Artykuł metodologiczny

Protokół dla eksplantatów rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1

DOI:

10.3791/67260

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmutowane IDH1 rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości to rzadkie nowotwory, które są trudne do hodowli. Wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę eksplantacji, która zachowuje ekspresję białka z mutacją IDH1 i utrzymuje kultury przez wiele miesięcy. Co ważne, technika ta działa w przypadku kriokonserwowanych guzów, oferując cenne źródło informacji do badań nad glejakiem.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozlane glejaki, najbardziej rozpowszechnione pierwotne guzy mózgu, są klasyfikowane na niskie i wysokie na podstawie kryteriów histopatologicznych i mutacji genetycznych. Rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości stanowią podgrupę, dotykającą głównie młodych dorosłych i predysponującą do glejaków o wysokim stopniu złośliwości. Istnieją dwa główne typy rozlanych glejaków o niskim stopniu złośliwości: gwiaździaki i skąpodrzewiaki, z których każdy jest zdefiniowany przez odrębne cechy genetyczne i histologiczne. Guzy te charakteryzują się zmutowanym wariantem enzymu metabolicznego IDH1, zaburzając różnicowanie komórkowe. Są niejednorodne, zawierają zarówno proliferacyjne komórki macierzyste, jak i bardziej zróżnicowane, spokojne komórki glejowe.

Specyficzne dla pacjenta, modele nowotworów in vitro mają znaczny potencjał do odkrywania mechanizmów onkogennych i dostosowywania wyboru leków do spersonalizowanej terapii. Jednak brak wiarygodnych modeli in vitro specyficznych dla glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 utrudnił badania podstawowe i translacyjne. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę hodowli guzów z mutacją IDH1 jako eksplantatów w określonych pożywkach bez konieczności dysocjacji enzymatycznej. Te eksplantaty mogą być utrzymywane przez dłuższy czas, utrzymując ekspresję białka z mutacją IDH1, a także markery komórek progenitorowych oligodendrocytów, takich jak ASCL1 (MASH1), OLIG1 i OLIG2 oraz astrocytów (GFAP, SOX9). Można je również ustalić z zamrożonych guzów w DMSO. Kultury te mogą służyć jako cenna platforma do badań przesiewowych leków, wideomikroskopii i badań genów, ułatwiając w ten sposób postęp w zrozumieniu i leczeniu tych trudnych nowotworów. Oferują również potencjał do wyprowadzania linii komórkowych z mutacją IDH1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Glejaki rozlane są najczęstszymi pierwotnymi nowotworami mózgu. Guzy te są obecnie nieuleczalne pomimo bardzo intensywnego leczenia (operacja, radioterapia i chemioterapia)1. Coraz więcej dowodów potwierdza hipotezę, że glejakowa geneza wywodzi się z dorosłych komórek macierzystych lub glejowych komórek progenitorowych rezydujących w mózgu2. Chociaż glejaki wielopostaciowe reprezentują najbardziej agresywny typ, rozlane glejaki o niskim stopniu złośliwości (DLGG, guzy stopnia 2) są również powszechne (15% rozlanych glejaków)1,3. DLGG rosną powoli i migrują wzdłuż dróg istoty białej, co jest cechą charakterystyczną tego "rozlanego" nowotworu4. Te DLGG bardzo często nawracają pomimo leczenia, ostatecznie postępując do nowotworów złośliwych o wysokim stopniu złośliwości (stopnie 3 i 4)5.

DLGG charakteryzują się mutacją typu missense w genie dehydrogenazy izocytrynianowej 1 lub 2 (IDH1 lub IDH2), co skutkuje nieprawidłową produkcją onkometabolitu 2-hydroksyglutaranu (2HG). Powoduje to zakłócenie różnicowania komórek poprzez dysregulacje epigenetyczne6. Glejaki z mutacją IDH1 są dalej klasyfikowane do podtypów: gwiaździaki zazwyczaj mają mutacje w ATRX i P53, podczas gdy skąpodrzewiaki charakteryzują się delecjami 1p19q7. Guzy te wykazują niejednorodność komórek nowotworowych. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i immunocharakterystyka ujawniły zróżnicowaną populację komórek nowotworowych, wykazujących fenotypy podobne do komórek macierzystych, astrocytów i oligodendrocytów w tych nowotworach8,9.

W przeciwieństwie do glejaka, który korzysta z łatwo dostępnych, długoterminowych hodowli i linii komórkowych, istnieje zauważalny niedobór narzędzi komórkowych dostosowanych do badania nowotworów z mutacją IDH11. Stanowi to poważną przeszkodę w postępie w rozwoju terapii i pogłębieniu naszej wiedzy na temat glejakogenezy i progresji choroby z mutacją IDH1. Tradycyjne linie komórkowe hodowane w surowicy, choć długo stosowane, nieodpowiednio replikują pierwotne nowotwory, wykazując zmienione profile transkrypcyjne. Alternatywnie, warunki hodowli bez surowicy, zarówno w modelach 2D, jak i 3D guzów, skuteczniej zachowują profile transkrypcyjne komórek nowotworowych i ich fenotypy in vivo, takie jak inwazja na normalną tkankę mózgową10,11.

Ponadto, krótkoterminowe hodowle komórek pochodzące z próbki chirurgicznej pacjenta zachowują profil molekularny i różnorodność komórkową guza, tym samym lepiej reprezentując biologiczne cechy nowotworów w porównaniu z liniami komórkowymi12. W niniejszym artykule wprowadzamy prostą, nieenzymatyczną metodę hodowli rozproszonych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 w postaci eksplantatów pochodzących ze świeżych lub mrożonych resekcji pacjentów, mając na celu zaspokojenie potrzeby ulepszonych modeli in vitro do badań nad glejakiem i rozwoju terapeutycznego. Oferują również potencjał do wyprowadzania linii komórkowych z mutacją IDH1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fragmenty guza użyte w tym protokole zostały uzyskane z dobrze scharakteryzowanej i etycznie zatwierdzonej kolekcji, za zgodą pacjenta. Badania przeprowadzono w ramach projektu pt. Gliomacult: Charakterystyka i pierwotne kultury glejaków o niskim stopniu złośliwości (nr projektu). RECH/P722/1-5) i został zatwierdzony przez radę naukową biobanku nowotworów w dniu 28 sierpnia 2023 r.

1. Przygotowanie płytek hodowlanych

UWAGA: Wykonaj te kroki pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym.

  1. Co najmniej 1 godzinę przed hodowlą należy przygotować 24-dołkowe płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL) i lamininą.
    1. Rozcieńczyć 10 mg proszku PDL w 100 ml buforu boranowego (pH 8,4) do końcowego stężenia 100 μg/ml. Po rozpuszczeniu przefiltrować roztwór (0,22 μm) pod kątem sterylności. PDL jest gotowy do użycia; przygotować 3 ml porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    2. Rozmrozić probówkę z lamininą o stężeniu 1-2 mg/ml w temperaturze 4 °C, aby uniknąć tworzenia się żelu. Przygotować 50 μl porcji i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Należy unikać wielokrotnego rozmrażania i zamrażania.
    3. Powlekanie płyt
      1. Opcjonalny krok: umieścić sterylne szkiełka nakrywkowe Ø, 13 mm, odpowiednie do naczyń do hodowli komórkowych, w 24-dołkowej płytce, po jednym szkiełku nakrywkowym na basenik.
        UWAGA: Ten krok służy do dalszego barwienia immunologicznego eksplantatów glejaka.
      2. W celu pokrycia studzienek należy zmieszać 3 ml roztworu PDL z 9 ml 1x PBS i dodać 50 μl lamininy. Dodać 500 μl tego roztworu do każdej studzienki, aby uzyskać stężenie powłoki 1-2 μg/cm². Inkubować powlekane płytki w temperaturze pokojowej, najlepiej z powolnym kołysaniem (15 obr./min), przez co najmniej 1 godzinę.
      3. Bezpośrednio przed hodowlą usunąć roztwór PDL-lamininy i dwukrotnie spłukać sterylnym 1x PBS.
        UWAGA: Nie pozwól, aby studzienki wyschły.

2. Multimedia

  1. Hodowla eksplantatów z mutacją IDH1 w określonym pożywce zawierającej DMEM/F12 uzupełnioną L-glutaminą, wraz z mieszanką zastępczą surowicy składającą się z N2 i B27 bez witaminy A. Stosuj antybiotyki, w tym cyprofloksacynę, gentamycynę i grzyby, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu i grzybiczemu. Dodatkowo należy wprowadzić do pożywki czynniki wzrostu: heparynę, EGF i FGF2, przefiltrować je (0,2 μm) i przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat składników i przygotowania podłoża znajdują się w Tabeli 1 i Tabeli materiałów.

3. Przygotowanie eksplantacji

  1. Przed przetworzeniem próbki przygotuj przestrzeń roboczą i sterylne narzędzia, jak pokazano na rysunku Rysunek 1A. Zdezynfekuj chłodny okład, spryskując go 70% etanolem. Wysterylizuj nożyczki i kleszcze, zanurzając je w 70% etanolu i spłukując PBS.
  2. Niezwłocznie przenieś resekcję guza do posiewu na lodzie, najlepiej w ciągu 2 godzin po ekstrakcji chirurgicznej (Rysunek 1B).
    UWAGA: Próbka guza powinna mieć minimalną średnicę 9-10 mm, aby zapewnić lepsze wyniki. Tkanka jest transportowana bez pożywki hodowlanej, ponieważ ta metoda jest preferowana do celów histologicznych. Brak cieczy zapobiega tworzeniu się kryształków lodu podczas błyskawicznego zamrażania, zachowując w ten sposób integralność tkanek do późniejszego badania histologicznego, jeśli to konieczne.
  3. Umieść naczynie hodowlane z próbką guza na chłodnym opakowaniu i delikatnie spłucz je 1X PBS, aby usunąć nadmiar krwi.
  4. Wycięty guz często wykazuje znaczny rozmiar i niejednorodność, obejmującą masę guza, naciekaną tkankę i składniki nienowotworowe (Figura 1C). Wybierz porcje o szarym kolorze z miękką lub galaretowatą teksturą do izolacji komórek nowotworowych, ponieważ mają one tendencję do zawierania większej liczby komórek nowotworowych. I odwrotnie, unikaj twardych i białych obszarów, ponieważ mogą one zawierać mniej komórek nowotworowych nadających się do hodowli (Rysunek 1D), a także obszarów poczerniałych, ponieważ są one prawdopodobnie wynikiem elektrokoagulacji i mogą nie dostarczyć wiarygodnych wyników do analizy.
  5. Przenieś wybrane próbki do mikroprobówki lub kriowialu o pojemności 1,5 ml w celu rozdrobnienia. Dodać 1 ml sterylnego podłoża do mikroprobówki lub kriowialu o pojemności 1,5 ml i posiekać próbkę sterylnymi nożyczkami, aż do uzyskania małych kawałków (1-2 mm3).
    UWAGA: Potrzeba około 1-2 minut siekania, aby uzyskać drobne fragmenty, zwykle o wielkości 1-2 mm3 (Rysunek 1E).
  6. Sterylnymi nożyczkami ostrożnie przytnij koniec niebieskiej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl, aby uzyskać szeroki otwór o średnicy około 3-4 mm. Za pomocą tej zmodyfikowanej końcówki odpipetuj 50-200 μl zmielonych fragmentów tkanek i rozprowadź je równomiernie w każdym dołku. Ponieważ mniejsze kawałki mają tendencję do szybkiego osiadania, delikatnie ponownie homogenizuj zawiesinę w każdym dołku, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie.
    UWAGA: Unikaj przeludnienia i utrzymuj równowagę, nie wprowadzając nadmiernej liczby fragmentów do każdej studzienki (Rysunek 1F).
  7. Inkubuj fragmenty guza w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 o wilgotności 100%. Zmieniaj pożywkę codziennie, jeśli wymaga tego aktywność metaboliczna guza (na co wskazuje szybkie żółknięcie pożywki) i liczba fragmentów w każdym dołku. Podczas wymiany pożywki należy zachować ostrożność, delikatnie odsysając pożywkę za pomocą pipety wyposażonej w końcówkę o pojemności 200 μl, upewniając się, że nie naruszyć przylegających fragmentów guza
    8. .

figure-protocol-1
Rysunek 1: Procedura hodowli eksplantatów guza. Rozlaną resekcję glejaka o niskim stopniu złośliwości uzyskano od 44-letniego pacjenta, u którego zdiagnozowano gwiaździaka II stopnia zgodnie z klasyfikacją WHO 2021. Guz wykazywał mutację IDH1 (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) i mutację TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), wraz z brakiem barwienia ATRX. Nie wykryto mutacji w miejscach wiązania Ets/TCF (C250T i C228T) genu TERT. (A) Powierzchnia robocza składa się z chłodnego wkładu, zapewniającego środowisko, które minimalizuje degradację próbki i utrzymuje żywotność składników biologicznych. Te środki ostrożności są ważne dla zachowania jakości i integralności tkanki. (B) Transport próbki ze szpitala do laboratorium powinien odbywać się na lodzie. (C) Fragment resekcji guza. Strzałki pokazują najbardziej odpowiednie części dla kultury. (D) Sekcja guza jest wykonywana w celu wybrania najbardziej odpowiedniej części do zmielenia. Z naszego doświadczenia wynika, że istota biała jest na ogół mniej skłonna do generowania udanych eksplantatów. (E) Fragmenty guza o średnicy około 1-2 mm³ w probówce o pojemności 15 ml po mechanicznym zmieleniu nożyczkami. (F) Liczba kawałków guza wymaganych do prawidłowego wysiewu jest pokazana dla studzienek na 24-dołkowej płytce. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Kriokonserwacja i rozmrażanie guzów mielonych

UWAGA: Kriokonserwacja zapewnia wsparcie w przypadku zanieczyszczenia i utraty kultur eksplantacji lub późniejszego przetworzenia próbek guza

.
  1. Kriokonserwacja: Przygotować pożywkę do zamrażania (20% v/v roztwór DMSO), dodając 2 ml DMSO do 8 ml pożywki do hodowli komórkowych.
  2. Połączyć 1 objętość mielonej zawiesiny guza z równą objętością 20% pożywki zamrażającej DMSO, aby uzyskać końcowe stężenie 10% DMSO. Ostrożnie pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie, a następnie dozować około 1 ml do kriowialiów.
  3. Szybko przenieś kriowiale do pojemnika kriogenicznego w celu stopniowego obniżania temperatury, a następnie wykonaj nocną inkubację w temperaturze -80 °C przed ostatecznym przechowywaniem w ciekłym azocie.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać natychmiast po umieszczeniu komórek w podłożu zamrażającym, ponieważ niektóre krioprotektanty, takie jak DMSO, mogą być szkodliwe, jeśli komórki są wystawione na ich działanie w temperaturze pokojowej dłużej niż to konieczne.
  4. Rozmrażanie: Usuń kriowiale z ciekłego azotu i natychmiast umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż około 80% komórek się rozmrozi
    5. .
  5. Aby usunąć DMSO, należy szybko odpipetować zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego 1x PBS i odwirować przy 300 × g przez 5 minut.
  6. Usunąć supernatant i powtórzyć płukanie z 1X PBS, a następnie odwirować (krok 4.5). Odessać supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu, i dodać odpowiednią ilość pożywki, aby przenieść ją do wstępnie powleczonej 24-dołkowej płytki PDL-Laminin i umieścić w inkubatorze.
  7. Po 24 godzinach sprawdź, czy komórki są połączone. Po kilku dniach usuń nieprzylegające fragmenty, wymieniając pożywkę hodowlaną.

5. Przejście kultury

UWAGA: Po ustaleniu, eksplantaty mogą być używane do wideomikroskopii lub barwienia immunologicznego. Alternatywnie, jeśli komórki nowotworowe wyemigrowały z eksplantatu i wydają się zdrowe, eksplant może zostać poddany przez dysocjację enzymatyczną i ponownie zasiany w studzienkach w celu dalszych eksperymentów. Należy jednak pamiętać, że ten protokół nie jest przeznaczony do wielokrotnego przechodzenia. Zazwyczaj można podjąć próbę tylko jednego przejścia, zanim komórki nowotworowe zestarzeją się lub umrą. Nie wszystkie kultury eksplantatów zakończą się pomyślnym pasażem.

  1. Aby przejść, usuń stare pożywki, przepłucz 1X PBS i dodaj (125 μL) 0,05% trypsyny-EDTA do studzienek i inkubuj przez 3-4 minuty w temperaturze 37 °C, a następnie dodaj 6,5 μl inhibitora trypsyny, 12 μl 20 mM CaCl2 (końcowe rozcieńczenie do 2 mM) i 1 μl DNAzy I.
    UWAGA: Czas inkubacji potrzebny do dysocjacji może się różnić w zależności od kultury. Ważne jest, aby sprawdzić, czy ogniwa są odłączone po co najmniej 3 minutach. Zazwyczaj eksplant może nie być w pełni zdysocjowany do zawiesiny jednokomórkowej, a małe skupiska są często zatrzymywane, co może generować nowe kultury eksplantatów.
  2. Z p1000 ustawionym na 500-600 μl, delikatnie przepłukać, aby rozdzielić eksplantaty. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
  3. Dodać 5 ml 1x PBS i wirować przez 5 minut w temperaturze 300 × g. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad w świeżym, podgrzanym podłożu i policzyć do wysiewu.
  4. Zidentyfikuj kultury o potencjale generowania linii komórkowych, obserwując dzielące się komórki pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Te dzielące się komórki mają zazwyczaj zaokrągloną morfologię i widoczne chromosomy, jak pokazano na Rysunek 2A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po kilku dniach, niektóre fragmenty guza przylgną do powierzchni studni, inicjując wzrost komórek z eksplantatów. Czas między początkowym posiewem a pojawieniem się komórek rosnących nowotworu różni się w zależności od próbki. Początkowe hodowle często zawierają znaczne szczątki komórkowe, co utrudnia ocenę obecności żywotnych komórek. W związku z tym kulturę należy utrzymywać przez co najmniej 4 tygodnie. Gdy komórki zaczynają rosnąć, obserwuje się wydłużone komórki o dwubiegunowym lub wielobiegunowym wyglądzie (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie modeli in vitro i przedklinicznych glejaków o niskim stopniu złośliwości z mutacją IDH1 jest szczególnie trudne ze względu na powolny wzrost tych nowotworów i złożoność replikacji rozległych zmian genomowych i epigenomicznych spowodowanych mutacją IDH. Co więcej, te naciekające komórki nowotworowe aktywnie oddziałują z otaczającymi komórkami, w tym komórkami odpornościowymi, śródbłonka, glejowymi i neuronalnymi, potencjalnie polegając na nich w celu przeżycia. Ta złożona interakcja jest trudna do odtworzenia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyte tutaj fragmenty guza są częścią kolekcji NEUROLOGY świeżych próbek tkanek utrzymywanej przez Centrum Zasobów Biologicznych w Szpitalu Uniwersyteckim w Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Badania przeprowadzono w ramach projektu pt. "Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas" kierowanego przez prof. J. P. Hugnota (nr projektu J. P. Hugnot. RECH/P722/1-5). Prace te były wspierane przez La ligue contre le cancer, ARC (Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C jest wspierany przez Krajową Radę Nauk Humanistycznych i Technologii (CONAHCYT) w Meksyku oraz Stowarzyszenie Badań nad Nowotworami Mózgu (ARTC) we Francji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Anty-ASCL1BD Pharmingen&handel;556604Rozcieńczenie 1:500
Anty-ATRXSigma-AldrichHPA001906Rozcieńczenie 1:100
Anty-CD68AgilentM081401-2Rozcieńczenie 1:500
Anty-GFAPAves LabsAB_2313547Rozcieńczenie 1:500
Przeciwciała anty-IBA1Wako019-19741Dylituion 1:1000
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-IDH1 (R132H)DianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen&handel;556003Napęd 1:1000
Anty-OLIG1R& D Systems®AF2417Dulituion 1:300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50Rozcieńczenie 1:250
Anty-SOX9Abcam®EPR14335-78Rozcieńczenie 1:100
Suplement B-27 (50x), bez witaminy AThermo Fisher Scientific12587010
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)CiteAbA-421-100
Cyprofloksacyna HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning®432000Pojemnik do zamrażania komórek, do 12 x 1 ml lub 2 ml fiolki kriogeniczne
Szkiełko nakrywkowe Ø, 13 mmKarl Hecht™ Asystent i handel;
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM/F-12, bez glutaminyThermo Fisher Scientific21331020
DNAza ISigma-Aldrich10104159001
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TCCorning®
Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning®353047Wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z powłoką TC, z pokrywką, sterylna 
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamycynaThermo Fisher Scientific15750-037
HeparynaSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Człowiek EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Ludzki FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-GlutaminaThermo Fisher Scientific25030-024
Suplement N-2 (100x )Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
Filtr strzykawkowy Serum acrodisc 37 mm z GF/0,2 i mikro; m SuporPALL Corporation4525
Inhibitor trypsynyThermo Fisher Scientific17075-029
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaMikroskop Thermo Fisher Scientific25300054
Zeiss Z1 Apotome 3Prosty szerokopolowy mikroskop epifluorescencyjnyZeiss
328017353003

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  3. Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review. Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).
  4. Louis, D. N. Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).
  5. Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data. J Pers Med. 11 (8), 818(2021).
  6. Pirozzi, C. J., Yan, H. The implications of idh mutations for cancer development and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).
  7. Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma. J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).
  8. Suva, M. L., Tirosh, I. The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).
  9. Augustus, M., et al. Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis. Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).
  10. Hubert, C. G., Rich, J. N. Patient-derived explants as tumor models. Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).
  11. Abdullah, K. G., et al. Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma. Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).
  12. Yuzhakova, D. V., et al. Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).
  13. Kloosterman, D., et al. Morphology of microglia across contexts of health and disease. Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).
  14. Thomas, D. L. 2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review. Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).
  15. Azar, S., et al. Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation. Glia. 66 (2), 239-255 (2018).
  16. Bhaduri, A., et al. Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma. Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Glioma z mutacj IDH1protok eksplantacji guzakom rki progenitorowe oligodendrocyt wmarkery astrocyt wmikro rodowisko guzaprotok kriokonserwacji3D modele nowotworowespersonalizowany screening lek w

Powiązane artykuły