Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67256

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Streszczenie

Dokładna ocena miana przeciwciał wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV) jest kluczowa dla skutecznej kontroli i nadzoru nad chorobami drobiu. W artykule przedstawiono zoptymalizowaną metodę przygotowania roztworu antygenu z 4 jednostek hemaglutynacji (4-HAU), kluczowego składnika testu hamowania hemaglutynacji (HI) stosowanego w wykrywaniu serologicznym NDV. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, które obejmują czasochłonne i niezdefiniowane etapy miareczkowania wstecznego i adiustacji, to podejście usprawnia ten proces poprzez dokładny pomiar miana kwasu hialuronowego przy użyciu początkowej serii rozcieńczeń (1:3, 1:5, 1:7 i 1:9). Zapewniamy również specjalną metodę dostosowywania lub zmiany formuły w oparciu o wyniki miareczkowania wstecznego, zmniejszając potrzebę wielokrotnego miareczkowania wstecznego. Ponadto oceniliśmy wpływ dokładności roztworu antygenu 4-HAU na miano HI w surowicy i stwierdziliśmy, że gdy miano antygenu 4-HAU było niższe niż 3, spowodowało to pojawienie się fałszywie dodatnich próbek HI. Zapewniając dokładną metodę i minimalizując zadania obliczeniowe, podejście to zwiększa wydajność i wiarygodność testów, przyczyniając się do poprawy nadzoru i kontroli chorób w populacjach drobiu.

Wprowadzenie

Newcastle Disease (ND) to powszechna i poważna choroba drobiu rozpoznawana na całym świecie1,2,3. Objawia się różnymi objawami, takimi jak wysoka gorączka, niewydolność oddechowa, czerwonka, zaburzenia nerwowe i krwotok śluzówkowy4. Czynnik sprawczy, wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), przetrwał prawie sto lat, atakując ponad 200 gatunków ptaków, w tym kurczaki, kaczki, gęsi i gołębie5. Przenoszenie następuje głównie poprzez bezpośredni lub pośredni kontakt z zakażonymi ptakami, przy czym drób, gołębie i ptaki żyjące na wolności służą jako potencjalne rezerwuary6. Pomimo pojedynczego serotypu NDV, jego różnorodność genetyczna stanowi poważne wyzwanie dla zarządzania i kontroli choroby3,7.

Szczepienie służy jako podstawowa strategia kontroli ND, uzupełniona rygorystycznymi środkami bezpieczeństwa biologicznego5,8. Na całym świecie dostępne są różne komercyjne szczepionki dla drobiu, które wywołują silną odpowiedź przeciwciał w surowicy po szczepieniu9. Przeciwciała te odgrywają kluczową rolę w łagodzeniu nasilenia objawów po ekspozycji na zjadliwe szczepy oraz w ograniczaniu transmisji międzystadnej10. Standardowe protokoły szczepień przypominających, zazwyczaj obejmujące żywe atenuowane szczepionki podawane co 6-12 tygodni, są standardową praktyką w regionach endemicznych dla ND9. Rutynowe monitorowanie mian przeciwciał po szczepieniu w komercyjnych stadach drobiu jest niezbędne do oceny skuteczności szczepionki11,12,13. Niskie miana przeciwciał po szczepieniu mogą wskazywać na niepowodzenie szczepienia, skłaniając do podjęcia w odpowiednim czasie działań naprawczych, takich jak szczepienie uzupełniające lub badanie potencjalnych czynników immunosupresyjnych wpływających na odpowiedź immunologiczną14.

Do wykrywania przeciwciał przeciwko NDV w surowicy wykorzystuje się wiele technik, w tym test immunoenzymatyczny połączony z immunosorbentem, hamowanie hemaglutynacji (HI) i test neutralizacji9,13,15,16. Każda metoda ma unikalne zalety i ograniczenia dotyczące czułości, swoistości i opłacalności.

Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół oparty na protokole Światowej Organizacji Zdrowia Zwierząt (OIE) do przeprowadzania HI w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla surowicy przeciwko NDV11. Hemagglutynacja (HA), zjawisko wywołane przez niektóre wirusy otoczkowe, takie jak NDV, polega na zlepianiu się czerwonych krwinek (RBC)9. Białko hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) na powierzchni NDV oddziałuje z krwinkami czerwonymi, powodując zlepianie się komórek i tworzenie sieci2. Test HI jest preferowany jako metoda serologiczna ze względu na jego zdolność do oceny swoistości przeciwciał w surowicy w stosunku do białka HN NDV8,9. Co więcej, jego opłacalność i niezależność od specjalistycznego oprzyrządowania sprawiają, że jest dostępny i praktyczny w rutynowym użytkowaniu.

Aby poprawić efektywność testu, udoskonaliliśmy przepływ pracy protokołu OIE11, koncentrując się na uzyskaniu dokładniejszych mian antygenu HA i oferując szczegółowe korekty dla roztworu antygenu 4 jednostek hemaglutynacji (4-HAU). Dodatkowo, poprzez analizę porównawczą, oceniliśmy wpływ dokładności 4-HAU na wyniki HI, dostarczając cennych informacji dla praktyków terenowych. Podejście to nie ogranicza się do badania przeciwciał NDV, ale obejmuje wykrywanie podtypów wirusa i innych wirusów hemaglutynujących, w tym odry, poliomawirusa, świnki i różyczki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Zatwierdzenie protokołu udzielono przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i jej wykorzystania. Wszystkie procedury wykorzystujące antygeny żywej wirusa oraz próbki surowicy klinicznej przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, zgodnie z ustalonymi protokołami bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie 1% zawiesiny krwinek czerwonych kurzych

  1. Do sterylnego stożkowego pojemnika do wirowania o pojemności 15 mL dodaj 3 mL roztworu Alservera (środek przeciwzakrzepowy).
  2. Zebrane z żyły skrzydłowej każdej z trzech kur nieimmunnych (bez przeciwciał przeciwko wirusowi NDV) 1 mL krwi natychmiast przenieś do pojemnika zawierającego środek przeciwzakrzepowy i delikatnie wymieszaj.
  3. Dopełnij pojemnik sterylnym roztworem buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,2–7,4) do całkowitej objętości 12 mL i delikatnie wymieszaj. Wirowanie prowadź przy 500 × g przez 10 min przy użyciu wirówki z wirującym poziomo wirnikiem.
  4. Starannie usuń nadmiar płynu oraz warstwę białych krwinek. Powtórz kroki 1.3 i 1.4 dwa razy w celu uzyskania osadu krwinek czerwonych.
  5. Przy użyciu pipety odwrotnej przenieś 1 mL osadu krwinek czerwonych do 99 mL sterylnego roztworu PBS, aby przygotować zawiesinę krwinek czerwonych o stężeniu 1%.
    UWAGA: Szacunkowa objętość potrzebnej zawiesiny krwinek czerwonych kurzych w stężeniu 1% wynosi 3 mL/plytka (25 µL/dołek x 96 dołków x 1,25 = 3,0 mL; gdzie współczynnik 1,25 uwzględnia straty podczas pipetowania, zapewniając wystarczającą objętość).

2. Odtworzenie antygenu lub surowicy w postaci liofilizowanej

  1. Dodaj 2 mL sterylnej roztworu PBS do ampułki zawierającej antygen lub surowicę w postaci liofilizatu. Delikatnie wstrząśnij ampułką i pozostaw ją na 2–3 minuty, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków i zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    UWAGA: Należy postępować zgodnie z instrukcjami konkretnego producenta, ponieważ w niniejszym badaniu nie porównywano różnych typów materiałów liofilizowanych.
  2. Przenieś porcje odtworzonego roztworu do probówek wirowarkowych o pojemności 1,5 mL i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
    UWAGA: Za każdym razem, gdy antygen jest rozmrażany i używany, lub gdy przygotowywany jest nowy zawiesinę krwinek czerwonych, należy ponownie wyznaczyć tytuł HA.

3. Titerowanie antygenów metodą HA

  1. Pipetuj odpowiednio 40, 80, 120 i 160 µL PBS do czterech sąsiednich dołków jednorazowej 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej o kształcie V na dnie, następnie dodaj po 20 µL antygenu do każdego dołka i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy, aby uzyskać rozcieńczenia odpowiednio 1:3, 1:5, 1:7 i 1:9. Schematyczny rysunek operacji rozcieńczania przedstawiono na Rysunku 1.

Metoda rozcieńczeń szeregowych, dodawanie PBS i antygenu, schemat, technika pipetowania, przygotowanie ELISA.
Rycina 1: Schematyczny diagram ilustrujący procedurę rozcieńczania roztworu antygenu w teście hemaglutynacji. Roztwór antygenu rozcieńcza się w buforze PBS w stosunkach 1:3, 1:5, 1:7 oraz 1:9. PBS w dołkach płytek lub probówkach wirówek oznaczono na niebiesko, a antygeny przedstawiono na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Oznacz nową płytę mikrotitracyjną. Dodaj po 25 µL roztworu PBS do każdego dołka w rzędach 1–5.
  2. Pipetą wielokanałową dodaj po 25 µL rozcieńczonych roztworów antygenu do pierwszych dołków rzędów 1–5 i wymieszaj, pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy.
  3. Przenieś po 25 µL z pierwszego dołka każdego rzędu do drugiego dołka, dokładnie wymieszaj. Kontynuuj przenoszenie z dołka do dołka aż do 11. kolumny, aby uzyskać kolejne rozcieńczenia dwukrotne (1:2 do 1:2048). Po 11. kolumnie odrzuć 25 µL.
  4. Dodaj po 25 µL roztworu PBS do każdego dołka, zaczynając od tych zawierających najniższe stężenie antygenu.
  5. Dodaj po 25 µL zawiesiny krwinek czerwonych kurzych (1%) do każdego dołka, ponownie zaczynając od dołków o najniższym stężeniu antygenu.
  6. Wymieszaj dokładnie, wstrząsając płytą na wstrząsarce mikropłytkowej przez około 20 s.
  7. Pozostaw płytę nietkniętą na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez około 30 min, aż krwinki czerwone w 12. kolumnie całkowicie osiądą. Schemat układu płyty przedstawiono na Rysunku 2.

Diagram sekwencyjnego rozcieńczenia dwukrotnego w mikropłytkach; gradient pokazuje poziomy rozcieńczenia antygenu.
Rycina 2: Schematyczny układ mikropłytki stosowanej w teście aglutynacji krwinek czerwonych. Pierwsza kolumna wierszy 1–5 zawiera nierozcieńczony roztwór antygenu oraz różne wstępne rozcieńczenia, po których następuje sekwencyjne rozcieńczanie dwukrotne w kierunku od lewej do prawej aż do kolumny 11. Kontrola zawierająca bufor PBS znajduje się w ostatniej kolumnie. Gradient od ciemnego do jasnego odcienia wskazuje malejące stężenie antygenu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

  1. Odczytaj i zapisz wyniki. Aglutynację hemaglutynującą (HA) wyznacza się poprzez przechylenie płytki o 90° na około 25 s i obserwację występowania lub braku strumieniowania krwinek czerwonych w kształcie łez. Najwyższe rozcieńczenie, w którym obserwuje się pełną hemaglutynację (brak strumieniowania), odpowiada 1 jednostce HA. Studzienki w 12. kolumnie stanowią kontrole krwinek czerwonych (ujemne).
  2. Oblicz tytrom HA dla każdego rzędu, korzystając z Tabela 1, a następnie użyj najwyższej wartości do przygotowania roztworu antygenu o stężeniu 4 jednostek HA. Na przykład, jeśli wartości a, b, c, d i e wynoszą odpowiednio 9, 8, 7, 6, 6, wówczas największą wartością jest 3 x 28 = 768, która stanowi tytr HA roztworu antygenu.
AntygenyKolumna najwyższych rozcieńczeń pełnego HAWitrość HA nierzozcieńczonego roztworu zapasowego
Nierzozcieńczony roztwór zapasowya2a
Rozcieńczenie 3-krotneb3 x 2b
Rozcieńczenie 5-krotnec5 x 2c
Rozcieńczenie 7-krotned7 x 2d
Rozcieńczenie 9-krotnee9 x 2e

Tabela 1: Wyniki testu HA i obliczenie miana HA roztworu wyjściowego.

4. Przygotowanie roztworu antygenu 4-HAU

  1. Oblicz czynnik rozcieńczenia do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU: Równanie testu hemaglutynacji D=HATiter/4; analiza ilościowa w badaniach wirusologicznych.. Określ całkowitą objętość 4-HAU potrzebną do pracy: V = 3 mL × liczba mikropłytek. Następnie oblicz wymagane objętości roztworu macierzystego antygenu: Równanie równowagi statycznej Va=V/D, wzór, cele edukacyjne. oraz roztworu PBS: Vp = V – Va.
    UWAGA: Objętości są podawane w mililitrach. Szacunkowo potrzeba 3 mL na każdą mikropłytkę 4-HAU (25 µL/dobrka × 96 dobrok × 1,25 = 3 mL).
  2. Pipetą odmierz obliczoną objętość roztworu PBS do pojemnika, dodaj odpowiednią objętość roztworu macierzystego antygenu i dokładnie wymieszaj, aby uzyskać roztwór antygenu 4-HAU.
    UWAGA: Roztwór antygenu 4-HAU należy używać jak najszybciej po przygotowaniu.

5. Miareczkowanie odwrotne roztworu antygenu 4-HAU

  1. Pipetuj 25, 50, 75, 100, 125 i 150 µL PBS do sześciu sąsiednich dołków płytki mikrotitracyjnej, następnie dodaj po 25 µL roztworu antygenu 4-HAU do każdego dołka i mieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    UWAGA: Rozcieńcz roztwór antygenu 4-HAU roztworem PBS w stosunkach 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 i 1:7. Schematyczny rysunek operacji rozcieńczania przedstawiono na Ryc. 3.

Schemat pipetowania; dodawanie objętości PBS i roztworu 4-HAU, układ wielopłytowy, procedura mieszania.
Rycina 3: Schematyczny diagram procedury rozcieńczania roztworu o stężeniu 4 jednostek hemaglutynacji w tytryzacji wstecznej. Roztwór roboczy 4-HAU rozcieńcza się buforem PBS w stosunkach 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 oraz 1:7. Bufor PBS przedstawiono na niebiesko, a antygeny na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Przenieś po 25 µL każdego rozcieńczonego roztworu antygenu do dołków kolejnego rzędu za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj 25 µL PBS do dodatkowego dołka jako kontrolę ujemną.
  2. Dodaj po 25 µL PBS do każdego dołka, a następnie dodaj po 25 µL 1% krwinek czerwonych kurzych do każdego dołka.
  3. Mieszaj płytkę na wibratorze mikropłytkowym przez około 20 s.
  4. Odwiecz płytkę bez zakłóceń na stole w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez około 30 min, aż do całkowitego osiadnięcia krwinek czerwonych w kontrolce ujemnej.
  5. Odczytaj i zanotuj wyniki.
    UWAGA: W dołku kontrolnym nie powinno wystąpić hemaglutynacji. W idealnym przypadku rozcieńczenie 1:4 to dokładnie najwyższe rozcieńczenie, przy którym występuje pełna hemaglutynacja. Jeśli mian roztworu 4-HAU jest wyższy niż 4, najwyższe rozcieńczenie może wynosić 1:5, 1:6 lub 1:7; jeśli niższy – może to być 1:2 lub 1:3. Schematyczny układ tytryzacji wstecznej oraz przykładowe wyniki przedstawiono na Rysunku 4.

Badanie seryjnych rozcieńczeń, antygen 4-HAU, wyniki hemaglutynacji, krotności rozcieńczeń, analiza tytracji.
Rycina 4: Schematyczny układ dołków do tytracji wstecznej oraz reprezentatywny wynik. Rozcieńczony roztwór roboczy 4-HAU przenosi się do nowego rzędu, z dodatkowym kontrolnym buforem PBS. Gradient od ciemno do jasnozielonego oznacza stężenie antygenu od wysokiego do niskiego. Reprezentatywne wyniki pokazują, że rozcieńczenie 1:4 to najwyższe rozcieńczenie, przy którym obserwuje się pełną hemaglutynację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Dostosuj lub przeformułuj roztwór antygenu 4-HAU, jeśli to konieczne.
    UWAGA: Jeśli objętość roztworu antygenu 4-HAU użyta w tytryzacji wstecznej wynosi ≤1% objętości całkowitej (objętość roztworu antygenu 4-HAU ≥ 15 mL), skorzystaj z Tabeli 2, aby wprowadzić odpowiednie korekty. Na przykład, jeśli najwyższe rozcieńczenie dające pełną hemaglutynację wynosi 1:2, mian roztworu antygenu 4-HAU wynosi obecnie 2 i należy dodać taką samą objętość antygenu, jak w poprzednim przygotowaniu roztworu 4-HAU. Z kolei, jeśli najwyższe rozcieńczenie dające pełną hemaglutynację wynosi 1:6, mian roztworu antygenu 4-HAU wynosi obecnie 6 i należy uzupełnić połowę objętości roztworem PBS.
    Jeśli objętość użyta w tytryzacji wstecznej przekracza 1% objętości całkowitej (objętość roztworu antygenu 4-HAU < 15 mL), przeformułuj roztwór antygenu 4-HAU, stosując skorygowany współczynnik rozcieńczenia. Skorzystaj z Tabeli 3, aby określić odpowiednie korekty. Na przykład, jeśli najwyższe rozcieńczenie dające pełną hemaglutynację wynosi 1:2, mian roztworu antygenu 4-HAU wynosi obecnie 2, a współczynnik rozcieńczenia należy dostosować do 1/2 wartości pierwotnej. Z kolei, jeśli najwyższe rozcieńczenie dające pełną hemaglutynację wynosi 1:6, mian roztworu antygenu 4-HAU wynosi obecnie 6, a współczynnik rozcieńczenia należy dostosować do 3/2 wartości pierwotnej.
Tytrowanie HA w tyłUzupełnienie antygenu lub PBS
1:2Va
1:3Va/3
1:5Vp/4
1:6Vp/2
1:73Vp/4

Tabela 2: Tabela odniesienia do korygowania stężenia 4-HAU na podstawie wyników tytracji odwrotnej. Va i Vp oznaczają odpowiednio objętości antygenu i roztworu buforowego PBS użyte do przygotowania roztworu antygenu o stężeniu 4-HAU.

Wysokość miana HA w tytryzacji wstecznejKorekta współczynnika rozcieńczenia
1:2D/2
1:33D/4
1:55D/4
1:63D/2
1:77D/4

Tabela 3: Tabela odniesienia czynnika rozcieńczenia do ponownego przygotowania antygenu 4-HAU. D oznacza czynnik rozcieńczenia wcześniej używany w przygotowaniu antygenu 4-HAU.

6. Przygotowanie surowicy

  1. Zbierz około 1 mL krwi z krwi wyciętej z skrzydeł kurzych bez użycia antykoagulanta.
  2. Przenieś krew do probówki wirowarkowej o pojemności 1,5 mL i inkubuj w temperaturze 37 °C przez około 2 h. Wirowanie przeprowadź przy 3 000 x g przez 10 min, a następnie ostrożnie odessaj supernatant do nowej probówki.

7. Test hemaglutynacji

  1. Oznacz płytki mikrotitracyjne zgodnie z układem testu. Dodaj 25 µL PBS do każdego dołka w kolumnach 1–11 oraz 50 µL do dołków w kolumnie 12, używając pipety wielokanałowej.
  2. Dodaj po 25 µL surowicy do pierwszego dołka każdego rzędu, w tym rzędów zawierających dodatni i ujemny kontrolny próbkę surowicy. Dokładnie wymieszaj, przez pipetowanie w górę i w dół co najmniej 5 razy.
  3. Przenieś 25 µL z pierwszego dołka każdego rzędu do drugiego dołka i dokładnie wymieszaj. Kontynuuj przenoszenie i mieszanie z drugiego dołka do trzeciego i tak dalej, aż do kolumny 10. Odrzuć 25 µL cieczy z dołka w kolumnie 10 po wymieszaniu.
  4. Dodaj po 25 µL antygenu 4-HAU do każdego dołka w kolumnach 1–11, w kierunku od niskiego do wysokiego stężenia surowicy.
  5. Potrząśnij płytką na wstrząsarce do mikopłytek przez około 20 s. Pozostaw ją nietkniętą na blacie przez około 30 min.
  6. Dodaj po 25 µL 1% krwinek czerwonych kurzych do każdego dołka w kierunku od niskiego do wysokiego stężenia surowicy.
  7. Potrząśnij płytką na wstrząsarce do mikopłytek przez około 20 s, aby dokładnie wymieszać. Pozostaw ją nietkniętą na blacie przez około 30 min, aż krwinki czerwone w dołkach kontrolnych z PBS całkowicie się osadzą.
  8. Odczytaj i zanotuj wyniki.
    UWAGA: Tytrom HI jest najwyższe rozcieńczenie surowicy, które całkowicie hamuje hemaglutynację antygenu 4-HAU. Kroplowaty ślad krwinek czerwonych można zaobserwować w ostatniej kolumnie każdego rzędu, po przechyleniu płytki o 90° na 25 s. Pełna HA (brak śladu) może być zaobserwowana w przedostatnim dołku każdego rzędu. Aby wynik testu był poprawny, tytr HI dodatniego kontrolnego próbnika surowicy musi mieścić się w granicach jednego rozcieńczenia od znanego tytru HI; tytr HI ujemnego kontrolnego próbnika surowicy musi wynosić ≤ 2 log2; oraz nie może występować samoistna HA w kontrolnym próbniku krwinek czerwonych. Schematyczny diagram przebiegu testu HA przedstawiono na Rysunku 5.

Schemat procedury ELISA; sekwencyjne rozcieńczenia mikopłytki, dodanie antygenu, PBS; wstrząsarka, etapy inkubacji.
Rycina 5: Schematyczny diagram procedury testu hemaglutynacji. PBS oznaczono na niebiesko, surowicę na żółto, roztwór antygenu 4-HAU na zielono, a zawiesinę 1% czerwonych krwinek kurzych na czerwono. Strzałki wskazują kolejność dawkowania cieczy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidacja miana roztworu antygenu 4-HAU przygotowanego zgodnie z zoptymalizowaną metodą
W badaniu zastosowano różne rozcieńczenia roztworu zapasu antygenu, aby dokładnie określić miano HA, co ułatwiło obliczenie czynnika rozcieńczenia niezbędnego do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Wyniki wykazują, że zoptymalizowana metoda jest zarówno wydajna, jak i precyzyjna, co pozwala na zmniejszenie liczby powtarzalnych procedur wstecznego mianowania i korekty. W pierwszym przypadku początkowe miano HA w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zoptymalizowana metoda zaproponowana w niniejszym artykule przedstawia podejście do precyzyjnego przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Chociaż wytyczne OIE i UE sugerują wstępne rozcieńczenia dla miareczkowania HA, nie podają one dokładnych szczegółów dotyczących stosunków rozcieńczeń ani nie oferują konkretnych metodologii11,12. Ponadto, mimo że FAO i OIE zalecają miareczkowanie powrotne jako sposób na zwiększenie dokładności 4-HAU, brakuje im jasnego protokołu11<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

C.C. był wspierany przez program Taicang Technology (TC2021JC16) oraz Fundusze Zespołu ds. Innowacji Instytutu Technologii Suzhou Chien-shiung (2023JXKYTD01). H.Y. był wspierany przez program Taicang Technology (TC2021JC11). Oba projekty były wspierane przez Start-up Fund for New Ph.D. Researchers z Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Sterylna probówka wirówkowa (15 ml) Labshark130201030
Wolnoobrotowa wirówka stołowa chłodzona powietrzem TitanLDC-5
Alserve's SolutionSangon BiotechE607058
WirówkaDLAB9032002121
Jednorazowa pipeta PasteuraTitanSWXG-004
Jednorazowa sterylna strzykawka (1 ml)BeyotimeFS801-30PCS Jednorazowa
V (96 dołków)Labshark
Wytrząsarka do mikropłytekJiangsu Xinkang Medical Equipment Co., LtdXK96-3
NDV HI Ujemna surowicaQingdao Centrum Rozwoju
NDV HI Dodatnia surowicaQingdao Centrum Rozwoju
NDV HI Test antygenuQingdao Centrum Rozwoju
PBS Rozwiązanie (1x) Adamas LifeC8020
Sterylna probówka wirówkowa (1,5 ml)Labshark130201012
płytka do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery 130207001Diagnostyki RegenDiagnostyki RegenDiagnostyki Regen

Bibliografia

  1. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. (80), e50830(2013).
  2. Chen, Y., et al. The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization. PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).
  3. Miller, P. J., Decanini, E. L., Afonso, C. L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infect Genet Evol. 10 (1), 26-35 (2010).
  4. Terregino, C., Capua, I. Clinical traits and pathology of Newcastle disease infection and guidelines for farm visit and differential diagnosis. Avian Influenza and Newcastle Disease: A Field and Laboratory. , 113-122 (2009).
  5. Dimitrov, K. M., Afonso, C. L., Yu, Q., Miller, P. J. Newcastle disease vaccines—A solved problem or a continuous challenge. Vet Microbiol. 206, 126-136 (2017).
  6. Sheng, W., et al. Molecular characteristics and phylogenetic analysis of pigeon paramyxovirus type 1 isolates from pigeon meat farms in Shanghai (2009-2012). Sci Rep. 14 (1), 10741(2024).
  7. Yates, J. G. E., et al. Production of high-titer recombinant Newcastle disease virus from allantoic fluid. J of Vis Exp. (183), e63817(2022).
  8. van Boven, M., et al. Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol. 37 (1), 1-5 (2008).
  9. Oberländer, B., et al. Evaluation of Newcastle disease antibody titers in backyard poultry in Germany with a vaccination interval of twelve weeks. PloS One. 15 (8), e0238068(2020).
  10. Bhattacharya, S., et al. Spillover of Newcastle disease virus to Himalayan Griffon vulture: a possible food-based transmission. Virus Genes. 60 (4), 385-392 (2024).
  11. World Organisation for Animal Health (OIE). Newcastle disease (Infection with Newcastle disease virus). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. , (2024).
  12. Council of European Union. Council Directive 92/66/EEC of 14 July 1992 Introducing Community measures for the control of Newcastle disease. Document 31992L0066. L260, 1-20 (1992).
  13. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. 2002/22, RAP Publication. 1-129 (2002).
  14. Dortmans, J. C. F. M., Peeters, B. P. H., Koch, G. Newcastle disease virus outbreaks: Vaccine mismatch or inadequate application. Vet Microbiol. 160 (1-2), 17-22 (2012).
  15. De Sousa, R. L. M., Montassier, H. J., Pinto, A. A. Detection and quantification of antibodies to Newcastle disease virus in ostrich and Rhea sera using a liquid phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (6), 940-944 (2000).
  16. Chumbe, A., Izquierdo-Lara, R., Calderón, K., Fernández-Díaz, M., Vakharia, V. N. Development of a novel Newcastle disease virus (NDV) neutralization test based on recombinant NDV expressing enhanced green fluorescent protein. Virol J. 14 (1), 232(2017).
  17. Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO animal influenza manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test HIantygen 4-HAUdetekcja przeciwciałmetoda wstecznego miareczkowaniakurze erytrocytypłytka mikrotitracyjnadetekcja serologiczna
Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.