Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Podsumowanie

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Streszczenie

Wirus związany z adenowirusem (AAV) to niepatogenny wirus używany jako nośnik do transferu genów terapeutycznych do pacjentów. Dokładna kwantyfikacja liczby kopii genomu AAV w preparatach wektorowych jest niezbędna do optymalizacji procesów biologicznych i obliczania dawek zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych produktów terapii genowej opartej na AAV. Obecnie brakuje wspólnego protokołu miareczkowania genomu wirusa AAV. W tym miejscu przedstawiamy cyfrowy protokół kropelkowego PCR (dd_PCR) do oznaczania ilościowego genomów wirusów w oczyszczonych próbkach wektorowych. Próbki są poddawane działaniu DNazy I w celu wyeliminowania nieopakowanego zanieczyszczenia DNA. Próbki poddane działaniu DNazy są następnie mieszane z odpowiednim zestawem starter-sonda (zaprojektowanym zgodnie z docelowym genomem AAV) i odczynnikami PCR, a następnie ładowane do generatora kropel. Przygotowane kropelki przenosi się na płytkę PCR, gdzie przeprowadzana jest i analizowana amplifikacja PCR. Miano genomu wirusa oblicza się na podstawie stężenia (kopii/μl), z uwzględnieniem rozcieńczeń próbki. Udany pomiar wykazuje wyraźne oddzielenie dodatnich i ujemnych chmur kropel, ma co najmniej 10 000 zaakceptowanych kropel, wykazuje wartość od 10 kopii/μl do 10 000 kopii/μl, a współczynnik zmienności (CV) między powtórzeniami jest mniejszy niż 20%. Wiarygodne miareczkowanie genomu wirusa pomoże w opracowaniu bezpiecznych i skutecznych produktów terapii genowej opartej na AAV.

Wprowadzenie

Terapia genowa jest powszechnie stosowaną metodą terapeutyczną w leczeniu zaburzeń genetycznych. Konstrukcja danej terapii genowej jest specyficzna dla powiązanej patologii wskazania docelowego, ale wszystkie terapie genowe obejmują wewnątrzkomórkowe dostarczanie materiału genetycznego do komórek docelowych w celu wywołania efektu terapeutycznego¹. Terapię genową można dalej podzielić na kilka kategorii, w tym wymianę genów w przypadku mutacji powodujących utratę funkcji, wyciszanie genów w przypadku nieprawidłowości związanych z przyrostem funkcji oraz techniki edycji genów. Niezależnie od zastosowanej konkretnej strategii, terapeutyczny materiał kwasu nukleinowego (określany jako transgen) musi być upakowany w wektor, aby osiągnąć ukierunkowane dostarczanie wewnątrzkomórkowe².

Chociaż do rozwoju terapii genowej dostępne są różne systemy wektorów wirusowych i niewirusowych, często wybierane są wirusy związane z adenowirusami (AAV) ze względu na szeroki tropizm wirusowy i niską immunogenność związaną z tą grupą wirusów^1,2. Do tej pory siedem terapii genowych wykorzystujących AAV do terapeutycznego dostarczania genów uzyskało zgodę Europejskiej Agencji Leków (EMA) lub Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) ukierunkowanych na choroby od hemofilii (np. Raktawia) do rdzeniowego zaniku mięśni (np. Zolgensma)³.

Produkcja terapii genowych opartych na AAV wynika ze zrozumienia samego AAV typu dzikiego. AAV to mały wirus DNA z rodziny Parvoviridae, składający się z 13 głównych serotypów (AAV1-13)³. Genom AAV składa się z ~ 4,7 kb, jednoniciowej cząsteczki DNA zawierającej dwie główne otwarte ramki odczytu (ORF), które kodują niezbędne geny wirusowe niezbędne do replikacji genomu, składania kapsydu i pakowania (rep, cap). Genom wirusa jest otoczony zarówno na końcach 5', jak i 3' przez sekwencje nukleotydowe palindromiczne, zwane odwróconymi powtórzeniami końcowymi (ITR). Te ITR tworzą struktury przypominające spinki do włosów, które odgrywają kluczową rolę w replikacji genomu i pakowaniu genomów wirusa de novo do nowo zsyntetyzowanych kapsydów wirusowych. AAV jest wirusem zależnym od pomocnika i dlatego wymaga ekspresji genów pomocniczych z innych wirusów, takich jak wirus opryszczki pospolitej (HSV) lub adenowirus (AdV), aby stać się kompetentnym w replikacji¹.

W celu wytworzenia AAV, stosuje się odpowiedni komórkowy system ekspresji, który ułatwia ekspresję białek kapsydu wirusa i późniejsze składanie w cząsteczki wirusa de novo, a następnie enkapsydację wybranego transgenu z flanką ITR (określanego również jako genom wektorowy). Proces ten zwykle wykorzystuje potrójny system plazmidowy, składający się z (1) plazmidu zawierającego geny pomocnicze pochodzące z wirusa pomocniczego, (2) plazmidu kodującego niezbędne elementy wirusa (rep / cap) oraz (3) plazmidu przenoszącego kasetę ekspresji terapeutycznej (powszechnie określaną jako plazmid transferowy) 4. Unikalna obecność sygnałów pakowania z odwróconym powtórzeniem końcowym (ITR) otaczających kasetę ekspresji terapeutycznej w plazmidzie transferowym zapewnia specyficzne upakowanie transgenu, jednocześnie wykluczając w większości geny wirusa obecne na innych plazmidach. Kotransfekcja tego trójplazmidowego systemu do komórkowej platformy ekspresyjnej (zwykle HEK293T komórek) powoduje produkcję kompetentnych do transdukcji, dereplikacyjnych cząstek wirusa, odpowiednich do stosowania w zastosowaniach terapii genowej^3,4.

Istnieje wiele krytycznych atrybutów jakości (CQA) związanych z produkcją terapii genowych opartych na AAV, które muszą zostać ocenione w celu zapewnienia mocy, czystości i bezpieczeństwa zamierzonego produktu leczniczego⁴. Te CQA obejmują miano wirusa, zawartość kapsydu i agregację. Miano wirusa samo w sobie jest kombinacją liczby cząstek wirusa (miano kapsydu) i liczby genomów wektorowych (miano genomu wektorowego) obecnych w danym preparacie. Idealnie byłoby, gdyby stosunek między tymi dwoma mianami wynosił 1:1, ponieważ każda cząsteczka wirusa powinna zawierać jeden genom wektora, ale nieefektywność pakowania genomu wektora podczas biosyntezy powoduje współprodukcję pustych lub częściowo wypełnionych kapsydów (zawierających częściowe sekwencje genomu wektora i/lub sekwencje genomu bez wektora)⁵. Obecność takich zanieczyszczeń może potencjalnie wywołać nieuzasadnioną odpowiedź immunologiczną i konkurować o miejsca wiązania wektorów, zwiększając w ten sposób ryzyko immunotoksyczności i zmniejszając szybkość transdukcji pełnych kapsydów⁶. Dokładna kwantyfikacja genomów AAV jest zatem niezbędna do ustalenia miana wirusa i zawartości kapsydu. Ma to wpływ zarówno na badania podstawowe, jak i na branżę terapii genowej, która wymaga dokładnego dawkowania w celu utrzymania zarówno bezpieczeństwa, jak i skuteczności produktów leczniczych.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (dd_PCR) stała się ściśle związana z kwantyfikacją miana wirusa, ponieważ może być wykorzystana do określenia liczby genomów wektorów obecnych w dowolnym preparacie⁷. Sam cyfrowy PCR został po raz pierwszy wprowadzony w latach 90. XX wieku^8,9 i dd_PCR jest ulepszeniem tej technologii, które pozwala na przetwarzanie próbek o wysokiej przepustowości^10,11. W dd_PCR 20 μl reakcji PCR w czasie rzeczywistym dzieli się na około 20 000 kropelek pokrytych olejem, co daje do 96 takich reakcji po umieszczeniu na standardowej 96-dołkowej płytce. W porównaniu z konwencjonalnym ilościowym PCR (qPCR), dd_PCR oferuje kilka zalet, w tym zwiększoną czułość, zwiększoną precyzję oraz bardziej bezpośrednią i bezwzględną kwantyfikację sekwencji docelowych bez konieczności stosowania standardowych krzywych. Co więcej, wysoki poziom partycjonowania w dd_PCR zmniejsza wpływ inhibitorów PCR i minimalizuje potencjał błędu systematycznego wynikającego z preferencyjnej amplifikacji niektórych matryc, co czyni go atrakcyjną opcją do pomiarów analitycznych miareczkowania genomu wektorowego.

Protokół

Opisany tutaj protokół ma na celu ilościowe określenie miana genomu wirusa oczyszczonego, wyprodukowanego we własnym zakresie wektora AAV9 z białkiem zielonej fluorescencji (GFP) jako transgene¹² z dużą precyzją (Tabela 1). Protokół ten ma jednak zastosowanie do każdego serotypu AAV i dowolnego projektu genomu wektorowego, pod warunkiem, że zestawy starter/sonda są zaprojektowane tak, aby celować w określony genom wektora będącego przedmiotem zainteresowania. Szczegółowe informacje na temat odczynników, starterów, sond i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie roztworów podstawowych

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory podstawowe wymagane do rozcieńczenia próbki na stanowisku PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia obcym DNA.

1. Przygotować 10 razy bufor do testów PCR, który składa się z 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl₂ i 0,01% (w/v) BSA. Zmierzyć pH roztworu i dostosować je do 8.3.
   UWAGA: Ten roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca.
2. Przygotować bufor do rozcieńczania AAV, który składa się z 1 buforu do oznaczania PCR, 0,2 ng/μL DNA ścinanego plemników łososia (sss) i 0,1 % pluronu F-68. Roztwór ten sporządzać na świeżo przy każdym oznaczeniu i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Jeśli pluroniczny F-68 nie jest dostępny, można zastosować alternatywę, taką jak niejonowy środek powierzchniowo czynny Poloxamer 188.

2. Przygotowanie próbek - obróbka DNazą I i seryjne rozcieńczanie

UWAGA: W celu usunięcia zanieczyszczeń DNA, które mogłyby obniżyć dokładność miareczkowania genomu wektorowego, wolne DNA obecne w próbce AAV (w tym pozostałe DNA plazmidowe lub niekapsułkowane genomy wirusowe) mogą zostać usunięte przed amplifikacją PCR za pomocą DNazy. Jest to możliwe, ponieważ genomy wektorów są zamknięte w kapsydach AAV i dlatego nie są dostępne aż do etapu denaturacji samej reakcji PCR (patrz krok 5). Ponadto, ponieważ liczba genomu wektora w danej próbce jest nieznana, konieczne jest przeprowadzenie seryjnego rozcieńczania próbek, aby upewnić się, że pomiary pozostają w górnej i dolnej wykrywalnej granicy. Wszystkie czynności związane z próbkami należy wykonywać na stacji roboczej PCR. Wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie, chyba że określono inaczej.

1. Wymieszaj próbkę AAV wybraną do analizy, krótko wirując, a następnie odwirowując, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie probówki zawierającej próbkę.
2. W przypadku leczenia DNazy dodać 45 μl roztworu zawierającego 1x bufor DNazy I, 0,1% pluronu F-68 i 0,04 U/μL DNazy I w wodzie wolnej od DNaz do 0,2 ml probówki z 8 probówkami do PCR.
3. Przenieść 5 μl próbki do probówki zawierającej roztwór DNAzy. Zwirować próbki i na krótko odwirować, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie.
4. W termocyklerze inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie schłodzić do temperatury 4 °C. Umieścić na lodzie tak szybko, jak to możliwe po osiągnięciu temperatury 4 °C.
5. Używając świeżego paska z 8 probówkami do PCR o pojemności 0,2 ml, należy odpowiednio rozcieńczyć próbkę poddaną działaniu DNazy w buforze rozcieńczającym AAV. Zalecane rozcieńczenia próbki zależą od oczekiwanego miana vg (Tabela 2), ale należy dążyć do co najmniej 2 różnych rozcieńczeń na próbkę i przeprowadzić każde rozcieńczenie w dwóch powtórzeniach. Upewnij się, że rygorystycznie (2 000-3 000 obr./min) wirujesz próbki przez 5 sekund przed wyjęciem jakiejkolwiek objętości.
6. Po seryjnym rozcieńczeniu należy zwirować próbki i odwirować, aby upewnić się, że cała ciecz pozostała na dnie probówek.
7. Obejmują kontrolę dodatnią, której miano vg jest znane, oraz kontrolę ujemną (tylko bufor rozcieńczający AAV), która jest również nazywana kontrolą bez matrycy (NTC).
   UWAGA: Kontrola pozytywna może być wyprodukowanym we własnym zakresie AAV lub komercyjnym materiałem referencyjnym AAV, który zawiera docelową sekwencję starterów/sondy.

3. Przygotowanie dd_PCR master mix

UWAGA: Wybierz odpowiednią sekwencję docelową w genomie wektora i zaprojektuj starter do przodu, starter odwrotny i sondy hydrolizy oznaczone fluoroforami reporterowymi FAM lub HEX zgodnie z opublikowanymi wytycznymi¹³. Startery, które są ukierunkowane na transgen, są preferowane w stosunku do starterów, które są ukierunkowane na ITR, ponieważ transgen jest specyficzny dla projektu genomu wektorowego, a drugorzędna struktura związana z tworzeniem się spinki do włosów przez ITR może utrudniać skuteczne wiązanie starterów. Co więcej, startery ITR mogą zawyżać miana AAV, jeśli częściowo wypełnione kapsydy, które zawierają skrócone fragmenty genomu wektora, są obecne i nadal zawierają jedną z sekwencji ITR¹⁴. Przygotuj dd_PCR mieszankę wzorcową w dedykowanym, oddzielnym stanowisku pracy (pomieszczenie pre-PCR). Pomieszczenie to powinno być oddzielone od pomieszczenia, w którym przygotowywane są próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

1. Pozwól, aby starter, sonda i dd_PCR odczynniki supermix osiągnęły temperaturę pokojową (20-25 °C). Następnie zwiruj wszystkie odczynniki i krótko odwiruj probówki, aby zebrać cały płyn na dnie probówki.
2. Przygotować objętość mieszanki wzorcowej dd_PCR w oddzielnej probówce do mikrowirówki zgodnie z wymaganą liczbą reakcji, łącząc startery do przodu i do tyłu, sondę dd_PCR supermiks oraz wodę wolną od DNaz zgodnie z objętościami i stężeniami opisanymi w tabeli 3.
   1. Zmieszaj mieszankę główną, a następnie krótko odwiruj probówkę, aby upewnić się, że cały płyn pozostał na dnie probówki.
      UWAGA: Zawsze należy przygotować więcej dd_PCR objętości mieszanki głównej niż jest to wymagane (n + 1), aby uwzględnić ubytek objętości pipetowania.
3. Przenieść 19,8 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki na świeżym pasku z 8 probówkami o pojemności 0,2 ml do PCR.

4. Generowanie kropel

UWAGA: Próbki i dd_PCR główny miks są mieszane oddzielnie przed załadowaniem do kartridżu generującego kropelki. Wszystkie manipulacje należy wykonywać na stanowisku do PCR, najlepiej na innym stanowisku niż to, na którym przygotowano próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia amplikonem. Alternatywnie, po przygotowaniu próbek należy dokładnie wyczyścić stację roboczą PCR.

1. Przenieść 2,2 μl rozcieńczonej próbki do 19,8 μl objętości dd_PCR mieszanki wzorcowej w każdej probówce 8-probówkowego paska do PCR i dobrze wymieszać. Odwirować i krótko odwirować, aby upewnić się, że cały płyn pozostał na dnie.
2. Przenieść 20 μl tego roztworu do studzienek znajdujących się w środkowym rzędzie "próbek" wkładu wytwarzającego kropelki. Unikaj pęcherzyków we wkładzie generującym kropelki; Może to spowodować, że urządzenie będzie wyświetlać błędy, a kropelki nie będą generowane.
   UWAGA: Ponieważ wkłady są w formacie 8-dołkowym, podobnie jak paski probówki do PCR, zaleca się stosowanie pipety 8-kanałowej.
3. Przenieść 60 μl oleju wytwarzającego kropelki do studzienek znajdujących się w dolnym rzędzie "oleju" wkładu generującego kropelki.
   UWAGA: Nigdy nie pozostawiaj pustej studzienki wkładu wytwarzającego kropelki; Wypełnić pustą próbkę studzienką dd_PCR kontrolą buforową dla sond (o odpowiedniej objętości opisanej powyżej).
4. Umieść gumową uszczelkę na kartridżu generującym krople i umieść go w generatorze kropel.
5. Po wytworzeniu kropelek za pomocą 8-kanałowej pipety powoli przenieś 42,5 μl roztworu z chipa dd_PCR na wielodołkową płytkę PCR.
   UWAGA: Pipetę należy pipetować powoli i pod kątem 45 stopni, aby uniknąć ścinania kropel w cieczy podczas pipetowania. Sprawdź wzrokowo płytkę, aby wszystkie studzienki były wypełnione taką samą ilością cieczy, a kropelki były widoczne jako nieprzezroczysta warstwa w studni.
6. Uszczelnić płytkę osłoną z folii aluminiowej w zgrzewarce na 5 s w temperaturze 180 °C.
   UWAGA: Sprawdź wzrokowo, czy wszystkie studzienki są uszczelnione. Jeśli nie, powtórz kolejne 5 s w temperaturze 180 °C. Szczelnie zamknięta płytka może być przechowywana do 4 godzin w temperaturze 4 °C przed dd_PCR amplifikacji w termocyklerze.

5. dd_PCR amplifikacji

UWAGA: Termocykler powinien być umieszczony w oddzielnym pomieszczeniu od pomieszczenia pre-PCR, aby przestrzennie oddzielić działania pre-PCR od amplifikacji PCR i uniknąć fałszywie pozytywnych wyników z powodu zanieczyszczenia amplikonem.

1. Umieścić płytkę w termocyklerze (z modułem reakcyjnym z 96 głębokich dołków) w celu amplifikacji PCR i szczelnie ją zamknąć.
2. Skonfiguruj termocykler tak, aby działał w warunkach opisanych w Tabeli 4 i przy objętości reakcji 40 μL. Uwzględnij etap wstępnego podgrzewania w ustawieniach programu i upewnij się, że pokrywka jest podgrzana do 99 °C.
3. Po zakończeniu programu PCR należy utrzymywać płytkę w temperaturze 4 °C przez co najmniej 15 minut, aby upewnić się, że płytka jest całkowicie schłodzona.
   UWAGA: Płytkę można przechowywać przez 48-72 godzin w temperaturze 4 °C, zanim konieczne będzie odczytanie kropel.

6. Odczyt kropelki

1. Załaduj płytkę do czytnika kropelkowego, wprowadź następujące informacje do oprogramowania systemowego i kontynuuj odczyt.
   UWAGA: Typ eksperymentu = Kwantyfikacja bezpośrednia; Supermix = dd_PCR supermix dla sond (bez dUTP); Rodzaj testu = pojedynczy cel na kanał; Informacje o celu, kanał sygnału 1 = kanał FAM lub kanał HEX zgodnie z użytą sondą.
2. Opisz próbki, aby można było określić pozycję każdej próbki i skutecznie zidentyfikować ją na podstawie pliku danych.

7. Analiza danych

1. Przeprowadź analizę danych przy użyciu kompatybilnego oprogramowania dostarczonego przez producenta czytnika kropel.
2. Przeprowadzić test przydatności systemu w celu oceny ogólnej wydajności (a tym samym wiarygodności) testu.
   1. Sprawdź liczbę zdarzeń (liczbę kropel) zmierzoną dla każdego dołka na płytce PCR. Idealnie, liczba zdarzeń wynosi od 15 000 do 20 000. Jeśli liczba zdarzeń wynosi <10 000, ta wartość musi zostać wykluczona z analizy.
   2. Oceń wykres amplitudy 1D lub 2D i sprawdź, czy nie ma deszczu kropelkowego.
   3. Przejdź do zakładki tabela danych i wyeksportuj dane do pliku Excel.
3. Oblicz miano vg, wykonując poniższe czynności:
   1. Zakres roboczy dd_PCR wynosi 10-10 000 kopii/μL. Z analizy należy wykluczyć wszelkie wartości wynoszące <10 kopii/μL. Zalecany zakres dla sprzętu do dd_PCR używanego w tym dokumencie to 25-5000 kopii/μL.
      UWAGA: Oprogramowanie do analizy danych poda liczbę genomu wektora zgodną z objętością reakcji PCR (40 μL), ale nie uwzględnia to współczynników rozcieńczenia zastosowanych podczas przygotowania próbki.
   2. Obliczyć miano vg próbki na objętość (zwykle wyrażone jako vg/ml), uwzględniając różne współczynniki rozcieńczenia podczas przygotowywania próbki, stosując następującą zależność:
      UWAGA: Stężenie (wartość uzyskana z analizy danych) x 10 (rozcieńczenie przed obróbką DNazy I) x 10 (rozcieńczenie mieszanki głównej PCR) x 1000 (μL do ml) rozcieńczenie wybranej próbki (w buforze do rozcieńczania AAV - np. Tabela 2).
   3. Obliczyć współczynnik zmienności (% CV) między kontrpróbami i między różnymi rozcieńczeniami tej samej próbki.
      UWAGA: %CV oblicza się, dzieląc odchylenie standardowe przez średnią. Jeżeli %CV między różnymi rozcieńczeniami wynosi >20 %, wartość ta nie powinna być uważana za dokładną.
   4. Sprawdź wartości kontroli ujemnej i dodatniej. Kontrola ujemna powinna być mniejsza niż 5 kopii/μl.

Wyniki

Wyniki można wizualizować za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Dla każdej studzienki wykres amplitudy 1D wyświetla wszystkie krople w stosunku do ich amplitudy. Oczekuje się wyraźnego oddzielenia kropel dodatnich i ujemnych. Jeśli więcej niż 10% wszystkich kropel znajduje się między dodatnimi i ujemnymi chmurami kropel (zjawisko określane jako deszcz kropelkowy), konieczne jest ponowne zmierzenie próbki (patrz Rysunek 1). Dodatkowe informacje na temat deszczu kropelkowego są dostępne w dyskusji.

Można utworzyć tabelę danych, która podsumowuje wszystkie zarejestrowane informacje, w tym nazwę próbki, liczbę zaakceptowanych kropel (liczba zdarzeń) i stężenie (kopie/μL). Idealnie byłoby, gdyby liczba zdarzeń mieściła się w przedziale od 15 000 do 20 000 zaakceptowanych kropli. Jeśli liczba zdarzeń dla odwiertu jest mniejsza niż 10 000, punkt danych powinien zostać wyłączony z analizy. Przykładowe dane wyjściowe przedstawiono w tabeli 5.

Miano vg można obliczyć na podstawie stężenia (kopie/μL), z uwzględnieniem rozcieńczeń próbki. Zakres roboczy dd_PCR wynosi 10-10 000 kopii/μL. Wartości poniżej 10 kopii/μL powinny być wyłączone z analizy. Należy obliczyć miano vg dla próbek, jak również kontrole dodatnie i ujemne. Zmierzona wartość kontroli dodatniej powinna mieć współczynnik zmienności (%CV) niższy niż 20 % w stosunku do wartości teoretycznej. Kontrola ujemna powinna być mniejsza niż 5 kopii/μl. Dodatkowo należy obliczyć %CV między powtórzeniami i różnymi rozcieńczeniami dla każdej próbki. Jeśli %CV między różnymi rozcieńczeniami przekracza 20%, wartość może zostać uznana za niedokładną i próbka może wymagać ponownego pomiaru.

Udany pomiar charakteryzuje się wyraźnym oddzieleniem dodatnich i ujemnych chmur kropel, co najmniej 10 000 akceptowanych kropel, wartością między 10 kopii/μL a 10 000 kopii/μL oraz %CV między powtórzeniami mniejszymi niż 20%.

Rysunek 1: Wizualizacja kropel dd_PCR. (A) Wykres amplitudy 1D pokazuje wyraźne rozdzielenie kropli dodatnich i ujemnych, co wskazuje na pomyślne podział kropel. (B) Wykres pokazuje słabą separację dodatnich i ujemnych kropel, znaną jako deszcz kropelkowy, co sugeruje nieoptymalny podział lub potencjalne problemy z testem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Procedura ilościowego oznaczania genomów wirusów za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego. (1), odczynniki i roztwory są przygotowywane zgodnie z instrukcjami producenta lub krokiem 1 protokołu (Przygotowanie roztworów podstawowych). (2) 45 μl roztworu DNazy I podaje się w porcji do każdej probówki 8-probówkowego paska do PCR. Po wirowaniu i krótkim odwirowaniu próbek, do jednej z probówek dodaje się 5 μl próbki. DNazę I i zawierający próbkę ośmioprobówkowy pasek PCR inkubuje się w termocyklerze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, a następnie próbki są poddawane seryjnym rozcieńczeniom. (3) Mastermix do PCR przygotowuje się zgodnie z opisem, a 19,8 μl podaje się do każdej probówki 8-probówkowego paska PCR. Próbki seryjnych rozcieńczeń z kroku 2 dodaje się do mastermixu. 20 μl mastermix plus
Roztwór próbki umieszcza się w środkowym rzędzie wkładu, a 60 μl oleju wytwarzającego kropelki przenosi się do dolnych studzienek wkładu wytwarzającego kropelki. Wkład jest następnie umieszczany w generatorze kropel i uruchamiany zgodnie z określonymi warunkami. Po wytworzeniu kropel 42,5 μl z górnego rzędu wkładu przenosi się na wielodołkową płytkę PCR. (4) Płytkę PCR umieszcza się w termocyklerze PCR i uruchamia zgodnie z przewidzianymi warunkami. Płyta jest analizowana za pomocą czytnika dd_PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Dane precyzyjne. Poniższa tabela przedstawia precyzyjne dane z czterech zestawów próbek kontroli jakości (QC), z których każdy ma pięć stężeń (QC1-QC5). Każda kontrola jakości została zmierzona pięć razy. Pokazany jest współczynnik zmienności (%CV) między różnymi seriami, reprezentujący powtarzalność (A) oraz między różnymi zestawami próbek, reprezentujący pośrednią precyzję (B). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Rozcieńczenia próbek. W tabeli przedstawiono zalecane rozcieńczenia próbek w oparciu o oczekiwane miano genomu wirusa (vg/mL). Zaleca się w sumie trzy rozcieńczenia, aby upewnić się, że co najmniej dwie wartości mieszczą się w zakresie roboczym testu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: dd_PCR główny skład miksu. Poniższa tabela przedstawia skład dd_PCR głównego miksu, który obejmuje starter do przodu i do tyłu (909 nM), sondę (227 nM) i dd_PCR supermix dla sond (bez dUTP, 1x). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 4: Warunki termocyklu. Tabela zawiera szczegółowe informacje na temat zalecanego programu PCR, który obejmuje: 1) 10-minutową inkubację w temperaturze 95 °C w celu rozerwania kapsydu i aktywacji enzymu, 2) 40 cykli po 30 s w temperaturze 94 °C w przypadku denaturacji DNA i 1 minutę w temperaturze 60 °C w celu wyżarzania i przedłużania, 3) 10-minutową inkubację w temperaturze 98 °C w celu dezaktywacji enzymu, oraz (4) utrzymywanie w temperaturze 4 °C. Temperatura wyżarzania może wymagać optymalizacji w oparciu o zastosowany zestaw podkładu/sondy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 5: Przykład danych wyjściowych z rzeczywistego przebiegu AAV. Tabela zawiera przykład danych wyjściowych z rzeczywistej serii AAV, w której jedna próbka została zmierzona w dwóch różnych rozcieńczeniach, z których każda była zduplikowana. Miano genomu wirusa (vg) (w vg/ml) oblicza się przy użyciu następującego wzoru: 10 (DNaza I przed zabiegiem) x 10 (rozcieńczenie w mieszance wzorcowej) x 1 000 (μl do ml) x rozcieńczenie w buforze rozcieńczającym AAV. ODCHODNE oznacza odchylenie standardowe, a CV wskazuje współczynnik zmienności. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Dokładna kwantyfikacja kopii genomu wektora AAV w preparatach wektorowych ma zasadnicze znaczenie dla rozwoju produktów terapii genowej opartej na AAV. Istnieje kilka metod określania miana vg, przy czym ilościowe PCR (qPCR) i dd_PCR są dwiema najczęściej stosowanymi i akceptowanymi technikami. dd_PCR jest często preferowany w stosunku do qPCR ze względu na jego niezależność od wydajności amplifikacji, wyższą precyzję i większą wytrzymałość¹⁵. W literaturze dostępnych jest wiele protokołów miareczkowania genomu wektora przez dd_PCR, z których każdy ma własne metody przygotowania próbek 15,16,17. Brakuje jednak kwalifikowanego protokołu konsensusu. W artykule przedstawiono zwalidowany, dopasowany do celu protokół dd_PCR do kwantyfikacji genomów wektorów AAV w oczyszczonych próbkach wektorów (ryc. 2).

Szczególna uwaga poświęcona obchodzeniu się z próbkami ma kluczowe znaczenie podczas wykonywania tego protokołu. Zanieczyszczenie krzyżowe może stanowić poważne wyzwanie w dokładnej ocenie miana VG; dlatego próbki najlepiej przetwarzać pod stacją roboczą PCR, aby uniknąć zanieczyszczenia obcym DNA. Dodatkowo, prawidłowe wykonanie inkubacji DNazy ma kluczowe znaczenie dla wyeliminowania nieopakowanego zanieczyszczenia DNA bez zakłócania kapsydu i potencjalnego trawienia upakowanego genomu wektorowego. Wiele protokołów obejmuje inaktywację termiczną i leczenie proteinazą K 16,17,18. Jednak podczas opracowywania metody we własnym zakresie stwierdzono, że nadmierne ogrzewanie było szkodliwe dla miareczkowania vg, a leczenie proteinazą K nie było konieczne (dane nie pokazane).

Ponieważ dd_PCR staje się coraz bardziej popularna w ilościowym określaniu genomów wirusów, producenci opublikowali szczegółowe przewodniki aplikacyjne zawierające wytyczne dotyczące projektowania i optymalizacji testów dd_PCR¹⁹. Dostępne są również informacje dotyczące rozwiązywania problemów. W praktyce, gdy test jest prawidłowo zaprojektowany, najczęstszymi problemami są krople deszczu i niska liczba kropel. Deszcz kropelkowy jest często spowodowany słabym dostępem startera/sond do amplikonu, ale kilka strategii może rozwiązać ten problem. Na przykład eksperyment z gradientem temperatury może pomóc w ustaleniu optymalnej temperatury wyżarzania. Ponadto rozcieńczanie próbek w celu obniżenia ilości DNA (zalecana mniejsza niż 66 ng) lub przeprowadzanie trawienia restrykcyjnego za pomocą określonych enzymów, które wycinają poza region amplikonu, może poprawić dostępność matrycy. Zalecenie 10 U enzymu restrykcyjnego na μg DNA jest zazwyczaj skuteczne. Problem małej liczby kropel (poniżej 10 000) jest często spowodowany nieprawidłowym pipetowaniem próbki i oleju we wkładach. Zaleca się powolne pipetowanie z odpowiednimi końcówkami, aby uniknąć ścinania kropel. Chociaż test dd_PCR jest solidny, jednym z ograniczeń jest wydłużony czas oczekiwania na wynik. Proces od obróbki próbki do odczytu kropelki trwa kilka godzin, co może być wadą, gdy wyniki są potrzebne szybko.

Dokładna kwantyfikacja kopii genomu AAV w preparatach wektorowych jest niezbędna na wszystkich etapach cyklu życia terapii genowej AAV. W szczególności jest to ważne dla optymalizacji procesów produkcji i oczyszczania, prowadzenia badań przedklinicznych i określania dawek klinicznych dla produktów terapii genowej opartej na AAV. Przedstawiony tutaj protokół dd_PCR ma szerokie zastosowanie i może być stosowany do oczyszczonych produktów AAV o różnych serotypach i transgenach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta 8-kanałowa 10 i mikro; L	Eppendorf	3,12,50,00,010
Pipeta 8-kanałowa 200 &mikro; L	Eppendorf	3,12,50,00,036
Pipeta 8-kanałowa 300 &mikro; L	Eppendorf	3,12,50,00,052
8-dołkowy pasek PCR	Sarstedt	72.991.002
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
C1000 Dotykowy termocykler z 96– Moduł reakcyjny Deep Well	Bio-Rad	1851197
ddPCR Buffer Control dla sond 9 ml (2 x 4,5 mL)	Bio-Rad	1863052
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP) (2 x 1 mL)	Bio-Rad	1863023
ddPCR 96-dołkowe płytki (opakowanie 25 szt.)	Bio-Rad	12001925
ddPCR Olejek do czytnika kropel (2 x 1L)	Bio-Rad	1863004
Uchwyt na kartridże DG8	Bio-Rad	1863051
Wkłady DG8 do QX200/QX100 (opakowanie 24 szt.)	Uszczelki Bio-Rad	1864008
DG8 do QX200/QX100 (opakowanie 24 szt.)	Bio-Rad	1863009
DNase I (10U/µ L) + bufor	Roche	4716728001
Olej do generowania kropelek do sond (10 x 7 mL)	Bio-Rad	1863005
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Końcówka filtra, 0,1-10 μ L, 34 mm, Stojak, PCR Clean, STERYLNY	Eppendorf	30078500
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Końcówka filtra, 20-300 μ L, 55 mm, Stojak, PCR Clean, STERYLNY	Eppendorf	30078560
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Końcówka filtra, 2-100 μ L, 53 mm, Stojak, PCR Clean, STERYLNY	Eppendorf	30078543
Forward liofilizowane startery i odpowiednie zapasy główne przy 100 mM	IDT		GFP jako sekwencja docelowa. Starter do przodu: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Sonda
liofilizowana i materiał główny przy 100 &mikro; M	IDT		GFP jako sekwencja docelowa. Sonda PrimeTime Eco: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/
Chlorek magnezu (MgCl2)	Chemlab Analytical	CL00.1381
Woda wolna od nukleaz	IDT	11-04-02-01
Zgrzewka płytkowa PCR, folia, przebijalna (opakowanie 100 szt.)	Bio-Rad	1814040
Niejonowy środek powierzchniowo czynny Pluronic F-68 (100x)	Thermo Fisher Scientific	24040032
Chlorek potasu (KCl)	Chemikalia badawcze Honeywell	31248
Oprogramowanie menedżerskie QX	Bio-Rad		Oprogramowanie do analizy danych ddPCR
Generator kropel QX200	Bio-Rad	1864002
QX200 Czytnik kropel	Bio-Rad	1864003
Zbiornik na odczynniki	VWR	613-1181
Odwrócone liofilizowane startery i odpowiednie zapasy główne przy 100 mM	IDT		GFP jako sekwencja docelowa. Starter odwrotny: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'Probówka
reakcyjna SafeSeal, 1,5 ml	Sarstedt	72.706.200
DNA plemników łososia, ścięte (10 mg/ml)	Bufor Thermo Fisher Scientific	AM9680
TE	IDT		W komplecie ze starterami przy zamawianiu
chlorowodorku Tris (Tris-HCl)	Roche	10812846001