Artykuł metodologiczny

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67261

⸱

4 października 2024

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Streszczenie

Optogenetyka oferuje możliwość naśladowania złożonej czasoprzestrzennej kontroli aktywności enzymów aż do rozdzielczości subkomórkowej. Jednak większość podejść optogenetycznych często napotyka poważne wyzwania związane z integracją wielu możliwości w jednym narzędziu, które ma zastosowanie do szerokiego zakresu białek docelowych. Osiągnięcie precyzyjnej kontroli nad kinetyką włączania/wyłączania, zapewnienie minimalnej nieszczelności w ciemności i wykazanie wydajnej wydajności w komórkach ssaków z subkomórkową precyzją to tylko niektóre z najczęstszych wyzwań napotykanych w tej dziedzinie. Obiecującym rozwiązaniem jest zastosowanie racjonalnie zaprojektowanych domen światłoczułych do allosterycznej kontroli aktywności białek. Korzystając z tej strategii, opracowaliśmy metodę optogenetyczną łączącą wszystkie pożądane cechy. Podejście to polega na włączeniu regulowanego światłem modułu przełącznika allosterycznego (LightR) do białka docelowego w celu regulacji aktywności enzymu za pomocą światła niebieskiego (465 nm). Domena LightR jest generowana przez połączenie dwóch domen fotoreceptorów Vivid (VVD), tworząc światłoczuły zacisk, który można włączyć do małej elastycznej pętli w domenie katalitycznej enzymu. W stanie ciemnym zacisk LightR jest otwarty, zniekształcając w ten sposób domenę katalityczną enzymu i dezaktywując ją. Po wystawieniu na działanie światła niebieskiego domena LightR zamyka się i przywraca strukturę domeny katalitycznej oraz aktywność enzymatyczną. W tym manuskrypcie omawiamy strategie projektowania w celu wygenerowania kinazy białkowej regulowanej światłem i wykazania jej kontroli za pomocą światła niebieskiego, odwracalności, kinetyki i precyzyjnej regulacji na poziomie subkomórkowym, umożliwiając ścisłą precyzję czasoprzestrzenną. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, prezentujemy protokół skutecznej regulacji aktywności kinazy LightR-Src. Wykazaliśmy również możliwość zastosowania LightR w różnych klasach enzymów, zwiększając użyteczność systemu narzędzi w rozwiązywaniu mechanistycznych problemów szlaków sygnałowych w różnych chorobach.

Wprowadzenie

Zdolność komórki do interpretowania sygnałów zewnętrznych i przekształcania ich w określone reakcje w kontekstach fizjologicznych lub patologicznych jest kierowana przez dedykowane grupy białek. Udział dowolnego białka w takich złożonych reakcjach jest często definiowany przez jego subkomórkową lokalizację, poziom ekspresji i czas przejściowej, trwałej lub oscylacyjnej aktywacji. Analiza roli tych indywidualnych parametrów w regulacji sygnalizacji wymaga metod zdolnych do odtworzenia skomplikowanej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek na poziomie subkomórkowym. Tradycyjne techniki, takie jak manipulacje genetyczne i inhibitory małocząsteczkowe, nie spełniają oczekiwań pod tym względem. Natomiast techniki optogenetyczne obiecują potencjał w zakresie analizy procesów biologicznych poprzez manipulowanie lub naśladowanie procesów fizjologicznych i patologicznych. Jednak obecne narzędzia często nie mają szerokiego zastosowania ani kontroli subkomórkowej. Kilka istniejących strategii zapewnia ścisłą regulację lokalizacji i interakcji białek; ale nie mają bezpośredniej kontroli nad aktywnością enzymatyczną1,2,3,4. Inne umożliwiają regulację aktywności enzymatycznej, ale mogą nie mieć kontroli subkomórkowej lub mają ograniczoną przydatność w różnych klasach enzymów5,6,7,8,9. W tym dokumencie dotyczącym protokołu opisujemy nowatorską metodę inżynierii białek, która łączy zalety optogenetyki w jednym narzędziu: ścisłą regulację czasową, przestrajalną kinetykę, kontrolę subkomórkową i szerokie zastosowanie enzymów10. Zaprojektowaliśmy domenę regulowaną światłem (LightR), która działa jak przełącznik allosteryczny po wprowadzeniu do docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Strategia ta umożliwia ścisłą czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji i dezaktywacji białka będącego przedmiotem zainteresowania w żywych komórkach.

Tutaj omówiono projekt i strategię zastosowania narzędzia optogenetycznego LightR w kilku klasach enzymów. Badanie to oferuje krok po kroku protokół opracowania, scharakteryzowania i zastosowania regulowanej światłem kinazy tyrozynowej Src (LightR-Src). Badanie dodatkowo demonstruje możliwość przestrajania kinetyki inaktywacji przełącznika LightR. Wolno dezaktywujący się przełącznik LightR może utrzymywać aktywność enzymów przy zmniejszonej częstotliwości oświetlenia, podczas gdy wersja z szybką jazdą na rowerze, FastLightR, wymaga częstszego podświetlania do aktywacji, ale wykazuje szybką dezaktywację, gdy oświetlenie jest wyłączone. Aktywacja/inaktywacja FastLightR-Src w żywych komórkach indukuje cykle rozprzestrzeniania się i wycofywania komórek. Rozprzestrzenianie się komórek indukowane przez FastLightR-Src zgadza się z fizjologiczną rolą kinazy Src11,12. Ze względu na szybką kinetykę inaktywacji, FastLightR-Src może być również regulowany na poziomie subkomórkowym, co powoduje stymulację lokalnych wypukłości i polaryzację komórek. Aby zademonstrować możliwość zastosowania narzędzia LightR do innych typów enzymów, pokrótce przeprowadzimy czytelników przez podobny sukces z zmodyfikowaną kinazą bRaf regulowaną światłem (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) i specyficzną dla miejsca rekombinazą DNA Cre (LightR-Cre). Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat złożonych szlaków sygnałowych kształtujących patofizjologię różnych chorób.

Protokół

1. Projektowanie i opracowanie LightR (Rycina 1)

  1. Planowanie strategiczne
    UWAGA: Domena LightR składa się z dwóch tandemowo połączonych domen fotoreceptorów Vivid (VVD) z Neurospora crassa13,14,15,16. Domeny VVD tworzą homodimery w obecności światła, a dimeryzacja ta wiąże się ze zmianą konformacyjną, która przybliża koniec N jednego monomeru VVD do końca C innego monomeru VVD (Rysunek 1A). Połączenie dwóch domen VVD za pomocą elastycznego łącznika tworzy domenę przypominającą zacisk, która jest otwarta w ciemności i zamyka się po naświetleniu niebieskim światłem. Integracja tego zacisku z domeną katalityczną enzymu umożliwia regulację aktywności za pomocą światła. W ciemności otwarty zacisk zniekształca domenę, dezaktywując enzym; naświetlanie niebieskim światłem powoduje zamknięcie zacisku, co przywraca aktywność enzymu (Rysunek 1B). Koncepcję tę można zastosować do enzymów z różnych rodzin, w tym do kinaz białkowych i rekombinaz DNA10 (Rysunek 1C).
    1. Projektowanie LightR
      1. Aby połączyć dwie cząsteczki VVD, należy użyć elastycznego łącznika składającego się z 22 aminokwasów (GGS)4G(GGS)3 pomiędzy każdym monomerem.
        UWAGA: Łącznik zapewnia wystarczającą elastyczność i długość, aby umożliwić asocjację i dysocjację monomerów VVD.
      2. Do końca N i końca C domeny LightR należy dodać odpowiednio łączniki GPGGSGG i GSGGPG.
        UWAGA: Długość i skład łączników mogą wymagać dostosowania do konkretnego białka. Krótsze łączniki GSG i pojedyncze łączniki Gly są rutynowo stosowane, gdy wymagana jest ściślejsza regulacja. Wielkość pętli insercyjnej oraz jej bliskość względem reszt katalitycznych będą również wpływać na zakres dynamiczny regulacji. Krótsze pętle z większym prawdopodobieństwem zapewnią ściślejszą regulację aktywności katalitycznej, ale mogą prowadzić do niższej aktywności po naświetleniu. Sekwencja domeny LightR znajduje się w Tabeli uzupełniającej 1.
    2. Insercja LightR
      UWAGA: Odpowiednie miejsce insercji LightR umożliwi ścisłą regulację funkcji docelowej domeny bez blokowania sterycznego jej oddziaływań lub powodowania nieodwracalnych zmian strukturalnych, które wpłynęłyby na jej rolę biologiczną. Struktura krystaliczna białka docelowego jest idealnym przewodnikiem przy identyfikacji takich elastycznych obszarów pętli do insercji LightR. Jeśli jest to konieczne, wystarczy struktura krystaliczna bliskiego homologu. Poniżej przedstawiono niektóre ogólne kryteria, które należy wziąć pod uwagę.
      1. Należy upewnić się, że pętla insercyjna jest strukturalnie sprzężona z krytycznymi elementami katalitycznymi enzymu. Należy upewnić się, że wybrana pętla insercyjna nie jest istniejącym miejscem wiązania białka i że insercja LightR potencjalnie nie zaburza żadnych oddziaływań funkcjonalnych z powodu efektów sterycznych.
      2. Jako strategię początkową należy zastąpić jeden aminokwas w pętli insercyjnej podczas wprowadzania LightR. Należy celować w środek pętli insercyjnej zawierającej aminokwas polarny lub mały (np. Glu, Arg, Lys, Gly) wyeksponowany na rozpuszczalnik i nieuczestniczący w oddziaływaniach wewnątrzcząsteczkowych.
        UWAGA: Gdy zastąpienie jednego aminokwasu nie prowadzi do powstania funkcjonalnego białka, optymalizacja konstruktu LightR będzie wymagała zastąpienia wielu aminokwasów lub całej pętli insercyjnej. Należy ocenić funkcjonalność wielu miejsc insercji LightR w obrębie zdefiniowanej pętli.
      3. Należy upewnić się, że docelowy enzym działa niezależnie od regulacji endogennej. Można to osiągnąć, używając konstytutywnie aktywnej wersji mutantu enzymu jako matrycy do insercji.
        UWAGA: Do generowania konstruktów LightR można również użyć enzymów typu dzikiego, ale może to skutkować systemem z bramką logiczną typu AND, który będzie regulowany przez mechanizmy endogenne oraz światło.
      4. Kontrole pozytywne i negatywne są niezbędne do analizy aktywności enzymu LightR. Jako kontrole pozytywne należy stosować konstytutywnie aktywne mutanty białek endogennych, a jako kontrole negatywne katalitycznie nieaktywne wersje mutantów docelowego enzymu LightR.
        UWAGA: Przy wyborze mutacji inaktywujących kluczowe jest zapewnienie, aby mutacja była wystarczająco oddalona od miejsca insercji LightR, aby uniknąć zaburzenia nieodwracalności fałdowania enzymu LightR. W oparciu o powyższe kryteria, miejsce insercji LightR w kinazie Src wybrano w regionie elastycznej pętli, która jest strukturalnie sprzężona z wysoko konserwowanym motywem GXGXXG w regionie pętli G wiążącej ATP/pętli bogatej w glicynę za pomocą pasma beta. Co ważne, znajduje się ono z dala od kieszeni wiązania ATP i regionu wiązania substratu10,17 (Rysunek 1C (i)).
        UWAGA: Ze względu na homologię strukturalną między kinazami, miejsce insercji LightR w bRaf wybrano w tej samej pętli strukturalnej co miejsce insercji w Src (Rysunek 1C (ii)).
        UWAGA: W oparciu o zasady określone w sekcji 1.1.2., miejsce insercji LightR w rekombinazie Cre, która nie jest kinazą, wybrano w jednej z elastycznych pętli oddalonych od rdzenia katalitycznego, tj. miejsca wiązania DNA. Jednak pętla insercyjna jest nadal strukturalnie sprzężona z krytycznymi resztami katalitycznymi w obrębie domeny wiążącej DNA poprzez alfa-helisę, aby zapewnić funkcjonalność LightR-Cre (Rysunek 1C (iii)). Wszystkie miejsca insercji wraz z kontrolami pozytywnymi i negatywnymi dla różnych enzymów opisanych w niniejszym protokole szczegółowo przedstawiono w Tabeli uzupełniającej 2.
    3. Opracowanie FastLightR.
      UWAGA: Wprowadzenie mutacji I85V do obu domen VVD w LightR umożliwia szybszą dynamikę aktywacji-inaktywacji, co przypisuje się szybkiej konwersji mutantu do stanu ciemnego18,19. Generowanie FastLightR-Src i FastLightR-bRaf z szybką kinetyką inaktywacji umożliwia ścisłą kontrolę czasową aktywacji i inaktywacji. Pozwala to na osiągnięcie regulacji subkomórkowej LightR-Src w żywych komórkach.
      UWAGA: Aktywność rekombinazy Cre prowadzi do nieodwracalnej rekombinacji DNA; zatem właściwości odwracalności LightR nie mają tutaj zastosowania.
      UWAGA: Aby uprościć detekcję konstruktu LightR, do końca N lub C białka docelowego można przyłączyć białko fluorescencyjne lub inny odpowiedni znacznik. W niniejszym badaniu użyto mCherry-myc dla LightR-Src, Venus dla LightR-bRaf oraz miRFP670 dla rekombinazy LightR-Cre.
  2. Strategia klonowania
    UWAGA: Podejście do klonowania, w przeciwieństwie do metod tradycyjnych, opiera się na mutogenezie ukierunkowanej, która nie polega na specyficznych miejscach restrykcyjnych10,20.
    1. Generowanie „megaprimera”
      1. Należy zoptymalizować kodony genów LightR, aby zapewnić stabilną ekspresję dwóch tandemowych sekwencji DNA VVD pochodzenia grzybowego w komórkach ssaków oraz aby uczynić sekwencje jak najbardziej odmiennymi dla bezbłędnego klonowania za pomocą PCR. Aby przeprowadzić optymalizację kodonów, należy postępować zgodnie z krokami 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Należy zestawić obok siebie sekwencję aminokwasową domen VVD oraz wybranych łączników, aby stworzyć teoretyczną mapę sekwencji LightR.
      3. Sekwencję należy wkleić do dowolnej internetowej platformy do optymalizacji kodonów, która wykorzystuje zaawansowany algorytm optymalizacji kodonów, aby określić najlepszy wariant sekwencji o minimalnej złożoności. Należy upewnić się, że wybrano organizm docelowy, zachowano ramkę odczytu i wybrano sekwencje VVD do optymalizacji.
      4. DNA LightR należy uzyskać jako fragment syntetyzowany na zamówienie (patrz Tabela uzupełniająca 1) lub z wcześniej opublikowanego konstruktu LightR10.
      5. Gen LightR należy namnożyć w celu wygenerowania „megaprimera” przy użyciu wcześniej opisanej20 strategii przedstawionej na Rysunku 1D. „Megaprimer” LightR należy zsyntetyzować za pomocą PCR zgodnie z zaleceniami producenta dla konkretnej polimerazy DNA, stosując następującą mieszaninę reakcyjną PCR:
             bufor 5x kompatybilny z polimerazą DNA: 10 µL
             100 µM megaprimer Forward: 0.5 µL
             100 µM megaprimer Reverse: 0.5 µL
             10 nM mieszanka dNTP: 2 µL
             polimeraza DNA (2000 jednostek/mL): 1 µl (0.02 U/µL)
             50 ng matrycy DNA: 1 µL
             woda klasy PCR: 35 µL
        ​UWAGA: W tym przypadku stosuje się polimerazę DNA o wysokiej wierności typu hot start z uniwersalnymi temperaturami przyłączania starterów.
      6. Otrzymany megaprimer należy rozdzielić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Produkt będzie miał długość około 1000 nukleotydów. Megaprimer należy wyciąć z żelu agarozowego i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu, zgodnie z zaleceniami producenta lub przy użyciu analogicznej techniki.
    2. Insercja genu LightR za pomocą mutogenezy ukierunkowanej: Należy wstawić LightR, zastępując wybrany aminokwas lub sekwencję aminokwasów. Plazmidem matrycowym będzie plazmid, w którym wstawiono domenę LightR. Reakcję PCR należy przeprowadzić zgodnie z wcześniejszym opisem20, stosując następującą mieszaninę.
           bufor 5x kompatybilny z polimerazą DNA: 5 µL
           10 nM mieszanka dNTP: 1 µL
           polimeraza DNA (2000 jednostek/mL): 1 µL (0.02 U/µL)
           50 ng docelowej matrycy DNA: 1 µL
           wyekstrahowany megaprimer (obliczona masa): 10 µL
           DMSO: 2.5 µL
           woda klasy PCR: 2.5 µL
      ​UWAGA: Masa megaprimera (ng) = pożądany stosunek molowy insert/wektor x masa wektora x stosunek długości insertu do wektora. Stosowany pożądany stosunek molowy insert/wektor wynosi 3/1.
    3. Po zakończeniu reakcji PCR należy dodać 1 µL enzymu DpnI (2000 jednostek/mL), aby selektywnie strawić tylko nadmiar i zmetylowane DNA, a następnie inkubować mieszaninę w 37 °C przez 1-1,5 h. Znacznie zwiększy to wydajność zmodyfikowanego konstruktu.
    4. Należy przekształcić 1-2 µL reakcji PCR do kompetentnych komórek DH5α zgodnie z protokołami producenta.
    5. Przekształcone bakterie należy wysiać na płytki z agarem Luria Broth (LB) z odpowiednim antybiotykiem do selekcji. Płytkę należy inkubować w 37 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej (RT; 25-30 °C) przez 72 h.
      UWAGA: Płytki LB z wyrośniętymi koloniami można przechowywać w 4 °C do 1 miesiąca, a protokół można w tym czasie przerwać.
    6. PCR do screeningu kolonii
      1. W przypadku screeningu kolonii opartego na PCR należy zaprojektować startery, które przyłączają się do insertu LightR i docelowego DNA, aby wygenerować fragmenty o długości około 400-700 bp.
      2. Do poniższej mieszaniny PCR należy dodać niewielką ilość kolonii z płytki LB i przystąpić do termocyklingu zgodnie z zaleceniami producenta dla konkretnej polimerazy DNA.
             2x Taq RED Master Mix: 5 µL
             woda klasy PCR : 5 µL
             100 µM starter Forward : 0.5 µL
             100 ​µM starter Reverse: 0.5 µL
      3. Pozytywne kolonie należy zweryfikować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
      4. Należy wybrać kolonie, które wygenerowały produkt PCR o pożądanej wielkości, i zaszczepić je indywidualnie do 3 mL bulionu LB z antybiotykiem, dopasowanym do oporności na antybiotyki w szkielecie plazmidu. Następnie należy inkubować i wytrząsać w 37 °C przez noc.
      5. DNA plazmidowe należy wyekstrahować z hodowli płynnej zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do oczyszczania plazmidów i zweryfikować obecność insertu za pomocą sekwencjonowania.
        UWAGA: Startery do klonowania zestawiono w Tabeli uzupełniającej 3.

2. Wysiew komórek i analiza biochemiczna aktywności enzymu LightR (Rysunek 2A)

  1. Do analizy biochemicznej kinaz LightR (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf) wysiej 1 x 106 komórek LinXE na szalkę hodowlaną o średnicy 3,5 cm dla każdej grupy eksperymentalnej. Patrz Supplementary Table 4.
  2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5 % CO2 przez 16-18 h.
  3. Następnego dnia przeprowadź transfekcję komórek wybranym konstruktem DNA, używając odpowiedniego odczynnika do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta (Supplementary Table 4).
    UWAGA: Optymalny odczynnik do transfekcji będzie zależał od konstruktu, wektora i rodzaju użytych komórek. W niniejszym badaniu na szalkę 3,5 cm użyto 2 µg DNA z zastosowaniem odczynnika do transfekcji. W celu ustalenia optymalnego odczynnika do transfekcji należy przeprowadzić testy empiryczne. Ponieważ transfekowane konstrukty będą exprimować białka regulowane światłem niebieskim, wszystkie kolejne etapy pracy z transfekowanymi komórkami muszą być wykonywane w czerwonym świetle. Przed umieszczeniem w inkubatorze owiń szalki z transfekowanymi komórkami folią aluminiową, aby zapobiec przypadkowemu naświetleniu.
  4. Po 16-18 h od transfekcji poddaj komórki działaniu światła niebieskiego10. W tym celu umieść w inkubatorze do hodowli tkanek system lamp panelowych z diodami emitującymi światło (LED) o długości fali 465 nm. Powyżej lampy, w odległości 10 cm, umieść perforowany panel z pleksiglasu, aby uzyskać pożądaną natężenie oświetlenia 3 mW/cm2 (Supplementary File 1). Perforowany panel jest niezbędny do zachowania niezakłóconej cyrkulacji powietrza w inkubatorze. Naświetlaj komórki przez wybrany czas.
  5. Do aktywacji LightR-Src i LightR-bRaf stosuj naświetlanie ciągłe. W przypadku naświetlania ciągłego włączaj i wyłączaj panel LED ręcznie.
  6. Aby utrzymać cykl aktywacji/inaktywacji FastLightR Src, stosuj cykle ON/OFF sterowane ręcznie lub za pomocą mikrokontrolera.
    UWAGA: Można wykorzystać kilka zestawów narzędzi programistycznych zapewniających zintegrowane środowisko programistyczne (IDE) do pisania i wgrywania wymaganego kodu. Zestawy te wspierają programowanie w C/C++ i oferują dostęp do wejścia/wyjścia ogólnego przeznaczenia (GPIO), co jest niezbędne do sterowania naświetlaniem pulsacyjnym. Szczegółowy opis protokołów i kodu użytego w tych celach znajduje się w Supplementary File 1.
  7. Pod koniec odpowiednich punktów czasowych eksperymentu (Supplementary Table 4) zbierz komórki przy bezpiecznym czerwonym świetle. Odessaj medium i przemyj komórki zimnym PBS.
  8. Aby wyizolować białko, zlizuj komórki za pomocą 500 µL 2-krotnego buforu Laemmli z dodatkiem 5% v/v 2-merkaptoetanolu. Inkubuj lizat w temperaturze 100 °C przez 5 min. Analizuj lizaty komórkowe za pomocą elektroforezy białek w żelu i Western blottingu21.
    UWAGA: Skład 2-krotnego buforu Laemmli jest następujący: na 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 mL glicerolu, 52,5 mL 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8.
  9. Oceń aktywność LightR-Src, analizując poziom fosforylacji endogennego p130cas w pozycji Tyr249 oraz paksylliny w pozycji TyrY11822,23(Figure 2). Oceń aktywność LightR-bRaf, analizując poziom fosforylacji MEK1 w pozycji Ser217/221 oraz ERK1/2 w pozycji TyrY202/20424,25.

3. Analiza funkcjonalna aktywności LightR-Cre

  1. Do analizy funkcjonalnej aktywności LightR-Cre należy wysiać 1 x 106 komórki LinXE na szalkę hodowlaną o średnicy 3,5 cm. Inkubować komórki w 37 °C oraz 5% CO22 przez 16–18 h.
  2. Przeprowadź transfekcję komórek zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 2, Rysunek 2A, i Tabela uzupełniająca 5Współtransfekować łącznie 2 µg DNA w stosunku 1:9 plazmidu LightR-Cre-iRFP670 do plazmidu reporterowego Floxed-STOP-mCherry2.
  3. Po 16–18 h od transfekcji naświetl komórki. Efektywna aktywacja LightR-Cre wymaga długotrwałego naświetlania. Aby zatem uniknąć fototoksyczności, zastosuj naświetlanie pulsacyjne przez 8 h w cyklach 2 s włączenia (ON) i 20 s wyłączenia (OFF), wykorzystując system lamp panelowych LED o długości fali 465 nm sterowany za pomocą mikrokontrolera, zgodnie ze szczegółami opisanymi w sekcji 2 oraz Plik uzupełniający 1.
  4. Wykonaj obrazowanie z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej z obiektywem powietrznym 20x. Do wizualizacji LightR-Cre-iRFP670 użyj zestawu filtrów Cy5, a do wizualizacji mCherry z ekspresji Floxed-mCherry użyj zestawu filtrów RFP.
    UWAGA: Do obrazowania wykorzystuje się mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w kostki filtracyjne Cy5/RFP.

4. Przygotowanie próbek do obrazowania żywych komórek

  1. Wysiać 2 x 105 komórek HeLa na 35 mm szalkę do hodowli tkanek w pożywce do hodowli komórkowej i inkubować przez 2 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  2. Po przytwierdzeniu komórek i osiągnięciu konfluencji na poziomie około 60%-70%, przeprowadzić kotransfekcję komórek HeLa jedną z poniższych mieszanin: (i) 0,85 µg FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 µg Stargazin-iRFP lub (ii) 0,75 µg FastLightR-bRaf-Venus/0,25 µg mCherry-ERK2
    UWAGA: W eksperymentach z FastLightR-Src białko Stargazin-iRFP służy do znakowania błony plazmatycznej w celu analizy rozprzestrzeniania się komórek. Jeśli pożądana jest wyższa ekspresja FastLightR-Src, można pominąć stargazin-iRFP i zamiast tego użyć 1 µg FastLightR-Src. W takich przypadkach do wizualizacji komórek należy użyć barwnika błonowego. Do znakowania błon komórkowych rutynowo stosuje się barwniki błony plazmatycznej.
  3. Przykryć szalkę folią aluminiową, aby uniknąć przypadkowego naświetlenia komórek, i inkubować przez 16-18 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  4. Wszystkie poniższe kroki należy wykonywać przy oświetleniu czerwonym, aby uniknąć niezamierzonej aktywacji konstruktów. Ekspozycja na światło białe wywoła aktywację kinaz LightR i może wpłynąć na późniejsze wyniki.
  5. Tego samego dnia pokryć 3 okrągłe szkiełka podstawowe (średnica 25 mm, grubość 0,17 mm) warstwą 5 mg/L fibronektyny w PBS i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Przepłukać szkiełka podstawowe PBS 16-18 h po transfekcji i wysiać około 1 x 105 transfektowanych komórek HeLa na każde szkiełko. Inkubować w pożywce do hodowli komórkowej przez 2 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    UWAGA: Niska gęstość wysiewu jest niezbędna, aby zapewnić, że komórki w polu widzenia nie będą się ze sobą stykać.
  7. Przygotować pożywkę do obrazowania, dodając FBS do pożywki do obrazowania Levobitz's L-15 do stężenia końcowego 5%. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 µm i podgrzać do 37 °C.
  8. Podgrzać olej mineralny do 37 °C.
  9. Przemyć szkiełka z komórkami dwa razy PBS. W przypadku stosowania barwnika błonowego, zabarwić komórki zgodnie z instrukcją producenta przed przemyciem szkiełek.
  10. Ostrożnie umieścić szkiełko w komorze do obrazowania żywych komórek. Dodać do komory 1 mL pożywki do obrazowania L-15.
  11. Dodać 1 mL oleju mineralnego na powierzchnię pożywki, aby zapobiec parowaniu podczas procesu obrazowania.
  12. Przechowywać komorę w ciemności w temperaturze 37 °C do momentu rozpoczęcia obrazowania.

5. Globalna aktywacja i obrazowanie FastLightR-Src (Rysunek 3)

  1. Zamocuj pierścieniowe oświetlenie LED w kolorze niebieskim do kondensora mikroskopu, pozycjonując je około 1.5 cm nad uchwytem próbki. Podłącz przekaźnik sterujący AC/DC oświetlenia pierścieniowego do komputera mikroskopowego.
    UWAGA: W eksperymentach przeprowadzonych w niniejszym badaniu oświetlenie było kontrolowane za pomocą interfejsu TTL (Transistor-Transistor Logic) poprzez oprogramowanie do obrazowania. Jeśli zewnętrzne źródło światła jest niedostępne, do globalnej aktywacji konstruktów LightR można użyć oświetlenia epifluorescencyjnego. Długości fal wzbudzenia GFP, takie jak filtr wzbudzenia 490/20 nm, są skuteczne w aktywacji LightR.
  2. Umieść komorę na stoliku mikroskopu wstępnie podgrzanym do 37 °C i wybierz komórki ekspresyjne dla FastLightR-Src-mCherry i Stargazin-iRFP (Rysunek 3B) lub FastLightR-bRaf-Venus i mCherry ERK-2 (Rysunek 5B).
  3. Do badań nad oświetleniem globalnym i eksperymentów obrazowania należy używać kompatybilnych z mikroskopem, wysokowydajnych obiektywów (40x) z korekcją apochromatyczną, korekcją płaskiego pola i wysoką aperturą numeryczną.
    1. W badaniach kinazy Src opartych na oświetleniu globalnym należy użyć filtrów wzbudzenia 561/10 nm i emisji 595/40 nm do wizualizacji FastLightR-Src-mCherry oraz filtrów wzbudzenia 640/20 nm i emisji 655LP do wizualizacji stargazin-iRFP.
    2. W badaniach kinazy bRaf opartych na oświetleniu globalnym należy użyć filtrów wzbudzenia 514/10 nm i emisji 540/21 nm do wizualizacji FastLightR-bRaf-Venus oraz filtrów wzbudzenia 561/10 nm i emisji 595/40 nm do wizualizacji mCherry-ERK-2.
    3. We wszystkich kanałach obrazowania fluorescencyjnego należy zastosować wielopasmowe lustro polichromatyczne.
  4. W zależności od warunków eksperymentalnych należy wziąć pod uwagę następujące zalecenia:
    1. Obrazuj komórki przez co najmniej 10 min przed oświetleniem, aby ustalić bazową aktywność komórek.
      UWAGA: Poziom bazowy jest niezbędny do określenia, czy aktywacja kinazy FastLightR poprzez oświetlenie wywołuje jakiekolwiek zmiany w zachowaniu komórek lub lokalizacji białek. Można również przeprowadzić dłuższe okresy obrazowania bazowego, aby uzyskać większą istotność statystyczną.
    2. Ze względu na szybką kinetykę inaktywacji FastLightRs, uwzględnienie wielu komórek w obrazowaniu może spowodować dezaktywację Src/bRaf pomiędzy pozycjami stolika i może osłabić odpowiedź. Aby uniknąć takiego błędu, podczas analizy aktywności FastLightR-Kinazy w opisanym protokole obrazuj 4 komórki/min, a każdą wybraną komórkę obrazuj co minutę przez łącznie 110 min (Plik uzupełniający 2).
    3. Stosuj oświetlenie impulsowe zamiast ciągłego, aby zmniejszyć potencjalne efekty fototoksyczne niebieskiego światła. Skuteczne jest oświetlenie trwające 12 s dla każdych 4 komórek/min (Plik uzupełniający 2, Rysunek 3A).
      UWAGA: Cykle oświetlenia powinny zostać określone empirycznie dla różnych konstruktów i typów źródeł światła.
    4. Wyłącz oświetlenie podczas obrazowania komórek, aby uniknąć przesłuchów (bleed-through) w kanałach fluorescencyjnych.
      UWAGA: Obrazowanie zbyt wielu komórek jednocześnie skróci całkowity czas oświetlenia dostępny dla próbki, co doprowadzi do osłabienia odpowiedzi z powodu niewystarczającej aktywacji.
  5. Po obrazowaniu zapisz filmy w formacie plików stosu .TIF do analizy.
    UWAGA: Ze względu na mniejszą jednorodność oświetlenia przy epifluorescencji GFP w porównaniu do oświetlenia pierścieniowego, eksperymenty z użyciem epifluorescencji GFP będą wymagały częstszego oświetlania. Skutkuje to obrazowaniem mniejszej liczby komórek w jednym eksperymencie.

6. Subkomórkowa aktywacja i obrazowanie FastLightR-Src (Rysunek 4)

  1. Umieść komorę na stoliku mikroskopu wstępnie podgrzanym do 37 °C i wybierz pojedynczą komórkę wykazującą ekspresję zarówno FastLightR-Src-mCherry, jak i Stargazin-iRFP.
  2. Wybierz konkretne obszary (ROI) wewnątrz komórki do oświetlenia. W niniejszym badaniu wybrano niewielki obszar na obwodzie wybranej komórki.
    UWAGA: Do lokalnego oświetlania stosuje się laser 445 nm ogniskowany przez moduł TIRF w trybie FRAP lub urządzenie z mikrolusterkami sterowane przez interfejs TTL za pomocą oprogramowania do obrazowania. W tych eksperymentach sprawdzi się każdy system oświetlenia wzorcowego. W przypadku zastosowania systemu skanującego należy określić intensywność i jednorodność lasera, aby zapewnić wystarczającą aktywację bez uszkodzenia komórki.
  3. Wykonuj obrazy wybranej komórki co minutę przez 20 min w stanie podstawowym przed oświetleniem, przez 50 min podczas lokalnego oświetlania, a następnie przez 20 min po aktywacji, łącznie przez 90 min (Supplementary File 2).
  4. W przypadku aktywacji i dezaktywacji należy zapewnić odpowiednią ilość czasu, dostosowaną do białka docelowego, aby umożliwić całkowitą dezaktywację białka LightR. Dla FastLightR-Src należy przewidzieć co najmniej 10 min dezaktywacji, aby pozostała aktywność ustąpiła, oraz 20 min dezaktywacji w zaprezentowanym układzie eksperymentalnym do lokalnego oświetlania.
  5. Po obrazowaniu zapisz filmy w formacie plików stosu .TIF do analizy.

7. Analiza rozprzestrzeniania się komórek

  1. Przygotuj obrazy do przetwarzania i analizy danych. Upewnij się, że obrazy są w formacie stosu .TIF. Zapisz je bezpośrednio z oprogramowania do obrazowania lub przekonwertuj za pomocą programu open-source.
  2. Pobierz pakiet skryptów CellGeo z dołączonych do danych uzupełniających plików zip26.
    UWAGA: Pakiet CellGeo zawiera kilka różnych skryptów. Wybierz odpowiedni pakiet z listy w zależności od rodzaju analizy opisanej w sekcjach protokołu 7-9.
  3. Otwórz i uruchom skrypt o nazwie MovThresh, aby utworzyć maskę komórki.
    1. Wybierz File > Import (.tif) i zaznacz obrazy komórek Stargazin-iRFP.
    2. Przejrzyj klatki za pomocą paska przewijania w lewym dolnym rogu. Jeśli sugerowany próg jest odpowiedni, przejdź do kroku 7.4.
    3. Jeśli sugerowany próg nie odpowiada zachowaniu komórki, wybierz krzywe wygładzone (smoothed) lub niestandardowe (custom) w sekcji Curve Selection. Utwórz niestandardową krzywą, przewijając klatki, a następnie dostosowując próg po prawej stronie okna.
    4. Kliknij Re-Threshold.
    5. Kliknij File > Save as masks, zmień nazwę pliku i zapisz go za pomocą opcji Save as.
  4. Otwórz nowo utworzony plik stosu w programie do analizy obrazów open-source.
  5. Wybierz Image > Adjust > Threshold > Apply.
  6. Wybierz Analyze > Analyze particles > Check display results -> OK.
  7. Oblicz zmianę powierzchni dla każdej komórki, dzieląc powierzchnię w dowolnym momencie przez średnią powierzchnię tej samej komórki przed naświetlaniem światłem niebieskim.
  8. Przedstaw zmianę powierzchni na wykresie liniowym lub słupkowym.
  9. Oblicz wartość średnią i 90% przedziały ufności dla każdego punktu czasowego dla wszystkich komórek traktowanych w tych samych warunkach.

8. Analiza dynamiki krawędzi komórki

  1. Przygotuj pliki stosów zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 7 protokołu.
  2. Otwórz i uruchom skrypt o nazwie ProActive.
    1. Wybierz File > Import > Masks (.tif) i zaznacz maskę utworzoną za pomocą skryptu MovThresh .
    2. W prawym dolnym rogu wybierz analizowaną aktywność (Protrusive, Retractive, lub Total).
    3. Wybierz typ normalizacji. W tych analizach zazwyczaj stosuje się normalizację powierzchni.
    4. Za pomocą suwaka po lewej stronie wybierz początkową klatkę odniesienia. Suwak opóźnienia (lag) po prawej stronie określi odstęp czasu między dwoma punktami czasowymi używanymi do pomiaru powierzchni zyskanej i utraconej przez komórkę.
    5. Jeśli suma wybranej klatki i wartości opóźnienia jest większa niż liczba klatek w filmie, obraz podglądu nie zostanie wyświetlony. Zresetuj te wartości tak, aby ich suma była mniejsza niż całkowita liczba klatek.
  3. Zmodyfikuj progowanie dla protruzji lub retrakcji, zaznaczając pole Smooth Curve w sekcji Results . Pozwala to na uśrednienie progów w określonym oknie, co może rozwiązać problemy w przypadkach, gdy niewielkie fluktuacje są wykrywane jako aktywność.
  4. Wybierz Run the Range , aby obliczyć aktywność w czasie określonym przez suwaki klatki i opóźnienia.
  5. Zapisz dane numeryczne, wybierając File > Save As > Results(.mat) , a następnie wykorzystaj je do wyznaczenia średniej aktywności protrusyjnej lub retrakcyjnej.
  6. Wyznacz 90% przedziały ufności dla każdego punktu czasowego.
    UWAGA: Spowoduje to zapisanie macierzy kilku różnych wartości. Plik tekstowy „How to use ProActive” dołączony do skryptu zawiera szczegółowy opis tego, co reprezentuje każda wartość i w jaki sposób została ona wyznaczona26.
  7. Zapisz wizualną reprezentację aktywności, wybierając File > Save As > Images (.tif).

9. Analiza przesunięcia centroidu

  1. Do analizy przesunięcia centroidu należy użyć dowolnego oprogramowania umożliwiającego wyznaczenie współrzędnych centroidu.
  2. W oprogramowaniu analitycznym należy otworzyć maskowany stos obrazów wybranej komórki, zgodnie z opisem w sekcji 7 protokołu.
  3. Należy wybrać Measure > Integrated Morphometry Analysis, a następnie kliknąć Preferences > Draw Centroid Mark > Check, a następnie wybrać Measure.
    1. Zapisz współrzędne centroidu przed ruchem (A).
    2. Zapisz współrzędne centroidu na koniec eksperymentu (B).
    3. Zapisz współrzędne środka wzoru oświetlenia (C).
  4. Po zebraniu trzech punktów należy wyznaczyć kąt Pomiar kąta; symbol matematyczny; pojęcia geometryczne; schemat edukacyjny; równowaga statyczna.BAC8. θ1 odpowiada kątowi Pomiar kąta; symbol matematyczny; pojęcia geometryczne; schemat edukacyjny; równowaga statyczna.ABC , a θ2 odpowiada kątowi Pomiar kąta; symbol matematyczny; pojęcia geometryczne; schemat edukacyjny; równowaga statyczna.CBA (Rycina 4Cii). Należy to zrobić, korzystając z następującego równania:
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    UWAGA: Dla ułatwienia można użyć kalkulatora do bezpośredniego wyznaczenia kątów i odległości na podstawie współrzędnych.
  5. Przesunięcie centroidu wyznacza się, mnożąc odległość, jaką przebył centroid komórki w pikselach, przez współczynnik konwersji, przyjmując, że 1 piksel równa się 0.4 µm. Konkretna konwersja pikseli na odległość zależy od powiększenia i konfiguracji kamery w systemie.
  6. Po wyznaczeniu kąta i odległości przesunięcia centroidu należy otworzyć oprogramowanie graficzne umożliwiające generowanie obrazów w układzie współrzędnych biegunowych.
  7. Wprowadź kąt przesunięcia centroidu jako pomiar θ, a przebytą odległość jako promień. Wykorzystaj test ANOVA do weryfikacji 95% przedziałów ufności.
  8. Narysuj wyniki i zapisz obraz.

Wyniki

LightR-Src został zaprojektowany i wytworzony zgodnie ze strategią opisaną na Ryc. 1A,B. Analiza biochemiczna LightR-Src obejmuje badanie fosforylacji znanych endogennych substratów Src, p130Cas (Y249)22 oraz paxylliny (Y118)23 w odpowiedzi na światło niebieskie przy 60 min ciągłego naświetlania (Ryc. 2B). Co istotne, nie obserwuje się tła aktywacji kinazy Src, gdy LightR-Src jest ekspresowany wyłącznie w ciemności przez 16-18 h po transfekcji. Ponadto katalitycznie nieaktywny mutant LightR-Src z mutacją D388R nie indukuje fosforylacji substratu Src, co dowodzi, że fosforylacja jest przeprowadzana przez aktywny LightR-Src, a nie jest spowodowana nieswoistym efektem naświetlania światłem niebieskim (Ryc. 2B). Uwzględniając doniesienia o oscylacyjnej aktywności kinazy Src27 w żywych komórkach, zbadaliśmy, czy LightR-Src można dostroić tak, aby wykazywał cykliczną aktywację. Pierwotny LightR-Src wykazywał wolną kinetykę dezaktywacji (Ryc. 2C), co skłoniło do stworzenia nowego wariantu, Fast-LightR-Src, posiadającego mutację I85V w obu domenach VVD. Ryc. 2D ilustruje, że Fast-LightR-Src wykazuje wyraźnie szybszą kinetykę dezaktywacji i ulega całkowitej inaktywacji w ciągu 10 min po wyłączeniu światła, w porównaniu do ponad godziny w przypadku LightR-Src. Dzięki zastosowaniu Fast-LightR-Src byliśmy również w stanie osiągnąć powtarzalne cykle aktywacji/inaktywacji (Ryc. 2E). Wyniki te wspólnie demonstrują zdolność narzędzia LightR do specyficznej i ściśle kontrolowanej regulacji aktywności Src w żywych komórkach.

Zastosowanie FastLightR-Src pozwala również na ocenę wpływu przejściowej aktywacji Src na morfodynamikę komórek. Aktywacja FastLightR-Src w komórkach HeLa indukuje rozprzestrzenianie się komórek, a proces ten ustaje natychmiast po dezaktywacji FastLightR-Src. Po aktywacji zaobserwowano translokację FastLightR-Src z obszaru okołojądrowego do adhezji ogniskowych i błony komórkowej, co jest zachowaniem charakterystycznym dla kinazy Src typu dzikiego11,12. Naświetlanie komórek wykazujących nieaktywny katalitycznie mutant D388RLightR-Src nie wywołuje takich efektów rozprzestrzeniania (Rycyna 3B,C). Potwierdza to ponadto, że FastLightR-Src funkcjonuje podobnie jak jego odpowiednik typu dzikiego. Lokalna iluminacja regionu komórki prowadzi do zlokalizowanej aktywacji FastLightR-Src, objawiającej się lokalną akumulacją LightR Src w adhezjach ogniskowych, której towarzyszy tworzenie lokalnych wypustek błony (Rycina 4B (i), (ii)) oraz przesunięcie centroidu komórki (Rycina 4C (i), (ii)), co skutkuje ruchem komórki w stronę światła. Po ustaleniu możliwości zastosowania narzędzia LightR do regulacji kinazy Src, prezentujemy szerokie zastosowanie LightR rozszerzone na regulację kinazy bRaf oraz rekombinazy DNA Cre. Analiza LightR-bRaf wykazuje indukowaną światłem fosforylację endogennego substratu bRaf, MEK1, oraz następczą fosforylację kinaz ERK1/224,25 na poziomach porównywalnych z poziomami konstytutywnie aktywnego mutanta bRaf (V600E) (Rycina 5A). Z kolei nieaktywny katalitycznie D575RLightR-bRaf nie wykazuje fosforylacji MEK1 i ERK1/2, co jest porównywalne z nieoświetlonymi próbkami LightR-bRaf, potwierdzając tym samym specyficzność regulacji LightR-bRaf. Obrazowanie żywych komórek wykazało, że powtarzające się cykle aktywacji/dezaktywacji FastLightR-bRaf indukują powtarzającą się translokację ERK2 do jądra i z jądra, co jest zgodne ze znanymi efektami aktywacji bRaf28 (Rycina 5B). Aktywacja LightR-Cre skutkuje pomyślną rekombinacją genu reporterowego mCherry, co demonstruje przydatność LightR w odniesieniu do różnych klas enzymów (Rycina 5C).

Schematy oddziaływań białkowych i metoda syntezy megaprimerów w mutogenezie miejscowej DNA aktywowanej światłem.
Rysunek 1: Strategia opracowania podejścia LightR. (A) Struktury krystaliczne dwóch monomerów Vivid w stanie ciemnym (PDB: 2PD7) oraz dimeru w stanie naświetlonym (PDB: 3RH8). (B) Schematyczne przedstawienie konstrukcji LightR. Dwa połączone tandemowo fotoreceptory VVD wstawione w domenę katalityczną zaburzają aktywność katalityczną białka w ciemności. Dimeryzacja VVD w odpowiedzi na światło niebieskie przywraca aktywność białka. (C) Struktury krystaliczne domen katalitycznych (i) Src (PDB 1Y57) oraz (ii) bRaf (PDB 4MNF). (ii) Struktura rekombinazy Cre (PDB 1MA7). Żółte strzałki wskazują miejsce wstawienia LightR oraz zastąpione aminokwasy. (D) Schemat strategii klonowania w celu wstawienia domeny LightR do sekwencji docelowego enzymu19. W kroku 1 specjalnie zaprojektowane primery są wykorzystywane do syntezy PCR fragmentu LightR flankowanego sekwencjami hybrydyzującymi z genem docelowym przed i po miejscu wstawienia. W kroku 2 tak otrzymany fragment LightR jest wykorzystywany jako „megaprimer” do wstawienia LightR do genu docelowego enzymu za pomocą ukierunkowanej mutogenezy miejscowej metodą Quick change. Panele A-C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya i wsp.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Optogenetyczna aktywacja i analiza Src; schemat, wyniki western blot; fosforylacja białek.
Rycina 2: Charakterystyka biochemiczna zmodyfikowanych białek LightR. (A) Schematyczna reprezentacja protokołu eksperymentalnego dla charakterystyki biochemicznej LightR Src. (B) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne konstrukt LightR Src z mCherry i znacznikiem myc na C-końcu były naświetlane światłem niebieskim przez 60 min przy użyciu układu LED 465 nm. W lizatach komórkowych badano fosforylację substratów Src: paxylliny i p130Cas. Wyniki Western Blot wykazują fosforylację endogennej paxylliny i p130Cas w odpowiedzi na aktywację LightR-Src w żywych komórkach. (C,D) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne wskazanych konstruktów LightR-Src z tandemowym znacznikiem mCherry-myc na C-końcu były stale naświetlane światłem niebieskim przez określony czas (0 min i 30 min), a następnie pozostawione w ciemności na wskazane okresy. W lizatach komórkowych badano fosforylację substratów Src, co pokazuje porównanie kinetyki aktywacji i dezaktywacji pomiędzy (C) LightR-Src a (D) FastLightR-Src. (E) Komórki LinXE przejściowo ekspresyjne wskazanych konstruktów LightR-Src z tandemowym znacznikiem mCherry-myc na C-końcu były stale naświetlane światłem niebieskim przez 20 min, po czym następowała powtarzalna inkubacja w ciemności przez 10 min i w świetle przez 20 min. Zebrano lizaty komórkowe i zbadano fosforylację substratów Src, wykazując efektywność cyklowania kinazy Src pomiędzy stanami aktywacji i inaktywacji. Wszystkie eksperymenty powtórzono co najmniej trzy razy, uzyskując podobne wyniki. Liczby wyświetlane obok paneli western blot B-E reprezentują masy cząsteczkowe białek mierzone w kilodaltonach (kDa). Panele B-E zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zachowanie komórek pod wpływem niebieskiego światła; mikroskopia i wykresy statystyczne; konfiguracja analizy fotoaktywacji.
Rysunek 3: Globalna i czasowa kontrola oświetlenia oraz jej wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Schematyczna reprezentacja planu eksperymentalnego dotyczącego globalnego i czasowego cyklicznego oświetlania oraz późniejszych analiz danych. (B,C) Regulacja morfologii komórek i lokalizacji FastLightR-Src przez niebieskie światło przedstawiona jest na reprezentatywnych obrazach komórek HeLa uzyskanych z serii time-lapse przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Komórki te przejściowo koeksprymowały FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 komórek) lub katalitycznie nieaktywny D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 komórek) wraz ze Stargazin-iRFP670 (marker błony plazmatycznej). Obrazowanie żywych komórek przeprowadzano w każdej minucie, podczas gdy komórki były globalnie oświetlane niebieskim światłem (niebieskie obramowania). (B) Żółte strzałki wskazują lokalizację FastLightR-Src w strukturach przypominających adhezje ogniskowe. Obrazy uzyskano z serii time-lapse komórek HeLa przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. (C) Ilościowa ocena zmian powierzchni komórek wywołanych aktywacją FastLightR-Src w porównaniu do D388RLightR-Src jest przedstawiona na każdym panelu. Okno oświetlenia zaznaczono niebieskimi prostokątami. Wykresy przedstawiają średnią ± 90% przedziały ufności. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane za zgodą Shaaya et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Metoda oświetlenia subkomórkowego przy użyciu światła niebieskiego w migracji komórek; schemat z wynikami analizy.
Rycina 4: Lokalna kontrola oświetlenia subkomórkowego i jej wpływ na aktywność FastLightR-Src. (A) Schematyczne przedstawienie układu eksperymentalnego lokalnej kontroli oświetlenia subkomórkowego. (B) (i) Sekwencja time-lapse ilustrująca komórkę HeLa wykazującą ekspresję FastLightR-Src-mCherry, lokalnie oświetloną światłem niebieskim (oznaczonym niebieskim okręgiem). Obrazy były rejestrowane w odstępach jednej minuty przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (obiektyw 60x). Obrazy przedstawiono jako obrazy o odwróconym kontraście, uzyskane w określonych odstępach czasu. (ii) Obrazy projekcyjne komórek wyświetlające wypustki utworzone w określonych odstępach czasu. Progowanie i maskowanie morfologii komórki w czasie trwania eksperymentu stanowi platformę do analizy rozprzestrzeniania się komórek i dynamiki ich krawędzi. Wyznaczony oświetlony obszar komórki jest obramowany niebieskim okręgiem. (C) (i) Wykres polarny dla komórek przedstawiający dystans migracji centroidu (d) oraz kąt odchylenia (θ) względem lokalnego oświetlenia światłem niebieskim. Czarne kropki reprezentują poszczególne komórki HeLa wykazujące ekspresję katalitycznie nieaktywnego D388RLightR-Src (N = 6 komórek) lub FastLightR-Src (N = 10 komórek). (ii) Schematyczne przedstawienie dystansu przesunięcia centroidu (d) przebytego przez centroid komórki od rozpoczęcia (1) do zakończenia (2) lokalnej stymulacji światłem niebieskim. Kąt odchylenia (θ) wskazuje stopień dywergencji ruchu centroidu komórki od miejsca naświetlania światłem niebieskim. Jasnoszare cieniowanie wskazuje obszar wypustki utworzonej przez komórkę w odpowiedzi na lokalną stymulację FastLightR-Src. Wyznaczony oświetlony obszar komórki jest wskazany pełnym niebieskim okręgiem. Panele B i C zostały zaadaptowane i zmodyfikowane na podstawie pracy Shaaya et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aktywacja mCherry-ERK2 indukowana światłem niebieskim; Western blot, mikroskopia, odpowiedź komórkowa w czasie.
Rysunek 5: Szerokie zastosowanie podejścia LightR. (A) Regulacja LightR-bRaf. Komórki LinXE przejściowo wyrażające LightR-bRaf-Venus, katalitycznie nieaktywny D575R LightR-bRaf Venus lub konstytutywnie aktywny bRaf (V600E)-Venus poddano ciągłemu naświetlaniu światłem niebieskim przez określony czas. W lizatach komórkowych badano fosforylację wskazanych białek. (B) Reprezentatywne obrazy uzyskane z serii time-lapse obrazowania żywych komórek z użyciem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej ilustrują regulację globalnej odpowiedzi na światło niebieskie w komórkach LinXE przejściowo ko-ekspresujących FastLightR-bRaf-Venus i mCherry-ERK2. Komórki te naświetlano globalnie światłem niebieskim (impulsy 50 ms co sekundę, 50 impulsów na minutę) przez określone przedziały czasu zaznaczone na niebiesko. Obrazowanie żywych komórek dla mCherry-ERK2 przeprowadzano co minutę. Żółte strzałki wskazują etapy lokalizacji jądrowej ERK2 indukowanej aktywacją zmodyfikowanego bRaf światłem niebieskim. (C) Komórki LinXE poddano przejściowej ko-transfekcji reporterem Floxed-stop-mCherry oraz LightR-Cre-iRFP670. Komórki utrzymywano w ciemności lub poddawano impulsowemu naświetlaniu światłem niebieskim (2 s włączone, 10 s wyłączone) przez maksymalnie 8 h. Obrazy dla wszystkich punktów czasowych każdego kanału pozyskano za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego (obiektyw 10x) przy identycznych ustawieniach i dostosowano do spójnych poziomów jasności i kontrastu, aby ułatwić porównanie poziomów ekspresji białek między próbkami. Eksperyment powtórzono co najmniej trzy razy, uzyskując podobne wyniki. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany na podstawie pracy Shaaya et al.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Sekwencja LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Opis miejsc insercji LightR oraz lista kontrolna projektowania białek LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Primery do klonowania LightR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Warunki transfekcji dla analizy biochemicznej aktywności białek LightR-Protein. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Warunki transfekcji dla analizy aktywności białek LightR w oparciu o obrazowanie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Oświetlenie impulsowe z wykorzystaniem zintegrowanego środowiska programistycznego (IDE). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Ustawienia oświetlenia mikroskopu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Nasze badanie przedstawia optogenetyczne podejście do badania różnych szlaków sygnałowych i wykazuje jego szerokie zastosowanie w rozwiązywaniu różnych problemów biologicznych. System narzędzi LightR zapewnia kilka istotnych korzyści: (1) allosteryczna regulacja aktywności białek, (2) ścisła kontrola czasowa aktywności, którą można dostroić w celu uzyskania różnej kinetyki aktywacji i inaktywacji, (3) przestrzenna rozdzielczość aktywności na poziomie subkomórkowym, (4) specyficzność modulacji sygnalizacji i aktywności biologicznej oraz (5) szeroki zakres zastosowania do różnych białek docelowych. Warto zauważyć, że LightR w unikalny sposób integruje wszystkie te korzyści w jednym narzędziu, zapewniając w ten sposób znaczący krok naprzód.

Konstrukcja LightR jako przełącznika allosterycznego ma kilka zalet. Zdolność LightR do kontrolowania aktywności białek po umieszczeniu w małej, elastycznej pętli zapewnia znaczną wszechstronność w zastosowaniu do różnych białek o różnych strukturach i funkcjach. Będąc przełącznikiem allosterycznym, LightR reguluje tylko domenę docelową białka będącego przedmiotem zainteresowania i nie wpływa na inne domeny białka. W związku z tym metoda ta pozwala na specyficzną regulację aktywności bez uszczerbku dla podstawowych funkcji białka, takich jak interakcje z jego partnerami wiążącymi lub natywna lokalizacja w komórkach. Dwuskładnikowe systemy optogenetyczne zostały z powodzeniem zastosowane do regulacji lokalizacji, interakcji lub innych podstawowych funkcji białek za pomocą kontroli homo- lub heterodimeryzacji za pośrednictwem światła 29,30,31,32,33,34,35. Jednak systemy te często wymagają zoptymalizowanej równomolowej ekspresji dwóch białek, co sprawia, że ich zastosowanie jest trudniejsze. Regulacja allosteryczna za pomocą systemu LightR jest osiągana w obrębie pojedynczego białka, a tym samym zapewnia znacznie bardziej wszechstronne podejście do badania sygnalizacji komórkowej.

Szeroki zakres zastosowań przełącznika LightR do różnych klas białek jest częściowo osiągnięty dzięki optymalizacji różnych modułów w domenie LightR. Łączniki łączące LightR z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania oraz łącznik łączący dwie domeny VVD w obrębie LightR (linker między VVD) mogą wpływać na skuteczność regulacji. Wybór elastycznego łącznika między VVD (GGS)4G(GGS)3 zapewnia wystarczającą elastyczność i długość, aby zapewnić asocjację i dysocjację monomerów VVD w domenie LightR. Ten łącznik zapewnił do tej pory skuteczną regulację wszystkich docelowych białek. Jednak w przypadkach, gdy domena LightR nie dezaktywuje wystarczająco białka w ciemności, można wprowadzić sztywniejszy łącznik, który utrzyma domeny VVD dalej od siebie, aby zwiększyć otwarcie zacisku LightR, utrzymując w ten sposób enzym nieaktywny. Łącznik powinien nadal zachowywać wystarczającą elastyczność, aby umożliwić dimeryzację VVD i aktywację docelowego białka. Aby połączyć LightR z interesującym nas białkiem, używamy krótkich elastycznych łączników, GPGGSGG i GSGGPG, dodanych do N- i C-końców domeny LightR. Zapewniają one wystarczającą elastyczność połączenia, zapobiegając w ten sposób nieodwracalnemu zakłóceniu docelowego białka. Są one jednak na tyle krótkie, że umożliwiają zniekształcenie docelowego białka w ciemności, jednocześnie ułatwiając przywrócenie funkcji białka w świetle. Te łączniki wspierają regulację przez LightR dla wielu zastosowań białkowych. Jednak w niektórych przypadkach, gdy te łączniki mogą nie zapewniać wystarczającej inaktywacji białka w ciemności, skrócenie łączników może być korzystne. Takie skrócenie łącznika może zmniejszyć elastyczność i zwiększyć zniekształcenia spowodowane przez otwarty zacisk LightR w ciemności, minimalizując w ten sposób wszelkie nieszczelności. Niemniej jednak ta regulacja może zagrozić maksymalnej aktywności enzymu ze względu na potencjalne zniekształcenia strukturalne w stanie zapalonym. Alternatywnie, zastąpienie wielu aminokwasów w pętli insercyjnej może zapewnić podobne korzyści w postaci zrównoważonej elastyczności w przypadkach, gdy niestabilność konformacyjna nie jest istotnym problemem.

Wiele krytycznych procesów sygnalizacyjnych jest aktywowanych przejściowo lub regulowanych w sposób oscylacyjny 36,37,38,39,40,41,42,43. Przestrajalność narzędzia LightR pozwala nam naśladować złożone wzorce sygnalizacji, a tym samym zapewnia potężne podejście do badania czasowo kontrolowanych procesów biologicznych. Osiągamy to poprzez modulację kinetyki wyłączenia LightR poprzez wprowadzenie mutacji I85V do obu domen VVD. Mutacja ta skraca okres półtrwania dimeru VVD w stanie ciemnym z 18 000 s do 780 s19, ułatwiając w ten sposób szybszą inaktywację enzymu FastLightR.

Kinetyka szybkiej inaktywacji umożliwia również regulację aktywności białek w rozdzielczości subkomórkowej. Enzymy LightR, o powolnej kinetyce, mogą utrudniać obserwację efektów aktywacji subkomórkowej z powodu wewnątrzkomórkowej dyfuzji aktywowanego konstruktu. Dzięki kinetyce fast-off każdy enzym FastLightR, który dyfunduje poza strefę lokalnego oświetlenia, zostanie szybko dezaktywowany. Poprzez selektywną aktywację określonych regionów subkomórkowych naukowcy mogą uzyskać wgląd w lokalne funkcje białek, aby lepiej zrozumieć ich udział w złożonych szlakach komórkowych i sieciach sygnałowych.

Chociaż FastLightR są nieocenione w ograniczonej przestrzennie i czasowo optycznej kontroli aktywności białek w komórkach, nadal istnieją zastosowania, w których pożądana może być kinetyka spowolnienia. LightR z kinetyką spowolnienia może zostać zastosowany w badaniach, w których wymagana jest trwała i zwiększona aktywność indukowana światłem niebieskim. Zastosowania te będą wymagały jedynie rzadkich impulsów świetlnych, aby utrzymać ciągłą aktywność optogenetyczną, minimalizując w ten sposób również problemy, takie jak fototoksyczność. Dla różnych scenariuszy szeroki zakres modyfikacji kinetycznych10,18 może być wdrażany samodzielnie lub w połączeniu ze sobą, aby zaoferować obiecujące rozwiązanie do dostrajania wydajności LightR w celu optymalizacji jego zastosowania dla konkretnego eksperymentu.

Możliwość zastosowania enzymów LightR zależy od ich zdolności do naśladowania funkcji biologicznych ich endogennych odpowiedników. W związku z tym bardzo ważne jest, aby ocenić ich specyficzność substratową, sygnalizację w dół i lokalizację subkomórkową. Specyficzność aktywności LightR-Src potwierdza się poprzez fosforylację substratów Src, w tym paxilliny i p130Cas22,23. FastLightR-Src przemieszcza się między obszarem okołojądrowym a ogniskowymi zrostami pod wpływem cyklicznego oświetlenia, powodując rozprzestrzenianie się komórek. Takie zjawisko z powodzeniem przypomina wcześniejsze obserwacje wykonane za pomocą natywnej kinazy Src i dodatkowo potwierdza skuteczność obecnego narzędzia w badaniu biologii Src 11,12,44,45,46,47. LightR-bRaf wykazuje również swoistość w celowaniu w kompleksy sygnałowe, takie jak kinazy MEK i ERK24,25. Dodatkowo, FastLightR-bRaf wykazuje cykliczne oscylacje wahadłowca jądrowego ERK w odpowiedzi na niebieskie światło, co jest znaną konsekwencją aktywacji bRaf28. Zdolność enzymów LightR do ścisłego naśladowania funkcji białek endogennych stanowi nieocenione narzędzie do badania ich funkcji.

Powyższa dyskusja przedstawia zdolność kinaz LightR do replikacji precyzyjnych szlaków sygnalizacji komórkowej w określonych przedziałach komórkowych. Zgodnie z takim sukcesem kinaz, LightR-Cre służy jako model ilustracyjny demonstrujący funkcjonalność oryginalnej rekombinazy Cre pochodzącej z bakteriofaga P1. Rekombinaza Cre należy do rodziny integraz rekombinaz specyficznych dla miejsca i działa poprzez ułatwianie rekombinacji między dwoma miejscami rozpoznawania zwanymi loxP na docelowym DNA. Taka rekombinacja powoduje rearanżację DNA poprzez zdarzenie crossover. W oparciu o kierunkową orientację miejsca loxP na docelowym DNA, zdarzenie skrzyżowania może prowadzić do delecji, duplikacji lub translokacji elementów chromosomowych48. Rekombinaza Cre jest szeroko stosowana do generowania modeli in vivo indukowalnej regulacji genów49,50. Jednak inne spontaniczne, chemicznie indukowane lub optogenetycznie indukowane systemy rekombinazy cre zapewniają ograniczoną kontrolę nad tym, kiedy i gdzie rekombinacja DNA jest indukowana w modelu zwierzęcym. LightR-Cre pokonuje te ograniczenia, umożliwiając ścisłą czasową i przestrzenną kontrolę rekombinacji DNA. Co więcej, możliwość przestrajania LightR pozwala nam wyeliminować niepożądaną nieszczelność i zapewnić regulację Cre z wysoką precyzją. Możliwości te otwierają nowe możliwości w zakresie modelowania patologii chorób i opracowywania nowych metod leczenia.

Precyzyjna regulacja LightR w kinazach i rekombinacji DNA stanowi kolejny dowód na to, że narzędzie to można zastosować do kilku białek przy użyciu tej samej strategii. Oprócz aktywacji różnych klas enzymów, LightR może być potencjalnie przyłączany do innych typów białek, gdzie modulacja allosteryczna może być wykorzystana do lokalizacji białek w określonych regionach subkomórkowych, indukowania interakcji białko-białko, inżynierii biosensorów indukowanych niebieskim światłem i nie tylko. Ze względu na allosteryczne zalety celowania w specyficzną domenę, LightRs można również łączyć z innymi podejściami chemogenetycznymi i optogenetycznymi w tym samym białku, aby osiągnąć wyższy stopień przestrajania do badania procesów biologicznych.

Z powodzeniem zastosowaliśmy LightR do wielu innych białek (manuskrypty w przygotowaniu). Pomimo tego sukcesu, opracowanie funkcjonalnego białka LightR może napotkać potencjalne wyzwania, szczególnie w zakresie wyboru odpowiedniego miejsca insercji i dokładnego naśladowania funkcji biologicznej białka docelowego. Gdy struktura krystaliczna jest niedostępna, naukowcy muszą polegać na przewidywanych strukturach lub informacjach o sekwencji aminokwasów, co wymaga dalszych działań związanych z rozwiązywaniem problemów w celu inżynierii białek z wieloma miejscami insercji lub podstawieniami aminokwasów. Ponadto zmodyfikowana aktywność białka musi być precyzyjnie dostrojona, aby dokładnie odtworzyć funkcję biologiczną w komórce. Powodzenie tych eksperymentów zależy od precyzyjnej funkcjonalnej mimikry zmodyfikowanego białka, z jego endogennym homologiem, który często wymaga rygorystycznego rozwiązywania problemów i może się różnić w zależności od typu komórki, klasy białka docelowego i typu, a także siły i czasu trwania aktywacji światła niebieskiego.

Podsumowując, system LightR stanowi potężne narzędzie do osiągnięcia precyzyjnej czasoprzestrzennej kontroli nad funkcją białek. Jego solidność, możliwość przestrajania i wszechstronność sprawiają, że jest nieoceniony w badaniu złożonych procesów komórkowych, odkrywaniu szlaków sygnałowych i wyjaśnianiu mechanizmów regulacji genów. Zapewniając naukowcom bezprecedensową kontrolę nad aktywnością białek, system LightR może przyczynić się do pogłębienia naszej wiedzy na temat podstawowych procesów biologicznych i utorowania drogi dla innowacyjnych interwencji terapeutycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Markowi Shaaya za jego wkład w rozwój enzymów LightR i związanych z nimi protokołów. pCAG-iCre był prezentem od Wilsona Wonga (plazmid Addgene #89573), pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry był prezentem od Mositoshi Sato (plazmid Addgene #122963), konstrukt bRaf-Venus z mutacją V600E był prezentem od Dr. Johna O'Bryana (MUSC); Gen ERK2 z pCEFL-ERK2 (prezent z laboratorium dr Channinga Dera, UNC) został sklonowany do szkieletu mCherry-C1 w celu uzyskania plazmidu mCherry-ERK2; a pmiRFP670-N1 był prezentem od Vladislava Verkhusha (plazmid Addgene # 79987). Prace były wspierane przez granty NIH R33CA258012, R35GM145318 i P01HL151327 dla AK. Prace te były dodatkowo wspierane przez stypendium szkoleniowe T32 VBST T32HL144459 dla Holandii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#1.5 Szkiełka nakrywkowe szklane 25 mm okrągłeWarner Instruments 64-0715 
Probówki 1,5 ml Amerykański Naukowiec cc7682-3394
2x BuforNa 500 ml: 5,18 g  Tris-HCL, 131,5 ml glicerolu, 52,5 ml 20% SDS, 0,5 g błękitu bromofenolowego, końcowe pH 6,8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żelBiorad4561096
5x Phusion Plus Buffer Thermo Scientific F538L
60 LED Mikroskop Lampa pierścieniowaBoli OptykaML46241324Niebieska dioda LED, średnica 60 mm, 5 W
Agaroza GoldBiotechA-201
Przeciwciało anty-Erk 1/2Sygnalizacja komórkowa9102
Przeciwciało anty-GAPDHinvitrogenAM4300
Anty-GFPClontech632380
Przeciwciało anty-mCherryinvitrogenM11217
Sygnalizacja komórkowaanty-MEK9122
Anty-p130CasBD Biosciences610271
Sygnalizacja komórkowaanty-paksyliny2542
Anty-phospho-erk 1/2 T202 / Y204Sygnalizacja komórkowa9101
Anty-fosfo-pY249 Sygnalizacja komórkowa p130Cas4014
Anty-fosfo-Y118Sygnalizacja komórkowa2541
Anto-phospho-S217/221 Komórka MEK Sygnalizacja9121
Zasilacz kompatybilny z ArduinoKomputer korporacyjnyLJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎
Komora komórkowa AttofluorinvitrogenA7816
Wzorcowa płodowa surowica bydlęca (FBS) Gemini Bio-products100-106Inaktywowany termicznie potrójny 0,1 i mikro; m sterylnie filtrowane 
bRaf-V600E-VenusPrezent od dr Johna O'Bryana, MUSC
BSA GoldBiotechA-420 
Carbenicillin (Disodium)Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask Deep Red barwnik błony plazmatycznejinvitrogenc10046
Colony Screen MasterMix Genesee42-138
Kompetentne komórki DH5a NEB C2987H
DMEM Corning 15-013-CV
Drabina DNA GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
Enzym DPN1 NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-Dithiothreitol, Odczynniki Clelanda 
EGTAAcros 
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
Fibronektyna z osocza bydlęcego Sigma F1141
Odczynnik do transfekcji FuGENE(R) 6 PromegaE2692Odczynnik do transfekcji
Żel Zielony barwnik kwasu nukleinowego GoldBioG-740-500
Barwnik w żelu fioletowy 6x NEBB7024A Zestaw do ekstrakcji żelu
GeneJET Thermo Scientific K0692Zestaw do ekstrakcji żelu 
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Scientific K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l (100x) 100 mL 
Ogniwa HEK 293T ATCC CRL-11268
Komórki HeLa ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Przekaźnik IoTRejestratory cyfroweDLI 705020645490Przekaźnik sterujący AC/DC do oświetlenia
Monosiarczan Kanamycyny ZłotoBiotechnologiaK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1xCorning 10-045-CV 
LB Agar FisherBP1425-2
LED Grow Light SystemHQRP884667106091218System lamp panelowych LED 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024aOprogramowanie do uruchamiania skryptów CellGEO
analizy obrazowaniamolekularnychMetamorph
MgCl2 Fisher ChemicalM33-500
Olej mineralnySigma Zestaw M5310
MiniPrep Wybór genów 96-308
Prefabrykowane żele Mini-PROTEAN TGX 12 dołkówBio-Rad4561085
Klasa biologii molekularnej Woda Corning 46-000-CV 
Wielopasmowe lustro polichroiczne89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
PBS bez Ca i Mg Corning 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2Prezent od laboratorium dr Channinga Dera,
probówki UNC PCR labForce1149Z650,2 ml 8-paskowe probówki i nakrętki, sztywne paski indywidualnie mocowane kołpaki kopułkowe 
Phusion Plus Polimeraza DNAThermo Scientific F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Wielokąt 400 Wzorzysty oświetlaczMightexDSI-G-00C
Podkłady IDT
PVDFBioRad1620219Immun-Blot PVDF/Filter Paper Kanapki 
T0,25% Trypsyna, 2,21 mM, eDTA, 1x [-] korzennik sodu 25-053-CI
Tris-octan-EDTA (TAE) 50x Fischer BP1332-1 Do elektroforezy 
UPlanSApo 40x Mikroskop ObiektywOlympus1-U2B828
USB TTL BoxNational Instruments6501Do interfejsu TTL
i beta;-MerkaptoetanolFisher Chemical O3446I-100
Laemmli przeciwciała Paxillin A000066409910250Oprogramowanie do urządzeń Membrany

Bibliografia

  1. Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
  2. Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
  3. Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
  4. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  5. Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
  6. Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788(2020).
  7. Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
  8. Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
  9. Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
  10. Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647(2020).
  11. Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
  12. Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
  13. Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
  14. Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50(2011).
  15. Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
  16. Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
  17. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  18. Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
  19. Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
  20. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256(2015).
  21. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  22. Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
  23. Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12(2009).
  24. Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
  25. Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
  26. Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
  27. Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
  28. Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
  29. Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024(2018).
  30. Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042(2018).
  31. Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
  32. Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
  33. Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141(2020).
  34. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
  35. Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708(2020).
  36. Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
  37. Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
  38. Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
  39. Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
  40. Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354(2017).
  41. Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
  42. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  43. Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
  44. Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
  45. Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
  46. Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
  47. Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
  48. Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509(2021).
  49. Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
  50. Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja optogenetycznadomena LightRaktywacja wiat em niebieskimkontrola kinazy bia kowejprecyzja subkom rkowamigracja kom rekadhezje ogniskowe
Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.