Artykuł metodologiczny

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

DOI:

10.3791/67264

⸱

27 września 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) jelit jest ostrym stanem charakteryzującym się uszkodzeniem tkanek wynikającym z ograniczonego przepływu krwi do naczyń krezkowych, co prowadzi do patologii zarówno miejscowych, jak i ogólnoustrojowych o złym rokowaniu. Zarówno niedokrwienie, jak i reperfuzja wywołują szereg odpowiedzi komórkowych i molekularnych, przy czym komórki zapalne służą jako kluczowe regulatory patologii. W tych interakcjach ze śródbłonkiem niedokrwiennym pośredniczą liczne receptory adhezyjne. Stworzono kilka modeli zwierzęcych, aby naśladować tę patologię i badać zaangażowane szlaki molekularne. W tym badaniu mikrochirurgiczny model uszkodzenia I/R jest łączony z mikroskopią przyżyciową w celu wizualizacji zwijania leukocytów, adhezji i tworzenia pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET). Model ten stosuje się do myszy transgenicznych z niedoborem śródbłonkowego PAR1 (F2r) w celu oceny wpływu PAR1 na toczenie leukocytów i tworzenie NET 1 godzinę po niedokrwieniu i bezpośrednio po reperfuzji. In vivo zastosowano barwienie leukocytów pomarańczą akrydynową, a NET zwizualizowano za pomocą barwienia kwasem nukleinowym. Co ciekawe, u myszy pozbawionych śródbłonka receptora PAR1 zaobserwowano zmniejszoną adhezję leukocytów i tworzenie NET. Model ten umożliwia analizę in vivo kluczowych regulatorów zaangażowanych w uszkodzenia I/R.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostre niedokrwienie krezki (AMI) jest rzadką patologią1 o wysokim ryzyku śmiertelności2, charakteryzujący się zmniejszonym przepływem krwi w krezce z powodu skrzeplin w osi trzewki, czyli tętnicy krezkowej górnej lub dolnej. W 60%-70% przypadków ostre niedrożności tętnicy krezkowej górnej spowodowane zakrzepicą lub embolizacją są odpowiedzialne za ostre niedokrwienie jelit3. Natomiast w 5-15% przypadków zakrzepica żył krezkowych odpowiada za niedokrwienie krezki obejmujące żyłę krezkową górną i, rzadziej, żyłę krezkową dolną4. Niedotlenienie i niedożywienie wynikające z niedokrwienia prowadzą do zaburzeń metabolizmu energetycznego na poziomie komórkowym5. Na przykład upośledzona funkcja mitochondriów aktywuje wiele szlaków sygnałowych, inicjując mechanizmy śmierci komórkowej6. Chociaż szybka reperfuzja umożliwia przywrócenie metabolizmu tlenowego, przywrócenie przepływu krwi do obszaru niedokrwionego często powoduje rozległe uszkodzenia tkanek z powodu produkcji reaktywnych form tlenu (ROS)7, przeciążenie wapniem8, dysfunkcja śródbłonka9 i reakcje zapalne10.

Wiele eksperymentalnych modeli zwierzęcych wykorzystujących tymczasową niedrożność naczyń tętnicy krezkowej górnej zostało stworzonych w celu wyjaśnienia mechanizmów molekularnych podczas uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (I/R)11. Stosowanie takich modeli w połączeniu z mikroskopią przyżyciową (IVM) ma fundamentalne znaczenie dla uzyskania wglądu w podstawowe interakcje komórkowe i postęp choroby11. Dysfunkcję bariery jelitowej obserwuje się wkrótce po niedokrwieniu12, przy czym nabłonek traci swoją integralność13, co skutkuje translokacją bakteryjną do miejsc pozajelitowych, takich jak krezkowe węzły chłonne, śledziona, wątroba i nerki12,14. Reperfuzja dodatkowo pogarsza uraz błony śluzowej15. Reakcja zapalna w tętniczkach objawia się zwijającym się i mocnym przyleganiem leukocytów do warstwy komórek śródbłonka, co jest zależne od cząsteczek takich jak L-selektyna16, P-selektyna (CD62P)17, płytki krwi GPIIb/IIIa i fibrinogen18. Co ciekawe, na adhezję leukocytów do żyłek krezkowych wpływa obecność mikrobioty jelitowej19 oraz sygnalizacji receptora Toll-like 410. Uszkodzenie I/R wyzwala również tworzenie się pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET)10. Terapeutyczne ukierunkowanie na zewnątrzkomórkowe DNA, pochodzące z aktywowanych leukocytów, takich jak neutrofile, poprawia wyniki uszkodzenia I/R jelit20. W wątrobie uszkodzenie I/R jest inicjowane przez rezydentne mikrofagi21, a hamowanie mikroRNA znacznie osłabia apoptozę22. Warto zauważyć, że uraz I/R w krezce powoduje dysbiozę jelitową, która jest odwracalna i ustępuje po rewaskularyzacji23.

Na śródbłonek wpływają również szkodliwe skutki uszkodzenia I/R, przy czym ROS odgrywa kluczową rolę w tym procesie24. Obserwuje się adhezję leukocytów do warstwy komórek śródbłonka, uszkodzenie śródbłonka i zmiany w metabolizmie tlenku azotu (NO)9. Jednak zaangażowane szlaki molekularne nie zostały jeszcze w pełni zbadane.

Receptor aktywowany proteazą 1 (PAR1, F2r), jest receptorem błonowym wyrażanym przez różne komórki, w tym komórki śródbłonka, i jest aktywowany podczas stanów zapalnych25. Jego aktywacja następuje, gdy proteazy serynowe rozszczepiają receptor na N-końcu, odsłaniając uwięziony ligand, który z kolei aktywuje receptor poprzez wiązanie się z drugą pętlą zewnątrzkomórkową cząsteczki26. Szlak sygnałowy receptora białka C śródbłonka (EPCR)-PAR1 wpływa na homeostazę NO śródbłonka i ułatwia przywrócenie przepływu krwi w niedokrwieniu obwodowym27.

W tym badaniu, uszkodzenie I/R zostało zastosowane do genetycznego modelu myszy charakteryzującego się niedoborem PAR1 specyficznym dla komórek śródbłonka, aby uwidocznić zwijanie leukocytów, adhezję i tworzenie NET. Połączenie mysiego modelu genetycznego i mikroskopii przyżyciowej po mikrochirurgii I/R dostarcza cennych informacji, podkreślając konkretne typy komórek zaangażowanych w postęp choroby. Zastosowanie uszkodzeń I/R do genetycznych modeli myszy ma zasadnicze znaczenie w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych, które można wykorzystać do poprawy przebiegu choroby. Ponadto wykazano znaczenie śródbłonka PAR1 w NETozie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez lokalny komitet ds. ustawodawstwa dotyczącego zwierząt (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Niemcy; G21-1-041). 6-8 tygodniowy samiec i suczka B6. Do badania wykorzystano myszy FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc. Specyficzna dla komórek śródbłonka regulacja F2r (PAR1) zachodzi za pośrednictwem promotora VE-Cadherin Cre 28. W tym badaniu flox-F2r x VE-Cadherin Cre + (F2RΔEC) wykazywał zmniejszoną ekspresję F2r (PAR1) na komórkach śródbłonka, a flox-F2r x VE-Kadheryna Cre- (WT) wyrażają normalne poziomy F2r śródbłonka (PAR1). Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie do zabiegu

  1. Wysterylizuj niezbędne narzędzia chirurgiczne (bardzo wąskie nożyczki proste, kleszcze, zacisk naczyniowy itp.).
  2. Przygotuj system znieczulenia na bazie tlenu i izofluranu ze stożkiem nosowym i płytą grzewczą.

2. Przygotowanie zwierząt

  1. Zważ zwierzę.
  2. Wykonaj znieczulenie: Znieczulij myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie (i.p.) roztworu zawierającego midazolam (5 mg / kg), medetomidynę (0,5 mg / ml) i fentanyl (0,5 mg / kg) (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).
  3. Usuń sierść z obszaru operacji szyi i brzucha za pomocą golarki elektrycznej dla małych zwierząt.
  4. Ustaw mysz w pozycji grzbietowej na poduszce grzewczej i podłącz ją do systemu tlenowego za pomocą stożka nosowego. Przymocuj kończyny myszy do podgrzewanej podkładki za pomocą taśmy chirurgicznej. Upewnij się, że lateksowa membrana stożka nosa dobrze przylega do głowy myszy. Monitoruj temperaturę ciała zwierzęcia doodbytniczo za pomocą termometru specyficznego dla gryzoni
    5. .
  5. Nałóż krem do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy z obszaru chirurgicznego szyi i przetrzyj skórę obszaru operacyjnego 70% etanolem.
  6. Wykonaj test szczypania palców u nóg (odruch pedałowania), aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone.

3. Zabieg chirurgiczny

  1. Implantacja cewnika w żyle szyjnej
    1. Wykonaj poprzeczne nacięcie (~0,5 cm) nad tchawicą, usuń skórę pokrywającą szyję i odizoluj prawą żyłę szyjną.
    2. Użyj jedwabnej nici o długości około 5 cm, zamknij dystalny koniec żyły i przymocuj ją kleszczami chirurgicznymi. Umieść trzy jedwabne nici około 2 cm poniżej żyły: jedną blisko dystalnego końca i dwie blisko bliższego końca żyły szyjnej. Zawiąż węzeł chirurgiczny, ale nie zamykaj naczynia.
    3. Przygotować cewnik polietylenowy (0,28 mm ID, 0,61 mm OD) wypełniony 0,9% NaCl i zatkany strzykawką o pojemności 1 ml. Za pomocą nożyczek wytnij otwór między drugim a trzecim węzłem i wszczepij cewnik do żyły szyjnej. Odessać strzykawkę, aby upewnić się, że w cewniku znajduje się krew.
    4. Zamocuj cewnik w żyle, zawiązując jedwabną nić, upewniając się, że jest dobrze zamocowana. Użyj taśmy medycznej, aby zabezpieczyć strzykawkę.
    5. Przygotuj oranżę akrydynową: rozcieńczyć w stosunku 1:4 roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej (0,5 mg/ml stężenie końcowe) w strzykawce o pojemności 1 ml. Trzymać strzykawkę w ciemności i wstrzyknąć 50 μl do myszy.
    6. Przygotować barwnik kwasu nukleinowego: rozcieńczyć w stosunku 1:1000 5 mM roztworu podstawowego sterylnym roztworem soli fizjologicznej (5 μM stężenie końcowe) w strzykawce o pojemności 1 ml. Trzymać strzykawkę w ciemności i wstrzyknąć 50 μl do myszy.
    7. Wstrzyknąć in vivo oranż akrydynowy (50 μg/μl, 50 μl na mysz) przez cewnik do żyły szyjnej, aby uwidocznić barwione leukocyty i zewnątrzkomórkowy barwnik fluorescencyjny DNA, podobnie jak w przypadku barwnikowych pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) (5 μM, 50 μl na mysz). NET i leukocyty są obrazowane jednocześnie.
  2. Model urazu krezki I/R
    1. Zdezynfekuj skórę brzucha 70% etanolem.
    2. Wykonaj laparotomię 3-5 cm wzdłuż kresy białej za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    3. Za pomocą dwóch bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie usuń jelito i zidentyfikuj miejsce o minimalnym pokryciu tłuszczem. Umieść gałęzie jelita cienkiego na czarnym cieście, aby zmniejszyć sygnał tła.
    4. Zdobądź filmy przed I/R (stan przed niedokrwieniem).
    5. Zrób kompres wilgoci za pomocą NaCl i umieść w nim jelito. Upewnij się, że jelito jest otoczone kompresem i utrzymuje wilgoć podczas kroku 5.6.
    6. Zatkaj tętnicę krezkową górną za pomocą małego zacisku naczyniowego.
    7. Delikatnie wepchnij jelito z powrotem do jamy brzusznej za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną i użyj szwu 7-0, aby zamknąć ścianę brzucha, aby zapobiec utracie wilgoci i temperatury. Utrzymuj niedokrwienie przez 60 minut, sprawdzając znieczulenie co najmniej co 20 minut.
    8. Po 1 godzinie rozpocząć reperfuzję, zdejmując zacisk.
      UWAGA: Prawidłowe wykonanie zabiegu niedokrwienia skutkuje widoczną zmianą. Początkowo dotknięty obszar będzie wyglądał na blady lub biały z powodu braku przepływu krwi. Po zdjęciu zacisku przepływ krwi będzie stopniowo wracał do obszaru niedokrwiennego, który odzyska swój normalny kolor, co oznacza udaną okluzję. Konieczne jest uważne obserwowanie myszy w sposób ciągły przez cały etap niedokrwienia.
    9. Po okresie niedokrwienia nałóż kilka kropli soli fizjologicznej na strzyżony obszar, a następnie delikatnie usuń klipsy mikronaczyniowe za pomocą aplikatora do klipsów.
    10. Za pomocą bawełnianych końcówek zwilżonych solą fizjologiczną delikatnie usuń jelito, umieść małe gałęzie żyły na czarnym cieście, ponownie wstrzyknij 50 μl pomarańczy akrydynowej i uchwyć filmy z tą samą żyłą w tym samym miejscu (po niedokrwieniu).

4. Przywnętrzna, szybka mikroskopia epifluorescencyjna wideo

  1. Wizualizuj leukocyty i NET za pomocą szybkiego, szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kondensor dalekiego zasięgu, monochromator, 10-krotny obiektyw zanurzeniowy w wodzie i kamerę urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym. Akwizycja obrazu została zrealizowana przy czasie naświetlania 30 ms i filtrach Alexa Fluor 488(495/519) i Rhodamine Red (570/590).
  2. Używaj oprogramowania do obrazowania do pozyskiwania i analizy obrazów.
  3. Określ ilościowo rekrutację komórek w obszarze zainteresowania o powierzchni 0,06 mm².
  4. Określ ilościowo przylegające leukocyty jako komórki pozostające nieruchome lub przyczepione do wyściółki śródbłonka przez 20-sekundowy okres obserwacji.
  5. Zidentyfikuj NET jako struktury zewnątrzkomórkowe znakowane zarówno leukocytami, jak i zewnątrzkomórkowymi barwnikami fluorescencyjnymi kwasu nukleinowego.
  6. Eutanazja zwierząt przez zwichnięcie szyjki macicy pod koniec eksperymentu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).

5. Izolacja komórek śródbłonka wątroby (LEC) i ilościowy RT-PCR

  1. Izolowanie LEC za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS)29.
  2. Wyizoluj całkowite RNA.
  3. Przeprowadź komplementarną syntezę DNA (cDNA) 27, mieszając 2 μg całkowitego RNA z 2 μl buforu RT, 0,8 μl mieszanki dNTP, 2 μl losowych starterów RT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4,2 μl sterylnie destylowanegoH2O.
  4. Transkrypcję cDNA przeprowadzono w następujących warunkach: 25 °C przez 10 min, 37 °C przez 120 min, 85 °C przez 5 min.
  5. Użyj 20 ng cDNA do qPCR.
  6. Użyj następujących starterów: F2r (do przodu): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r (do tyłu): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32 (do przodu): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32 (do tyłu): TCTGGGTTTCCGCCAGTTTTT. Stosować następujące warunki: 95 °C 30 s, 45 cykli (95 °C przez 10 s, 60 °C przez 25 s), 60 °C do 95 °C przez 6 s przy ΔΤ 1 °C.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać zależny od komórek śródbłonka wpływ na zwijanie i adhezję leukocytów, a także na tworzenie NET, początkowo zbadano skuteczność indukowanego niedoboru F2r VE-Cadherin Cre w komórkach śródbłonka. Magnetyczne sortowanie komórek zastosowano w celu wyizolowania komórek śródbłonka wątroby. Następnie wyizolowano RNA, a następnie przeprowadzono ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR). Myszy F2rΔEC, u których nie występuje rekombinaza Cre wyrażana pod kontrolą promotora VE-Kadheryny, wykazały znacznie obniżone poziomy mRNA F2r (PAR1) (o ok. jedną trzecią) w porównaniu z kontrolami WT (Figura 1).

Po potwierdzeniu niedoboru w linii myszy, wykonano uszkodzenie I/R krezki w celu zbadania wpływu PAR1 wyrażanego przez komórki śródbłonka naczyniowego na toczenie i adhezję leukocytów, uwidocznione za pomocą mikroskopii przyżyciowej (Rysunek 2A,B). Po 1 godzinie niedokrwienia zacisk został usunięty, a naczynie pozwolono na ponowne utożsamienie. Obserwowano i rejestrowano zwijanie i adhezję leukocytów (zabarwione na zielono, oznaczone białymi strzałkami). Chociaż obie grupy wykazały zwiększoną liczbę przylegających leukocytów po uszkodzeniu I / R, niedobór śródbłonka F2r (PAR1) skutkował znacznie, ale nie znacząco zmniejszoną adhezją leukocytów do śródbłonka krezki aktywowanego I/R, co sugeruje aktywną rolę śródbłonkowej aktywacji PAR1 w rekrutacji leukocytów do niedokrwionych żyłek krezkowych (Figura 2C).

Następnym celem było zbadanie, czy śródbłonkowe wyrażenie PAR1 reguluje powstawanie NET wywołane urazem I/R. Dlatego zewnątrzkomórkowe kwasy nukleinowe wybarwiono nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem30 i zwizualizowano wygenerowane NET za pomocą mikroskopii przyżyciowej (oznaczonej czarnymi strzałkami) (Rysunek 2A,B). Po uszkodzeniu I/R NET obserwowano tylko w grupie WT wyrażającej normalne poziomy PAR1 na komórkach śródbłonka, co wskazuje na regulacyjną rolę PAR1 w NETozie (Figura 2C, D). Warto zauważyć, że gdy śródbłonkowa ekspresja F2r została stłumiona, nie było żadnych NET w uszkodzonych żyłkach krezkowych I/R.

figure-results-1
Rysunek 1: Ekspresja mRNA F2r (PAR1). Ekspresja komórek śródbłonka wątroby F2r myszy WT (n = 6) i F2rΔEC (n = 9) w stosunku do genu porządkowego L32. Dane są prezentowane jako mediana z 95% przedziałem ufności. Test Manna-Whitneya został użyty do porównania dwóch niezależnych grup, *p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Śródbłonek PAR1 wpływa na adhezję leukocytów i tworzenie NET w żyłkach krezkowych uszkodzonych I/R. Reprezentatywne obrazy mikroskopii przyżyciowej przylegających leukocytów wybarwionych pomarańczem akrydynowym (białe strzałki) i NET wybarwionych Sytox Orange (czarne strzałki) myszy WT i F2rΔEC przed (przed) i po (po) urazie I / R (A) powiększenie 10x i (B) 20x. Podziałka liniowa: A, 50 μm; B, 20 μm. (C) Adhezja leukocytów i (D) NET namm2 myszy WT (n = 7) i F2rΔEC (n = 4) przed (przed) i po (po) urazie I/R. Wszystkie dane przedstawiono jako medianę z 95% przedziałem ufności. Porównania statystyczne przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowego testu ANOVA, **p< 0,01 oraz wielokrotnych testów porównawczych Sídáka, aby porównać średnie różnych genotypów w każdym punkcie czasowym (przed i po niedokrwieniu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie I/R krezki w połączeniu z mikroskopią przyżyciową zastosowano do genetycznego mysiego modelu niedoboru F2r (PAR1) w komórkach śródbłonka do analizy in vivo leukocytów i NET po 1 godzinie niedokrwienia. Model uszkodzenia krezki I/R jest często stosowany u gryzoni, u których czas zarówno niedokrwienia, jak i reperfuzji waha się od minut do kilku godzin23,31, wpływając na wynik stanu zapalnego32 i śmiertelność33. Model zależy również od kilku czynników, w tym mikrobioty19,34, receptorów immunologicznych 10,35,36,37, płci38,39 i wieku35 lat. Oprócz różnych czasów I/R, kolejną zmienną w tym modelu jest zróżnicowana reakcja różnych części jelita na uraz, przy czym jelito cienkie wykazuje większe uszkodzenie błony śluzowej niż okrężnica40. Umiejscowienie klipsa mikronaczyniowego wpływającego na obszar niedokrwienny ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności metody32,33. Co ważne, doskonała niedrożność tętnicy krezkowej w połączeniu z przerwaniem przepływu pobocznego daje wskaźniki śmiertelności, które są konsekwentnie związane z czasem trwania niedokrwienia41.

W tym badaniu myszy poddano 1-godzinnemu niedokrwieniu, a adhezję leukocytów in vivo i tworzenie NET uwidoczniono natychmiast po reperfuzji w celu zbadania wczesnej odpowiedzi zapalnej wywołanej stanem niedokrwiennym przy braku śródbłonkowej ekspresji F2r . Zastosowanie tych metod do genetycznych modeli myszy pozwala na zbadanie, w jaki sposób niektóre cząsteczki docelowe wpływają na zachowanie komórek i odpowiedź zapalną zarówno po niedokrwieniu, jak i podczas reperfuzji.

W protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, w tym utrzymanie integralności jelit. Obchodzenie się z jelitem musi być delikatne, aby uniknąć uszkodzenia tkanek. W tym celu odpowiednie narzędzie do czasowego odłączenia jelita od jamy brzusznej są wilgotne waciki. Bardzo ważne jest, aby jelito pozostało wilgotne, dopóki nie zostanie ponownie umieszczone w jamie brzusznej. Drobne urazy związane z przenoszeniem mogą wywołać aktywację różnych typów komórek, takich jak płytki krwi i komórki śródbłonka, co może wpływać na wyniki.

Aby zachować spójność, ważne jest, aby uwidocznić to samo miejsce segmentów jelita przed i po niedokrwieniu. Może to być trudne, ponieważ po niedokrwieniu jelito jest przestawiane w jamie brzusznej. Aby rozwiązać ten problem, jednym ze sposobów jest umieszczenie małego kawałka wilgotnego kompresu na części jelita, która została uwidoczniona przed niedokrwieniem.

Aby uwidocznić zwijanie i adhezję leukocytów, a także tworzenie NET in vivo, myszom wstrzyknięto zarówno leukocyt, jak i barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego przez żyłę szyjną. Barwnik leukocytów (patrz tabela materiałów) jest przepuszczalnym dla komórek metachromatycznym barwnikiem fluorescencyjnym, który wiąże się z białymi krwinkami, ale nie z czerwonymi krwinkami i jest szeroko stosowany do barwienia leukocytów in vivo 17,42. Barwnik nakłada się dożylnie i zapewnia silne barwienie leukocytów w ciągu kilku sekund. Jednak swoistość może być ograniczeniem, ponieważ barwi również inne komórki jądrzaste, takie jak komórki śródbłonka. Niemniej jednak komórki krążące dłużej utrzymują zabarwienie ze względu na efekt wypłukiwania43. Barwnik fluorescencyjny kwasu nukleinowego (patrz tabela materiałów) jest nieprzepuszczalnym dla komórek barwnikiem kwasu nukleinowego, powszechnie stosowanym do wizualizacji tworzenia NET 30,44,45. Może być również stosowany dożylnie, wiąże się z dużym powinowactwem, jest szybki i łatwy w użyciu. Ponownie, specyficzność jest wadą, ponieważ barwnik zwiąże się z każdą komórką z nienaruszoną błoną. Najlepiej połączyć go z markerem neutrofili (np. CD15, CD11b) lub markerem NETosis (np. przeciwciałami anty-citH3) w celu zwiększenia swoistości. Barwniki te umożliwiają obrazowanie in vivo leukocytów w żyłkach krezkowych zwierząt laboratoryjnych.

Głównym ograniczeniem tej techniki jest obecność tłuszczu trzewnego, który ogranicza wizualizację naczyń włosowatych jelit i znacznie utrudnia pozyskiwanie obrazu. Aby uniknąć tego powikłania, konieczne jest wykorzystanie młodych zwierząt doświadczalnych (w wieku 6-8 tygodni), które mają zmniejszone tworzenie się tłuszczu trzewnego. Dodatkowo analiza histologiczna ex vivo jest utrudniona przez stosowanie barwienia in vivo . Kolejnym ograniczeniem jest wpływ mikrobioty jelitowej i diety na ten model, który może się znacznie różnić w zależności od hodowli myszy46. Aby rozwiązać to ograniczenie, można rozważyć badanie gnotobiotycznych modeli myszy10.

W tym badaniu badano natychmiastową odpowiedź komórkową po niedokrwieniu i obserwowano zmniejszone odkładanie leukocytów do aktywowanego śródbłonka krezki i tworzenie NET in vivo. Degradacja NET przez dożylne podanie DNazy 1 godzinę po niedokrwieniu zmniejsza wczesną odpowiedź prozapalną i łagodzi przerwanie bariery jelitowej47. Warto zauważyć, że leczenie trombomoduliną, transbłonową glikoproteiną, która hamuje aktywność trombiny48, poprawiło przeżywalność myszy z ciężkim uszkodzeniem I/R jelit, osłabiając odpowiedź zapalną dysfunkcji śródbłonka i zmniejszając intensywną akumulację histonów w odległych narządach49. W tym przypadku wykazano, że śródbłonkowy receptor trombiny wpływa na wynik I/R, podkreślając znaczenie połączenia modelu uszkodzenia I/R jelit z mikroskopią przyżyteczną u genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu zbadania ważnych mediatorów patologii choroby.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.R. dziękuje za dofinansowanie ze strony Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz i ReALity (projekt MORE), BMBF Cluster4Future CurATime (projekt MicrobAIome; 03ZU1202CA), Wilhelm Sander-Stiftung (Nr. 2022.131.1) oraz Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) Fundusz Innowacji "Microbiome" (81X2210129). C.R. jest naukowcem w Niemieckim Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK). C.R. jest członkiem Centrum Translacyjnej Biologii Naczyniowej (CTVB), Centrum Badawcze Immunoterapii (FZI) oraz Potentialbereich EXPOHEALTH na Uniwersytecie Johannesa Gutenberga w Moguncji. C.R. jest członkiem Jednostki Badawczej DFG 5644 INFINITE (RE 3450/15-1). C.R. otrzymał stypendium w Gutenberg Research College na Uniwersytecie Johannesa Gutenberga w Moguncji. K.K. jest wspierana w ramach Programu Doskonałości DZHK "Promocja Kobiet-Naukowców" i jest członkiem Młodej DZHK. Z.G i O.D. są doktorantami w Szkole Badawczej Biomedycyny Translacyjnej w Moguncji (TransMed).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pomarańcza akrydynowaSigma-Aldrich   A-6014
Płytka 96-dołkowa Multiply PCR-Platten Sarstedt721977202.00
Systemy anestezjologiczne dla gryzoniGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
plastelinaStaedtler
CD146 Mikrogranulki, myszMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensOlympusOlympus cellSense Dimension Desktop 2.3oprogramowanie
urządzenie ze sprzężeniem ładowanym aparatHamamatsu PhotonicsORCA-R2
waciki bawełniane Bö ttger09-119-9100
Zakrzywiony Hemostat 125mm/5"Instrumenty indygo 22466
Krem do depilacjiBaleanie dotyczy
Dorbene Vetzoetis
Dumont KleszczeFine Science Tools11251-35
Etanol rocznie 99,5 %Roth5504.20
Bardzo wąskie nożyczki – Prosty/Ostry-Ostry/10.5FST14088-10
FentanylJanssen-Cilag GmBH
Kleszcze "Dumont #5" (Inox, końcówka 0,1 mm, długość 11 cm)FST11251-20
GentleMACS C RurkiMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpadPrism 10oprogramowanie
izofluranowe Piramal4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
Taśma medyczna LeukofixBSNMedical0213600
Zestaw do dysocjacji wątroby, myszMiltenyi Biotec130-105-807
Kolumny separacyjne LS MACSMiltenyi Biotec130-042-401
Inteligentne sitko MACS 100 &mikro; mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
Uchwyt na igłyFST12001-13
Niewchłanialny pleciony jedwabny szew, Rozmiar: 7/0, 91 metrów Fine Science Tools18020-70
Mikroskop fluorescencyjny Olympus BX51WIMikroskop Olympus
PCR do pasków probówekSarstedt72985002.00
Pokrywki probówek do PCRSarstedt65989002.00
Cewnik do pliyetylenuSmith Medical Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G), Polipropylen 6-0, Nahtmaterial Johnson & Johnson Medical GmbH 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Zestaw do odwróconego tanskryptyzacji (cDNA o dużej pojemności)Applied Biosystems4368813.00
Waga szkolna KERN & SOHN GmbHEMB 500-1
- kątowe na bokFST15006-09
Mikroskop stereoskopowyLeicaM50
Proste hemostatyki 135mm/5.5"Instrumenty indygo 22468
Strzykawka 1 mlBraun9166017V
SYTOXOrange Thermo Fisher ScientificS11368
Regulator temperatury TC-1000FMI Fö hr Medical Instruments GmbHnie dotyczy
Kleszczyki do tkanek - 1x2 zębyFST18057-14
zacisk naczyniowyFine Science Tools18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480
Nożyczki sprężynowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adhezja leukocyt wr db onkowy PAR1myszy wolne od mikroorganizm wmikroskopia fluorescencyjnatoczenie si leukocyt w

Powiązane artykuły