Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Streszczenie

Optogenetyka oferuje możliwość naśladowania złożonej czasoprzestrzennej kontroli aktywności enzymów aż do rozdzielczości subkomórkowej. Jednak większość podejść optogenetycznych często napotyka poważne wyzwania związane z integracją wielu możliwości w jednym narzędziu, które ma zastosowanie do szerokiego zakresu białek docelowych. Osiągnięcie precyzyjnej kontroli nad kinetyką włączania/wyłączania, zapewnienie minimalnej nieszczelności w ciemności i wykazanie wydajnej wydajności w komórkach ssaków z subkomórkową precyzją to tylko niektóre z najczęstszych wyzwań napotykanych w tej dziedzinie. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie racjonalnie zaprojektowanych domen światłoczułych do allosterycznej kontroli aktywności białek. Korzystając z tej strategii, opracowaliśmy metodę optogenetyczną łączącą wszystkie pożądane cechy. Podejście to polega na włączeniu regulowanego światłem modułu przełącznika allosterycznego (LightR) do białka docelowego w celu regulacji aktywności enzymu za pomocą światła niebieskiego (465 nm). Domena LightR jest generowana przez połączenie dwóch domen fotoreceptorów Vivid (VVD), tworząc światłoczuły zacisk, który można włączyć do małej elastycznej pętli w domenie katalitycznej enzymu. W stanie ciemnym zacisk LightR jest otwarty, zniekształcając w ten sposób domenę katalityczną enzymu i dezaktywując ją. Po wystawieniu na działanie światła niebieskiego domena LightR zamyka się i przywraca strukturę domeny katalitycznej oraz aktywność enzymatyczną. W tym manuskrypcie omawiamy strategie projektowania w celu wygenerowania kinazy białkowej regulowanej światłem i wykazania jej kontroli za pomocą światła niebieskiego, odwracalności, kinetyki i precyzyjnej regulacji na poziomie subkomórkowym, umożliwiając ścisłą precyzję czasoprzestrzenną. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, prezentujemy protokół skutecznej regulacji aktywności kinazy LightR-Src. Wykazaliśmy również możliwość zastosowania LightR w różnych klasach enzymów, zwiększając użyteczność systemu narzędzi w rozwiązywaniu mechanistycznych problemów szlaków sygnałowych w różnych chorobach.

Wprowadzenie

Zdolność komórki do interpretowania sygnałów zewnętrznych i przekształcania ich w określone reakcje w kontekstach fizjologicznych lub patologicznych jest kierowana przez dedykowane grupy białek. Udział dowolnego białka w takich złożonych reakcjach jest często definiowany przez jego subkomórkową lokalizację, poziom ekspresji i czas przejściowej, trwałej lub oscylacyjnej aktywacji. Analiza roli tych indywidualnych parametrów w regulacji sygnalizacji wymaga metod zdolnych do odtworzenia skomplikowanej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek na poziomie subkomórkowym. Tradycyjne techniki, takie jak manipulacje genetyczne i inhibitory małocząsteczkowe, nie spełniają oczekiwań pod tym względem. Natomiast techniki optogenetyczne obiecują potencjał w zakresie analizy procesów biologicznych poprzez manipulowanie lub naśladowanie procesów fizjologicznych i patologicznych. Jednak obecne narzędzia często nie mają szerokiego zastosowania ani kontroli subkomórkowej. Kilka istniejących strategii zapewnia ścisłą regulację lokalizacji i interakcji białek; ale nie mają bezpośredniej kontroli nad aktywnością enzymatyczną^1,2,3,4. Inne umożliwiają regulację aktywności enzymatycznej, ale mogą nie mieć kontroli subkomórkowej lub mają ograniczoną przydatność w różnych klasach enzymów^5,6,7,8,9. W tym dokumencie dotyczącym protokołu opisujemy nowatorską metodę inżynierii białek, która łączy zalety optogenetyki w jednym narzędziu: ścisłą regulację czasową, przestrajalną kinetykę, kontrolę subkomórkową i szerokie zastosowanie enzymów¹⁰. Zaprojektowaliśmy domenę regulowaną światłem (LightR), która działa jak przełącznik allosteryczny po wprowadzeniu do docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Strategia ta umożliwia ścisłą czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji i dezaktywacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w żywych komórkach.

Tutaj omówiono projekt i strategię zastosowania narzędzia optogenetycznego LightR w kilku klasach enzymów. Badanie to oferuje krok po kroku protokół opracowania, scharakteryzowania i zastosowania regulowanej światłem kinazy tyrozynowej Src (LightR-Src). Badanie dodatkowo demonstruje możliwość przestrajania kinetyki inaktywacji przełącznika LightR. Wolno dezaktywujący się przełącznik LightR może utrzymywać aktywność enzymów przy zmniejszonej częstotliwości oświetlenia, podczas gdy wersja z szybką jazdą na rowerze, FastLightR, wymaga częstszego podświetlania do aktywacji, ale wykazuje szybką dezaktywację, gdy oświetlenie jest wyłączone. Aktywacja/inaktywacja FastLightR-Src w żywych komórkach indukuje cykle rozprzestrzeniania się i wycofywania komórek. Rozprzestrzenianie się komórek indukowane przez FastLightR-Src zgadza się z fizjologiczną rolą kinazy Src^11,12. Ze względu na szybką kinetykę inaktywacji, FastLightR-Src może być również regulowany na poziomie subkomórkowym, co powoduje stymulację lokalnych wypukłości i polaryzację komórek. Aby zademonstrować możliwość zastosowania narzędzia LightR do innych typów enzymów, pokrótce przeprowadzimy czytelników przez podobny sukces z zmodyfikowaną kinazą bRaf regulowaną światłem (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) i specyficzną dla miejsca rekombinazą DNA Cre (LightR-Cre). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat złożonych szlaków sygnałowych kształtujących patofizjologię różnych chorób.

Protokół

1. Projektowanie i rozwój LightR ( Rysunek 1)

1. Planowanie strategiczne
   UWAGA: Domena LightR składa się z dwóch tandemowo połączonych domen fotoreceptorów Vivid (VVD) z Neurospora crassa^13,14,15,16. VVD homodimeryzują się w obecności światła, a taka dimeryzacja obejmuje zmianę konformacyjną, która zbliża N-koniec jednego monomeru VVD do C-końca innego monomeru VVD (Rysunek 1A). Połączenie dwóch domen VVD za pomocą elastycznego konsolidatora tworzy domenę przypominającą zacisk, która będzie otwarta w ciemności i zamknięta po podświetleniu niebieskim światłem. Zintegrowanie tego zacisku z domeną katalityczną enzymu umożliwia regulację aktywności za pośrednictwem światła. W ciemności otwarty zacisk zniekształca domenę, dezaktywując enzym; Podświetlenie niebieskim światłem powoduje zamknięcie zacisku, przywracając aktywność enzymu (Rysunek 1B). Koncepcja ta może być zastosowana do enzymów z różnych rodzin, w tym kinaz białkowych i rekombinaz DNA¹⁰ (Rysunek 1C).
   1. Konstrukcja LightR
      1. Aby połączyć dwie cząsteczki VVD, użyj elastycznego łącznika 22-aminokwasowego (GGS)4G(GGS)3 między każdym monomerem.
         UWAGA: Łącznik zapewnia wystarczającą elastyczność i długość, aby dostosować się do asocjacji i dysocjacji monomerów VVD.
      2. Dodaj konsolidatory GPGGSGG i GSGGPG odpowiednio do N- i C-końcowych końców domeny LightR.
         UWAGA: Długość i skład łączników może wymagać dostosowania do określonego białka. Krótsze łączniki GSG i pojedyncze Gly są rutynowo używane, gdy potrzebna jest ściślejsza regulacja. Wielkość pętli wtrąceniowej i jej bliskość do pozostałości katalitycznych również będą miały wpływ na dynamiczny zakres regulacji. Krótsze pętle z większym prawdopodobieństwem zapewnią ściślejszą regulację aktywności katalitycznej, ale mogą skutkować niższą aktywnością po oświetleniu. Sekwencja dziedziny LightR jest przedstawiona w tabeli uzupełniającej 1.
   2. Wstawienie LightR
      UWAGA: Odpowiednie miejsce insercji LightR umożliwi ścisłą regulację funkcji domeny docelowej bez sterylnego blokowania jej interakcji lub powodowania nieodwracalnych zmian strukturalnych, które wpłyną na jej rolę biologiczną. Struktura krystaliczna białka docelowego jest idealnym przewodnikiem w identyfikacji takich elastycznych regionów pętli do insercji LightR. W razie potrzeby wystarcza struktura krystaliczna bliskiego homologu. Poniżej przedstawiono kilka ogólnych kryteriów, które należy wziąć pod uwagę.
      1. Upewnij się, że pętla insercyjna jest strukturalnie sprzężona z krytycznymi elementami katalitycznym enzymu. Upewnij się, że wybrana pętla insercyjna nie jest istniejącym miejscem wiązania białka i że insercja LightR nie zakłóca potencjalnie żadnych interakcji funkcjonalnych z powodu efektów sterycznych.
      2. Jako początkową strategię, zastąp jeden aminokwas w pętli insercyjnej podczas wstawiania LightR. Celuj w środek pętli insercyjnej zawierającej polarny lub mały aminokwas (np. Glu, Arg, Lys, Gly) wystawiony na działanie rozpuszczalnika i niebiorący udziału w interakcjach wewnątrzcząsteczkowych.
         UWAGA: Gdy zamiana jednego aminokwasu nie powoduje powstania funkcjonalnego białka, optymalizacja konstruktu LightR będzie wymagała zastąpienia wielu aminokwasów lub całej pętli insercyjnej. Oceń funkcjonalność wielu miejsc wstawiania dla LightR w zdefiniowanej pętli.
      3. Upewnij się, że enzym docelowy działa niezależnie od regulacji endogennej. Osiągnij to, używając konstytutywnie aktywnej zmutowanej wersji enzymu dla matrycy insercyjnej.
         UWAGA: Enzymy typu dzikiego mogą być również używane do generowania konstruktów LightR, ale może to skutkować systemem bramkowanym AND, który będzie regulowany przez mechanizmy endogenne i światło.
      4. Kontrole pozytywne i ujemne są niezbędne do analizy aktywności enzymu LightR. Stosować konstytutywnie aktywne mutanty białek endogennych jako kontrole dodatnie i katalitycznie nieaktywne zmutowane wersje docelowego enzymu LightR jako kontrole negatywne.
         UWAGA: Podczas wyboru mutacji inaktywujących ważne jest, aby upewnić się, że mutacja jest wystarczająco oddalona od miejsca insercji LightR, aby uniknąć zakłócenia nieodwracalności fałdowania enzymu LightR. Opierając się na powyższych kryteriach, miejsce insercji LightR w kinazie Src jest wybierane w elastycznym regionie pętli, który jest strukturalnie sprzężony z wysoce konserwatywnym motywem GXGXXG w regionie pętli G wiążącym ATP / bogatym w glicynę za pośrednictwem nici beta. Co ważne, jest on umieszczony z dala od kieszeni wiążącej ATP i regionu wiązania substratu^10,17 (Rysunek 1C (i)).
         UWAGA: Ze względu na homologię strukturalną między kinazami, miejsce insercji LightR w bRaf jest wybierane w tej samej pętli strukturalnej, co miejsce insercji w Src (Rysunek 1C (ii)).
         UWAGA: W oparciu o zasady określone w sekcji 1.1.2., miejsce insercji LightR w rekombinazie Cre, niebędącej kinazą, jest wybierane w jednej z elastycznych pętli odległych od rdzenia katalitycznego, tj. w miejscu wiązania DNA. Jednak pętla insercyjna jest nadal strukturalnie sprzężona z krytycznymi resztami katalitycznymi w domenie wiążącej DNA przez α-helisę, aby zapewnić sukces funkcjonalności LightR-Cre (Rysunek 1C (iii)). Wszystkie miejsca insercji z kontrolą dodatnią i ujemną dla różnych enzymów opisanych w obecnym protokole są szczegółowo opisane w tabeli uzupełniającej 2.
   3. Opracowanie FastLightR.
      UWAGA: Wprowadzenie mutacji I85V do obu VVD w LightR umożliwia szybszą dynamikę aktywacji-inaktywacji, przypisywaną szybkiej przemianie mutanta w stan ciemny^18,19. Generacja FastLightR-Src i FastLightR-bRaf z kinetyką szybkiej inaktywacji umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji i inaktywacji. Pozwala na osiągnięcie subkomórkowej regulacji LightR-Src w żywych komórkach.
      UWAGA: Aktywność rekombinazy Cre powoduje nieodwracalną rekombinację DNA; w związku z tym właściwości odwracalności LightR nie mają zastosowania.
      UWAGA: Aby uprościć wykrywanie konstruktu LightR, białko fluorescencyjne lub inny odpowiedni znacznik może być przyłączony do N- lub C- końca białka docelowego. W badaniu tym wykorzystano mCherry-myc dla LightR-Src, Venus dla LightR-bRaf i miRFP670 dla rekombinazy LightR-Cre.
2. Strategia klonowania
   UWAGA: Podejście do klonowania, w przeciwieństwie do tradycyjnych podejść, opiera się na mutagenezie ukierunkowanej na witrynę, która nie opiera się na określonych miejscach ograniczeniach^10,20.
   1. Generacja "Megaprimera"
      1. Optymalizuj kodon genów LightR, aby zapewnić stabilną ekspresję dwóch tandemowych sekwencji DNA VVD pochodzenia grzybowego w komórkach ssaków i aby sekwencje były jak najbardziej różne w celu bezbłędnego klonowania za pomocą PCR. Aby przeprowadzić optymalizację kodonów, wykonaj kroki 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Dopasuj sekwencję aminokwasową VVD i wybrane łączniki obok siebie, aby utworzyć teoretyczną mapę sekwencji LightR.
      3. Wklej sekwencję na dowolnej platformie optymalizacji kodonów online, która wykorzystuje zaawansowany algorytm do optymalizacji kodonów w celu określenia najlepszej opcji sekwencji przy minimalnej złożoności. Upewnij się, że organizm docelowy jest wybrany, ramka odczytu jest zachowana, a sekwencje VVD są wybrane do optymalizacji.
      4. Uzyskaj DNA LightR jako niestandardowy zsyntetyzowany fragment (patrz tabela uzupełniająca 1) lub z wcześniej opublikowanego konstruktutu LightR ¹⁰.
      5. Amplifikuj gen LightR, aby wygenerować "Megaprimer" przy użyciu wcześniej opisanej strategii ²⁰ opisanej w Rysunek 1D. Zsyntetyzować LightR "Megaprimer" metodą PCR zgodnie z zaleceniami producenta dla specyficznej polimerazy DNA i przy użyciu następującej mieszaniny reakcyjnej PCR:
         5x bufor kompatybilny z polimerazą DNA: 10 μL
         100 μM Megaprimer do przodu: 0,5 μL
         100 μM Odwrócony megaprimer: 0,5 μL
         Mieszanina 10 nM dNTP: 2 μL
         Polimeraza DNA (2000 jednostek/ml): 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng Matryca DNA: 1 μL
         Woda klasy PCR: 35 μL
         UWAGA: W tym przypadku stosuje się polimerazę DNA o wysokiej wierności gorącego startu z uniwersalnymi temperaturami wyżarzania startera.
      6. Oddziel powstały megaprimer za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Produkt będzie miał około 1000 nukleotydów długości. Z żelu agarozowego należy wyciąć megaprimer i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta lub stosując analogiczną technikę.
   2. Insercja genu LightR za pomocą mutagenezy ukierunkowanej: Wstaw LightR, zastępując pożądany aminokwas lub długość aminokwasów. Plazmid matrycowy będzie tym, w którym wstawiona jest domena LightR. Przeprowadź reakcję PCR zgodnie z wcześniejszym opisem²⁰ używając następującej mieszaniny.
      5x bufor kompatybilny z polimerazą DNA: 5 μL
      Mieszanina 10 nM dNTP: 1 μL
      Polimeraza DNA (2000 jednostek/ml): 1 μl (0,02 U/μL)
      50 ng Matryca docelowa DNA: 1 μL
      Wyekstrahowany Megaprimer (w przeliczeniu na masę): 10 μL
      DMSO: 2,5 μL
      Woda klasy PCR: 2,5 μL
      UWAGA: Masa megaprimera (ng) = pożądany stosunek molowy wkładki do wektora x masa wektora x stosunek długości wkładki do wektora. Pożądany stosunek molowy wstawiania do wektora wynosi 3/1.
   3. Po zakończeniu reakcji PCR dodać 1 μl enzymu DpnI (2000 jednostek/ml) w celu selektywnego trawienia tylko nadmiaru i metylowanego DNA i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1-1,5 godziny. To znacznie zwiększy wydajność zmodyfikowanej konstrukcji.
   4. Przekształć 1-2 μl reakcji PCR w komórki kompetentne DH5α zgodnie z protokołami producenta.
   5. Bakterie przekształcone na płytce Luria Broth (LB)-agar z odpowiednim antybiotykiem do selekcji. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej (RT; 25-30 °C) przez 72 godziny
      UWAGA: Płytki LB z wyhodowanymi na nich koloniami można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, a protokół może zostać wstrzymany.
   6. PCR na ekranie kolonii
      1. W przypadku badań przesiewowych kolonii opartych na PCR zaprojektuj startery, które wyżarzają się we wstawce LightR i celują w DNA, aby wygenerować około 400-700 pz fragmentów.
      2. Dodaj niewielką ilość kolonii z płytki LB do mieszanki PCR podanej poniżej i przystąp do termocyklingu zgodnie z zaleceniami producenta dla specyficznej polimerazy DNA.
         2x Taq RED Master Mix: 5 μL
         Woda klasy PCR: 5 μL
         100 μM Starter do przodu: 0,5 μL
         100 μM Podkład odwrotny: 0,5 μL
      3. Sprawdź, czy nie ma dodatnich kolonii za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
      4. Wybierz kolonie, które wygenerowały pożądany rozmiar produktu PCR i zaszczep je indywidualnie w 3 ml bulionu LB z antybiotykiem, dopasowując oporność na antybiotyki w szkielecie plazmidowym. Następnie inkubować i wstrząsać w temperaturze 37 °C przez noc.
      5. Ekstrahować plazmidowe DNA z płynnej kultury zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do oczyszczania plazmidu do ekstrakcji plazmidowego DNA i sprawdzić obecność wstawki przez sekwencjonowanie.
         UWAGA: Startery do klonowania podsumowano w Tabeli Uzupełniającej 3.

2. Posiewanie komórek i analiza biochemiczna aktywności enzymu LightR (Rysunek 2A)

1. Do analizy biochemicznej kinaz LightR (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), płytka 1 x 10⁶ komórek LinXE na 3,5 cm szalkę do hodowli komórkowej dla każdej grupy eksperymentalnej. Patrz Tabela uzupełniająca 4.
2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5 % CO₂ przez 16–18 godzin.
3. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję komórek wybranym konstruktem DNA, używając odpowiedniego odczynnika do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta (Tabela uzupełniająca 4).
   UWAGA: Optymalny odczynnik do transfekcji będzie zależał od konstrukcji, wektora i rodzaju użytych komórek. W badaniu wykorzystano 2 μg DNA w naczyniu o średnicy 3,5 cm przy użyciu odczynnika do transfekcji. Należy przeprowadzić badania empiryczne w celu określenia optymalnego odczynnika do transfekcji. Ponieważ transfekowane konstrukty będą wyrażać białka regulowane przez niebieskie światło, wszystkie kolejne kroki dotyczące transfekowanych komórek muszą być wykonywane w czerwonym świetle. Owiń płytki transfekowanymi komórkami folią aluminiową przed umieszczeniem ich w inkubatorze, aby zapobiec przypadkowemu oświetleniu.
4. Po 16-18 godzinach transfekcji wystawiaj komórki na działanie niebieskiego światła¹⁰. W tym celu należy umieścić system lamp panelowych z diodami elektroluminescencyjnymi (LED) o długości fali 465 nm w inkubatorze do hodowli tkankowych. Umieść perforowany panel z pleksi 10 cm nad lampą, aby uzyskać pożądane oświetlenie 3 mW/^cm2 (plik uzupełniający 1). Perforowany panel jest potrzebny do utrzymania nieprzerwanej cyrkulacji powietrza w inkubatorze. Oświetl komórki na żądany okres.
5. Do aktywacji LightR-Src i LightR-bRaf należy użyć oświetlenia ciągłego. Aby uzyskać ciągłe oświetlenie, ręcznie włączaj i wyłączaj panel LED.
6. Aby utrzymać cykl aktywacji/dezaktywacji FastLightR Src, należy używać cykli włączania/wyłączania sterowanych ręcznie lub za pomocą mikrokontrolera.
   UWAGA: Można skorzystać z kilku zestawów narzędzi programowych, które zapewniają zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) do pisania i przesyłania wymaganego kodu. Te zestawy narzędzi obsługują programowanie w języku C/C++ i oferują dostęp do wejścia/wyjścia ogólnego przeznaczenia (GPIO), co jest niezbędne do sterowania pulsacyjnym oświetleniem. Szczegółowy opis protokołów i kodu wykorzystywanych do tych celów znajduje się w pliku uzupełniającym 1.
7. Pod koniec odpowiednich punktów czasowych eksperymentu (Tabela uzupełniająca 4) należy pobrać komórki pod bezpiecznymi czerwonymi światłami. Odessać pożywkę i umyć komórki zimnym PBS.
8. Aby wyizolować białko, należy lizować komórki za pomocą 500 μl 2x buforu próbki Laemmli uzupełnionego 5% v/v 2-merkaptoetanolem. Inkubować lizat w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Analiza lizatów komórkowych za pomocą elektroforezy w żelu białkowym i Western blotting²¹.
   UWAGA: Skład 2x buforu Laemmli jest następujący: Na 500 ml: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8.
9. Oceń aktywność LightR-Src, oceniając poziom fosforylacji endogennego p130cas na Tyr249 i paxillin na TyrY118^22,23(Rysunek 2). Oceń aktywność LightR-bRaf, oceniając poziom fosforylacji MEK1 na Ser217/221 i ERK1/2 na TyrY202/204^24,25.

3. Analiza funkcjonalna aktywności LightR-Cre

1. Do analizy funkcjonalnej aktywności LightR-Cre należy podać płytkę 1 x 10⁶ komórek LinXE na 3,5 cm naczynie do hodowli komórkowych. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 16-18 godzin.
2. Transfekcja komórek zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 2, Rysunek 2A i Tabela uzupełniająca 5. Współtransfekcja łącznie 2 μg DNA, w stosunku 1:9 LightR-Cre-iRFP670 i plazmidu reporterowego Floxed-STOP-mCherry².
3. Po 16-18 godzinach od transfekcji oświetlić komórki. Wydajna aktywacja LightR-Cre wymaga długotrwałego oświetlenia. Dlatego, aby uniknąć fototoksyczności, należy stosować oświetlenie pulsacyjne przez 8 godzin z cyklami 2 s włączenia i 20 s wyłączenia z wykorzystaniem systemu lamp panelowych LED o długości fali 465 nm sterowanych przez mikrokontroler, jak opisano w sekcji 2 i pliku uzupełniającym 1.
4. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej z obiektywem powietrznym o powiększeniu 20x. Do wizualizacji LightR-Cre-iRFP670 należy użyć zestawu filtrów Cy5, a do wizualizacji mCherry z wyrażenia Floxed-mCherry należy użyć zestawu filtrów RFP.
   UWAGA: Do obrazowania stosuje się mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kostki świetlne Cy5/RFP.

4. Przygotowanie próbek do obrazowania żywych komórek

1. Płytka 2 x 10⁵ komórek HeLa na 35 mm naczynie do hodowli tkankowej w pożywce do hodowli komórkowych i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
2. Gdy komórki już się przyłączą, a konfluencja wynosi około 60%-70%, należy dokonać transfekcji komórek HeLa za pomocą jednej z następujących mieszanek: (i) 0,85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg Stargazin-iRFP, lub (ii) 0,75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg mCherry-ERK2
   UWAGA: W eksperymentach FastLightR-Src Stargazin-iRFP służy do oznaczania błony plazmatycznej do analizy rozprzestrzeniania się komórek. Jeśli pożądane jest wyższe wyrażenie FastLightR-Src, można pominąć stargazin-iRFP, a zamiast niego można użyć 1 μg FastLightR-Src. W takich przypadkach do wizualizacji komórek należy użyć barwnika błonowego. Barwniki błony plazmatycznej są rutynowo stosowane do oznaczania błon komórkowych.
3. Przykryj naczynie folią aluminiową, aby uniknąć przypadkowego oświetlenia komórek i inkubuj przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
4. Wykonaj wszystkie poniższe kroki przy czerwonym podświetleniu światła, aby uniknąć przypadkowej aktywacji konstrukcji. Ekspozycja na białe światło wywoła aktywację kinaz LightR i może wpłynąć na późniejsze wyniki.
5. Tego samego dnia pokryć przez noc 3 okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 25 mm, grubości 0,17 mm) 5 mg/l fibronektyny w PBS w temperaturze 37 °C.
6. Przepłukać szkiełka nakrywkowe PBS 16-18 h po transfekcji i umieścić na każdym szkiełku nakrywkowym ~1 x 10⁵ transfekowanych komórek HeLa. Inkubować w pożywkach do hodowli komórkowych przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂,
   UWAGA: Niska gęstość wysiewu jest konieczna, aby zapewnić, że komórki w polu widzenia nie stykają się ze sobą.
7. Przygotuj nośnik obrazu, dodając FBS do podłoża obrazowego L-15 firmy Levobitz do końcowego stężenia 5%. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm i ogrzać go do 37 °C.
8. Podgrzej olej mineralny do temperatury 37 °C.
9. Umyć szkiełka nakrywkowe zawierające komórki dwukrotnie PBS. Jeśli używasz barwnika membranowego, przed umyciem szkiełek nakrywkowych wybarwij komórki zgodnie z instrukcjami producenta.
10. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania żywych komórek. Dodać 1 ml pożywki do obrazowania L-15 do komory.
11. Dodaj 1 ml oleju mineralnego na wierzch podłoża, aby zapobiec parowaniu podczas procesu obrazowania.
12. Przechowywać komorę przed światłem w temperaturze 37 °C do czasu przygotowania do obrazowania.

5. Globalna aktywacja i obrazowanie FastLightR-Src (Rysunek 3)

1. Przymocuj niebieską lampę pierścieniową LED do mikroskopu mikroskopowego do kondensatora mikroskopu, umieszczając ją około 1.5 cm nad uchwytem próbki. Podłącz przekaźnik sterujący AC/DC lampy pierścieniowej do komputera mikroskopu.
   UWAGA: W eksperymentach w tym badaniu oświetlenie było kontrolowane za pomocą interfejsu logiki tranzystor-tranzystor (TTL) za pośrednictwem oprogramowania do obrazowania. Oświetlenie epifluorescencyjne może być również wykorzystywane do globalnej aktywacji konstrukcji LightR, jeśli zewnętrzne źródło oświetlenia nie jest dostępne. Długości fal wzbudzenia GFP, takie jak filtr wzbudzenia 490/20 nm, są skuteczne w aktywacji LightR.
2. Umieść komorę na stoliku mikroskopowym podgrzanym do 37 °C i wybierz komórki wykazujące ekspresję FastLightR-Src-mCherry i Stargazin-iRFP (Rysunek 3B) lub FastLightR-bRaf-Venus i mCherry ERK-2 (Rysunek 5B).
3. Do badania eksperymentów z globalnym oświetleniem i obrazowaniem należy używać kompatybilnych z mikroskopem, wysokowydajnych obiektywów (40x) z korekcją apochromatyczną, korekcją płaskiego pola i dużą aperturą numeryczną.
   1. Do globalnych badań kinazy Src opartych na oświetleniu należy użyć filtrów wzbudzenia 561/10 nm i emisji 595/40 nm do wizualizacji FastLightR-Src-mCherry oraz filtra wzbudzenia 640/20 nm i emisji 655LP do wizualizacji stargazin-iRFP.
   2. Do globalnych badań kinazy bRaf opartych na oświetleniu należy użyć filtrów wzbudzenia 514/10 nm i emisji 540/21 nm do wizualizacji FastLightR-bRaf-Venus oraz filtrów wzbudzenia 561/10 nm i emisji 595/40 nm do wizualizacji mCherry-ERK-2.
   3. Stosować wielopasmowe zwierciadło polichroiczne we wszystkich kanałach obrazowania fluorescencyjnego.
4. W zależności od warunków eksperymentalnych należy wziąć pod uwagę następujące zalecenia.
   1. Obrazuj komórki przez co najmniej 10 minut przed oświetleniem, aby ustalić podstawową aktywność komórek.
      UWAGA: Ten punkt odniesienia jest wymagany do określenia, czy aktywacja kinazy FastLightR przez oświetlenie indukuje jakiekolwiek zmiany w zachowaniu komórki lub lokalizacji białka. Można również wykonywać dłuższe okresy obrazowania podstawowego, aby zapewnić większą istotność statystyczną.
   2. Ze względu na szybką kinetykę inaktywacji FastLightRs, włączenie wielu komórek do obrazowania może powodować dezaktywację Src/bRaf między pozycjami stopnia i może osłabić jego odpowiedź. Aby uniknąć takiego błędu, należy zobrazować 4 komórki/min podczas analizy aktywności kinazy FastLightR w opisanym protokole i obrazować każdą wybraną komórkę co minutę przez łącznie 110 minut (Plik uzupełniający 2).
   3. Użyj oświetlenia pulsacyjnego zamiast oświetlenia ciągłego, aby zmniejszyć potencjalne efekty fototoksyczne światła niebieskiego. Oświetlenie przez 12 s dla każdej z 4 komórek/min jest skuteczne (Plik uzupełniający 2, Rysunek 3A).
      UWAGA: Cykle oświetlenia powinny być empirycznie określone dla różnych konstrukcji i typów źródeł oświetlenia.
   4. Wyłącz oświetlenie podczas obrazowania komórek, aby uniknąć krwawienia w kanałach fluorescencyjnych.
      UWAGA: Obrazowanie zbyt wielu komórek jednocześnie skróci całkowity czas oświetlenia dostępny dla próbki, prowadząc do osłabionej odpowiedzi z powodu niewystarczającej aktywacji.
5. Po zobrazowaniu zapisz filmy jako plik . Format pliku stosu TIF dla analizy.
   UWAGA: Ze względu na mniej równomierne oświetlenie z epifluorescencją GFP w porównaniu ze światłem pierścieniowym, eksperymenty z użyciem epifluorescencji GFP będą wymagały częstszego oświetlenia. Powoduje to, że w jednym eksperymencie obrazowana jest mniejsza liczba komórek.

6. Subkomórkowa aktywacja i obrazowanie FastLightR-Src (Rysunek 4)

1. Umieścić komorę na stoliku mikroskopowym podgrzanym do temperatury 37 °C i wybrać pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję zarówno FastLightR-Src-mCherry, jak i Stargazin-iRFP.
2. Wybierz określone regiony (ROI) w komórce, które chcesz oświetlić. W tym badaniu wybierany jest niewielki obszar na obrzeżach wybranej komórki.
   UWAGA: Do oświetlenia lokalnego używany jest laser 445 nm zogniskowany przez moduł TIRF w trybie FRAP lub urządzenie z mikrolustrem sterowane przez interfejs TTL za pomocą oprogramowania do obrazowania. Każdy wzorzysty system oświetlenia sprawdzi się w tych eksperymentach. Jeśli używany jest system oparty na skanowaniu, należy określić intensywność i jednorodność lasera, aby uzyskać wystarczającą aktywację bez uszkodzenia ogniwa.
3. Obrazuj wybraną komórkę co minutę przez 20 minut w stanie podstawowym przed oświetleniem, 50 minut podczas oświetlenia lokalnego, a następnie 20 minut po aktywacji, łącznie przez 90 minut (plik uzupełniający 2).
4. Na aktywację i dezaktywację należy zapewnić odpowiednią ilość czasu odpowiednią dla białka docelowego, aby umożliwić całkowitą dezaktywację białka LightR. W przypadku FastLightR-Src należy odczekać co najmniej 10 minut dezaktywacji w celu usunięcia pozostałej aktywności i pozwolić na 20-minutową dezaktywację w pokazanej konfiguracji eksperymentalnej dla lokalnego oświetlenia.
5. Po zobrazowaniu zapisz filmy jako . Format pliku stosu TIF do analizy.

7. Analiza rozprzestrzeniania się komórek

1. Przygotowanie obrazów do przetwarzania i analizy danych. Upewnij się, że obrazy znajdują się w formacie . Format stosu TIF. Zapisz je bezpośrednio w oprogramowaniu do obrazowania lub przekonwertuj je za pomocą programu typu open source.
2. Pobierz pakiet skryptów CellGeo z dodatkowych spakowanych plików danych²⁶.
   UWAGA: Pakiet CellGeo zawiera kilka różnych skryptów. Wybierz żądany pakiet z listy w oparciu o typ analizy, zgodnie z opisem w sekcjach 7-9 protokołu.
3. Otwórz i uruchom skrypt zatytułowany MovThresh, aby utworzyć maskę komórki.
   1. Wybierz opcję File > Import (.tif) i wybierz obrazy komórek Stargazin-iRFP.
   2. Skanuj ramki za pomocą paska przewijania w lewym dolnym rogu. Jeśli sugerowany próg jest odpowiedni, przejdź do kroku 7.4.
   3. Jeśli sugerowany próg nie jest wyrównany z zachowaniem komórki, wybierz krzywe wygładzone lub niestandardowe poniżej opcji Wybór krzywej. Utwórz krzywą niestandardową, przewijając ramki, a następnie dostosowując próg po prawej stronie okna.
   4. Kliknij przycisk Zmień próg.
   5. Kliknij pozycję Plik > Zapisz jako maski, zmień nazwę pliku i zapisz go za pomocą opcji Zapisz jako.
4. Otwórz nowo utworzony plik stosu w programie do analizy obrazów typu open source.
5. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj > próg > zastosować.
6. Wybierz Analizuj > Analizuj cząstki > Sprawdź wyniki wyświetlania -> OK.
7. Oblicz zmianę obszaru dla każdej komórki, dzieląc obszar w dowolnym momencie przez średni obszar tej samej komórki przed naświetlaniem światłem niebieskim.
8. Wykreśl zmianę obszaru jako wykres liniowy lub słupkowy.
9. Oblicz średnią wartość i 90% przedziały ufności dla każdego punktu czasowego wszystkich komórek traktowanych w tych samych warunkach.

8. Analiza dynamiki krawędzi komórki

1. Przygotuj pliki stosu, wykonując czynności opisane w sekcji 7 protokołu.
2. Otwórz i uruchom skrypt zatytułowany ProActive.
   1. Wybierz opcję File > Import > Masks (.tif) i wybierz maskę utworzoną za pomocą skryptu MovThresh.
   2. Wybierz aktywność będącą przedmiotem zainteresowania analizą w prawym dolnym rogu (Wysuwana, Wycofana lub Ogółem).
   3. Wybierz typ normalizacji. Zazwyczaj do tych analiz stosuje się normalizację obszaru.
   4. Wybierz początkowy układ odniesienia za pomocą suwaka po lewej stronie. Suwak opóźnienia po prawej stronie określi opóźnienie między dwoma punktami czasowymi używanymi do pomiaru obszaru zdobytego i utraconego przez komórkę.
   5. Jeśli wybrana klatka i liczba opóźnień są addytywnie większe niż liczba klatek w filmie, obraz podglądu nie zostanie wyświetlony. Zresetuj te wartości tak, aby były mniejsze niż łączna liczba klatek.
3. Zmodyfikuj progi dla wysunięcia lub wycofania, zaznaczając pole wyboru Gładka krzywa w sekcji Wyniki. Spowoduje to uśrednienie progów w określonym oknie, co może rozwiązać problemy, w których drobne wahania są wykrywane jako aktywność.
4. Wybierz opcję Uruchom zakres, aby obliczyć aktywność w czasie określonym przez suwaki klatki i opóźnienia.
5. Zapisz dane liczbowe, wybierając opcję File > Save As > Results (.mat) i użyj ich do określenia średniej aktywności wystającej lub retrakcyjnej.
6. Określ 90% przedziały ufności dla każdego punktu czasowego.
   UWAGA: Spowoduje to zapisanie tablicy kilku różnych wartości. Plik tekstowy "Jak korzystać z ProActive" dołączony do skryptu zawiera szczegółowy opis tego, co reprezentują poszczególne wartości i w jaki sposób zostały one określone²⁶.
7. Zapisz wizualną reprezentację działania, wybierając pozycję Plik > Zapisz jako obrazy > (.tif).

9. Analiza przesunięcia środka ciężkości

1. Do analizy przesunięcia środka ciężkości należy użyć dowolnego oprogramowania, które może określić współrzędne środka ciężkości.
2. W oprogramowaniu do analizy otwórz zamaskowany stos obrazów interesującej Cię komórki zgodnie z opisem w sekcji 7 protokołu.
3. Wybierz opcję Zmierz > Zintegrowana analiza morfometryczna, a następnie kliknij przycisk Preferencje > Rysuj znacznik środka ciężkości > Sprawdź, a następnie wybierz opcję Zmierz.
   1. Zapisz współrzędne środka ciężkości przed ruchem (A).
   2. Zapisz współrzędne środka ciężkości na końcu eksperymentu (B).
   3. Zapisz współrzędne środka wzoru oświetlenia (C).
4. Teraz, gdy trzy punkty zostały zebrane, określ kąt BAC⁸. θ₁ odpowiada kątowi ABC i θ₂ odpowiadają kątowi CBA (Rysunek 4Cii). Zrób to, używając następującego równania:
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   UWAGA: Kalkulator może być używany do określania kątów i odległości bezpośrednio na podstawie współrzędnych w celu ułatwienia użytkowania.
5. Określ przemieszczenie środka ciężkości, mnożąc odległość, jaką przebył środek ciężkości komórki w pikselach, przez współczynnik konwersji, gdzie 1 piksel jest równy 0,4 μm. Konkretna konwersja pikseli na odległość będzie zależeć od powiększenia i konfiguracji kamery w systemie.
6. Po określeniu kąta i odległości przesunięcia środka ciężkości otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów, które jest w stanie tworzyć obrazy współrzędnych biegunowych.
7. Wstaw kąt przesunięcia środka ciężkości jako miarę θ i przebytą odległość jako promień. Wykorzystaj ANOVA do testowania 95% przedziałów ufności.
8. Wykreśl wyniki i zapisz obraz.

Wyniki

LightR-Src jest projektowany i generowany zgodnie ze strategią opisaną w Rysunek 1A,B. Analiza biochemiczna LightR-Src uzyskuje dostęp do fosforylacji znanych endogennych substratów Src, p130Cas (Y249)²² i paxillin (Y118)²³ w odpowiedzi na niebieskie światło po 60 minutach ciągłego oświetlenia (Rysunek 2B). Warto zauważyć, że nie obserwuje się aktywacji kinazy Src w tle, gdy LightR-Src ulega ekspresji tylko w ciemności przez 16-18 godzin po transfekcji. Co więcej, katalitycznie nieaktywny mutant LightR-Src z mutacją D388R nie indukuje fosforylacji substratu Src, co pokazuje, że fosforylacja jest przeprowadzana przez aktywny LightR-Src i nie jest spowodowana niespecyficznym efektem oświetlenia światłem niebieskim (Figura 2B). Potwierdzając doniesienia o aktywności oscylacyjnej kinazy Src²⁷ w żywych komórkach, zbadaliśmy, czy LightR-Src można dostroić tak, aby wykazywał cykliczną aktywację. Oryginalny LightR-Src wykazywał powolną kinetykę dezaktywacji (Rysunek 2C), co skłoniło do wygenerowania nowego wariantu, Fast-LightR-Src, zawierającego mutację I85V w obu VVD. Rysunek 2D ilustruje, że Fast-LightR-Src wykazuje znacznie szybszą kinetykę dezaktywacji i całkowicie dezaktywuje się w ciągu 10 minut od wyłączenia światła, w porównaniu do ponad godziny w przypadku LightR-Src. Korzystając z FastLightR-Src, udało nam się również osiągnąć powtarzające się cykle aktywacji/dezaktywacji (Rysunek 2E). Wyniki te łącznie pokazują zdolność narzędzia LightR do osiągnięcia specyficznej i ściśle kontrolowanej regulacji aktywności Src w żywych komórkach.

Aplikacja FastLightR-Src pozwala również na ocenę wpływu przejściowej aktywacji Src na morfodynamikę komórki. Aktywacja FastLightR-Src w komórkach HeLa indukuje rozprzestrzenianie się komórek, a proces ten zatrzymuje się, gdy tylko FastLightR-Src zostanie dezaktywowany. Po aktywacji zaobserwowaliśmy translokację FastLightR-Src z przedziału okołojądrowego do zrostów ogniskowych i błony plazmatycznej, zachowanie wykazywane przez kinazę Src typu dzikiego^11,12. Komórki oświetlające eksprymujące katalitycznie nieaktywnego mutanta D388RLightR-Src nie wykazują takich efektów rozprzestrzeniania się (Rysunek 3B, C). To dodatkowo potwierdza, że FastLightR-Src działa podobnie do swojego dzikiego odpowiednika. Miejscowe oświetlenie obszaru komórki powoduje miejscową aktywację FastLightR-Src, na którą wskazuje lokalna akumulacja LightR Src w adhezji ogniskowej i towarzyszy jej tworzenie się lokalnych wypukłości błony (Rysunek 4B (i), (ii)) i przesunięcie środka ciężkości komórki ( Rysunek 4C (i), (ii)) powodujące ruch komórki w kierunku światła. Po ustaleniu zastosowania narzędzia LightR do regulacji kinazy Src, prezentujemy szerokie zastosowanie LightR rozszerzone o regulację kinazy bRaf i rekombinazy DNA Cre. Analiza LightR-bRaf wykazuje indukowaną światłem fosforylację endogennego substratu bRaf, MEK1 i dalszą fosforylację kinaz ERK1/2 ^24,25 na poziomach porównywalnych z konstytutywnie aktywnym mutantem bRaf (V600E) (Rysunek 5A). I odwrotnie, katalitycznie nieaktywny D575RLightR-bRaf nie wykazuje fosforylacji MEK1 i ERK1/2, porównywalnej z nieoświetlonymi próbkami LightR-bRaf, potwierdzając w ten sposób specyficzność regulacji LightR-bRaf. Obrazowanie żywych komórek wykazało, że powtarzające się cykle aktywacji/inaktywacji FastLightR-bRaf indukują powtarzającą się translokację ERK2 do i z jądra, co potwierdza znane wyniki aktywacji bRaf ²⁸ (Rysunek 5B). Aktywacja LightR-Cre skutkuje udaną rekombinacją reporterowego genu mCherry, wykazując zastosowanie LightR do różnych klas enzymów (Figura 5C).

Rysunek 1: Strategia rozwoju podejścia LightR. (A) Struktury krystaliczne dwóch monomerów Vivid w stanie ciemnym (PDB: 2PD7) i dimera w stanie świeconym (PDB: 3RH8). (B) Kreskówkowa reprezentacja projektu LightR. Dwa tandemowo połączone fotoreceptory VVD umieszczone w domenie katalitycznej zakłócają aktywność katalityczną białka w ciemności. Dimeryzacja VVD w odpowiedzi na światło niebieskie przywraca aktywność białka. (C) Struktury krystaliczne domen katalitycznych (i) Src (PDB 1Y57) i (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Struktura rekombinazy Cre (PDB 1MA7). Żółte strzałki wskazują miejsce insercji LightR i wskazują podstawiony aminokwas. (D) Schemat schematyczny strategii klonowania dla insercji domeny LightR do docelowej sekwencji enzymu¹⁹. W Kroku 1 specjalnie zaprojektowane startery są używane do syntezy PCR fragmentu LightR otoczonego miejscami wyżarzania w genie docelowym przed i po miejscu insercji. W kroku 2 wykazano, że wytworzony w ten sposób fragment LightR jest używany jako "megastarter" do wprowadzenia LightR do docelowego genu enzymatycznego przez szybką zmianę mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Panele A-C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Charakterystyka biochemiczna zmodyfikowanych białek LightR. (A) Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego protokołu do biochemicznej charakterystyki LightR Src. (B) Komórki LinXE przejściowo wyrażające konstrukt LightR Src z mCherry i znacznikiem myc na końcu C były stale oświetlane niebieskim światłem przez 60 minut, przy użyciu konfiguracji LED 465 nm. Lizaty komórkowe badano pod kątem fosforylacji substratów Src, paxilliny i p130Cas. Wyniki Western Blot wskazują na fosforylację endogennej paxilliny i p130Cas w odpowiedzi na aktywację LightR-Src w żywych komórkach. (C,D) Komórki LinXE przejściowo eksprymujące wskazane konstrukty LightR-Src opatrzone tandemowym znacznikiem mCherry-myc na C-końcu były stale wystawione na działanie niebieskiego światła przez określony czas (0 min i 30 min), a następnie umieszczone w ciemności na wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe badano pod kątem fosforylacji substratów Src, pokazując porównanie kinetyki aktywacji i dezaktywacji między (C) LightR-Src i (D) FastLightR-Src. (E) Komórki LinXE przejściowo eksprymujące wskazane konstrukty LightR-Src z tandemowym znacznikiem mCherry-myc na końcu C były stale wystawione na działanie niebieskiego światła przez 20 minut, a następnie wielokrotną inkubację w ciemności przez 10 minut i w świetle przez 20 minut. Zebrano lizaty komórkowe i zbadano je pod kątem fosforylacji substratów Src, wykazując skuteczność cyklicznego przepływu kinazy Src między stanami aktywacji i inaktywacji. Wszystkie eksperymenty powtórzono co najmniej trzy razy z podobnymi wynikami. Liczby wyświetlane obok każdego panelu Western blot B-E reprezentują masę cząsteczkową białek, mierzoną w kilodaltonach (kDa). Panele B-E zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Globalna i czasowa kontrola oświetlenia oraz wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Rysunkowa reprezentacja eksperymentalnego schematu globalnego i czasowego cyklicznego oświetlenia oraz późniejsze analizy danych. (B,C) Regulacja morfologii komórek i lokalizacja FastLightR-Src za pomocą światła niebieskiego jest przedstawiona na reprezentatywnych obrazach komórek HeLa uzyskanych z serii poklatkowej przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki te przejściowo wykazywały koekspresję FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 komórek) lub katalitycznie nieaktywną D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 komórek) wraz ze Stargazin-iRFP670 (marker błony komórkowej). Obrazowanie żywych komórek przeprowadzano co minutę, podczas gdy komórki były globalnie oświetlone niebieskim światłem (niebieskie kontury). (B) Żółte strzałki zaznaczają lokalizację FastLightR-Src w strukturach przypominających zrosty ogniskowe. Obrazy uzyskano z serii poklatkowej komórek HeLa przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. (C) Kwantyfikacja zmian w obszarze komórek wywołanych aktywacją FastLightR-Src w porównaniu z D388RLightR-Src jest pokazana na każdym panelu. Okno podświetlenia jest oznaczone jako niebieskie prostokąty. Wykresy przedstawiają średnie ± 90% przedziały ufności. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Lokalna kontrola oświetlenia subkomórkowego i wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Rysunkowa reprezentacja eksperymentalnego schematu lokalnej kontroli oświetlenia subkomórkowego. (B) (i) Sekwencja poklatkowa ilustrująca komórkę HeLa wyrażającą FastLightR-Src-mCherry, lokalnie oświetloną niebieskim światłem (przedstawionym niebieskim kółkiem). Obrazy były rejestrowane co minutę za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (obiektyw 60x). Obrazy są prezentowane jako obrazy o odwróconym kontraście uzyskane w określonych odstępach czasu. (ii) Obrazy rzutujące komórki pokazujące bulwy uformowane w określonych przedziałach czasowych. Progowanie i maskowanie morfologii komórek na osi czasu eksperymentu stanowi platformę do analizy rozprzestrzeniania się komórek i dynamiki krawędzi komórek. Określony oświetlony obszar komórki jest otoczony niebieskim kółkiem. (C) (i) Wykres biegunowy dla komórek przedstawiający odległość migracji środka ciężkości (d) i kąt odchylenia (θ) względem lokalnego oświetlenia światłem niebieskim. Czarne kropki reprezentują pojedyncze komórki HeLa wykazujące ekspresję katalitycznie nieaktywną D388RLightR-Src (N = 6 komórek) lub FastLightR-Src (N = 10 komórek). (ii) Schematyczne przedstawienie pokazujące odległość przesunięcia środka ciężkości (d) przebytą przez środek ciężkości komórki od inicjacji (1) do zakończenia (2) lokalnej stymulacji światłem niebieskim. Kąt odchylenia (θ) wskazuje zakres rozbieżności ruchu środka ciężkości komórki od lokalizacji światła niebieskiego. Jasnoszare cieniowanie wskazuje na obszar wystający przez komórkę w odpowiedzi na lokalną stymulację FastLightR-Src. Określony oświetlony obszar komórki jest oznaczony ciągłym niebieskim kółkiem. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane z Shaaya et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Szerokie zastosowanie podejścia LightR. (A) Regulacja LightR-bRaf. Komórki LinXE przejściowo eksprymujące LightR-bRaf-Venus, katalitycznie nieaktywne D575R LightR-bRaf Venus lub konstytutywnie aktywne bRaf (V600E)-Venus były wystawione na ciągłe działanie niebieskiego światła przez określony czas. Lizaty komórkowe badano pod kątem fosforylacji wskazanych białek. (B) Reprezentatywne obrazy uzyskane z serii poklatkowej obrazowania żywych komórek przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej ilustrują regulację globalnej odpowiedzi na światło niebieskie w komórkach LinXE przejściowo koeksprymujących FastLightR-bRaf-Venus i mCherry-ERK2. Ogniwa te były globalnie oświetlone niebieskim światłem (50 ms impulsów co sekundę, 50 impulsów na minutę) przez określony czas zaznaczony na niebiesko. Obrazowanie żywych komórek mCherry-ERK2 prowadzono co minutę. Żółte strzałki wskazują etapy lokalizacji jądrowej ERK2 indukowanej aktywacją światłem niebieskim przez zmodyfikowany bRaf. (C) Komórki LinXE były przejściowo współtransfekowane za pomocą reportera Floxed-stop-mCherry i LightR-Cre-iRFP670. Komórki poddano działaniu ciemnych warunków lub pulsacyjnego niebieskiego światła (2 s włączone, 10 s wyłączone) przez okres do 8 godzin. Obrazy dla wszystkich punktów czasowych każdego kanału uzyskano za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 10x) przy identycznych ustawieniach i dostosowano do stałych poziomów jasności i kontrastu, aby ułatwić porównanie poziomów ekspresji białek w próbkach. Eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy, uzyskując podobne wyniki. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany z Shaaya et al.¹⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Opis miejsc insercji LightR i lista kontrolna dla projektu białka LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Podstawy do klonowania LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Warunki transfekcji do analizy biochemicznej aktywności białka LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Warunki transfekcji dla analizy obrazowej aktywności białka LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Oświetlenie impulsowe przy użyciu zintegrowanego środowiska programistycznego (IDE). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Ustawienia oświetlenia mikroskopu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nasze badanie przedstawia optogenetyczne podejście do badania różnych szlaków sygnałowych i wykazuje jego szerokie zastosowanie w rozwiązywaniu różnych problemów biologicznych. System narzędzi LightR zapewnia kilka istotnych korzyści: (1) allosteryczna regulacja aktywności białek, (2) ścisła kontrola czasowa aktywności, którą można dostroić w celu uzyskania różnej kinetyki aktywacji i inaktywacji, (3) przestrzenna rozdzielczość aktywności na poziomie subkomórkowym, (4) specyficzność modulacji sygnalizacji i aktywności biologicznej oraz (5) szeroki zakres zastosowania do różnych białek docelowych. Warto zauważyć, że LightR w unikalny sposób integruje wszystkie te korzyści w jednym narzędziu, zapewniając w ten sposób znaczący krok naprzód.

Konstrukcja LightR jako przełącznika allosterycznego ma kilka zalet. Zdolność LightR do kontrolowania aktywności białek po umieszczeniu w małej, elastycznej pętli zapewnia znaczną wszechstronność w zastosowaniu do różnych białek o różnych strukturach i funkcjach. Będąc przełącznikiem allosterycznym, LightR reguluje tylko domenę docelową białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie wpływa na inne domeny białka. W związku z tym metoda ta pozwala na specyficzną regulację aktywności bez uszczerbku dla podstawowych funkcji białka, takich jak interakcje z jego partnerami wiążącymi lub natywna lokalizacja w komórkach. Dwuskładnikowe systemy optogenetyczne zostały z powodzeniem zastosowane do regulacji lokalizacji, interakcji lub innych podstawowych funkcji białek za pomocą kontroli homo- lub heterodimeryzacji za pośrednictwem światła 29,30,31,32,33,34,35. Jednak systemy te często wymagają zoptymalizowanej równomolowej ekspresji dwóch białek, co sprawia, że ich zastosowanie jest trudniejsze. Regulacja allosteryczna za pomocą systemu LightR jest osiągana w obrębie pojedynczego białka, a tym samym zapewnia znacznie bardziej wszechstronne podejście do badania sygnalizacji komórkowej.

Szeroki zakres zastosowań przełącznika LightR do różnych klas białek jest częściowo osiągnięty dzięki optymalizacji różnych modułów w domenie LightR. Łączniki łączące LightR z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania oraz łącznik łączący dwie domeny VVD w obrębie LightR (linker między VVD) mogą wpływać na skuteczność regulacji. Wybór elastycznego łącznika między VVD (GGS)4G(GGS)3 zapewnia wystarczającą elastyczność i długość, aby zapewnić asocjację i dysocjację monomerów VVD w domenie LightR. Ten łącznik zapewnił do tej pory skuteczną regulację wszystkich docelowych białek. Jednak w przypadkach, gdy domena LightR nie dezaktywuje wystarczająco białka w ciemności, można wprowadzić sztywniejszy łącznik, który utrzyma domeny VVD dalej od siebie, aby zwiększyć otwarcie zacisku LightR, utrzymując w ten sposób enzym nieaktywny. Łącznik powinien nadal zachowywać wystarczającą elastyczność, aby umożliwić dimeryzację VVD i aktywację docelowego białka. Aby połączyć LightR z interesującym nas białkiem, używamy krótkich elastycznych łączników, GPGGSGG i GSGGPG, dodanych do N- i C-końców domeny LightR. Zapewniają one wystarczającą elastyczność połączenia, zapobiegając w ten sposób nieodwracalnemu zakłóceniu docelowego białka. Są one jednak na tyle krótkie, że umożliwiają zniekształcenie docelowego białka w ciemności, jednocześnie ułatwiając przywrócenie funkcji białka w świetle. Te łączniki wspierają regulację przez LightR dla wielu zastosowań białkowych. Jednak w niektórych przypadkach, gdy te łączniki mogą nie zapewniać wystarczającej inaktywacji białka w ciemności, skrócenie łączników może być korzystne. Takie skrócenie łącznika może zmniejszyć elastyczność i zwiększyć zniekształcenia spowodowane przez otwarty zacisk LightR w ciemności, minimalizując w ten sposób wszelkie nieszczelności. Niemniej jednak ta regulacja może zagrozić maksymalnej aktywności enzymu ze względu na potencjalne zniekształcenia strukturalne w stanie zapalonym. Alternatywnie, zastąpienie wielu aminokwasów w pętli insercyjnej może zapewnić podobne korzyści w postaci zrównoważonej elastyczności w przypadkach, gdy niestabilność konformacyjna nie jest istotnym problemem.

Wiele krytycznych procesów sygnalizacyjnych jest aktywowanych przejściowo lub regulowanych w sposób oscylacyjny 36,37,38,39,40,41,42,43. Przestrajalność narzędzia LightR pozwala nam naśladować złożone wzorce sygnalizacji, a tym samym zapewnia potężne podejście do badania czasowo kontrolowanych procesów biologicznych. Osiągamy to poprzez modulację kinetyki wyłączenia LightR poprzez wprowadzenie mutacji I85V do obu domen VVD. Mutacja ta skraca okres półtrwania dimeru VVD w stanie ciemnym z 18 000 s do 780 s¹⁹, ułatwiając w ten sposób szybszą inaktywację enzymu FastLightR.

Kinetyka szybkiej inaktywacji umożliwia również regulację aktywności białek w rozdzielczości subkomórkowej. Enzymy LightR, o powolnej kinetyce, mogą utrudniać obserwację efektów aktywacji subkomórkowej z powodu wewnątrzkomórkowej dyfuzji aktywowanego konstruktu. Dzięki kinetyce fast-off każdy enzym FastLightR, który dyfunduje poza strefę lokalnego oświetlenia, zostanie szybko dezaktywowany. Poprzez selektywną aktywację określonych regionów subkomórkowych naukowcy mogą uzyskać wgląd w lokalne funkcje białek, aby lepiej zrozumieć ich udział w złożonych szlakach komórkowych i sieciach sygnałowych.

Chociaż FastLightR są nieocenione w ograniczonej przestrzennie i czasowo optycznej kontroli aktywności białek w komórkach, nadal istnieją zastosowania, w których pożądana może być kinetyka spowolnienia. LightR z kinetyką spowolnienia może zostać zastosowany w badaniach, w których wymagana jest trwała i zwiększona aktywność indukowana światłem niebieskim. Zastosowania te będą wymagały jedynie rzadkich impulsów świetlnych, aby utrzymać ciągłą aktywność optogenetyczną, minimalizując w ten sposób również problemy, takie jak fototoksyczność. Dla różnych scenariuszy szeroki zakres modyfikacji kinetycznych^10,18 może być wdrażany samodzielnie lub w połączeniu ze sobą, aby zaoferować obiecujące rozwiązanie do dostrajania wydajności LightR w celu optymalizacji jego zastosowania dla konkretnego eksperymentu.

Możliwość zastosowania enzymów LightR zależy od ich zdolności do naśladowania funkcji biologicznych ich endogennych odpowiedników. W związku z tym bardzo ważne jest, aby ocenić ich specyficzność substratową, sygnalizację w dół i lokalizację subkomórkową. Specyficzność aktywności LightR-Src potwierdza się poprzez fosforylację substratów Src, w tym paxilliny i p130Cas^22,23. FastLightR-Src przemieszcza się między obszarem okołojądrowym a ogniskowymi zrostami pod wpływem cyklicznego oświetlenia, powodując rozprzestrzenianie się komórek. Takie zjawisko z powodzeniem przypomina wcześniejsze obserwacje wykonane za pomocą natywnej kinazy Src i dodatkowo potwierdza skuteczność obecnego narzędzia w badaniu biologii Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf wykazuje również swoistość w celowaniu w kompleksy sygnałowe, takie jak kinazy MEK i ERK^24,25. Dodatkowo, FastLightR-bRaf wykazuje cykliczne oscylacje wahadłowca jądrowego ERK w odpowiedzi na niebieskie światło, co jest znaną konsekwencją aktywacji bRaf²⁸. Zdolność enzymów LightR do ścisłego naśladowania funkcji białek endogennych stanowi nieocenione narzędzie do badania ich funkcji.

Powyższa dyskusja przedstawia zdolność kinaz LightR do replikacji precyzyjnych szlaków sygnalizacji komórkowej w określonych przedziałach komórkowych. Zgodnie z takim sukcesem kinaz, LightR-Cre służy jako model ilustracyjny demonstrujący funkcjonalność oryginalnej rekombinazy Cre pochodzącej z bakteriofaga P1. Rekombinaza Cre należy do rodziny integraz rekombinaz specyficznych dla miejsca i działa poprzez ułatwianie rekombinacji między dwoma miejscami rozpoznawania zwanymi loxP na docelowym DNA. Taka rekombinacja powoduje rearanżację DNA poprzez zdarzenie crossover. W oparciu o kierunkową orientację miejsca loxP na docelowym DNA, zdarzenie skrzyżowania może prowadzić do delecji, duplikacji lub translokacji elementów chromosomowych⁴⁸. Rekombinaza Cre jest szeroko stosowana do generowania modeli in vivo indukowalnej regulacji genów^49,50. Jednak inne spontaniczne, chemicznie indukowane lub optogenetycznie indukowane systemy rekombinazy cre zapewniają ograniczoną kontrolę nad tym, kiedy i gdzie rekombinacja DNA jest indukowana w modelu zwierzęcym. LightR-Cre pokonuje te ograniczenia, umożliwiając ścisłą czasową i przestrzenną kontrolę rekombinacji DNA. Co więcej, możliwość przestrajania LightR pozwala nam wyeliminować niepożądaną nieszczelność i zapewnić regulację Cre z wysoką precyzją. Możliwości te otwierają nowe możliwości w zakresie modelowania patologii chorób i opracowywania nowych metod leczenia.

Precyzyjna regulacja LightR w kinazach i rekombinacji DNA stanowi kolejny dowód na to, że narzędzie to można zastosować do kilku białek przy użyciu tej samej strategii. Oprócz aktywacji różnych klas enzymów, LightR może być potencjalnie przyłączany do innych typów białek, gdzie modulacja allosteryczna może być wykorzystana do lokalizacji białek w określonych regionach subkomórkowych, indukowania interakcji białko-białko, inżynierii biosensorów indukowanych niebieskim światłem i nie tylko. Ze względu na allosteryczne zalety celowania w specyficzną domenę, LightRs można również łączyć z innymi podejściami chemogenetycznymi i optogenetycznymi w tym samym białku, aby osiągnąć wyższy stopień przestrajania do badania procesów biologicznych.

Z powodzeniem zastosowaliśmy LightR do wielu innych białek (manuskrypty w przygotowaniu). Pomimo tego sukcesu, opracowanie funkcjonalnego białka LightR może napotkać potencjalne wyzwania, szczególnie w zakresie wyboru odpowiedniego miejsca insercji i dokładnego naśladowania funkcji biologicznej białka docelowego. Gdy struktura krystaliczna jest niedostępna, naukowcy muszą polegać na przewidywanych strukturach lub informacjach o sekwencji aminokwasów, co wymaga dalszych działań związanych z rozwiązywaniem problemów w celu inżynierii białek z wieloma miejscami insercji lub podstawieniami aminokwasów. Ponadto zmodyfikowana aktywność białka musi być precyzyjnie dostrojona, aby dokładnie odtworzyć funkcję biologiczną w komórce. Powodzenie tych eksperymentów zależy od precyzyjnej funkcjonalnej mimikry zmodyfikowanego białka, z jego endogennym homologiem, który często wymaga rygorystycznego rozwiązywania problemów i może się różnić w zależności od typu komórki, klasy białka docelowego i typu, a także siły i czasu trwania aktywacji światła niebieskiego.

Podsumowując, system LightR stanowi potężne narzędzie do osiągnięcia precyzyjnej czasoprzestrzennej kontroli nad funkcją białek. Jego solidność, możliwość przestrajania i wszechstronność sprawiają, że jest nieoceniony w badaniu złożonych procesów komórkowych, odkrywaniu szlaków sygnałowych i wyjaśnianiu mechanizmów regulacji genów. Zapewniając naukowcom bezprecedensową kontrolę nad aktywnością białek, system LightR może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat podstawowych procesów biologicznych i utorowania drogi dla innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
#1.5 Szkiełka nakrywkowe szklane 25 mm okrągłe	Warner Instruments	64-0715
Probówki 1,5 ml	Amerykański Naukowiec	cc7682-3394
2x Bufor			Na 500 ml: 5,18 g  Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Mikroskop Lampa pierścieniowa	Boli Optyka	ML46241324	Niebieska dioda LED, średnica 60 mm, 5 W
Agaroza	GoldBiotech	A-201
Przeciwciało anty-Erk 1/2	Sygnalizacja komórkowa	9102
Przeciwciało anty-GAPDH	invitrogen	AM4300
Anty-GFP	Clontech	632380
Przeciwciało anty-mCherry	invitrogen	M11217
Sygnalizacja komórkowa	anty-MEK	9122
Anty-p130Cas	BD Biosciences	610271
Sygnalizacja komórkowa	anty-paksyliny	2542
Anty-phospho-erk 1/2 T202 / Y204	Sygnalizacja komórkowa	9101
Anty-fosfo-pY249 Sygnalizacja komórkowa p130Cas		4014
Anty-fosfo-Y118	Sygnalizacja komórkowa	2541
Anto-phospho-S217/221 Komórka MEK	Sygnalizacja	9121
Zasilacz kompatybilny z Arduino	Komputer korporacyjny	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Komora komórkowa Attofluor	invitrogen	A7816
Wzorcowa płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Inaktywowany termicznie potrójny 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowane
bRaf-V600E-Venus			Prezent od dr Johna O'Bryana, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red barwnik błony plazmatycznej	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
Kompetentne komórki DH5a	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
Drabina DNA	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Enzym DPN1	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Odczynniki Clelanda
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronektyna z osocza bydlęcego	Sigma	F1141
Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6	Promega	E2692	Odczynnik do transfekcji
Żel Zielony barwnik kwasu nukleinowego	GoldBio	G-740-500
Barwnik w żelu fioletowy 6x	NEB	B7024A Zestaw do ekstrakcji żelu
GeneJET	Thermo Scientific	K0692	Zestaw do ekstrakcji żelu
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
Ogniwa HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Komórki HeLa	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Przekaźnik IoT	Rejestratory cyfrowe	DLI 705020645490	Przekaźnik sterujący AC/DC do oświetlenia
Monosiarczan Kanamycyny Złoto	Biotechnologia	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	System lamp panelowych LED
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Oprogramowanie do uruchamiania skryptów CellGEO
	analizy obrazowania	molekularnych	Metamorph
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Olej mineralny	Sigma	Zestaw M5310
MiniPrep	Wybór genów	96-308
Prefabrykowane żele Mini-PROTEAN TGX 12 dołków	Bio-Rad	4561085
Klasa biologii molekularnej Woda	Corning	46-000-CV
Wielopasmowe lustro polichroiczne	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS bez Ca i Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Prezent od laboratorium dr Channinga Dera,
probówki UNC PCR	labForce	1149Z65	0,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski indywidualnie mocowane kołpaki kopułkowe
Phusion Plus Polimeraza DNA	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Wielokąt 400 Wzorzysty oświetlacz	Mightex	DSI-G-00C
Podkłady	IDT
PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Kanapki
T0,25% Trypsyna, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] korzennik sodu		25-053-CI
Tris-octan-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	Do elektroforezy
UPlanSApo 40x Mikroskop Obiektyw	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	Do interfejsu TTL
i beta;-Merkaptoetanol	Fisher Chemical	O3446I-100