Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Podsumowanie

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Streszczenie

Pobudzające komórki, takie jak komórki neuronalne i mięśniowe, mogą być głównymi celami w szybko rozwijających się terapiach opartych na elektroporacji. Jednak impulsy elektryczne mogą na nie wpływać nawet w terapiach, w których nie są głównymi celami, a to może powodować niepożądane skutki uboczne. Dlatego, aby zoptymalizować leczenie tkanek pobudliwych i niepobudliwych oparte na elektroporacji, istnieje potrzeba zbadania wpływu impulsów elektrycznych na pobudliwe komórki, ich kanały jonowe i pobudliwość in vitro. W tym celu opracowano protokół optycznego monitorowania zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w wyniku elektroporacji na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie zmodyfikowanych komórek HEK z tet-onem. Za pomocą fluorescencyjnego barwnika potencjometrycznego monitorowano zmiany napięcia transbłonowego pod mikroskopem fluorescencyjnym, a odpowiednie parametry odpowiedzi komórek ekstrahowano automatycznie za pomocą aplikacji MATLAB. W ten sposób można skutecznie ocenić pobudliwe reakcje komórek na różne impulsy elektryczne oraz wzajemne oddziaływanie między wzbudzeniem a elektroporacją.

Wprowadzenie

Podczas elektroporacji, impulsy elektryczne o wysokim napięciu powodują wzrost przepuszczalności błony plazmatycznej dla cząsteczek, które w innym przypadku są słabo przepuszczalne¹. Techniki oparte na elektroporacji są obecnie szeroko stosowane w medycynie², biotechnology³ i technologii żywności⁴.

Pobudzające komórki, takie jak komórki neuronalne i mięśniowe, są jednymi z głównych celów szybko pojawiających się terapii opartych na elektroporacji w sercu, mózgu i mięśniach szkieletowych⁵. Co więcej, mogą być one narażone na działanie impulsów elektrycznych nawet w terapiach, w których nie są głównymi celami, co może powodować niepożądane skutki uboczne, takie jak ból, drganie mięśni i uszkodzenie nerwów⁶. Mianowicie, impulsy elektryczne mogą powodować stymulację elektryczną komórek pobudliwych: aktywują kanały jonowe bramkowane napięciem i wyzwalają potencjały czynnościowe (AP). Jednak przy wyższych polach elektrycznych błona plazmatyczna komórek staje się przepuszczalna i pojawia się dodatkowy prąd jonowy przez pory/defekty⁷. Ten dodatkowy prąd jonowy wpływa na pobudliwość komórek w złożonej interakcji między wzbudzeniem a elektroporacją. Dlatego, aby zoptymalizować leczenie tkanek pobudliwych i niepobudliwych oparte na elektroporacji, istnieje potrzeba zbadania wpływu impulsów elektrycznych na pobudliwe komórki, ich kanały jonowe i pobudliwość in vitro.

W niedawnym badaniu⁸, zbadaliśmy genetycznie modyfikowane ludzkie embrionalne komórki nerkowe (HEK) opracowane przez Cohen et al.^9,10, jako cenne narzędzie do badania elektroporacji w komórkach pobudliwych. W tych skądinąd niepobudliwych komórkach wyraża się minimalny zestaw kanałów sodowych i potasowych (Na_V1,5 i K_ir2,1) potrzebnych do pobudliwości. Ekspresja K_ir2,1 w tych komórkach jest kontrolowana przez indukowany doksycykliną system tet-on, który umożliwia ustanowienie dwóch wariantów komórek: pobudliwego impulsowego S-HEK (zawierającego Na_V1,5 i K_ir2,1) i niepobudliwych niewybijających komórek NS-HEK (zawierających tylko kanały Na_V1,5). Pozwala nam to porównać wpływ impulsów elektrycznych na pobudliwe i niepobudliwe warianty tego samego typu komórek. W porównaniu z izolowanymi pierwotnymi komórkami pobudliwymi, komórkami pobudliwymi zróżnicowanymi z embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz liniami komórkowymi pochodzącymi z tkanek pobudliwych, komórki S-HEK mają kilka zalet: są łatwe w obsłudze, hodowli i rozmnażaniu, mają dobrze zdefiniowane kanały sodowe i potasowe oraz generują solidne APs⁸.

Zaprojektowaliśmy protokół monitorowania zmian napięcia transmembranowego (TMV) wywołanych impulsami elektrycznymi o różnych amplitudach za pomocą fluorescencyjnego barwnika potencjometrycznego. W ten sposób możemy zbadać, jak elektroporacja wpływa na wytwarzanie AP w ogniwach S-HEK i inne zmiany w TMV zarówno w ogniwach S-HEK, jak i NS-HEK. Krótko mówiąc, ogniwa S-HEK lub NS-HEK są wystawione na pojedynczy impuls elektryczny o wartości 100 μs co 2 minuty, a względne zmiany fluorescencji są rejestrowane przez około 3 sekundy wokół każdej aplikacji impulsu. Stosowane impulsy mają rosnące napięcie, najpierw wyzwalając AP w komórkach, a przy wyższym polu elektrycznym elektroporację. 2-minutowy odstęp między aplikacjami impulsów został wybrany, aby zminimalizować możliwe skumulowane efekty kolejnych impulsów, jednocześnie utrzymując eksperymenty wystarczająco krótkie, aby nie pogorszyć stanu komórek. Przetwarzanie obrazu zostało zautomatyzowane za pomocą niestandardowej aplikacji MATLAB w celu wyodrębnienia odpowiednich parametrów odpowiedzi fluorescencyjnych barwnika potencjometrycznego, a tym samym oceny zmian w TMV (AP i trwałej depolaryzacji spowodowanej elektroporacją) w komórkach S-HEK i NS-HEK.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników i hodowla komórkowa

1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych, uzupełniając Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy, penicyliną-streptomycyną (penicylina 100 U/ml, streptomycyna 100 μg/ml), 2 μg/ml puromycyny, 5 μg/ml blasticydyny i 200 μg/ml genetycyny.
2. Przygotować buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS) o stężeniu 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ i 1,8 mM KH₂PO₄ o pH 7,4. Przefiltruj go przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.
3. Przygotuj roztwór Tyrode z 2 mM KCl, 125 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM glukozy, pH 7,3. Przygotować roztwór Tyrode o niskiej zawartości potasu z 0,5 mM KCl, 126,5 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, 30 mM glukozy, pH 7,3. Przefiltruj oba roztwory przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.
4. Przygotować 1 mg/ml roztwór podstawowy poli-L-lizyny, dodając 5 ml PBS do fiolki zawierającej 5 mg poli-L-lizyny.
5. Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny o stężeniu 2 mg/ml w wodzie destylowanej i przefiltrować przez sterylizujący filtr membranowy o wielkości porów 0,22 μm.
6. Przygotować 4 mM potencjometryczny roztwór podstawowy barwnika ElectroFluor630 w czystym etanolu (dodać 25 μl czystego etanolu do probówki zawierającej 100 nM - 73 μg barwnika).
7. Hodowla genetycznie zmodyfikowanych komórek HEK w kolbie T25 w 6 ml pożywki do hodowli komórek, jak wcześniej opisano⁸. Składniki pożywki hodowlanej są wrażliwe na światło; W ten sposób należy chronić podłoże przed światłem (owinąć pożywkę w folię aluminiową) i wykonywać pasażowanie w warunkach słabego oświetlenia.
8. Komórki należy przepuszczać co 3-4 dni, wysiewając 3 x 10⁵ lub 5 x 10⁵ komórek do świeżej kolby T25. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Utrzymuj komórki w kolbie głównej jako niepobudliwe komórki NS-HEK bez dodatku doksycykliny, ponieważ nie tolerują one trwałej ekspresji K_ir2,1. W eksperymentach używaj komórek z pasaży niższych niż 14.

2. Przygotowanie próbki

1. Powłoka poli-L-lizynowa szkiełek nakrywkowych
   1. Odpipetować 1 ml PBS do jednego dołka z 2-dołkowymi szkiełkami przykrywkowymi, dodać 10 μl sterylnego roztworu poli-L-lizyny o stężeniu 1 mg/ml i dobrze wymieszać pipetą.
   2. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Usunąć PBS z poli-L-lizyną bez dalszego mycia.
2. Wysiewanie komórek
   1. Przygotować roztwór podstawowy doksycykliny w stosunku 1:10 w pożywce hodowlanej w probówce o pojemności 1,5 ml. Na każdą studzienkę potrzeba 30 μl rozcieńczenia doksycykliny w stosunku 1:10 (3 μl roztworu podstawowego doksycykliny i 27 μl pożywki hodowlanej), należy przygotować końcową objętość w zależności od całkowitej liczby studzienek doświadczalnych.
   2. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T25 i trypsynizować komórki 2,5 ml roztworu trypsyny-EDTA w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
   3. Dodać 2,5 ml świeżej pożywki hodowlanej i delikatnym pipetowaniem oderwać komórki od powierzchni. Dobrze wymieszać zawiesinę komórkową.
   4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i określ gęstość komórek w zawiesinie.
   5. Obliczyć objętość zawiesiny komórek trypsynizowanych potrzebna do założenia hodowli. W przypadku hodowli 2-dniowej wysiewaj 2,5 x 10⁵ komórek, a w przypadku hodowli 3-dniowej wysiewaj 1 x 10⁵ komórek na studzienkę. W razie potrzeby dostosuj dokładną liczbę komórek.
   6. Obliczyć objętość pożywki hodowlanej, odejmując poprzednio obliczoną objętość zawiesiny komórek od 1470 μl. Pozostałe 30 μl odpowiada objętości rozcieńczenia doksycykliny w stosunku 1:10. Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 1500 μl (komórki, doksycyklina i pożywka hodowlana).
   7. W celu przygotowania próbek z pobudliwymi komórkami S-HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej i zawiesiny komórek trypsynizowanych do jednego dołka i dodać 30 μl doksycykliny w stosunku 1:10. Używaj tylko jednego dołka z komór dwudołkowych, ponieważ eksperyment trwa długo (około 40 minut). Dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie tuż przed umieszczeniem komór w inkubatorze CO_{2 .}
   8. W celu przygotowania próbek z niepobudliwymi komórkami NS-HEK należy odpipetować obliczoną objętość pożywki hodowlanej do studzienki i dodać 90% obliczonej objętości zawiesiny komórek dla komórek S-HEK bez doksycykliny. Komórki NS-HEK rosną nieco szybciej niż komórki S-HEK.
   9. Inkubować komory w inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez 2-3 dni przed eksperymentem. W przypadku próbek z doksycykliną ten czas inkubacji jest wystarczający, aby komórki stały się pobudliwe.
3. Etykietowanie komórek
   1. Przed eksperymentem odpipetować 3 μl potencjometrycznego roztworu podstawowego barwnika do probówki o pojemności 1,5 ml i pozostawić otwartą probówkę w temperaturze pokojowej w okapie z przepływem laminarnym, aby etanol odparował, a barwnik potencjometryczny wyschł (około 15 min). Dodać 997 μl zimnej pożywki hodowlanej (z lodówki w temperaturze 4 °C) do probówki i rozpuścić barwnik do końcowego stężenia 12 μM.
   2. Usuń pożywkę hodowlaną z dołka i dodaj 1 ml potencjometrycznego roztworu barwnika do komórek. Wstaw je do lodówki w temperaturze 4 °C i inkubuj przez 20 minut.
   3. Usuń potencjometryczny roztwór barwnika i zachowaj go w probówce do dalszego ponownego użycia (do sześciu sekwencyjnych eksperymentów w ciągu 1 dnia).
   4. Delikatnie przemyj komórki 3x roztworem Tyrode, a po ostatnim płukaniu odpipetuj 1 ml roztworu Tyrode o niskiej zawartości potasu do studzienki.

3. Elektrostymulacja i elektroporacja

1. Skonfiguruj synchronizację dostarczania impulsów z akwizycją obrazu za pomocą sygnału TTL z systemu mikroskopowego, który wyzwala generator impulsów. Do generowania impulsów wysokiego napięcia należy użyć niestandardowego generatora impulsów¹¹ lub dowolnego generatora impulsów, który może być wyzwalany zewnętrznie za pomocą sygnału TTL.
   UWAGA: W prezentowanej konfiguracji eksperymentalnej do akwizycji obrazu wykorzystywane jest oprogramowanie LAS X, które można skonfigurować tak, aby wysyłało sygnał TTL o wybranej godzinie podczas akwizycji poklatkowej.
2. Umieść dwie równoległe elektrody drutowe Pt/Ir o średnicy 0,8 mm i odległości między krawędziami wewnętrznymi 5 mm na dnie komory i zamocuj komorę pod mikroskopem.
3. Podłącz elektrody do generatora impulsów. Podłącz wyjście generatora impulsów do oscyloskopu za pomocą sondy napięciowej i prądowej, aby umożliwić weryfikację, czy impulsy zostały prawidłowo dostarczone podczas eksperymentu.
4. Ustaw ostrość komórek w jasnym polu. Wyobraź sobie ogniwa, które znajdują się mniej więcej pośrodku między elektrodami.
5. Rozpocznij pierwszą akwizycję obrazów fluorescencyjnych w trybie poklatkowym z obiektywem 40x, rejestrując sygnał fluorescencji w całym polu widzenia. Kamera powinna być na tyle szybka, aby uzyskać wyraźny przebieg czasowy potencjału czynnościowego (najlepiej wyższego niż 25 klatek/s).
   1. Zdobądź 80 obrazów w trybie poklatkowym, z co najmniej 25 klatkami na sekundę, aby określić przebieg potencjału czynnościowego w czasie rzeczywistym. Całkowity czas akwizycji obrazu wynosi około 3 s. Podczas akwizycji obrazu należy oświetlić ogniwa falą wzbudzenia o długości fali 635 nm, czasie ekspozycji 10 ms i wykryć emisję przy około 700 nm. W tej pierwszej akwizycji nie należy stosować żadnego impulsu - ta akwizycja zostanie wykorzystana do skorygowania kolejnych akwizycji w celu fotowybielania barwnikiem. Po tym przejęciu poczekaj 2 min.
      UWAGA: W tym eksperymencie wykorzystuje się 27,8 klatek/s, czyli okres 36 ms, czyli czas od początku pierwszej akwizycji obrazu do początku następnej akwizycji obrazu w nagraniu poklatkowym).
6. Co 2 minuty nagrywaj film poklatkowy w taki sam sposób, jak w kroku 3.5. W przypadku tych akwizycji należy zastosować pojedynczy impuls 100 μs w momencie uzyskania 10. obrazu (przy 324 ms). Uzyskaj obrazy z następującymi napięciami impulsów: 63 V, 75 V, 88 V, 100 V, 125 V, 150 V, 175 V i 200 V. Oszacuj pole elektryczne, na które narażone są ogniwa, jako stosunek przyłożonego napięcia do odległości elektrody (E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 i 400 V/cm).
   UWAGA: Przy niższych polach elektrycznych impulsy wyzwalają potencjały czynnościowe; Przy wyższych polach elektrycznych wyzwalają elektroporację, która objawia się przedłużoną depolaryzacją. Czas trwania eksperymentu na każdej próbce komórek wynosi około 40 minut (20 minut w przypadku znakowania i 20 minut w przypadku mikroskopii).

4. Analiza danych

1. Eksportuj nagrania poklatkowe do formatu tiff.
2. Umieść nagrania poklatkowe wszystkich zastosowanych napięć podczas pojedynczego eksperymentu (jednej próbki komórek) w jednym folderze. Zmień nazwy nagrań poklatkowych w takiej formie, aby pole elektryczne E mogło być rozpoznawane przez aplikację MATLAB: Vcm (np. 126Vcm na 126 V/cm). Pozostałe części nazwy mogą być dowolne. W przypadku akwizycji na początku eksperymentu, w której nie stosuje się impulsu, zmień nazwę, używając frazy 000Vcm. Przykładowe nazwy nagrań poklatkowych: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm itp.
3. Otwórz aplikację, którą można pobrać ze strony
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. Kliknij Wybierz folder danych, aby wybrać folder zawierający nagrania poklatkowe z jednego eksperymentu.
4. Wybierz piksele, które mają być używane do dalszej analizy danych. W tym celu należy za pomocą dwóch suwaków określić dolny próg dla wyraźnego obrazu membran (w kolorze fioletowym) oraz wysoki próg dla eliminacji zanieczyszczeń (duże plamy o wysokiej fluorescencji) z analizy (w kolorze zielonym).
5. Wybierz pozycję Analizuj dane. Na karcie Analiza pojawi się tabela z wyodrębnionymi parametrami. Po prawej stronie tabeli pojawiają się wykresy względnej fluorescencji w czasie dla każdego użytego E. Wybierz wykresy dla danego E z rozwijanego menu po lewej stronie nad tabelą.
6. Sprawdź wszystkie wykresy i wykonaj ręczną korektę w przypadku wykrycia fałszywego szczytu. Wybierz opcję Wyczyść szczyty AUTO u dołu karty Analiza, a szczyty, które zostały wykryte automatycznie, zostaną wyczyszczone. Kliknij wykres, aby ręcznie określić nowy punkt czasowy szczytu.
7. Wybierz opcję Uruchom ponownie automatyczne wykrywanie wartości szczytowej u dołu karty Analiza, aby ponownie przeprowadzić automatyczne wykrywanie szczytu. Wyodrębnione parametry zostaną teraz dostosowane do nowego piku.
8. Wybierz opcję Eksportuj dane w prawym dolnym rogu karty Analiza, aby wyeksportować dane do tego samego folderu w postaci pliku .mat, pliku arkusza kalkulacyjnego i obrazów PNG dla każdego użytego E.

Wyniki

Zmiany TMV w pobudliwych komórkach in vitro wywołane impulsami elektrycznymi mogą być monitorowane optycznie za pomocą tego protokołu, a sygnały fluorescencyjne mogą zostać poddane analizie w celu wyznaczenia istotnych parametrów.

Układ eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1A. Typowy sygnał impulsu elektrycznego o czasie trwania 100 µs stosowanego w eksperymentach pokazano na Rysunku 1B. Komórki w komorach umieszczonych p...

Dyskusja

Komórki S-HEK to prosty model komórek pobudliwych z dobrze zdefiniowanymi kanałami sodowymi i potasowymi, Na_V1,5 i K_ir2,1⁹. Dzięki temu możemy przeprowadzić dogłębne badania nad tym, jak pobudliwe komórki reagują na zastosowane impulsy elektryczne i połączyć dane eksperymentalne z modelami matematycznymi opartymi na dobrze znanych teoretycznych charakterystykach kanałów ulegających ekspresji w komórkach S-HEK. W naszym poprzednim badaniu⁸ opisaliśmy od...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówka 1,5 ml	Ratiolab	5615000
2-dołkowy Nunc Lab-Tek II komorowy #1.5 Niemiecki system szkła nakrywkowego	Thermo Fisher Scientific
ADP305 Sonda różnicowa napięcia	Teledyne LeCroy
AP015 Sonda prądowa	Teledyne LeCroy
Blasticidin	Thermo Fisher Naukowy
inkubator CO2	PHCbi	MCO -230AICUV
Doksycyklina	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco" s Zmodyfikowany Orzeł" s Pożywka o średnim wzroście glukozy	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
Sondy potencjometryczne	ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)	31795
Surowica bydlęca	płodu Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
Glutamina	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
Okap z przepływem laminarnym	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Penicylina– streptomycyna	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
Bromowodorek poli-L-lizyny	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
Generator impulsów	Wykonane		patrz odniesienie11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific
T25 25cm² Kolba do hodowli tkankowych	TPP	90026
Ogniwa HEK z tet-on	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	CRL-3479
System Live Cell Thunder Imager do mikroskopii fluorescencyjnej	Leica Microsystems
Roztwór trypsyna-EDTA	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A Oscyloskop	Teledyne LeCroy

155379A111390310131035 na zamówienie A1113803