Artykuł metodologiczny

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

DOI:

10.3791/67256

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna ocena miana przeciwciał wirusa rzekomego pomoru drobiu (NDV) jest kluczowa dla skutecznej kontroli i nadzoru nad chorobami drobiu. W artykule przedstawiono zoptymalizowaną metodę przygotowania roztworu antygenu z 4 jednostek hemaglutynacji (4-HAU), kluczowego składnika testu hamowania hemaglutynacji (HI) stosowanego w wykrywaniu serologicznym NDV. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod, które obejmują czasochłonne i niezdefiniowane etapy miareczkowania wstecznego i adiustacji, to podejście usprawnia ten proces poprzez dokładny pomiar miana kwasu hialuronowego przy użyciu początkowej serii rozcieńczeń (1:3, 1:5, 1:7 i 1:9). Zapewniamy również specjalną metodę dostosowywania lub zmiany formuły w oparciu o wyniki miareczkowania wstecznego, zmniejszając potrzebę wielokrotnego miareczkowania wstecznego. Ponadto oceniliśmy wpływ dokładności roztworu antygenu 4-HAU na miano HI w surowicy i stwierdziliśmy, że gdy miano antygenu 4-HAU było niższe niż 3, spowodowało to pojawienie się fałszywie dodatnich próbek HI. Zapewniając dokładną metodę i minimalizując zadania obliczeniowe, podejście to zwiększa wydajność i wiarygodność testów, przyczyniając się do poprawy nadzoru i kontroli chorób w populacjach drobiu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Newcastle Disease (ND) to powszechna i poważna choroba drobiu rozpoznawana na całym świecie1,2,3. Objawia się różnymi objawami, takimi jak wysoka gorączka, niewydolność oddechowa, czerwonka, zaburzenia nerwowe i krwotok śluzówkowy4. Czynnik sprawczy, wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), przetrwał prawie sto lat, atakując ponad 200 gatunków ptaków, w tym kurczaki, kaczki, gęsi i gołębie5. Przenoszenie następuje głównie poprzez bezpośredni lub pośredni kontakt z zakażonymi ptakami, przy czym drób, gołębie i ptaki żyjące na wolności służą jako potencjalne rezerwuary6. Pomimo pojedynczego serotypu NDV, jego różnorodność genetyczna stanowi poważne wyzwanie dla zarządzania i kontroli choroby3,7.

Szczepienie służy jako podstawowa strategia kontroli ND, uzupełniona rygorystycznymi środkami bezpieczeństwa biologicznego5,8. Na całym świecie dostępne są różne komercyjne szczepionki dla drobiu, które wywołują silną odpowiedź przeciwciał w surowicy po szczepieniu9. Przeciwciała te odgrywają kluczową rolę w łagodzeniu nasilenia objawów po ekspozycji na zjadliwe szczepy oraz w ograniczaniu transmisji międzystadnej10. Standardowe protokoły szczepień przypominających, zazwyczaj obejmujące żywe atenuowane szczepionki podawane co 6-12 tygodni, są standardową praktyką w regionach endemicznych dla ND9. Rutynowe monitorowanie mian przeciwciał po szczepieniu w komercyjnych stadach drobiu jest niezbędne do oceny skuteczności szczepionki11,12,13. Niskie miana przeciwciał po szczepieniu mogą wskazywać na niepowodzenie szczepienia, skłaniając do podjęcia w odpowiednim czasie działań naprawczych, takich jak szczepienie uzupełniające lub badanie potencjalnych czynników immunosupresyjnych wpływających na odpowiedź immunologiczną14.

Do wykrywania przeciwciał przeciwko NDV w surowicy wykorzystuje się wiele technik, w tym test immunoenzymatyczny połączony z immunosorbentem, hamowanie hemaglutynacji (HI) i test neutralizacji9,13,15,16. Każda metoda ma unikalne zalety i ograniczenia dotyczące czułości, swoistości i opłacalności.

Ten artykuł opisuje krok po kroku protokół oparty na protokole Światowej Organizacji Zdrowia Zwierząt (OIE) do przeprowadzania HI w celu ilościowego określenia miana przeciwciał specyficznych dla surowicy przeciwko NDV11. Hemagglutynacja (HA), zjawisko wywołane przez niektóre wirusy otoczkowe, takie jak NDV, polega na zlepianiu się czerwonych krwinek (RBC)9. Białko hemaglutyniny-neuraminidazy (HN) na powierzchni NDV oddziałuje z krwinkami czerwonymi, powodując zlepianie się komórek i tworzenie sieci2. Test HI jest preferowany jako metoda serologiczna ze względu na jego zdolność do oceny swoistości przeciwciał w surowicy w stosunku do białka HN NDV8,9. Co więcej, jego opłacalność i niezależność od specjalistycznego oprzyrządowania sprawiają, że jest dostępny i praktyczny w rutynowym użytkowaniu.

Aby poprawić efektywność testu, udoskonaliliśmy przepływ pracy protokołu OIE11, koncentrując się na uzyskaniu dokładniejszych mian antygenu HA i oferując szczegółowe korekty dla roztworu antygenu 4 jednostek hemaglutynacji (4-HAU). Dodatkowo, poprzez analizę porównawczą, oceniliśmy wpływ dokładności 4-HAU na wyniki HI, dostarczając cennych informacji dla praktyków terenowych. Podejście to nie ogranicza się do badania przeciwciał NDV, ale obejmuje wykrywanie podtypów wirusa i innych wirusów hemaglutynujących, w tym odry, poliomawirusa, świnki i różyczki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zatwierdzenie protokołu zostało udzielone przez lokalny instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt. Wszystkie procedury z udziałem żywych antygenów wirusa i klinicznych próbek surowicy przeprowadzono w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, zgodnie z ustalonymi protokołami bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie 1% zawiesiny RBC kurczaka

  1. Dodać 3 ml roztworu Alserver (antykoagulantu) do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  2. Zbierz 1 ml krwi z żyły skrzydłowej każdego z trzech nieuodpornionych kurcząt (bez przeciwciał NDV). Natychmiast przenieść krew do probówki zawierającej antykoagulant i delikatnie wymieszać.
  3. Napełnij probówkę sterylnym 1x roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, pH 7,2-7,4) do całkowitej objętości 12 ml i delikatnie wymieszaj. Wirować przy 500 × g przez 10 minut za pomocą poziomego wirnika.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant i warstwę białych krwinek. Powtórz kroki 1.3 i 1.4 2x, aby uzyskać osad RBC.
  5. Odwróć pipetą 1 ml osadu RBC do 99 ml sterylnego PBS, aby przygotować 1% zawiesinę RBC.
    UWAGA: Wymaganą objętość 1% zawiesiny RBC kurczaka szacuje się na 3 ml / płytkę (25 μl / basenik x 96 dołków x 1,25 = 3,0 ml; gdzie 1,25 odpowiada marnotrawstwu pipetowania w celu zapewnienia wystarczającej objętości).

2. Rekonstytucja liofilizowanego antygenu lub surowicy

  1. Dodać 2 ml sterylnego PBS do ampułki zawierającej liofilizowany antygen lub surowicę. Delikatnie wstrząśnij ampułką i odstaw ją na 2-3 minuty, aby zminimalizować pęcherzyki i zapewnić całkowite rozpuszczenie.
    UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, ponieważ w tym badaniu nie porównano różnych rodzajów materiałów liofilizowanych.
  2. Przygotowany roztwór rozdzielić na 1,5 ml probówek wirówkowych i zamrozić w temperaturze -20 °C do momentu użycia><. UWAGA: Ponownie określ miano kwasu hialuronowego za każdym razem, gdy antygen jest rozmrażany i używany lub gdy przygotowywana jest nowa zawiesina RBC.

3. Miareczkowanie antygenów HA

  1. Dozować odpowiednio 40, 80, 120 i 160 μl PBS do czterech sąsiednich studzienek jednorazowej 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery V, a następnie dodać 20 μl antygenu do każdej studzienki i wymieszać, pipetując w górę i w dół 10x, aby uzyskać rozcieńczenia odpowiednio 1:3, 1:5, 1:7 i 1:9. Schematyczny schemat operacji rozcieńczania jest pokazany w Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat ilustrujący procedurę rozcieńczania roztworu antygenu w teście hemaglutynacji. Roztwór antygenu rozcieńcza się w PBS w proporcjach odpowiednio 1:3, 1:5, 1:7 i 1:9. PBS w studzienkach lub probówkach wirówkowych jest reprezentowany na niebiesko, podczas gdy antygeny są pokazane na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Oznacz nową płytkę do mikromiareczkowania. Dodaj 25 μl PBS do każdej studzienki w rzędach 1-5.
  2. Umieścić 25 μl rozcieńczonych roztworów antygenu w pierwszych studzienkach rzędów 1-5 za pomocą pipety wielokanałowej i mieszać, pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy.
  3. Przenieść 25 μl z pierwszego dołka z każdego rzędu do drugiego dołka, dokładnie mieszając. Kontynuuj przenoszenie z jednego dołka do drugiego, aż do 11. kolumny, aby utworzyć dwukrotne seryjne rozcieńczenia (1:2 do 1:2048). Odrzucić 25 μl za 11. kolumną.
  4. Dodać 25 μl PBS do każdej studzienki, zaczynając od studzienek zawierających najniższe stężenie antygenu.
  5. Dodać 25 μl 1% zawiesiny krwinek czerwonych kurczaka do każdej studzienki, ponownie zaczynając od studzienek zawierających najniższe stężenie antygenu.
  6. Potrząsaj płytką na wytrząsarce do mikropłytek przez ~20 s, aby dokładnie wymieszać.
  7. Pozostaw go w spokoju na blacie w temperaturze pokojowej (20-25 °C) na ~30 minut, aż RBC 12. kolumny całkowicie się uspokoi. Aby zapoznać się z układem płyty, zapoznaj się z Rysunek 2.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematyczny układ mikropłytki użytej w teście hemaglutynacji. Pierwsza kolumna wierszy 1-5 zawiera nierozcieńczone i różne początkowe rozcieńczenia roztworu antygenu, po których następuje dwukrotne seryjne rozcieńczenie od lewej do prawej aż do kolumny 11. Formant PBS jest umieszczany w ostatniej kolumnie. Gradient od ciemnego do jasnego wskazuje na malejące stężenie antygenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Odczytaj i zapisz wyniki. HA określa się poprzez przechylenie płytki o 90° przez ~25 s i obserwację obecności lub braku strumienia RBC w kształcie łzy. Najwyższe rozcieńczenie wykazujące całkowitą hemaglutynację (bez strumieniowania) odpowiada 1 jednostce HA. Studzienki w 12. kolumnie służą jako kontrole RBC (negatywne).
  2. Obliczyć miano kwasu hialuronowego w każdym rzędzie, korzystając z tabeli 1, z których maksimum stosuje się do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Na przykład, jeśli a, b, c, d i e są równe odpowiednio 9, 8, 7, 6, 6, to 3 x 28 = 768 jest wartością maksymalną i jest mianem HA zasobu antygenu.
antygenyKolumna o najwyższym rozcieńczeniu pełnego kwasu hialuronowegoMiano kwasu hialuronowego w nierozcieńczonym materiale
Nierozcieńczony materiał surowyZA2a
3-krotne rozcieńczenieb3 x 2b
5-krotne rozcieńczeniec5 x 2c
Rozcieńczenie 7-krotned7 x 2d
9-krotne rozcieńczeniee9 x 2e

Tabela 1: Wyniki testu HA i obliczanie miana HA w roztworze podstawowym.

4. Przygotowanie roztworu antygenu 4-HAU

  1. Obliczyć współczynnik rozcieńczenia do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU: figure-protocol-3. Określ całkowitą potrzebną objętość 4-HAU: V = 3 ml x liczba mikropłytek. Następnie oblicz wymagane objętości roztworu podstawowego antygenu: figure-protocol-4, oraz PBS: Vp = V - Va.
    UWAGA: Objętości są mierzone w mililitrach. Oszacuj 3 ml na płytkę do mikromiareczkowania 4-HAU (25 μl/studzienka x 96 dołków x 1,25 = 3 ml).
  2. Odpipetować obliczoną objętość PBS do pojemnika, następnie dodać odpowiednią objętość roztworu podstawowego antygenu i dobrze wymieszać, aby otrzymać roztwór antygenu 4-HAU.
    UWAGA: Roztwór antygenu 4-HAU należy zużyć tak szybko, jak to możliwe.

5. Miareczkowanie wsteczne roztworu antygenu 4-HAU

  1. Dozować 25, 50, 75, 100, 125 i 150 μl PBS do sześciu sąsiednich dołków płytki do mikromiareczkowania, następnie dodać 25 μl roztworu antygenu 4-HAU do każdego dołka i mieszać pipetując w górę iw dół 10x.
    UWAGA: Rozcieńczyć roztwór antygenu 4-HAU PBS w rozcieńczeniach 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 i 1:7. Schematyczny schemat operacji rozcieńczania jest pokazany na Rysunek 3.

figure-protocol-5
Rysunek 3: Schemat ideowy procedury rozcieńczania roztworu 4 jednostek hemaglutynacji w miareczkowaniu wstecznym. Roztwór roboczy 4-HAU rozcieńcza się PBS w proporcjach 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 i 1:7. PBS jest przedstawiony na niebiesko, a antygeny na zielono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przenieść 25 μl każdego rozcieńczonego roztworu antygenu do studzienek w innym rzędzie za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj 25 μl PBS do dodatkowego dołka jako kontroli ujemnej.
  2. Dodaj 25 μl PBS do każdej studzienki, a następnie dodaj 25 μl 1% krwinek czerwonych kurczaka do każdej studzienki.
  3. Potrząsaj płytką na wytrząsarce do mikropłytek przez ~20 s, aby wymieszać.
  4. Pozostawić w spokoju na blacie w temperaturze pokojowej (20-25 °C) przez ~30 minut, aż erytrocyty kontroli ujemnej całkowicie się uspokoją.
  5. Przeczytaj i zapisz wyniki.
    UWAGA: Studzienka kontroli ujemnej nie powinna wykazywać kwasu hialuronowego. Idealnie, rozcieńczenie 1:4 jest dokładnie najwyższym rozcieńczeniem z pełnym kwasem hialuronowym (HA). Jeżeli miano roztworu 4-HAU jest większe niż 4, najwyższe rozcieńczenie może wynosić 1:5, 1:6 lub 1:7; Jeśli mniej, może to być 1:2 lub 1:3. Schematyczny układ miareczkowania wstecznego i reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 4.

figure-protocol-6
Rysunek 4: Schematyczny układ odwiertów do miareczkowania wstecznego i reprezentatywnego wyniku. Rozcieńczony roztwór roboczy 4-HAU przenosi się do nowego rzędu, z dodatkiem dodatkowej kontroli PBS. Gradient od ciemnego do jasnozielonego wskazuje stężenie antygenu od wysokiego do najniższego. Reprezentatywne wyniki pokazują, że rozcieńczenie 1:4 jest najwyższym rozcieńczeniem wykazującym całkowitą hemaglutynację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. W razie potrzeby dostosować lub zmienić formułę roztworu antygenu 4-HAU.
    UWAGA: Jeżeli objętość roztworu antygenu 4-HAU użytego do miareczkowania wstecznego wynosi ≤1% całkowitej objętości (objętość roztworu antygenu 4-HAU ≥ 15 ml), należy zapoznać się z tabelą 2 w celu uzyskania szczegółowych dostosowań. Na przykład, jeśli najwyższe rozcieńczenie z pełnym HA wynosi 1:2, miano roztworu antygenu 4-HAU wynosi teraz 2 i należy dodać równą objętość antygenu, jak w poprzednim przygotowaniu roztworu antygenu 4-HAU. I odwrotnie, jeśli najwyższe rozcieńczenie całkowitego kwasu hialuronowego wynosi 1:6, miano wynosi teraz 6 i należy uzupełnić połowę objętości PBS.
    Jeżeli objętość użyta w miareczkowaniu wstecznym przekracza 1% całkowitej objętości (objętość roztworu antygenu 4-HAU < 15 ml), należy zmienić skład roztworu antygenu 4-HAU, stosując skorygowany współczynnik rozcieńczenia. Szczegółowe korekty znajdują się w tabeli 3. Na przykład, jeśli najwyższe rozcieńczenie całkowitego kwasu hialuronowego wynosi 1:2, miano roztworu antygenu 4-HAU wynosi teraz 2, a współczynnik rozcieńczenia należy dostosować do 1/2 pierwotnego. I odwrotnie, jeśli najwyższe rozcieńczenie całkowitego HA wynosi 1:6, miano roztworu antygenu 4-HAU wynosi teraz 6, a współczynnik rozcieńczenia dostosowuje się do 3/2 pierwotnego.
Miano kwasu hialuronowego w procesie miareczkowania wstecznegoUzupełnienie antygenu lub PBS
1:2Va
1:3VA/3
1:5Wice/4
1:6Vp/2
1:73Vp/4

Tabela 2: Tabela referencyjna do regulacji stężenia 4-HAU na podstawie wyników miareczkowania wstecznego. Va i Vp reprezentują objętości antygenu i PBS użyte odpowiednio w postaci roztworu antygenu 4-HAU.

Miano kwasu hialuronowego w procesie miareczkowania wstecznegoKorekta współczynnika rozcieńczenia
1:2D/2
1:33D/4
1:55D/4
1:63D/2
1:77D/4

Tabela 3: Tabela referencyjna korekty współczynnika rozcieńczenia dla ponownego przygotowania antygenu 4-HAU. D oznacza współczynnik rozcieńczenia poprzednio stosowany w preparacie antygenu 4-HAU.

6. Przygotowanie surowicy

  1. Zbierz ~1 ml krwi ze skrzydełek kurczaka bez użycia antykoagulantu.
  2. Przenieść krew do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez ~2 godziny. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut i ostrożnie zassać supernatant do nowej probówki.

7. Test HI

  1. Oznaczyć płytki do mikromiareczkowania zgodnie z układem testu. Dodać 25 μl PBS do każdego dołka w kolumnach 1-11 i 50 μl do studzienek w kolumnie 12, używając pipety wielokanałowej.
  2. Dodać 25 μl surowicy do pierwszego dołka w każdym rzędzie, w tym do dodatniego i ujemnego rowka kontrolnego surowicy. Dokładnie wymieszaj, pipetując w górę i w dół co najmniej 5 razy.
  3. Przenieść 25 μl z pierwszego dołka każdego rzędu do drugiego dołka i dokładnie wymieszać. Kontynuuj przenoszenie i mieszanie z drugiej studzienki do trzeciej i tak dalej, aż do 10. kolumny. Po wymieszaniu wylać 25 μl cieczy z dołka w 10. kolumnie.
  4. Dodać 25 μl antygenu 4-HAU do każdej studzienki w kolumnach 1-11 w kierunku niskiego do wysokiego stężenia w surowicy.
  5. Potrząsaj płytką na wytrząsarce do mikropłytek przez ~20 s. Pozostaw ją w spokoju na blacie na ~30 min.
  6. Dodać 25 μl 1% krwinek czerwonych kurczaka do każdej studzienki w kierunku niskiego do wysokiego stężenia w surowicy.
  7. Potrząsaj płytką na wytrząsarce do mikropłytek przez ~20 s, aby dokładnie wymieszać. Pozostaw go w spokoju na blacie przez ~ 30 minut, aż erytrocyty studzienek kontrolnych PBS zostaną całkowicie osadzone.
  8. Przeczytaj i zapisz wyniki.
    UWAGA: Miano HI to najwyższe rozcieńczenie surowicy, które całkowicie hamuje hemaglutynację antygenu 4-HAU. Strumień RBC w kształcie łzy można zaobserwować w ostatniej kolumnie każdego rzędu, przechylając płytkę o 90° przez 25 s. Pełny HA (bez strumieniowania) można zaobserwować w przedostatniej studni od końca każdego rzędu. Ważne wyniki badań wymagają, aby miano HI dodatniej surowicy kontrolnej mieściło się w zakresie jednego rozcieńczenia od znanego miana HI; miano HI w ujemnej surowicy kontrolnej wynoszące ≤ 2 log2; oraz brak samo-HA kontroli RBC. Aby zapoznać się ze schematem przebiegu testu HA, zobacz Rysunek 5.

figure-protocol-7
Rysunek 5: Schemat przebiegu testu hemaglutynacji. PBS jest reprezentowany na niebiesko, surowica na żółto, roztwór antygenu 4-HAU na zielono, a 1% zawiesina RBC kurczaka na czerwono. Strzałki wskazują kolejność dozowania cieczy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja miana roztworu antygenu 4-HAU sformułowanego przy użyciu zoptymalizowanej metody
W badaniu wykorzystano różne rozcieńczenia podstawowego roztworu antygenu w celu dokładnego określenia miana HA, co ułatwiło obliczenie współczynnika rozcieńczenia do przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Wyniki pokazują, że zoptymalizowana metoda jest zarówno wydajna, jak i precyzyjna, zmniejszając liczbę powtarzających się procedur miareczkowania wstecznego i adiustacji. W pierwszym scenariuszu początkowe mi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoptymalizowana metoda zaproponowana w tym artykule przedstawia podejście do dokładnego przygotowania roztworu antygenu 4-HAU. Chociaż wytyczne OIE i UE sugerują wstępne rozcieńczenia do miareczkowania HA, nie podają one dokładnych szczegółów dotyczących stosowanych proporcji rozcieńczania ani nie oferują konkretnych metodologii11,12. Ponadto, chociaż FAO i OIE zalecają miareczkowanie wsteczne jako sposób na zwiększenie dokładności 4-HAU, brakuje im jasnego protokołu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. był wspierany przez program Taicang Technology (TC2021JC16) oraz Fundusze Zespołu ds. Innowacji Instytutu Technologii Suzhou Chien-shiung (2023JXKYTD01). H.Y. był wspierany przez program Taicang Technology (TC2021JC11). Oba projekty były wspierane przez Start-up Fund for New Ph.D. Researchers z Suzhou Chien-Shiung Institute of Technology.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Sterylna probówka wirówkowa (15 ml) Labshark130201030
Wolnoobrotowa wirówka stołowa chłodzona powietrzem TitanLDC-5
Alserve's SolutionSangon BiotechE607058
WirówkaDLAB9032002121
Jednorazowa pipeta PasteuraTitanSWXG-004
Jednorazowa sterylna strzykawka (1 ml)BeyotimeFS801-30PCS Jednorazowa
V (96 dołków)Labshark
Wytrząsarka do mikropłytekJiangsu Xinkang Medical Equipment Co., LtdXK96-3
NDV HI Ujemna surowicaQingdao Centrum Rozwoju
NDV HI Dodatnia surowicaQingdao Centrum Rozwoju
NDV HI Test antygenuQingdao Centrum Rozwoju
PBS Rozwiązanie (1x) Adamas LifeC8020
Sterylna probówka wirówkowa (1,5 ml)Labshark130201012
płytka do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery 130207001Diagnostyki RegenDiagnostyki RegenDiagnostyki Regen

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. (80), e50830(2013).
  2. Chen, Y., et al. The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization. PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).
  3. Miller, P. J., Decanini, E. L., Afonso, C. L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infect Genet Evol. 10 (1), 26-35 (2010).
  4. Terregino, C., Capua, I. Clinical traits and pathology of Newcastle disease infection and guidelines for farm visit and differential diagnosis. Avian Influenza and Newcastle Disease: A Field and Laboratory. , 113-122 (2009).
  5. Dimitrov, K. M., Afonso, C. L., Yu, Q., Miller, P. J. Newcastle disease vaccines—A solved problem or a continuous challenge. Vet Microbiol. 206, 126-136 (2017).
  6. Sheng, W., et al. Molecular characteristics and phylogenetic analysis of pigeon paramyxovirus type 1 isolates from pigeon meat farms in Shanghai (2009-2012). Sci Rep. 14 (1), 10741(2024).
  7. Yates, J. G. E., et al. Production of high-titer recombinant Newcastle disease virus from allantoic fluid. J of Vis Exp. (183), e63817(2022).
  8. van Boven, M., et al. Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol. 37 (1), 1-5 (2008).
  9. Oberländer, B., et al. Evaluation of Newcastle disease antibody titers in backyard poultry in Germany with a vaccination interval of twelve weeks. PloS One. 15 (8), e0238068(2020).
  10. Bhattacharya, S., et al. Spillover of Newcastle disease virus to Himalayan Griffon vulture: a possible food-based transmission. Virus Genes. 60 (4), 385-392 (2024).
  11. World Organisation for Animal Health (OIE). Newcastle disease (Infection with Newcastle disease virus). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. , (2024).
  12. Council of European Union. Council Directive 92/66/EEC of 14 July 1992 Introducing Community measures for the control of Newcastle disease. Document 31992L0066. L260, 1-20 (1992).
  13. Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. 2002/22, RAP Publication. 1-129 (2002).
  14. Dortmans, J. C. F. M., Peeters, B. P. H., Koch, G. Newcastle disease virus outbreaks: Vaccine mismatch or inadequate application. Vet Microbiol. 160 (1-2), 17-22 (2012).
  15. De Sousa, R. L. M., Montassier, H. J., Pinto, A. A. Detection and quantification of antibodies to Newcastle disease virus in ostrich and Rhea sera using a liquid phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (6), 940-944 (2000).
  16. Chumbe, A., Izquierdo-Lara, R., Calderón, K., Fernández-Díaz, M., Vakharia, V. N. Development of a novel Newcastle disease virus (NDV) neutralization test based on recombinant NDV expressing enhanced green fluorescent protein. Virol J. 14 (1), 232(2017).
  17. Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO animal influenza manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test HIantygen 4 HAUdetekcja przeciwciametoda wstecznego miareczkowaniakurze erytrocytyp ytka mikrotitracyjnadetekcja serologiczna

Powiązane artykuły