Artykuł metodologiczny

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET do obserwacji dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy

DOI:

10.3791/67263

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcje białek nadrodziny dynamin zależą od zmian konformacyjnych sprzężonych z hydrolizą GTP. System opisano za pomocą techniki jednocząsteczkowego FRET (smFRET) do monitorowania dynamiki konformacyjnej atlastyny GTPazy podobnej do dynaminy w różnych stanach obciążenia nukleotydami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rotacja ciała sztywnego w centralnej domenie trójhelisowej (3HB) względem domeny GTPazy atlastyny białka podobnego do dynaminy (ATL) jest kluczowym czynnikiem powodującym homotypową fuzję błonową w retikulum endoplazmatycznym (ER). Zakłócenia w tym procesie są związane z dziedziczną paraplegią spastyczną (HSP), zaburzeniem neurodegeneracyjnym. Badania strukturalne i biochemiczne sugerują, że zmiany konformacyjne w ATL są związane z hydrolizą GTP, ale wizualizacja tej dynamiki konformacyjnej w czasie rzeczywistym podczas cyklu hydrolizy GTP pozostaje wyzwaniem. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy mechaniczne stojące za funkcją ATL, wykorzystano jednocząsteczkowy transfer energii rezonansu Förstera (smFRET). Zastosowano trzy specyficzne strategie w celu unieruchomienia N-końcowego regionu cytozolowego ludzkiego ATL1 (ATL1cyto) w komorze mikroprzepływowej pokrytej streptawidyną, ułatwiając zastosowanie wewnątrzcząsteczkowego i międzycząsteczkowego obrazowania smFRET. Umożliwiło to precyzyjne monitorowanie konformacji białek w różnych stanach obciążenia nukleotydami, zapewniając bezpośredni wgląd w indywidualne zachowania molekularne. Metoda ta może być również stosowana do badania innych białek mechanochemicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W komórkach eukariotycznych białka nadrodziny dynamin pośredniczą w przebudowie błon biologicznych, w tym kanalikach błonowych, rozszczepieniu i fuzji1,2,3. Mutacje w tych białkach prowadzą do różnych chorób ludzkich, takich jak choroby neurodegeneracyjne. Członkowie nadrodziny dynamin zazwyczaj zawierają domenę GTPazy, domenę środkową składającą się z wiązek spiralnych, motyw wiązania błony i domenę efektorową GTPazy (GED). Jedną z takich dynaminopodobnych GTPazy jest atlastyna (ATL), która katalizuje homotypową fuzję błonową retikulum endoplazmatycznego (ER) w celu utworzenia sieci4,5,6,7,8,9,10. U ssaków występują trzy ATL (ATL1-3). Cząsteczka ATL składa się z N-końcowego regionu cytozolowego (cyto ATL), w tym domeny GTPazy i centralnej domeny o trzech helikach (3HB), po której następują dwa regiony transbłonowe, ale brakuje typowego GED. Alternatywnie, ATL zawiera ogon C-końcowy, który odgrywa kluczową rolę w fuzji membranowej11,12,13.

Stwierdzono, że efektywna fuzja membranowa opiera się na zależnym od hydrolizy GTP przegrupowaniu domeny w ATLcyto14,15,16,17,18,19,20. Jednak w porównaniu z kompleksem SNARE, który wykorzystuje energię fałdowania ze zmian konformacyjnych do napędzania heterotypowej fuzji błonowej21, homotypowy proces fuzji błonowej, w którym pośredniczy ATL i inne specyficzne dla fuzji białka podobne do dynaminy22 pozostaje nieuchwytny. Trzy struktury krystaliczne ludzkiegocyto ATL1 zostały określone w różnych warunkach obciążenia nukleotydami14,15,16,23. W strukturach te dwa 3HB w dimerze są skierowane w różnych kierunkach, ale nadal brakuje kompleksowego modelu wyjaśniającego, w jaki sposób dynamika konformacyjnacyto ATL i jego aktywność GTPazy są sprzężone.

W poprzednim modelu, monomeryczne cząsteczki ATL tworzą dimery na różnych błonach w sposób zależny od GTP, aby napędzać fuzję błonową. W tym miejscu opisano trzy strategie zastosowania jednocząsteczkowego transferu energii rezonansu Förstera (smFRET) do bezpośredniej obserwacji i dokładnego wykrywania zachowania poszczególnych cząsteczekcyto ATL1. smFRET to potężna technika szeroko wykorzystywana do badania dynamiki konformacyjnej i interakcji poszczególnych biomolekuł w czasie rzeczywistym, takich jak aktywacja β-aresztyny za pośrednictwem GPCR24, przebudowa chromatyny przez Snf225 oraz rearanżacje domen białka podobnego do dynaminy MxA w połączeniu z cyklami hydrolizy GTP26. Ponieważ smFRET może skutecznie wykrywać zmiany odległości tylko od ~3 nm do ~8 nm, zarówno międzycząsteczkowe, jak i wewnątrzcząsteczkowe eksperymenty smFRET są wymagane do kompleksowej analizy konformacjicyto ATL1 dla każdego stanu obciążenia nukleotydami. Wygenerowano trzy konstruktycyto ATL1 ze wszystkimi natywnymi cysteinami podstawionymi alaninami i K400 (ATL1 cyto-K) lub parą T51 / K400 (ATL1 cyto-TK) zmutowaną do cysteiny w celu znakowania fluoroforu. Strategie unieruchamianiacyto dimeru lub monomeru ATL1 w komorze mikroprzepływowej pokrytej streptawidyną (Rysunek 1A) dla międzycząsteczkowych lub wewnątrzcząsteczkowych eksperymentów smFRET są pokazane w Rysunek 1B-D. Metoda ta dostarcza więcej szczegółów na temat dynamiki konformacyjnej białek podobnych do dynaminy na każdym etapie hydrolizy GTP27.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zmodyfikowanego szkiełka nakrywkowego do komory immobilizacji białek

  1. preparat
    1. Przygotuj 50 ml roztworu piranii (skomponowanego ze stężonego kwasu siarkowego i nadtlenku wodoru w stosunku 3:1), powoli dodając nadtlenek wodoru do stężonego kwasu siarkowego, aby zapobiec nadmiernym temperaturom. Umieść go ostrożnie w dygestorium.
    2. Przygotować roztwór etoksydu sodu. Rozpuść 2 g NaOH w 15 ml ddH2O, dodaj 35 ml absolutnego etanolu i całkowicie wymieszaj. Pozostaw w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować roztwór o wysokiej zawartości soli (0,1 MNaHCO3 i 0,6 MK2SO4). Rozpuścić całkowicie i podać do podwielokrotności 500 μl/probówkę. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Podwielokrotność SVA-mPEG i SVA-mPEG-biotyny w ilości około 30 mg na probówkę i 3 mg na probówkę. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Dostosuj szkiełka mikroskopowe (75 mm × 26 mm × 1 mm) za pomocą 6 par otworów o średnicy 1,2 mm.
  2. Czyszczenie powierzchni szkiełka nakrywkowego
    1. Użyj pęsety, aby zebrać osiem szkiełek nakrywkowych i umieścić je w słoiku do barwienia. Dodaj aceton (~50 ml), aby przykryć szkiełka nakrywkowe, umieść słoik do barwienia w myjce ultradźwiękowej na 30 minut, a następnie spłucz szkiełka nakrywkowe trzykrotnie ddH2O.
    2. Umyć szkiełka nakrywkowe metanolem, jak w kroku 1.2.1.
    3. Dodać roztwór piranii (krok 1.1.1) do słoika do barwienia i podgrzewać go w czajniku z łaźnią wodną o temperaturze 95 °C przez 2 godziny. Po ostygnięciu słoika do barwienia do temperatury pokojowej spłukać szkiełka nakrywkowe co najmniej sześć razy za pomocą ddH2O.
    4. Roztwór etoksydu sodu dodać do słoika do barwienia, umieścić go w myjce ultradźwiękowej na 15 minut, a następnie spłukać trzykrotnie ddH2O.
    5. Dodaj ddH2O do słoika do barwienia, aby przykryć szkiełka nakrywkowe, umieść w myjce ultradźwiękowej na 15 minut, a następnie spłucz 3 razy ddH2O.
  3. Modyfikacja aminozylanizacji powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    1. Zaciśnij szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia na czystej ławce, osusz je azotem i włóż do innego słoika do barwienia (wcześniej wysuszonego).
    2. Słoik do barwienia piec w suszarce w temperaturze 120 °C przez 30 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze.
    3. Dodać 47,5 ml metanolu, 2,5 ml kwasu octowego i 0,5 ml 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES) do zlewki (wcześniej wysuszonej), równomiernie wymieszać, dodać do słoika do barwienia i inkubować przez 10 minut.
    4. Opłucz szkiełka nakrywkowe w słoiku do barwienia ddH2O co najmniej trzy razy i poddaj sonikacji przez 5 minut.
    5. Szkiełka nakrywkowe wyjmować jeden po drugim, spłukać ddH2O, wysuszyć azotem i umieścić na szalce Petriego o średnicy 10 cm, aby przygotować się do modyfikacji PEG.
      UWAGA: Modyfikacja APTES musi być przeprowadzana w suchym środowisku.
  4. Modyfikacja powierzchni szkiełka nakrywkowego za pomocą SVA-mPEG-Biotyna i SVA-mPEG
    UWAGA: Modyfikacja powierzchni szkiełka nakrywkowego biotyną pomaga zatrzymać biotynylowane białka (lub białka wiążące się z anty-His-biotyną) za pośrednictwem streptawidyny.
    1. Całkowicie rozpuścić zapakowane SVA-mPEG i SVA-mPEG-Biotyna w roztworze o wysokiej zawartości soli (1 mg odpowiada 10 μl roztworu o wysokiej zawartości soli). Dodać roztwór SVA-mPEG-Biotyna do roztworu SVA-mPEG w stosunku 1:100,
      UWAGA: Użyj wiru, aby wstrząsnąć roztworem, aby upewnić się, że SVA-mPEG lub SVA-mPEG-Biotyna są całkowicie rozpuszczone. Wodny roztwór SVA-mPEG lub SVA-mPEG-Biotin należy przygotować przed użyciem.
    2. Upuść przygotowany roztwór mieszanki na szkiełko nakrywkowe i przykryj go innym szkiełkiem nakrywkowym. Proces ten powinien zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Szkiełka nakrywkowe należy inkubować w pełni przy odpowiedniej wilgotności przez ponad 2 godziny lub przez noc.
    3. Po zakończeniu modyfikacji oddziel szkiełka nakrywkowe, spłucz je ddH2O i wysusz azotem. Zaznaczyć powierzchnię szkiełka nakrywkowego, która nie została zmodyfikowana za pomocą SVA-mPEG i SVA-mPEG-biotyny.
    4. Ostrożnie umieścić zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe w probówce mikrowirówkowej o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C po odkurzaniu.
      UWAGA: Zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe można przechowywać w próżni przez 1 miesiąc.

2. Przygotowanie preparatów mikroskopowych do komory immobilizacji białek

  1. Umyć szkiełka mikroskopowe zgodnie z opisem dla szkiełek nakrywkowych w kroku 1.2.
  2. Przedmuchaj szkiełka mikroskopowe do sucha azotem i umieść je w probówkach do mikrowirówek o pojemności 50 ml.
  3. Przechowuj szkiełka mikroskopowe zgodnie z opisem w kroku 1.4.4.

3. Ekspresja i oczyszczanie białek

  1. preparat
    1. Plazmidy: Sklonuj członka rodziny atlastyny lub patogenną mutację będącą przedmiotem zainteresowania w bakteryjny wektor ekspresyjny, na przykład pET-28a, i dodaj klasę Avitag27. Wprowadź cysteiny w odpowiednich pozycjach za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce (na przykład T51C i K400C27).
    2. Przygotuj następujące.
      1. Pożywka hodowlana Luria-Bertani (LB): Zmieszać 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g chlorku sodu w 1 l ddH2O. Autoklaw w temperaturze 121°C przez 20 min.
      2. Bufor do lizy: Wymieszaj 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1x kompletny koktajl inhibitorów proteazy wolny od EDTA, 10 mM imidazolu i 0,5 mM TCEP. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      3. Bufor do przemywania : Wymieszaj 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 30 mM imidazolu i 0,5 mM chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      4. Bufor elutowy: Wymieszaj 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 150 mM imidazolu i 0,5 mM TCEP. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
      5. Bufor oczyszczający: 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,5 mM TCEP. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Oczyszczanie białek
    1. Przenieś plazmidy27 do komórek E. coli Rosetta (DE3) (Biomed) przy użyciu metod szoku cieplnego transformacji bakteryjnej. Zawiesić przeniesione komórki w pożywce hodowlanej LB z dodatkiem końcowego stężenia 50 μg/μl kanamycyny.
      1. Hodowlę w temperaturze 37 °C do momentu, gdy absorbancja pożywki przy długości fali 600 nm wyniesie 0,6–0,8. Dodać izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) w końcowym stężeniu 50 μM w celu wywołania ekspresji białka w temperaturze 16 °C przez 20–24 godz.
        UWAGA: Szybkość wzrostu kultur komórkowych bakterii lub innych drobnoustrojów można monitorować, mierząc gęstość optyczną (absorbancję) kultury wzrostu komórek przy długości fali 600 nm.
    2. Zbierać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 30 ml buforu do lizy. Rozerwij ogniwa trzykrotnie za pomocą wysokociśnieniowej kruszarki do komórek.
    4. Klarować lizaty przez odwirowanie w temperaturze 2 000 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C przy użyciu wirnika ultrawirówkowego.
    5. Wyizolować białko za pomocą kolumny Ni-NTA. Przemyć kolumnę Ni-NTA buforem do płukania na 5 objętości kolumny. Białko elutyczne z buforem elucyjnym na objętość 1 kolumny. Zebrać eluat i zagęścić za pomocą filtrów odśrodkowych do ~ 500 μL.
    6. Następnie oczyść białko za pomocą chromatografii wykluczania wielkości27. Zebrać eluat (500 μl na probówkę).
    7. Potwierdź białko docelowe za pomocą jego masy cząsteczkowej określonej metodą elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE)27. Zbierz białko docelowe do dalszej modyfikacji.

4. Biotynylacja białek

  1. preparat
    1. Przygotuj następujące roztwory podstawowe.
      1. Rozpuścić tetrahydrat octanu magnezu (MgOAc·4H2O) w 25 mM buforu HEPES (pH 7,7) w stężeniu 100 mM (10×). Podaniec 100 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      2. Rozpuścić sól disodową adenozyno-5-trifosforanu (ATP) w ddH2O w stężeniu 100 mM (10×). Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Podaniec 100 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      3. Rozpuścić d-biotynę w ddH2O w stężeniu 500 μM. Podwielokrotność 100 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      4. Rozpuścić streptawidynę w ddH2O w stężeniu 1 mg/ml. Podwielokrotność 20 μl na probówkę i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Bufor biotynylacyjny białka: Dodaj 25 mM HEPES (pH 7,7), 200 mM kwasu L-glutaminowego potasu i 0,5 mM TCEP. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Oczyść ligazę biotyny BirA i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  2. Biotynylacja białek
    1. Zmień bufor białkowy na bufor biotynylacji białek. Do biotynylacji zmieszać 100 μl 100 mM ATP, 100 μl 100 mM MgOAc, 100 μl 500 μM d-biotyny, 10 μl 100 μM ligazy biotyny BirA, 50 μM białka do końcowej objętości 1 ml i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Usuń wolną d-biotynę za pomocą filtra odśrodkowego 10 K MWCO.
    3. Inkubować 20 μl biotynylowanego białka z 20 μl 15 μM streptawidyny przez 20 minut na lodzie. Wykrywanie skuteczności biotynylacji białek za pomocą SDS-PAGE27.

5. Znakowanie fluoroforów białkowych

  1. preparat
    1. Rozpuścić fluorofory LD555 (donor) i LD655 (akceptor) w dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia 5 mM. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotuj bufor do etykietowania: Wymieszaj 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl i 5 mM MgCl2. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    3. Zmień bufor białkowy na bufor znakujący.
  2. Znakowanie fluoroforem
    1. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET zmieszaćATL1 cyto-TK z LD555 i LD655 w stosunku 1:1,2:1,2 do końcowej objętości 100 μl (całkowita objętość fluoroforów nie powinna przekraczać 1 μl) i inkubować przez 5 godzin w temperaturze 4 °C.
    2. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET inkubowaćATL1 cyto-K lub ATL1cyto-T z LD555 w stosunku 1:1,2 i jednocześnie inkubować biotynylowanyATL1 cyto-K z LD655 w stosunku 1:1,2, przez 5 godzin w temperaturze 4 °C (taka sama objętość inkubacji jak w 5.2.1).
      UWAGA: Jednoczesna inkubacja białek i barwników pozwala na elastyczność w pozycjach znakowania dla LD555 (dawca) i LD655 (akceptor). Fakt, że LD555 jest oznaczony jako T51C lub K400C, nie ma wpływu na wyniki eksperymentu FRET. Schemat ideowy dawcy oznaczanego w miejscu T51C jest dostarczony (Rysunek 1C,D).
    3. Usuń nadmiar wolnych fluoroforów za pomocą kolumn odsalających wirowych 7 K MWCO27.
    4. Dodać TCEP do białek znakowanych fluoroforem w końcowym stężeniu 0,5 mM.
    5. Wykryj skuteczność znakowania białek za pomocą spektrofotometru. Zmierz absorbancję białka przy 280 nm, absorbancję LD555 przy 555 nm i absorbancję LD555 przy 655 nm i oblicz stężenia molowe, używając odpowiednio ich współczynników ekstynkcji. Skuteczność znakowania białek = (stężenie molowe barwnika fluorescencyjnego/stężenie molowe białka) x 100%.

6. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek FRET

  1. preparat
    1. Przygotować bufor do inkubacji: zmieszać 25 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM KCl i 5 mM MgCl2. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 1 mg/ml streptawidyny (rozpuszczonej w ddH2O) i 1 mg/ml biotynylowanego przeciwciała anty-He do immobilizacji białek.
    3. Przygotować 25 mM kwasu benzoesowego (pH 7,4; rozpuszczony w buforze zgodnie z opisem w 7.1.1) i 100 mM protokatechuianu 3,4-dioksygenazy (PCD) (rozpuszczonej w 40% roztworze gliceryny) w celu zminimalizowania fotowybielania podczas eksperymentów smBRET.
    4. Przygotować 100 mM soli sodowej 5'-difosforanu guanozyny (GDP), 5'O-[gamma-tio]trifosforanu guanozyny (GTPγS) i roztworów podstawowych AlCl3 rozpuszczonych w ddH2O. Przygotować 1 M roztworu podstawowego NaF rozpuszczonego w ddH2O.
    5. Wyjmij zakonserwowane próżniowo szkiełko nakrywkowe i szkiełko mikroskopowe i ostrożnie sklej je ze sobą za pomocą niestandardowej taśmy dwustronnej na czystej stole. Zainstaluj węże i końcówki, aby utworzyć komorę mikroprzepływową z sześcioma kanałami27.
      UWAGA: Nie wystawiaj zmodyfikowanego szkiełka nakrywkowego na działanie powietrza przez dłuższy czas. Przygotuj komorę mikroprzepływową27 przed rozpoczęciem eksperymentów smFRET.
  2. Korekta mapowania
    UWAGA: Podczas eksperymentu sygnały fluorescencyjne mają być zbierane odpowiednio z kanału donorowego i akceptorowego. Ze względu na zastosowanie mikroskopów mogą wystąpić niewielkie odchylenia w polach monitorowania kanałów dawczych i akceptorowych. W celu zmniejszenia odchylenia w polach monitorowania, przed rozpoczęciem eksperymentu należy przeprowadzić kalibrację mapowania.
    1. Dokładnie wymieszać 10% cząstek polistyrenu (średnica 3 μm), dodać 10 μl cząstek do szkiełka mikroskopowego (niemodyfikowanego) i przykryć szkiełkiem nakrywkowym (niemodyfikowanym).
    2. Wybierz pole view z jak największą liczbą cząstek polistyrenu. Uchwyć film w jasnym polu za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF).
      UWAGA: Do obrazowania w wysokiej rozdzielczości użyto obiektywu immersyjnego z olejkiem o dużej aperturze numerycznej (100x). W eksperymentach smFRET sygnały rejestrowano w odstępach 30 ms za pomocą kamery EMCCD.
    3. Użyj niestandardowego skryptu, aby wyrównać środkowe położenie tej samej cząstki polistyrenu w kanale dawczym i kanale akceptora, a następnie zapisz plik mapy jako plik txt. Niestandardowy kod MATLAB użyty w tym badaniu jest dostępny pod adresem https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET).
  3. Unieruchomienie białek w komorze
    1. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET należy zmieszać znakowaną LD555cytozyto-K ATL1 lubcyto-T ATL1 icytyto-K-biotynę ATL1 znakowaną LD655 w stosunku 1:1 z końcowym stężeniem 1 mM GTPγS lub GDP/AlF4- i inkubować przez 1 godzinę na lodzie w celu dimeryzacji białka.
    2. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRETcyto-T ATL1 i ATL1cyto-K należy zmieszaćcyto-T ATL1 znakowaną LD555 icyto-K-biotynę ATL1 znakowaną LD655 w stosunku 1:1 z końcowym stężeniem 1 mM GTPγS lub GDP/AlF4- i inkubować przez 1 godzinę na lodzie w celu uzyskania dimeryzowanych białek.
    3. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET należy inkubowaćcyto-TK ATL1 znakowane LD555 i LD655 z 1 mM GDP przez 1 godzinę na lodzie przed wykonaniem eksperymentów smFRET w warunkach GDP.
    4. W przypadku międzycząsteczkowych eksperymentów smFRET inkubować 10 μg/ml streptawidyny (rozcieńczonej 200 μl buforem inkubacyjnym) przez 10 minut w celu unieruchomienia białek. W przypadku wewnątrzcząsteczkowych testów smFRET dodać 10 μg/ml biotynylowanego przeciwciała anty-He (rozcieńczonego 200 μl buforem do inkubacji) i inkubować przez 10 minut w celu unieruchomienia białek. Przepłukać kanał raz buforem inkubacyjnym przed dodaniem każdego roztworu.
    5. Rozcieńczyć dimer ATL1 do ~0,3 nM lub monomer do ~1 nM w buforze inkubacyjnym o pojemności 200 μl i inkubować przez 10 minut w celu unieruchomienia białek w kanale. Przepłukać kanał buforem inkubacyjnym dwukrotnie. Dodać kwas benzoesowy i PCD do kanału w końcowym stężeniu 2,5 mM (rozcieńczony buforem 200 μl).
      UWAGA: Aby zasymulować różne etapy cząsteczekcyto ATL1 w procesie hydrolizy GTP, nukleotydy (GDP, GTPγS i GDP/AlF4-) dodawano w końcowym stężeniu 1 mM do w każdym kroku po unieruchomieniu białka w kanale. Dodawanie GTPγS naśladuje wiązanie GTP, GDP/AlF4- naśladuje hydrolizę GTP, dodawanie GDP naśladuje uwalnianie Pi, a apo sate reprezentuje uwalnianie GDP.
  4. Obrazowanie smFRET
    1. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej. Użyj pokręteł zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości, wyreguluj płaszczyznę ogniskowej, aby uzyskać ostrość próbki. W tym przypadku zastosowano zautomatyzowany system ustawiania ostrości, aby uzyskać optymalną ostrość.
    2. Skonfiguruj źródło wzbudzenia. Użyj lasera 532 nm jako źródła światła wzbudzenia. Dostosuj moc lasera do odpowiedniego poziomu, aby wzbudzić fluorofory. Tutaj zastosowano moc lasera 20-40 mW.
    3. Podłącz kamerę EMCCD do mikroskopu. Ustaw aparat tak, aby nagrywał w odstępie między klatkami 30 ms. Upewnij się, że kamera jest ustawiona na przechwytywanie obrazów w trybie 16-bitowym w celu uzyskania danych o wysokiej rozdzielczości.
    4. Nagraj film, upewniając się, że ostrość pozostaje stabilna przez cały czas akwizycji. Wydłuż czas naświetlania laserem 532 nm tak długo, jak to możliwe, aż większość cząsteczek fluorescencyjnych zostanie wygaszona podczas rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych.
    5. Zapisz nagrane filmy w 16-bitowym formacie TIFF do dalszej analizy.

7. Akwizycja i analiza danych

  1. Załaduj plik txt mapy w celu korekty przed wyodrębnieniem trajektorii FRET z nagranych filmów. Wybierz trajektorie FRET i zapisz wszystkie dane trajektorii FRET w formacie txt do dalszej analizy.
  2. Wyodrębnij dane z plików txt i oblicz wartości FRET za pomocą domowych skryptów w Matlab2022a. Niestandardowy kod MATLAB jest dostępny pod adresem https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET.
    UWAGA: Wartość FRET oblicza się za pomocą równania ILD655/(γILD555+ILD655). ILD555 i ILD655 reprezentują odpowiednio intensywność fluorescencji LD555 i LD655. γ jest parametrem otrzymanym wzorem γ = FA/FD. FA oznacza spadek intensywności dawcy, a FD jest przyrostem intensywności dawcy.
  3. Dopasuj dane smFRET według GaussAmp w Origin 2022, aby uzyskać histogram rozkładu.
    UWAGA: W przypadku danych z wieloma stanami FRET (dane w warunku GTPγS w międzycząsteczkowym smFRET lub dane wewnątrzcząsteczkowego smFRET w warunku GDP lub Apo), można zastosować dopasowanie wielopikowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty smFRET zostały przeprowadzone na mikroskopie TIRF, rejestrując intensywność fluoroforów co 30 ms. Reprezentatywne obrazy znakowanych LD555 (dawca) i/lub LD655 (akceptor) cząsteczkamicyto ATL1 przy braku lub obecności różnych nukleotydów są pokazane w Rysunek 2A-C. Zarejestrowano intensywność fluorescencji dwóch fluoroforów na pojedynczych cząstkach i wyekstrahowano setki trajektorii FRET wykazujących typowe cechy pojedynczej cząsteczk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia FRET opiera się na transferze energii pomiędzy dwoma barwnikami fluorescencyjnymi (donorem i akceptorem). W przypadku ich zbliżenia do siebie (zwykle 1-10 nm) wzbudzony donor przekazuje swoją energię do akceptora, co skutkuje spadkiem intensywności fluorescencji donora i wzrostem intensywności fluorescencji akceptora.

W eksperymentach smFRET cząsteczki są rozcieńczane do bardzo niskich stężeń i unieruchamiane na szkiełkach, a sygnały FRET poszczególnych cząsteczek są wykrywane za p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32371287), Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (63223043 i 63233053) oraz Projekt Szkolenia Talentów na Uniwersytecie Nankai (035-BB042112). Y.L. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (12022409 i T2221001) oraz Kluczowy Program Badawczy Nauk Granicznych CAS (ZDBS-LY-SLH015). L.M. jest wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32271274 i 31770812).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtry odśrodkowe 10 K AmiconUFC901096
3-aminopropylotrietoksysilan (APTES) Sigma-Aldrich440140
45 Ti rotor
532-nmlaser Olympus
640-nmlaser Olympus
7 K MWCO spinowe kolumny odsalająceThermo Scientific89882
Sól disodowa adenozyno-5-trifosforanu (ATP)Roche11140965001
Kwas benzoesowySigma-Aldrich242381
Biotyna-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
Biotynylowane przeciwciało anty HePrzeciwciała BiossBs-0287R-bio
d-biotynaSigma-AldrichB4501
Koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche11873580001
Kamera EMCCDAndorIX897
Sól sodowa 5′-difosforanu guanozyny (GDP)Sigma-Aldrich  G7127
5'-O-[gamma-tio]trifosforan guanozyny (GTPγ S)Roche10220647001
Obiektyw immersyjny z olejkiem o dużej aperturze numerycznejNikonNikon, 100x, NDA 1.49, zanurzenie w oleju
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
Isopropyl-Β-D-tiogalaktozydSigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
Kwas L-glutaminowy potasSigma-AldrichG1501
Tetrahydrat octanu magnezuSigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks, Natick, MAhttps://www.mathworks.com/
Szkło osłonowe mikroskopuFisherbrand18834 ( 24 mm i razy; 60 mm)
Szkiełka mikroskopoweIndywidualne, (75 mm & razy; 26 mm & razy; 1 mm) z 6 parami otworów przelotowych o średnicy 1,2 mm
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
OriginOprogramowaniehttps://www.originlab.com/
Cząstki polistyrenuQDSphereAG1265
Protokatechuat 3,4-dioksygenazaSigma-AldrichP8279
StreptawidynaSangon BiotechA610492
Superdex 200 Wzrost (10/300 GL)Cytiva28990944
Mikroskop TIRFNikonTi2
Chlorowodorek tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP)Thermo75259
Origin

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Atlastin GTPaseGTP HydrolysisProtein ImmobilizationIntramolecular FRETIntermolecular FRETEndoplasmic Reticulum FusionTotal Internal ReflectionEMCCD Camera

Powiązane artykuły