Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa, mikroskopowa kwantyfikacja uwalniania ludzkich neutrofili z zewnątrzkomórkowych pułapek i ocena farmakologii antagonistów w czasie rzeczywistym

DOI:

10.3791/67258

⸱

18 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Citryll B.V.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten zdefiniowany protokół opisuje podejście do mikroskopii wysokoprzepustowej w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji i ilościowego określenia uwalniania ludzkich neutrofili zewnątrzkomórkowych (NET) in vitro. Powtarzalna metoda pozwala na zbadanie charakterystyki i kinetyki uwalniania NET po stymulacji odrębnymi induktorami NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej, stosując kilka strategii, w tym uwalnianie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w procesie zwanym NETosis. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad stało się jasne, że akumulacja NET w tkankach przyczynia się do patofizjologii wielu chorób zapalnych i autoimmunologicznych. W związku z tym wzrosło zainteresowanie rozwojem antagonistów NETozy. Równolegle opracowywano zmienne i niestandardowe metody wykrywania i analizy NETozy, z których każda ma swoje zalety i ograniczenia. W tym miejscu opisujemy metodę mikroskopii w czasie rzeczywistym do ilościowego określania uwalniania NET przez człowieka, co pozwala na badanie NETozy, a także inhibicji NET w sposób wysokoprzepustowy. Półautomatyczna analiza oparta na powierzchni rozpoznaje NET i odróżnia je od neutrofili aktywowanych bez siatki. Wykazaliśmy, że niefizjologiczne induktory NETozy, jonofor wapnia i octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA), wyzwalają uwalnianie NET o różnych właściwościach i kinetyce. Ponadto pokazujemy, że takie podejście pozwala na badanie uwalniania NET w odpowiedzi na bodźce istotne dla choroby, w tym kompleksy immunologiczne, N-formylometioninę-leucylo-fenyloalaninę (fMLF), kryształy moczanu monosodu i kryształy pirofosforanu wapnia. Aby zilustrować przydatność tej metody do badania antagonistów NETozy, użyliśmy CIT-013, pierwszego w swojej klasie inhibitora przeciwciał monoklonalnych o uwalnianiu NET. CIT-013 celuje w cytrulinowany histon H2A i H4 i skutecznie hamuje uwalnianie NET dzięki IC50 4,6 nM. Inne testowane przeciwciała antyhisttonowe nie miały tej zdolności hamowania NETozy. Podsumowując, wykazaliśmy, że protokół ten umożliwia specyficzną, wiarygodną i powtarzalną wysokoprzepustową kwantyfikację NET, usprawniając badanie charakterystyki uwalniania NET, kinetyki i farmakologii antagonistów NETozy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są obficie obecne we krwi i migrują do tkanek po infekcji lub zapaleniu. Odgrywają ważną rolę we wrodzonej obronie immunologicznej, wykorzystując rozległą broń do ochrony gospodarza przed drobnoustrojami. Neutrofile zabijają patogeny poprzez fagocytozę, degranulację, wytwarzanie reaktywnych form tlenu (ROS) i uwalnianie zdekondensowanej chromatyny zwanej zewnątrzkomórkowymi pułapkami neutrofili (NET) w procesie zwanym NETosis1. NET to zewnątrzkomórkowe struktury chromatyny ozdobione m.in. ziarnistymi białkami i kalprotektyną2,3, i są uwalniane po stymulacji szerokim spektrum cząsteczek4. NETozę można ogólnie podzielić na dwie główne ścieżki: Oksydaza NADPH zależna lub niezależna5,6,7. Ponadto cytrulinacja argininy N-końcowych ogonów histonowych przez deiminazę peptydyloargininy 4 (PAD4) jest ściśle związana z NETozą i sprzyja dekondensacji chromatyny, co ostatecznie prowadzi do wydalenia zdekondensowanej chromatyny do środowiska zewnątrzkomórkowego.

Chociaż uwalnianie NET jest zaangażowane w eliminację patogenów, liczne badania wykazały, że nieprawidłowe i przedłużone uwalnianie NET jest związane z rozwojem różnych zaburzeń zapalnych, w tym ostrego uszkodzenia płuc8, reumatoidalne zapalenie stawów (RA)9, vasculitis10, oraz ropne zapalenie gruczołów potowych suppurativa11. Szkodliwa rola NET w chorobie jest wieloaspektowa, ponieważ NET są prozapalne, są źródłem autoantygenów, są cytotoksyczne dla otaczających tkanek, wywołują immunozakrzepicę i sprzyjają różnicowaniu osteoklastów i erozji kości9,12,13. Farmakologiczne hamowanie szlaku NETosis przez małocząsteczkowe inhibitory PAD4 pokazuje, że terapie ukierunkowane na NETosis mają potencjał w leczeniu chorób, w których akumulacja NET jest ważnym czynnikiem patogenezy14. Zamiast celować w enzym PAD4, użyliśmy pierwszego w swojej klasie przeciwciała monoklonalnego NETosis hamującego humanizowane przeciwciało monoklonalne antycytrulinowane histonami, CIT-013, które specyficznie wiąże się z cytrulinowanymi histonami H2A i H415. CIT-013 ma unikalny podwójny mechanizm działania poprzez hamowanie uwalniania NET i wzmacnianie fagocytozy NET za pośrednictwem makrofagów16. CIT-013 i cząsteczki prekursorowe wykazały skuteczność terapeutyczną w wielu mysich modelach zapalenia związanego z NET17.

Aby badać wydanie NET, na przestrzeni lat opracowano różne metody, takie jak między innymi 1) Wykrywanie DNA za pomocą nieprzepuszczalnego dla błony plazmatycznej znacznika DNA w połączeniu z czytnikiem płytek immunofluorescencyjnych, 2) wykrywanie DNA i DNA skompleksowanego z białkami specyficznymi dla NET w supernatantach za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) w supernatantach, 3) kolokalizacja cząsteczek związanych z NET z zewnątrzkomórkowym DNA za pomocą immunohistochemii oraz 4) metody cytometrii przepływowej w celu wykrycia neutrofili netto. Wszystkie te metody mają swoje zalety i ograniczenia. Opracowaliśmy wysokoprzepustowe podejście w czasie rzeczywistym do mikroskopowej kwantyfikacji uwalniania ludzkiej siatki, które wykorzystuje nieprzepuszczalny dla błony plazmatycznej barwnik DNA16,18. Opisana metoda pozwala w łatwy, wiarygodny i powtarzalny sposób badać kinetykę i charakterystykę NETozy oraz umożliwia ocenę farmakologii antagonistów NETozy, takich jak CIT-013.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy dawcy krwi wyrazili świadomą zgodę zgodnie z Deklaracją Helsińską, a badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Citryll dotyczącymi badań na ludziach.

UWAGA: Wszystkie czynności z ludzką krwią i izolowanymi neutrofilami muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej. Jeżeli w protokole nie wymieniono ustawień hamulca i przyspieszenia dla wirowania, można je rozważyć jako maksymalne.

1. Izolacja neutrofili z krwi

  1. Zbierz krew obwodową od zdrowych ochotników w probówkach z heparyną litową i przenieś krew do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
  2. Przepłukać probówki z heparyną litową 1x DPBS i przenieść do tej samej probówki o pojemności 50 ml, do której przeniesiono krew. Upewnij się, że ostateczny stosunek krwi do DPBS wynosi 1:1. Wymieszać krew i DPBS przez pipetowanie, aby uzyskać jednorodny roztwór.
  3. Dodać 13 ml roztworu gradientu gęstości do innej świeżej probówki o pojemności 50 ml i powoli dodawać (pipetą o pojemności 25 ml) rozcieńczoną krew w stosunku 1:1 na wierzch roztworu gradientu gęstości do maksymalnej objętości 50 ml.
  4. Wirować przy 400 x g i temperaturze pokojowej (RT) przez 40 minut z minimalnym przyspieszaniem i hamowaniem.
    UWAGA: Warstwy są formowane. Warstwy od góry do dołu są następujące: 1. plazma; 2. komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC); 3. Rozwiązanie gradientu gęstości; 4. Erytrocyty/neutrofile.
  5. Najpierw należy wyrzucić osocze za pomocą pipety o pojemności 10 ml, a następnie wyrzucić PBMC i warstwę roztworu gradientu gęstości za pomocą plastikowej pipety Pasteura tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając warstwy erytrocytów/neutrofili.
  6. Delikatnie zawiesić warstwę erytrocytów/neutrofili przez potrząsanie i ponownie zawiesić za pomocą pipety o pojemności 25 ml w 15 ml 1x DPBS.
  7. Dodać 25 ml 6% roztworu dekstranu/0,9% NaCl, wymieszać dziesięciokrotnie, odwracając probówkę i ustawić probówkę pionowo na 25 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Warstwy są formowane. Warstwy od góry do dołu są następujące: 1. Neutrofile; 2 erytrocyty.
  8. Przenieść warstwę neutrofili do świeżej probówki o pojemności 50 ml z pipetą o pojemności 10 ml i odwirować przez 10 minut przy 500 x g i RT.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, ponieważ osad neutrofili nadal zawiera pewne erytrocyty i nie jest mocno przymocowany do probówki.
  9. Odrzucić supernatant przez dekantację i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pipety o pojemności 10 ml w 10 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) (155 mM NH4Cl, 10 mMKHCO3 i 0,1 mM Na2EDTA; pH = 7,2), a następnie natychmiast dodać 40 ml buforu do lizy ACK.
  10. Inkubować w temperaturze pokojowej, ciągle odwracając probówkę, aż roztwór stanie się przezroczysty (trwa to 1-5 minut i może się różnić w zależności od dawcy) i wirować przez 10 minut przy 350 x g i RT.
  11. Usunąć supernatant i dodawać powoli i kroplami 5 ml pożywki hodowlanej zawierającej L-glutaminę uzupełnioną 10% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny (zwanej dalej pożywką hodowlaną 10%) na wierzch osadu neutrofili, nie wprowadzając neutrofili w zawiesinie. To skutecznie usunie większość erytrocytów z osadu neutrofili.
  12. Delikatnie obracaj probówkę o pojemności 50 ml, aż większość erytrocytów, obecnych na wierzchu osadu neutrofili, zostanie ponownie zawieszona w pożywce hodowlanej 10%. Następnie usunąć supernatant przez dekantację probówki.
  13. Zawiesić osad neutrofili w 10 ml pożywki hodowlanej 10%, a po całkowitym zawieszeniu dodać do 50 ml pożywki hodowlanej 10%. Wirować przez 10 minut przy 350 x g i RT.
  14. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej 10%.

2. Barwienie neutrofili w celu sprawdzenia czystości za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Aby określić stężenie komórek, rozcieńczyć zawiesinę neutrofili w 0,4% roztworze błękitu trypanowego (stosunek 1:1) i policzyć neutrofile za pomocą licznika komórek w jasnym polu.
    UWAGA: Można również zastosować inne metody liczenia.
  2. Przenieść 1 x 105 neutrofili w pożywce hodowlanej 10% do studzienek 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i wirować przez 3 minuty przy 400 x g i RT.
  3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 50 μl 1x DPBS uzupełnionym 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% (v/v) NaN3 (określanej dalej jako bufor sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)) zawierającego blok receptora Fc (50x rozcieńczony).
  4. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej i dodać 50 μl buforu FACS zawierającego 50 razy rozcieńczonego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD45 sprzężonego z APC-Cy7, 600 razy rozcieńczonego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD16 sprzężonego z PerCP-Cy5.5, 133x rozcieńczonego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD66b sprzężonego z FITC i 500-krotnie rozcieńczonego barwnika żywotności eFluor 506,
    UWAGA: CD45 ulega ekspresji na leukocytach. CD66b ulega ekspresji wyłącznie w granulocytach. CD16 ulega silnej ekspresji w neutrofilach, niskiej ekspresji w eozynofilach i nie ulega ekspresji w bazofilach.
  5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i wirować przez 3 minuty przy 400 x g i RT.
  6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić neutrofile w 175 μl buforu FACS i odwirować przez 3 minuty przy 400 x g i RT. Powtórzyć ten krok raz.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad neutrofili w 175 μl buforu FACS. Analizuj próbki za pomocą systemu cytometrii przepływowej i powiązanego oprogramowania.

3. Analiza czystości neutrofili za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej

UWAGA: Analiza danych cytometrii przepływowej została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, jak wskazano w Tabeli Materiałów.

  1. Wykonaj bramkowanie zgodnie z poniższą procedurą krok po kroku.
    1. Ustaw bramkę czasową na wykresie FSC-A w funkcji czasu, aby wybrać obszar o prawidłowym przepływie komórek.
    2. Ustaw bramkę komórkową na wykresie SSC-A vs. FSC-A, aby wybrać komórki i wykluczyć zanieczyszczenia.
    3. Ustaw żywotną bramkę komórkową na wykresie FSC-A vs. AmCyan-A, aby wybrać żywotne komórki.
    4. Ustaw bramkę leukocytów na wykresie FSC-A vs. APC-Cy7, aby wybrać komórki CD45+.
    5. Ustaw bramkę neutrofili na wykresie FITC w porównaniu z PerCP-Cy5.5, aby odróżnić CD66b+CD16+ (neutrofile), CD66b-CD16+ (eozynofile) i CD66b-CD16- (bazofile, monocyty i limfocyty).
    6. Ustaw pojedynczą bramkę komórkową na wykresie FSC-H vs. FSC-A, aby wybrać pojedyncze neutrofile.
    7. Określ czystość neutrofili, przedstawiając pojedyncze neutrofile jako częstość komórek (w bramie komórkowej).
      UWAGA: Aby kontynuować, czystość neutrofili musi przekraczać 85%.

4. Mikroskopia obrazowania na żywo

UWAGA: Ten test jest zoptymalizowany pod kątem wielu 96-dołkowych płytek obrazowych oraz różnych bodźców i antagonistów NETozy. Poniższy protokół opisuje ogólny pogląd na podejście, który można określić za pomocą dołączonych tabel.

  1. Przygotować 0,001% roztwór poli-L-lizyny, rozcieńczając 0,01% poli-L-lizyny w sterylnymH2Ow stosunku 1:10.
  2. Dodać 0,001% roztwór poli-L-lizyny do każdego dołka i inkubować co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Objętość na studzienkę zależy od 96-dołkowej płytki obrazowej (Tabela 1).
  3. Umyj studzienki 3 razy 200 μl DPBS, aby usunąć nadmiar poli-L-lizyny. Wykonaj wszystkie czynności w komorze laminarnej. Zdejmij pokrywę płytki i wysusz studzienki na powietrzu, otwierając płytkę w komorze z przepływem laminarnym do wyschnięcia (około 1 godziny).
  4. Obliczyć liczbę neutrofili potrzebną do eksperymentu i przenieść nadwyżkę do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez 10 minut przy 350 x g i RT.
    UWAGA: Ilość neutrofili w każdym dołku różni się w zależności od rodzaju 96-dołkowej płytki obrazowej (Tabela 1). Gęstość komórek jest zoptymalizowana, aby umożliwić dobrą separację poszczególnych komórek, co jest wymagane do prawidłowej analizy. Jeśli gęstość neutrofili jest zbyt wysoka, komórki i NET będą nakładać się na sąsiednie komórki i NET, co wpływa na jakość analizy.
  5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić neutrofile w pożywce bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 2% (v/v) FBS, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny, 10 mM HEPES i 1 mM CaCl2 (zwanych dalej buforem testowym NET).
  6. Przygotuj następujące rozwiązania robocze.
    1. Przygotować barwnik DNA o stężeniu 80 nM w buforze testowym NET.
    2. Przygotuj bodźce NETosis w buforze testowym NET.
    3. Przygotowanie antagonistów NETozy w buforze testowym NET.
      UWAGA: Należy pamiętać, że stężenia wyżej opisanych roztworów roboczych są 4 razy większe niż końcowe stężenie potrzebne w studni. Zalecane stężenia bodźców NETosis i antagonistów NETosis różnią się (Tabela 2 i Tabela 3).
  7. Dodaj 4x skoncentrowany barwnik DNA w buforze testowym NET do każdej studzienki.
  8. Dodać 4x skoncentrowane bodźce NETosis w buforze testowym NET do odpowiednich dołków i dodać bufor testowy NET tylko do studzienek bez bodźca lub do studzienek zawierających powlekane kompleksy immunologiczne (cIC; protokół w tabeli 2).
  9. Dodaj 4x skoncentrowanych antagonistów NETozy w buforze testowym NET do odpowiednich studzienek. Dodać bufor testowy NET tylko do studzienek bez antagonisty.
  10. Dodaj zawiesinę neutrofili do każdej studzienki.
    UWAGA: Objętość 4x skoncentrowanego barwnika DNA, 4x skoncentrowane bodźce NETosis w buforze testowym NET, 4x skoncentrowany antagonista NETozy w buforze testowym NET, liczba neutrofili i objętość zawiesiny neutrofili na studzienkę zależy od 96-dołkowej płytki obrazowej (Tabela 1). Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
  11. Odwirować płytkę przez 2 minuty przy 100 x g i RT i włożyć 96-dołkową płytkę obrazową do systemu analizy mikroskopii żywych komórek umieszczonego w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    UWAGA: Na dnie 96-dołkowej płytki obrazowej może dojść do kondensacji w ciągu pierwszej minuty inkubacji. Należy to usunąć za pomocą chusteczki.

5. Ustawianie oprogramowania systemu analizy mikroskopii żywych komórek do akwizycji

UWAGA: Obrazy kontrastu fazowego i immunofluorescencji zostały uzyskane przez system analizy mikroskopii żywych komórek, kontrolowany przez jego oprogramowanie analityczne.

  1. Otwórz oprogramowanie systemu analizy mikroskopii na żywych komórkach i kliknij przycisk Połącz z urządzeniem. Wprowadź nazwę użytkownika i hasło. Kliknij Zaplanuj, aby nabyć, a następnie kliknij przycisk plusa (Wystrzel, dodaj statek). Następnie wybierz opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem i kliknij przycisk Dalej.
  2. Aby utworzyć nowy statek od podstaw, wybierz opcję Nowy w sekcji Utwórz naczynie i kliknij przycisk Dalej. Wybierz opcję Standard (Standardowy) w sekcji Scan Type (Typ skanowania) i kliknij Next (Dalej).
  3. Wybierz następujące ustawienia skanowania i kliknij przycisk Dalej: Komórka po komórce: Brak; Kanały obrazu: kontrast fazowy i zielony (czas akwizycji 100 ms); Cel: 20x.
  4. Wybierz odpowiedni typ statku do skanowania w sekcji Vessel Selection (Wybór statku) i kliknij przycisk Next (Dalej).
    1. Jeśli używasz płytki 96-dołkowej #1, wybierz Corning, płytka, 96, N/A, 3603, 96-well Corning (Blk/Wht), Microplates.
    2. Jeśli używasz 96-dołkowej płytki #2, wybierz Nunc, Plate, 96, N/A, 152028, 96-well Nunc opt bottom (Blk/Wht), Microplates.
  5. Określ położenie naczynia w szufladzie i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Scan Pattern (Wzorzec skanowania) wybierz dołki, które mają zostać zeskanowane, wybierz liczbę obrazów na studzienkę (zeskanuj 4 obrazy na studzienkę, aby uzyskać reprezentatywny przegląd) i kliknij przycisk Next.
    UWAGA: Nie wybieraj pustych studzienek, ponieważ wpłynie to na autofokus.
  6. Podaj informacje o statku, wstawiając m.in. nazwę tabliczki w sekcji notatnika statku i kliknij przycisk Dalej. Wybierz opcję Odłóż analizę na później w sekcji Ustawienia analizy i kliknij przycisk Dalej.
  7. Zdefiniuj harmonogram skanowania dla statku w sekcji Harmonogram skanowania. Wybierz pozycję Utwórz nowy harmonogram ze skanowaniem w odstępach czasu i wybierz pozycję 1 godzina. Wybierz opcję Zatrzymaj skanowanie i 00:05 godziny po pierwszym skanowaniu. Kliknij przycisk Dalej i kliknij przycisk Dodaj do harmonogramu, gdy informacje o skanowaniu są poprawne.
    1. Gdy harmonogram skanowania musi zostać edytowany, kliknij dwukrotnie Harmonogram skanowania u góry ekranu. Kliknij prawym przyciskiem myszy Harmonogram skanowania i edytuj i dostosuj zgodnie z potrzebami. Kliknij ikonę dyskietki, aby zapisać harmonogram skanowania.
      UWAGA: Podczas obrazowania wielu naczyń (płyt) w tym samym eksperymencie, dodatkowe naczynia można dodać do istniejącego harmonogramu skanowania, klikając przycisk plusa (Uruchom dodaj naczynie), wybierając opcję Skanuj zgodnie z harmonogramem i klikając Dalej. Utwórz nowy statek od podstaw (patrz krok 5.2 w tym protokole), skopiuj istniejący statek lub użyj wcześniej zeskanowanego statku. Powoduje to skanowanie sekwencyjne z tą samą częstotliwością i ustawieniami, co poprzednia płyta.

6. Mikroskopia obrazowa na żywo Analiza testowa NET przy użyciu oprogramowania do analizy mikroskopii żywych komórek

UWAGA: Do analizy obrazów kontrastu fazowego i immunofluorescencji użyto oprogramowania do analizy mikroskopii na żywych komórkach (Tabela materiałów). Gdy nie korzystasz z tego systemu, podobną analizę NET można przeprowadzić za pomocą pakietu oprogramowania domeny publicznej4,18,19,20.

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy mikroskopii na żywych komórkach i kliknij Połącz z urządzeniem. Wprowadź nazwę użytkownika i hasło, a następnie kliknij Wyświetl ostatnie skany. Otwórz wybrany eksperyment do analizy, klikając dwukrotnie nazwę naczynia eksperymentu.
  2. Kliknij przycisk Uruchom analizę i wybierz opcję Utwórz nową definicję analizy. Kliknij Dalej.
  3. Wybierz opcję Analizator podstawowy w sekcji typu analizy i kliknij przycisk Dalej. W sekcji Image Channel (Kanał obrazu) wybierz opcję Green, usuń zaznaczenie opcji Phase (Faza) i kliknij przycisk Next (Dalej).
  4. Otwórz okno Warstwy obrazu i wybierz opcję Zielony i usuń zaznaczenie opcji Faza. Wyłącz automatyczne skalowanie w sekcji Zielony i ręcznie ustaw min i max dla kanału zielonego, aby odróżnić sieci NET od tła.
    UWAGA: Kontrast fazowy można włączać i wyłączać w razie potrzeby. Na przykład, aby określić, czy NET są wydalane w środowisku zewnątrzkomórkowym.
  5. Otwórz okno Vessel Scan Times (Czasy skanowania zbiorników) i wybierz odpowiedni czas skanowania statku, w którym muszą być obecne sieci NET. Należy wybrać zestaw obrazów reprezentujących zmienność w ramach eksperymentu (obrazy z dołków kontroli dodatniej z NET i obrazy ze studzienek kontroli ujemnej bez NET). Obrazy te zostaną użyte do wyświetlenia podglądu i uściślenia analizy. Kliknij Dalej.
  6. Otwórz okno Ustawienia definicji analizy i rozpocznij dostosowywanie ustawień analizy dla kanału zielonego w taki sposób, aby struktury NET były obrysowane bez tworzenia fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych sieci NET. Użyj następujących ustawień i kliknij opcję Podgląd bieżącego lub Podgląd wszystkiego, aby zastosować ustawienia odpowiednio do bieżącego lub wszystkich obrazów.
    1. W polu Nazwa obiektu wybierz pozycję NETs.
    2. W przypadku segmentacji wybierz opcję Bez odejmowania tła — adaptacyjne.
    3. W przypadku progu GCU wybierz od 3 do 5 (w zależności od eksperymentu).
    4. W przypadku podziału krawędzi wybierz opcję WŁĄCZONE (od -10 do 0).
    5. W celu oczyszczenia wybierz Wypełnienie otworu: 100 μm2 i Dostosuj rozmiar: -1 pikseli.
    6. W przypadku filtrów wybierz w zależności od eksperymentu, ale zalecane wartości odcięcia to: Obszar: >200 μm2, Średnia intensywność: <24,6, Intensywność zintegrowana: >7000.
      UWAGA: Struktury, które są wybierane na podstawie użytych ustawień, są oznaczone kolorem karmazynowy. Najechanie kursorem myszy na te struktury da więcej informacji o parametrach obiektów (tj. powierzchnia, mimośrod, zintegrowana intensywność i średnia intensywność), co pomaga zoptymalizować analizę związaną z kryteriami włączenia lub wykluczenia parametrów NET. Sprawdź wiele obrazów (z dołków kontroli dodatniej i ujemnej), aby sprawdzić, czy ustawienia analizy są prawidłowe.
  7. Jeśli ustawienia analizy NET są poprawne, kliknij przycisk Dalej. Wybierz punkty czasowe i studzienki do analizy w sekcji czasy skanowania i odwierty, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wstaw nazwę definicji w sekcji Zapisz i zastosuj definicję analizy, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Zakończ, gdy informacje analizy zostaną zweryfikowane i poprawne.
    UWAGA: W przypadku analizowania wielu płyt lub korzystania z analiz z poprzednich eksperymentów uruchom analizę i wybierz opcję Kopiuj istniejącą definicję analizy lub Użyj istniejącej definicji analizy i kliknij przycisk Dalej. Wybierz odpowiednią istniejącą definicję analizy i kliknij przycisk Dalej. Aby przeprowadzić kolejną procedurę analizy, przejdź do kroku 6.4, jeśli wybrano opcję Kopiuj istniejącą definicję analizy, lub kroku 6.7, jeśli wybrano opcję Użyj istniejącej definicji analizy.
  8. Otwórz analizę eksperymentu, klikając analizę w interesującym Cię naczyniu. Otwórz okno Metryki wykresu.
  9. Kliknij przycisk plusa (Utwórz metrykę). Dane mogą być prezentowane jako procentowa konfluencja NET (procent obszaru obrazu oznaczony jako NET) lub procentowa liczba neutrofili netto (liczba NET podzielona przez liczbę komórek).
    1. Podczas prezentowania danych jako procentowej konfluencji NET wybierz opcję Obszar w sekcji Metryka i wybierz pozycję Konfluencja w sekcji Wartość. Prezentując dane jako wartość procentową po odjęciu neutrofili, wybierz opcję Liczba obiektów w sekcji Metryka i wybierz opcję Na obraz w sekcji Wartość.
    2. Kliknij przycisk OK. Wybierz pozycję Zbieganie się obszaru sieci NET (%) lub Liczba obiektów sieci NET na obraz (na obraz) w sekcji Metryki zdefiniowane przez użytkownika. Wybierz wszystkie punkty czasowe, które mają zostać przeanalizowane w sekcji Wybierz skanowania. Zaznacz wszystkie studnie, które mają zostać przeanalizowane w sekcji Wybierz studnie i kliknij przycisk Eksportuj dane.
  10. Wybierz następujące ustawienia w sekcji Eksport wykresów.
    1. Wybierz opcję Pokaż każdy skan jako osobną tabelę (kolumny: 1, 2... wiersze: A, B...).
    2. Wybierz opcję Pokaż etykiety wierszy i kolumn.
    3. Wybierz opcję Wszystkie skanowania w jednym pliku i kliknij przycisk Przeglądaj, aby dostosować lokalizację i nazwę pliku.
    4. Wybierz opcję Uwzględnij szczegóły eksperymentu w nagłówku.
    5. Wybierz opcję Podziel dane na pojedyncze obrazy.
  11. Kliknij przycisk Eksportuj, aby wyeksportować dane jako plik ".txt", który można zaimportować i dalej analizować w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA: Aby określić procentową zawartość neutrofili netto, należy określić liczbę neutrofili przy t = 0. Aby to zrobić, przejdź do następujących kroków protokołu.
  12. Przejdź do kroku 6.1, aby rozpocząć dodatkową analizę niezbędną do zliczenia liczby neutrofili dla obrazów przy t = 0.
    1. W kroku 6.3 wybierz opcję Faza i usuń zaznaczenie opcji Zielony w sekcji kanału obrazu.
    2. W kroku 6.4 wybierz t = 0 w sekcji czasów skanowania statku.
    3. W kroku 6.5 usuń zaznaczenie opcji Zielony, wybierz Faza i w razie potrzeby dostosuj ustawienia kanału fazy.
    4. W kroku 6.6 dodaj nazwę obiektu, wybierz opcję Klasyczne zbieganie w sekcji Segmentacja i ustaw korektę segmentacji na 0 (Tło), dostosuj Wypełnienie otworu do 100 μm2 i dostosuj Obszar do 50 μm2.
    5. W kroku 6.7 wybierz t = 0 w sekcji wybierania skanów.
    6. W kroku 6.8 otwórz Analizę liczby neutrofili
      7. .
    7. W kroku 6.9 wybierz opcję Liczba obiektów na obraz (na obraz) w sekcji Metryki zdefiniowane przez użytkownika.
    8. Na koniec użyj poniższego obliczenia, aby wygenerować procent neutrofili netto: (liczba NET / liczba neutrofili przy t = 0) x 100%.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowa mikroskopia w czasie rzeczywistym, w połączeniu z nieprzepuszczalnym barwnikiem DNA, pozwala badać kinetykę, charakterystykę i podstawowe szlaki NETosis oraz umożliwia ocenę potencjalnych inhibitorów uwalniania NET. Dzięki takiemu podejściu, NET zdefiniowano jako struktury dodatnie dla barwnika DNA o znacznie większej powierzchni w porównaniu z powierzchnią zdrowych neutrofili (Rysunek 1A), co wskazuje, że chromatyna została wydalona do środowiska zewnątrzkomórkowego18. Analiza oparta na powierzchni pozwoliła nam rozróżnić NET i aktywowane neutrofile z naruszoną integralnością błony plazmatycznej, wykazując jasne wewnątrzkomórkowe barwienie DNA (Rysunek 1A).

Jonofor wapnia (A23187) i PMA są powszechnie stosowane do wywoływania NETozy in vitro. Pomimo tego, że są bodźcami niefizjologicznymi, są cenne, ponieważ aktywują odrębne szlaki NETozy i zapewniają stałą indukcję NETozy przy niskiej zmienności między dawcami. A23187 wyzwala napływ wapnia, prowadząc do aktywacji PAD4 i uwalniania NET bogatych w cytrulinowane histony, podczas gdy PMA aktywuje kompleks oksydazy NADPH, co skutkuje produkcją reaktywnych form tlenu (ROS), a następnie uwalnianiem NET o niskim poziomie cytrulinowanych histonów5,16,21. Szybkość i wielkość odpowiedzi NETosis zależą od stężenia każdego bodźca (Rysunek 1B, C), przy czym A23187 indukuje szybszą NETozę, a PMA skutkuje wyższym odsetkiem neutrofili uwalniających NET ( Rysunek 1D-F). NET powstałe w wyniku stymulacji A23187 (Rysunek 1D; czerwona strzałka) różniły się od NET indukowanych przez PMA (Rysunek 1D; żółta strzałka) tym, że były bardziej rozproszone poza błoną plazmatyczną neutrofili, podczas gdy NET indukowane PMA pozostawały bardziej przylegające do błony plazmatycznej neutrofili. Ponadto stymulacja A23187 spowodowała powstanie przepuszczalnych, niesieciowych neutrofili barwnikowo-dodatnich DNA (Rysunek 1D; niebieska strzałka), które nie wydalały swojego DNA do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Wykrywanie przepuszczalnych, niesieciowych neutrofili barwnikowych DNA zależało od stężenia A23187 (Figura 1G) i prawie nie występowało niezależnie od stężenia PMA stosowanego do stymulacji NETozy ( Figura 1D, H). Oprócz wykorzystania niefizjologicznych bodźców NETosis A23187 i PMA, test ten nadaje się również do badania istotnych dla choroby czynników wyzwalających NETosis. Na przykład neutrofile aktywowane rozpuszczalnymi kompleksami immunologicznymi (sIC) lub kryształami obecnymi w chorobie dyspozycyjnej pirofosforanu wapnia (CPPD) wykazywały znacznie zwiększone uwalnianie NET w porównaniu z brakiem bodźca. Tendencję do podwyższonych poziomów NET zaobserwowano, gdy neutrofile były aktywowane powlekanymi kompleksami immunologicznymi (cIC), fMLP i kryształami moczanu monosodowego (MSU) (Rysunek 1I); Jednak w przypadku tych bodźców zaobserwowaliśmy znaczne różnice między dawcami.

Farmakologiczne hamowanie szlaku NETosis i enzymów związanych z NETosis pokazało, że terapie ukierunkowane na NETosis mogą być skutecznymi metodami leczenia chorób, w których akumulacja NET znacząco napędza patologię14,17,22,23,24. Ten test NET z mikroskopii w czasie rzeczywistym jest łatwym, niezawodnym i powtarzalnym podejściem do badania antagonistów NETozy w sposób wysokoprzepustowy. Aby to zilustrować, użyliśmy pierwszego w swojej klasie humanizowanego przeciwciała monoklonalnego, CIT-013, które jest ukierunkowane na cytrulinowane histony H2A i H4 o wysokim powinowactwie15,16. A23187 aktywuje szlak NETosis, w wyniku czego NET zawierają cytrulinowane histony, które są następnie celem CIT-013 w celu wykonania funkcji hamującej NETosi16. Rzeczywiście, wydanie NET w odpowiedzi na A23187 zostało całkowicie zahamowane przez CIT-013 (Rysunek 2A i dodatkowe wideo 1), z IC50 4,6 nM ( Rysunek 2B). Zdolność CIT-013 do hamowania NETozy jest wyjątkowa, ponieważ inne komercyjne przeciwciała skierowane przeciwko różnym (nie) cytrulinowanym histonom nie były w stanie zahamować uwalniania NET (Figura 2C).

Poprzednio wykazaliśmy, że bardzo podobna cząsteczka prekursorowa CIT-013 (różniąca dwa aminokwasy, ale wiążąca podobne epitopy o równym powinowactwie) blokuje NETosis w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne, takie jak aktywowane płytki krwi, płyn maziowy dny moczanowej, a także płyn maziowy RA17. Tutaj pokazujemy, że uwalnianie NET indukowane przez sIC może być hamowane przez CIT-013 (Rysunek 2D). Terapeutyczne znaczenie hamowania NETozy indukowanej tym bodźcem podkreślają SLE, RZS i inne choroby autoimmunologiczne, w których autoprzeciwciała w surowicy lub płynie maziowym wspierają tworzenie IC, co wyzwala NETosis25,26.

Razem, te dane pokazują, że to wysokoprzepustowe podejście do mikroskopii w czasie rzeczywistym jest odpowiednie do badania kinetyki i charakterystyki uwalniania NET oraz pozwala na badanie inhibitorów NETosis. Chociaż metoda ta została zoptymalizowana pod kątem wykorzystania ludzkich neutrofili, z modyfikacjami może być również odpowiednia do badania neutrofili innych gatunków. Dane uzyskane za pomocą tego testu są kamieniem węgielnym uzasadnienia dla CIT-013 jako silnej i skutecznej terapii chorób wywołanych przez NET.

figure-results-1
Rysunek 1: Wysokoprzepustowa mikroskopia w czasie rzeczywistym do badania uwalniania NET. Neutrofile wyizolowane z krwi zdrowych ochotników stymulowano A23187 lub PMA w celu uruchomienia szlaku NETosis. Wydanie NET zostało zwizualizowane za pomocą wysokoprzepustowej mikroskopii w czasie rzeczywistym przy użyciu nieprzepuszczalnego barwnika DNA z błoną plazmatyczną i określone ilościowo na podstawie pola powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy mikroskopii żywych komórek. (A) Analiza powierzchni niestymulowanych zdrowych neutrofili (szarych), zewnątrzkomórkowych NET i przepuszczalnych neutrofili niesieciowych z wewnątrzkomórkowym barwieniem DNA (zielony). (B,C) Kwantyfikacja uwalniania NET w czasie z neutrofili stymulowanych wskazanymi stężeniami A23187 lub PMA (n = 2). (D) Reprezentatywne obrazy wydania NET w odpowiedzi na A23187 (czerwone strzałki) i PMA (żółte strzałki) w różnych punktach czasowych. Przykłady przepuszczalnych neutrofili niesieciowych są oznaczone niebieskimi strzałkami. (E) Kwantyfikacja uwalniania NET w czasie przedstawiona jako procent konfluencji NET (n = 5). Statystyki przeprowadzono na t = 240 min. (F) Kwantyfikacja uwalniania NET w czasie przedstawiona jako procent neutrofili netto (n = 2). (G, H) Oznaczanie ilościowe przepuszczalnych neutrofili niesieciowych w czasie z neutrofili, które zostały stymulowane wskazanymi stężeniami A23187 lub PMA (n = 2). (I) Kwantyfikacja uwalniania NET w t = 240 min indukowanego przez rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (sIC), powlekane IC (cIC), fMLP, kryształy moczanu monosodu (MSU) i kryształy obecne w chorobie dyspozycyjnej pirofosforanu wapnia (CPPD) (n = 8-28). Wyniki podaje się jako średnią ± błędem standardowym średniej. **P < 0,01 i ****P < 0,0001, Powtarzane pomiary jednoczynnikowej ANOVA z testem wielokrotnych porównań Dunnetta (B), test Kruskala-Wallisa z testem wielokrotnych porównań Dunna (I). Panele A-F zostały zmodyfikowane za zgodą van der Linden et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: CIT-013 hamuje uwalnianie NET. (A) Kwantyfikacja indukowanego przez A23187 uwalniania NET przy t = 240 min przy braku (No Ab) lub obecności CIT-013 lub przeciwciała kontrolującego izotyp (cIgG). (B) Zależne od dawki hamowanie indukowanego przez A23187 uwalniania NET za pomocą CIT-013 przy t = 240 min (n = 3). Dane znormalizowano do cIgG (ustawiono jako 100% uwolnienie NET). (C) Kwantyfikacja indukowanego przez A23187 uwalniania NET po t = 240 min w obecności wskazanych stężeń CIT-013, przeciwciała antyhistonowego H4, przeciwciała antycytrulinowanego histonu H3 #1 lub przeciwciała antycytrulinowanego histonu H3 #2 (n = 6). (D) Kwantyfikacja uwalniania NET w t = 240 min indukowanego przez rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (IC) w obecności CIT-013 lub cIgG. Wyniki podaje się jako średnią ± błędem standardowym średniej. P < 0,0001, Powtarzane pomiary jednokierunkowej ANOVA z wielokrotnymi porównaniami Tukeya (A) lub dwustronnym testem rang Wilcoxona z podpisem (D). Panele A, B i D zostały zmodyfikowane za zgodą van der Linden et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Płytka 96-dołkowa #1Płytka 96-dołkowa #2
Objętość: 0,001% roztworu poli-L-lizyny na studzienkę50 μL100 μL
Objętość zawiesiny neutrofili na studzienkę50 μL87,5 μL
Liczba neutrofili w basenie2 x 104 ogniwa3,5 x 104 ogniwa
Objętość 4x skoncentrowany (= 80 nM) barwnik DNA w buforze testowym NET na studzienkę50 μL87,5 μL
Objętość 4x skoncentrowane bodźce NETozy w buforze testowym NET na studzienkę50 μL87,5 μL
Objętość 4x skoncentrowani antagoniści NETozy w buforze testowym NET na studzienkę50 μL87,5 μL

Tabela 1: Objętości i numery komórek zoptymalizowane dla różnych 96-dołkowych płytek obrazowych.

Zagęszczony roztwór roboczy (4x skoncentrowany)Końcowe stężenie
Jonofor wapnia (A23187)50 μM12,5 μM
Pma16 nM4 nM
fMLP (Język angielski)4 μM1 μM
Kryształy moczanu sodu (MSU)400 μg/ml100 μg/ml
Kryształy choroby dyspozycyjności pirofosforanu wapnia (CPPD)400 μg/ml100 μg/ml
Rozpuszczalne kompleksy immunologiczne (sIC)1. Dodać 5 μg/ml albuminy surowicy ludzkiej (HSA) w DPBS do 282,5 μg/ml poliklonalnego królika przeciwciała anty-HSA w DPBS.
2. Inkubować przez co najmniej 90 minut w temperaturze 37 °C.
3. Homogenizować przez wirowanie i dodać 50 μl roztworu sIC do odpowiednich studzienek.
Powlekane kompleksy immunologiczne (cIC)1. Dodaj 10 μg/ml HSA w DPBS do odpowiednich dołków płytki 96-dołkowej.
2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 200 μL 0.05% Tween-20 w DPBS (zwanym dalej PBS/0.05%Tween).
4. Zatkaj studzienki 200 μL 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej w PBS/0,05% Tween (zwanej dalej buforem blokującym).
5. Inkubować przez 120 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszać (400 obr./min).
6. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 200 μL PBS/0,05% Tween.
7. Dodaj 50 μL poliklonalnego królika anty-HSA w buforze blokującym do odpowiednich studzienek.
8. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej i delikatnie mieszać (400 obr./min).
9. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 200 μL PBS/0,05% Tween.
10. Na koniec umyj studzienki 3 razy za pomocą 200 μL DPBS. Wells jest teraz gotowy do kroku 4.7 w protokole.

Tabela 2: Zalecane stężenia dla bodźców NETosi.

Zagęszczony roztwór roboczy (4x skoncentrowany)Końcowe stężenie
Przeciwciało anty-jaja kurzego przeciwko lizozymowi (przeciwciało kontrolne; cIgG)80 nM20 nM
Certyfikat CIT-01380 nM20 nM

Tabela 3: Zalecane stężenia dla antagonisty NETozy.

Dodatkowe wideo 1. Neutrofile stymulowano A23187 w obecności cIgG (po lewej) lub CIT-013 (po prawej), a uwalnianie NET wizualizowano w czasie za pomocą barwnika DNA nieprzepuszczalnego dla błony plazmatycznej. Uwalnianie NET jest zahamowane w obecności CIT-013. Film jest nakładką barwnika DNA (zielonego) i kontrastu fazowego. Ten film został uzyskany za zgodą van der Linden et al.16. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu odkrycia NET w 2004 r. opracowano wiele strategii eksperymentalnego badania uwalniania NET in vitro, przy czym mikrokopia immunofluorescencyjna jest najczęstszą techniką ilościowego oznaczania NETosis27,28. Chociaż mikroskopia jest przydatna do wizualizacji wydania NET, ma ograniczenia, ponieważ niezautomatyzowana mikroskopowa kwantyfikacja obrazów o stałych punktach czasowych jest raczej niedokładna i może cierpieć z powodu stronniczości obserwatora. Inną techniką stosowaną do badania uwalniania NET jest obrazowanie wielospektralne cytometria przepływowa29,30, która mierzy dużą liczbę neutrofili sieciowych i przyjmuje bezstronną analizę, ale koncentruje się na neutrofilach we wczesnych stadiach NETozy i nie określa ilościowo neutrofili, które uwolniły swoje NET. Wiele badań nad kinetyką NETozy wykorzystuje barwnik DNA do ilościowego określenia uwalniania NET w połączeniu z czytnikiem płytek fluorescencyjnych31. Technika ta nie jest w stanie odróżnić NET od aktywowanych lub umierających neutrofili z wewnątrzkomórkowym barwieniem DNA, a zatem nie nadaje się do ilościowego oznaczania uwalniania NET i badania antagonistów NETozy. Powyższe podkreśla, że podejścia stosowane obecnie do badania NETosis są cenne, ale mają swoje ograniczenia.

Opisana w tym badaniu metoda mikroskopii w czasie rzeczywistym rozwiązuje wiele problemów znalezionych we wcześniej opisywanych technikach. Oferuje bezstronną, półautomatyczną, wysokowydajną, powtarzalną i dokładną kwantyfikację NET. Rzeczywiście, takie podejście minimalizuje artefakty pipetowania, takie jak rozciągnięta morfologia NET18, i jest w stanie odróżnić NETozę od nekrozy i apoptozy dzięki odrębnej morfologii i kinetyce uwalniania DNA18,32. Ponadto podejście to daje możliwość zbadania różnych szlaków biochemicznych regulujących śmierć komórki, takich jak tworzenie NET w neutrofilach nekroptotycznych, które generują struktury spełniające funkcjonalne i fenotypowe kryteria NET33.

W tym protokole istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wykonać, aby pomyślnie określić ilościowo NET. Po pierwsze, prawidłowa liczba komórek w studzience jest ważna dla dokładnej kwantyfikacji NET. Gdy gęstość neutrofili jest zbyt wysoka, komórki i NET będą nakładać się na sąsiednie komórki i NET, co utrudni ich rozróżnienie, w wyniku czego kwantyfikacja stanie się niedokładna. Po drugie, warunkiem wstępnym jest użycie niskiego stężenia nietoksycznego, nieprzepuszczalnego dla błony plazmatycznej barwnika wiążącego DNA do barwienia NET, gdy są wydzielane do środowiska zewnątrzkomórkowego. Przepuszczalne dla błony plazmatycznej barwniki wiążące DNA mogą łatwo indukować aktywację neutrofili lub śmierć komórki. Po trzecie, należy zeskanować wiele obrazów na studzienkę, aby uzyskać reprezentatywny przegląd uwalniania NET w heterogenicznej populacji neutrofili. Po czwarte, obraz z kontrastem fazowym neutrofili przy t = 0 jest konieczny do skorygowania liczby neutrofili na obrazie i obliczenia procentu neutrofili netto.

Chociaż to wysokoprzepustowe podejście do mikroskopii w czasie rzeczywistym ma wiele zalet w porównaniu z innymi testami wykrywania NET, istnieją ograniczenia tej metody, ponieważ, o ile nam wiadomo, nie ma dostępnych barwników fluorescencyjnych do wykrywania dodatkowych składników NET w celu potwierdzenia uwolnienia NET. Przeciwciała znakowane fluorescencyjnie do wykrywania dodatkowych składników NET mogą być stosowane, ale mogą mieć niepożądane skutki, ponieważ kompleksy przeciwciało-układ odpornościowy wpływają na aktywację neutrofili i prawdopodobnie NETozę. Dlatego wolimy nie używać dodatkowych przeciwciał w tej konfiguracji testu i zamiast tego zalecamy stosowanie dobrze znanych bodźców indukujących NETozę. W przypadku gdy stosowane są jeszcze nieustalone bodźce NETozy, zalecamy użycie testu ELISA do wykrywania DNA skompleksowanego z białkami specyficznymi dla NET, takimi jak cytrulinowane histony, przed testem obrazowania na żywo. Po drugie, zmienność wewnątrz- i międzytestowa może wynikać ze zmienności między dawcami, przy czym neutrofile od zdrowych dawców reagują inaczej na różne bodźce NETozy ze względu na heterogeniczność w zdrowej populacji. Aby zminimalizować zmienność testu, neutrofile muszą zostać wyizolowane w ciągu 1 godziny ze świeżo pobranej krwi i natychmiast wykorzystane w doświadczeniu, ponieważ neutrofile są krótkotrwałe i nie można ich kriokonserwować. Ponadto ważne jest, aby protokół izolacji neutrofili został zatwierdzony i przyjęty w celu zminimalizowania aktywacji neutrofili. Neutrofile są wrażliwymi komórkami i mogą zmieniać swoją reakcję na bodźce podczas procesu oczyszczania z powodu stresu mechanicznego i innych rodzajów stresu. Na stan aktywacji neutrofili i uwalnianie NET może mieć wpływ rodzaj igły, użyte probówki do pobierania krwi, temperatura inkubacji, szybkość wirowania i czas od pobrania krwi do izolacji neutrofili 34,35,36,37. Dodatkowa metoda izolacji neutrofili, którą można rozważyć, została opisana przez Krémera i wsp.36 przy użyciu metody negatywnej selekcji immunomagnetycznej bez lizy czerwonych krwinek. Metoda ta przypomina nietknięte neutrofile we krwi pełnej i może być odpowiednia do zapobiegania aktywacji neutrofili podczas procesu oczyszczania. Wszystko to powinno służyć jako ostrzeżenie dla tej dziedziny, że dane z różnych grup badawczych muszą być porównywane z dużą ostrożnością.

Ogólnie rzecz biorąc, opisana metoda wysokoprzepustowej mikroskopii w czasie rzeczywistym umożliwia dokładne określenie ilościowe NET w powtarzalny i wydajny sposób oraz może być wykorzystana do badania charakterystyki, wielkości i kinetyki uwalniania NET oraz umożliwia badanie aktywności antagonistów NETozy. Jako przykład tego ostatniego zastosowaliśmy humanizowane przeciwciało monoklonalne antycytrulinowane histonem H2A i H4 CIT-013, które jest obecnie w fazie rozwoju klinicznego.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są pracownikami firmy Citryll i mają interesy finansowe.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Paulowi Vinkowi za zarządzanie częścią projektu dotyczącą metody mikroskopii obrazowania na żywo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
A-23187 Wolny kwas (kalcymycyna)Thermo FisherA1493
Chlorek amonu (NH4Cl)Sigma AldrichA9434
Lizozym jaj przeciw jajom kurzym (przeciwciało kontrolne; cIgG)CrownBioC0001
APC-Cy7-sprzężone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD45 (klon 2D1)Biolegend368515Stosować w 1 &mikro; g/mL
stężenie końcowe System BD FACSCantoTM II + oprogramowanie FACSDiva (wersja 8.0.1) BDn/aSystem cytometrii przepływowej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja VRoche10735108001
CaCl2 (1 M)VWRE506
Kryształy choroby dyspozycyjności pirofosforanu wapnia (CPPD)Celometr InvivoGenlrl-cppd
Auto T4 Licznik komórek Bright Field + oprogramowanie analityczne (wersja 3.3.9.5)Nexcelom Biosciencen/aLicznik komórek jasnego pola
CIT-013Citryll B.V.nie dotyczy
Costar 96-dołkowa płytka, przezroczyste dno Corning360396-dołkowa płytka #1
Dextran T500Pharmacosmos551005009006
DPBS (1x)Gibco14190-144
Surowica bydlęca płodu (FBS)SerenaS-FBS-SA-015
Ficoll GE Healthcare17-1440-02Roztwór gradientu gęstości
Sprzężone z FITC mysie przeciwciało anty-ludzkie CD66b (klon G10F5)eBioscience17-0666-42Stosować przy 1,5 i mikro; g / ml stężenie końcowe
Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor 506eBioscience65-0866-14
Oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowejFLowJoWersja 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES (1M)Gibco15630-080
Albumina surowicy ludzkiej (HSA)VWR31020
Człowiek TruStain FcX Biolegend422302Blok receptora Fc
IBIDI 96-dołkowa płytka, przezroczyste dno IBIDI8962696-dołkowa płytka #2
Oprogramowanie analityczne IncuCyte SX3 + (wersja 2022B Rev1) Satoriusn/aSystem analizy mikroskopowej żywych komórek
Kryształy moczanu soduInvivoGentlrl-msu
Mysie przeciwciało antyhistonowe H3 (cytrulina R2 + R8 + R17) Kajman17939Klon 11D3; określany jako #1
Mysie przeciwciało antyhistonowe H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) (Klon KM-2)Przeciwciała bezwzględneAb01681-2.0
Na2EDTASigma AldrichE5134
NaCl (0,9%)B. Braun25900
Penicylina (5000 U/mL) - Streptomycyna (5000 &mikro; g / mL)Gibco15070-063
PerCP-Cy5.5-sprzężone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD16 (klon 3G8)Biolegend302027Stosować w 0,33 &mikro; g / ml stężenie końcowe
PMASigma AldrichP1585
Poliklonalne królicze przeciwciało anty-HSASigma AldrichA0433-2ml
Poli-L-lizyna (0,01%)Sigma AldrichP4832
Wodorowęglan potasu (KHCO3)Przeciwciało antyhistonowe Sigma Aldrich237205
Rabbit H3 (cytrulina R2 + R8 + R17) Abcamab281584Multiklonalny; określany jako #2
RPMI 1640 z suplementem GlutaMAXTM Gibco61870-010Pożywka hodowlana zawierająca L-glutaminę
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej Gibco11835-030Pożywka hodowlana bez czerwieni fenolowej
Azydek sodu (NaN3)SigmaAldrich S2002
Sterylne H2OGibco15230204
Sytox Zielony barwnik kwasem nukleidowym Thermo FisherS7020Barwnik DNA
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)Gibco15250-061
Tween-20Sigma AldrichP1379
Probówki do krwi Vacutainer Li-Heparyna (17 IU / ml)BD367526

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. De Bont, C., Pruijn, G. J. M. Citrulline is not a major determinant of autoantibody reactivity to neutrophil extracellular traps. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 378 (1890), 20220249(2023).
  3. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 5 (10), e1000639(2009).
  4. Hoppenbrouwers, T., et al. In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review. PLoS One. 12 (5), e0176472(2017).
  5. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. ELife. 6, e24437(2017).
  6. Parker, H., Dragunow, M., Hampton, M. B., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus. J Leukoc Biol. 92 (4), 841-849 (2012).
  7. Neeli, I., Radic, M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release. Front Immunol. 4, 38(2013).
  8. Bosmann, M., Ward, P. A. Protein-based therapies for acute lung injury: targeting neutrophil extracellular traps. Expert Opin Ther Targets. 18 (6), 703-714 (2014).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  10. Shiratori-Aso, S., Nakazawa, D. The involvement of NETs in ANCA-associated vasculitis. Front Immunol. 14, 1261151(2023).
  11. Byrd, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps, B cells, and type I interferons contribute to immune dysregulation in hidradenitis suppurativa. Sci Transl Med. 11 (508), eaav5908(2019).
  12. Kimball, A. S., Obi, A. T., Diaz, J. A., Henke, P. K. The emerging role of NETs in venous thrombosis and immunothrombosis. Front Immunol. 7, 236(2016).
  13. O'Neil, L. J., et al. Neutrophil extracellular trap-associated carbamylation and histones trigger osteoclast formation in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 82 (5), 630-638 (2023).
  14. Li, M., et al. A novel peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor BMS-P5 blocks formation of neutrophil extracellular traps and delays progression of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. 19 (7), 1530-1538 (2020).
  15. Chirivi, R. G. S., et al. Anti-citrullinated protein antibodies as novel therapeutic drugs in rheumatoid arthritis. J Clin Cell Immunol. S6, 006(2013).
  16. Van der Linden, M., et al. Anti-citrullinated histone monoclonal antibody CIT-013, a dual action therapeutic for neutrophil extracellular trap-associated autoimmune diseases. MAbs. 15 (1), 2281763(2023).
  17. Chirivi, R. G. S., et al. Therapeutic ACPA inhibits NET formation: a potential therapy for neutrophil-mediated inflammatory diseases. Cell Mol Immunol. 18 (6), 1528-1544 (2021).
  18. Van der Linden, M., Westerlaken, G. H. A., Van Der Vlist, M., Van Montfrans, J., Meyaard, L. Differential signalling and kinetics of neutrophil extracellular trap release revealed by quantitative live imaging. Sci Rep. 7 (1), 6529(2017).
  19. Hoffmann, J. H. O., Schaekel, K., Gaiser, M. R., Enk, A. H., Hadaschik, E. N. Interindividual variation of NETosis in healthy donors: introduction and application of a refined method for extracellular trap quantification. Exp Dermatol. 25 (11), 895-900 (2016).
  20. Silva, L. M., Moutsopoulos, N., Bugge, T. H., Doyle, A. Live imaging and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Curr Protoc. 1 (7), e157(2021).
  21. De Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1865 (11 Pt A), 1621-1629 (2018).
  22. Gajendran, C., et al. Alleviation of arthritis through prevention of neutrophil extracellular traps by an orally available inhibitor of protein arginine deiminase 4. Sci Rep. 13 (1), 3189(2023).
  23. Biron, B. M., Chung, C. -S., O'Brien, X. M., Chen, Y., Reichner, J. S., Ayala, A. Cl-Amidine prevents histone 3 citrullination and neutrophil extracellular trap formation, and improves survival in a murine sepsis model. J Innate Immun. 9 (1), 22-32 (2017).
  24. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nat Commun. 10 (1), 1322(2019).
  25. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nat Med. 22 (2), 146-153 (2016).
  26. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  27. De Buhr, N., Von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. J Immunol Res. 2016, 1-13 (2016).
  28. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  29. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
  30. Gavillet, M., et al. Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps in blood samples. Am J Hematol. 90 (12), 1155-1158 (2015).
  31. Sil, P., Yoo, D., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. J Vis Exp. (112), e52779(2016).
  32. Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
  33. D'Cruz, A. A., et al. The pseudokinase MLKL activates PAD4-dependent NET formation in necroptotic neutrophils. Sci Signal. 11 (546), eaao1716(2018).
  34. Nash, G., Abbitt, K., Tate, K., Jetha, K., Egginton, S. Changes in the mechanical and adhesive behaviour of human neutrophils on cooling in vitro. Pflugers Arch. 442 (5), 762-770 (2001).
  35. Hundhammer, T., Gruber, M., Wittmann, S. Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils. Biomedicines. 10 (11), 2896(2022).
  36. Krémer, V., Godon, O., Bruhns, P., Jönsson, F., De Chaisemartin, L. Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation. Front Immunol. 14, 1301183(2023).
  37. Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L. F. C., Fernandes, E. Isolation and activation of human neutrophils in vitro. The importance of the anticoagulant used during blood collection. Clin Biochem. 41 (7-8), 570-575 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neutrophil Extracellular TrapsNETosis AntagonistsReal Time MicroscopyHigh Throughput QuantificationNeutrophil IsolationNET ReleaseLive Cell ImagingMonoclonal Antibody InhibitorPhase Contrast MicroscopyInflammatory Diseases

Powiązane artykuły