu zapewnia kilka korzyści, których sztuczne telomerowe DNA, powszechnie wytwarzane przez plazmid w bakteriach lub metodach PCR, nie może zaoferować. Jedną z zalet jest to, że ludzkie TRF są niejednorodne pod względem długości, co pozwala na badanie zależności długości telomerów w interakcjach białko-DNA. W przeciwieństwie do tego, sztuczne telomeryczne DNA ma zwykle jednolitą długość, a generowanie sztucznego telomerycznego DNA o różnych długościach byłoby czasochłonne i pracochłonne. Ponadto ludzkie TRF zawierają oryginalne sekwencje komórek, w tym naturalne markery, takie jak modyfikacje, mutacje i uszkodzenia. Pozwala to na badanie oddziaływań białko-DNA w warunkach fizjologicznych lub patologicznych, co nie jest możliwe w przypadku sztucznego telomerowego DNA.

Protokół ten jest niezbędny do badań w dziedzinie biologii telomerów na poziomie pojedynczej cząsteczki i może potencjalnie przynieść korzyści w odkrywaniu leków ukierunkowanych na telomery.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [Grant 32071227 dla Z.Y.], Tianjin Municipal Natural Science Foundation of China (22JCYBJC01070 do Z.Y.) oraz State Key Laboratory of Precision Measuring Technology and Instruments (Uniwersytet w Tianjin) [Grant pilab2210 dla Z.Y.].

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anty-digoxigenininRoche11214667001
BfaINew England Biolab (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
kamera CMOS MikrotronMC1362
CviAIINew England Biolab (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
Roztwór do ekstrakcji DNAG-CLONEEX0108
Dnaza I, bez rnazy, Hc EaThermo Fisher ScientificEN0523
mieszanina dNTPNanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Koraliki Dynabeads M-270  koralikiThermo Fisher Scientific65305Koraliki Streptawidyny
Koraliki Dynabeads MyOneThermo Fisher Scientific65001Koraliki Streptawidyny
EtanolTianjin No.6 Fabryka odczynników chemicznych1083
GlicerolPekin Hwrkchemical Współ. LtdSMG66258-1
ImidazolSolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
IsopropanolTianjin No.6 Fabryka odczynników chemicznychA1079
KanamycinThermo Fisher ScientificEN0523
Fragment Klenowa (3′-5′ exo-)New England Biolab (NEB)M0212S
LabViewNational Instrumentshttps://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.htmlOprogramowanie do programowania graficznego 
LiClBide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)BD136449
LysozymeSolarbioL8120-5
MseINew England Biolab (NEB)R0525S
NaClShanghai AladdinC111533
NaukowyspektrofotometrNanoDrop Thermo Fisher
NdeINew England Biolab (NEB)R0111S
Ni NTA Koraliki 6FFChangzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., LtdSA005025
Membrana nitrocelulozowaABklonalnaRM02801
PMSFSolarbioP8340
Proteinaza KBeyotime Biotech Inc (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart BufferNew England Biolab (NEB)B6004S
Rnase ASigma-AldrichR4875
Octan soduSERVA Electrophoresis GmbH2124902
Proteaza SumoBeyotime Biotech Inc (beyotime)P2312M

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
  2. Li, N., et al. The dynamics of forming a triplex in an artificial telomere inferred by DNA mechanics. Nucleic Acids Res. 47 (15), e86(2019).
  3. Yu, Z., et al. Click chemistry assisted single-molecule fingerprinting reveals a 3d biomolecular folding funnel. J Am Chem Soc. 134 (30), 12338-12341 (2012).
  4. Karimian, K., et al. Human telomere length is chromosome end-specific and conserved across individuals. Science. 384 (6695), 533-539 (2024).
  5. Maciejowski, J., De Lange, T. Telomeres in cancer: Tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (3), 175-186 (2017).
  6. Kinzig, C. G., Zakusilo, G., Takai, K. K., Myler, L. R., De Lange, T. Atr blocks telomerase from converting DNA breaks into telomeres. Science. 383 (6684), 763-770 (2024).
  7. Takai, H., Aria, V., Borges, P., Yeeles, J. T. P., De Lange, T. Cst-polymerase α-primase solves a second telomere end-replication problem. Nature. 627 (8004), 664-670 (2024).
  8. De Lange, T. How telomeres solve the end-protection problem. Science. 326 (5955), 948-952 (2009).
  9. De Lange, T. Shelterin-mediated telomere protection. Annual Review of Genetics. 52 (1), 223-247 (2018).
  10. Liu, B., et al. Structure of active human telomerase with telomere shelterin protein TPP1. Nature. 604 (7906), 578-583 (2022).
  11. Sfeir, A., De Lange, T. Removal of shelterin reveals the telomere end-protection problem. Science. 336 (6081), 593-597 (2012).
  12. Sarek, G., et al. Cdk phosphorylation of trf2 controls t-loop dynamics during the cell cycle. Nature. 575 (7783), 523-527 (2019).
  13. Myler, L. R., et al. DNA-PK and the TRF2 IDDR inhibit MRN-initiated resection at leading-end telomeres. Nat Struct Mol Biol. 30 (9), 1346-1356 (2023).
  14. Hanaoka, S., Nagadoi, A., Nishimura, Y. Comparison between TRF2 and TRF1 of their telomeric DNA-bound structures and DNA-binding activities. Protein Sci. 14 (1), 119-130 (2005).
  15. Chen, Y., et al. A shared docking motif in TRF1 and TRF2 used for differential recruitment of telomeric proteins. Science. 319 (5866), 1092-1096 (2008).
  16. Wan, B., et al. SLX4 assembles a telomere maintenance toolkit by bridging multiple endonucleases with telomeres. Cell Reports. 4 (5), 861-869 (2013).
  17. Rai, R., et al. NBS1 phosphorylation status dictates repair choice of dysfunctional telomeres. Molecular Cell. 65 (5), 801-817.e4 (2017).
  18. Benarroch-Popivker, D., et al. Trf2-mediated control of telomere DNA topology as a mechanism for chromosome-end protection. Mol Cell. 61 (2), 274-286 (2016).
  19. Poulet, A., et al. The n-terminal domains of TRF1 and TRF2 regulate their ability to condense telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 40 (6), 2566-2576 (2012).
  20. Schmutz, I., Timashev, L., Xie, W., Patel, D. J., De Lange, T. TRF2 binds branched DNA to safeguard telomere integrity. Nat Struct Mol Biol. 24 (9), 734-742 (2017).
  21. Doksani, Y., Wu, J. Y., De Lange, T., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence imaging of telomeres reveals TRF2-dependent t-loop formation. Cell. 155 (2), 345-356 (2013).
  22. Di Maro, S., et al. Shading the TRF2 recruiting function: A new horizon in drug development. J Am Chem Soc. 136 (48), 16708-16711 (2014).
  23. Gao, J., Pickett, H. A. Targeting telomeres: Advances in telomere maintenance mechanism-specific cancer therapies. Nat Rev Cancer. 22 (9), 515-532 (2022).
  24. Bejarano, L., et al. Inhibition of TRF1 telomere protein impairs tumor initiation and progression in glioblastoma mouse models and patient-derived xenografts. Cancer Cell. 32 (5), 590-607.e4 (2017).
  25. Chen, X., et al. Cyclic peptidic mimetics of apollo peptides targeting telomeric repeat binding factor 2 (TRF2) and apollo interaction. ACS Med Chem Lett. 9 (5), 507-511 (2018).
  26. Erdel, F., et al. Telomere recognition and assembly mechanism of mammalian shelterin. Cell Rep. 18 (1), 41-53 (2017).
  27. Pendlebury, D. F., et al. Dissecting the telomere-inner nuclear membrane interface formed in meiosis. Nat Struct Mol Biol. 24 (12), 1064-1072 (2017).
  28. Court, R., Chapman, L., Fairall, L., Rhodes, D. How the human telomeric proteins trf1 and trf2 recognize telomeric DNA: A view from high-resolution crystal structures. EMBO Rep. 6 (1), 39-45 (2005).
  29. Hu, H., et al. Structural basis of telomeric nucleosome recognition by shelterin factor trf1. Sci Adv. 9 (34), eadi4148(2023).
  30. Nurk, S., et al. The complete sequence of a human genome. Science. 376 (6588), 44-53 (2022).
  31. Rhie, A., et al. The complete sequence of a human y chromosome. Nature. 621 (7978), 344-354 (2023).
  32. Chang, T. R., Long, X., Shastry, S., Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule mechanical analysis of strand invasion in human telomere DNA. Biochemistry. 61 (15), 1554-1560 (2022).
  33. Kaur, P., et al. TIN2 is an architectural protein that facilitates TRF2-mediated trans- and cis-interactions on telomeric DNA. Nucleic Acids Res. 49 (22), 13000-13018 (2021).
  34. Parks, J. W., Stone, M. D. Single-molecule studies of telomeres and telomerase. Annu Rev Biophys. 46, 357-377 (2017).
  35. Zhao, X., et al. Exploring TRF2-dependent DNA distortion through single-DNA manipulation studies. Commun Biol. 7 (1), 148(2024).
  36. Patrick, E. M., Slivka, J. D., Payne, B., Comstock, M. J., Schmidt, J. C. Observation of processive telomerase catalysis using high-resolution optical tweezers. Nat Chem Biol. 16 (7), 801-809 (2020).
  37. Soman, A., et al. Columnar structure of human telomeric chromatin. Nature. 609 (7929), 1048-1055 (2022).
  38. Jansson, L. I., et al. Telomere DNA G-quadruplex folding within actively extending human telomerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (19), 9350-9359 (2019).
  39. Soranno, A., et al. Shelterin components modulate nucleic acids condensation and phase separation in the context of telomeric DNA. J Mol Biol. 434 (16), 167685(2022).
  40. Wong, S. Y., et al. The shelterin component TRF2 mediates columnar stacking of human telomeric chromatin. EMBO J. 43 (1), 87-111 (2024).
  41. Li, X., et al. Dynamics of TRF1 organizing a single human telomere. Nucleic Acids Res. 49 (2), 760-775 (2021).
  42. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers. J Vis Exp. (127), e56328(2017).
  43. Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for the measurement of twist and torque. J Vis Exp. (87), e51503(2014).
  44. Ma, K., et al. A DNA force circuit for exploring protein-protein interactions at the single-molecule level. Chinese Journal of Chemistry. 42 (13), 1456-1464 (2024).
  45. LB liquid medium. Cold Spring Harb Protoc. 2016 (9), (2016).
  46. LB agar plates. Cold Spring Harb Protoc. 2024 (4), (2024).
  47. HEPES buffer. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
  48. SDS-PAGE gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), (2015).
  49. 10x PBS. Cold Spring Harb Protoc. 2007 (4), (2007).
  50. TE buffer (1x). Cold Spring Harb Protoc. 2016 (5), (2016).
  51. Green, M. R., Sambrook, J. Buffers. Cold Spring Harb Protoc. 2018 (2), (2018).
  52. Tris buffer (1 M, pH 7.5). Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), (2011).
  53. EDTA. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  54. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Rev Sci Instrum. 85 (12), 123114(2014).
  55. Wang, Z., et al. Reading time and DNA sequence preference of TET3 CXXC domain revealed by single-molecule profiling. Chinese J Chem. 41 (10), 1177-1184 (2023).
  56. Kimura, M., et al. Measurement of telomere length by the southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths. Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).
  57. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: Calibration and applications for DNA dynamics. Biophys J. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  58. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophys J. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  59. Te Velthuis, A. J., Kerssemakers, J. W., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophys J. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  60. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Rev Sci Instrum. 85 (10), 103712(2014).
  61. Green, M. R., Sambrook, J. Cloning and transformation with plasmid vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2021 (11), (2021).
  62. Haneskog, L. Purification of histidine-tagged proteins using stepwise elution with imidazole. Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telomeric Protein DNAMagnetic TweezersSingle Molecule MethodsTRF2 PurificationTelomeric DNA PreparationShelterin ComplexForce Ramp AssayDNA Protein InteractionsDissociation KineticsSouthern Blotting

Related Articles