Artykuł metodologiczny

Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67266

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Oral Biology, College of Dentistry, University of Illinois Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku, wizualny przepływ pracy do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczej komórki w czasie gojenia się ran skóry myszy przy użyciu R. Protokół obejmuje standardowy potok do pobierania zestawów danych, kontroli jakości, wizualizacji i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat oraz analizy interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.

Streszczenie

Proces gojenia się ran jest regulowany przez złożone interakcje między różnymi typami komórek w przestrzeni i czasie. Poprzez profilowanie pojedynczych komórek w ich złożonym środowisku, metody transkryptomiki pojedynczej komórki umożliwiają badanie heterogeniczności komórkowej, sieci komunikacji komórkowej i interakcji komórka-komórka zaangażowanych w proces gojenia się ran. Jednak wiele narzędzi do analizy pojedynczych komórek jest uruchamianych w środowisku kodowania komputerowego, a ich szersze zastosowanie przez naukowców zajmujących się leczeniem ran jest udaremnione przez pozorny brak wiedzy bioinformatycznej. W związku z tym przedstawiono przepływ pracy krok po kroku pokazujący, jak używać graficznego środowiska kodowania o nazwie RStudio do wykonywania podstawowej analizy pojedynczej komórki zestawu danych czasowego gojenia ran skóry myszy wycinających. Ten wizualny i kierowany protokół umożliwi naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego pobranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran, wykonanie krytycznych kroków kontroli jakości, uruchomienie standardowego przepływu pracy analizy pojedynczej komórki, w tym wizualizacji zestawów danych i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat, przeprowadzenie analiz podtypów komórek, przeprowadzenie analiz punktacji modułów, przeprowadzenie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat oraz przeprowadzenie integracyjnych analiz wielu zestawów danych za pomocą Seurat. Wyjaśnienia narracyjne są dostarczane dla każdego kroku w protokole, a wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są prezentowane, aby bezpiecznie przeprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Celem tego wizualnego wprowadzenia do procesu analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran korzystania z narzędzi bioinformatycznych bezpośrednio w ich własnych laboratoriach, aby ułatwić głębsze analizy własnych zestawów danych jednokomórkowych, a także bardziej powszechne ponowne analizy wcześniej opublikowanych zestawów danych jednokomórkowych.

Wprowadzenie

Gojenie się ran jest jednym z najbardziej złożonych procesów w biologii ssaków i obejmuje spektrum trzech faz gojenia: zapalnej, proliferacyjnej i rozdzielczości 1,2. Te fazy gojenia szeroko klasyfikują skoordynowane działania dziesiątek typów komórek i setek ich produktów molekularnych w przestrzeni i czasie gojenia się ran3. Kilka dekad badań histologicznych i molekularnych opartych na próbkach tkanek ran w całym okresie gojenia wyjaśniło nadrzędne wzorce komórkowe naprawy tkanek3, szczególnie w odtwarzalnych mysich modelach gojenia się ran skóry 4,5,6. Dopiero w ciągu ostatnich dwóch dekad możliwe stało się pełniejsze docenienie złożoności gojenia się ran, począwszy od pojawienia się wysokoprzepustowych analiz transkryptomicznych ran w skali tkanekmasowych 7,8,9 i komórek 10,11,12,13,14. Ostatnio w kilku badaniach sprofilowano transkrypcyjnie rany skóry na poziomie pojedynczych komórek, identyfikując nowe podtypy komórek rany i pokazując, w jaki sposób mogą one wchodzić ze sobą w interakcje podczas gojenia 15,16,17,18,19,20. Hu i in. wykorzystali innowacyjne podejście do sekwencjonowania przestrzennego jednokomórkowego RNA do profilowania ran skóry w czasie gojenia w kilku promieniowych odległościach od centrum rany, co ujawniło nowe "ruchy" międzykomórkowe i molekularne w przestrzeni i czasie20. Takie badania odkrywają złożoność gojenia się ran w niespotykanych dotąd szczegółach i zaczynają malować obraz ogromnej różnorodności komórkowej i molekularnej.

Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie metod analizy bioinformatycznej umożliwiają biologiczne zrozumienie złożonych multiomicznych zestawów danych generowanych w dziedzinie badań nad gojeniem się ran. Pakiety do analizy pojedynczych komórek, takie jak Seurat, zapewniają narzędzia do solidnej analizy i integracji zestawów danych, w tym klasyfikacji typów komórek w złożonych tkankach, takich jak rany21. Do dalszej interpretacji danych z pojedynczych komórek narzędzia takie jak CellChat są używane do identyfikacji przypuszczalnych programów interakcji komórka-komórka, które mogą wyjaśnić, w jaki sposób komórki koordynują się w celu naprawy ran22. Chociaż narzędzia te są dobrze udokumentowane i dobrze cytowane, muszą być uruchamiane w środowisku kodowania komputerowego, takim jak R, statystyczny i graficzny język programowania, który jest najczęściej używany w dziedzinach bioinformatyki genomiki i transkryptomiki. Podczas gdy biolodzy i klinicyści zajmujący się gojeniem ran coraz częściej stosują podejścia jednokomórkowe do badania naprawy tkanek, niewielu z nich ma wykształcenie bioinformatyczne wymagane do korzystania z narzędzi takich jak Seurat i CellChat bezpośrednio we własnych laboratoriach. Taka bariera w korzystaniu z tych narzędzi bioinformatycznych nie tylko uniemożliwia naukowcom głębszą analizę własnych zbiorów danych bez pomocy bioinformatyków, ale także uniemożliwia naukowcom wiarygodną ponowną analizę bogactwa danych z pojedynczych komórek, które zostały już opublikowane przez inne grupy.

W związku z tym przedstawiono tutaj przepływ pracy krok po kroku, aby umożliwić naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego analizę wcześniej opublikowanego i publicznie dostępnego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych20. Protokół korzysta z powszechnego i bezpłatnego graficznego środowiska kodowania języka R o nazwie RStudio i pokazuje, jak poruszać się po tym środowisku w celu uruchamiania zalecanych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu Seurat i CellChat. W ramach tego protokołu przedstawiono siedem głównych metod istotnych dla badań nad gojeniem się ran, w tym: 1) instalację środowiska kodowania, 2) pobieranie zestawu danych i krytycznych etapów kontroli jakości, 3) przepływy pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje i adnotacje typów komórek, 4) analizy podtypów komórek, 5) analizy punktacji modułów, 6) analizy interakcji komórka-komórka oraz 7) analizy integracyjne wielu zestawów danych. W ramach każdej metody dostarczany jest rzeczywisty kod, który użytkownik może uruchamiać równolegle z protokołem, a rzeczywiste wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są wyświetlane, aby poprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Głównym celem tego wizualnego wprowadzenia do RStudio i podstawowego przepływu pracy analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran bezpośredniego korzystania z tych potężnych narzędzi, aby umożliwić szybszy postęp w dziedzinie badań.

Protokół

UWIEJ: W poniższych przepływach pracy szczegółowo opisano siedem metod bioinformatycznych, przy czym wszystkie kroki protokołów są dostępne jako odpowiednie fragmenty kodu, które powinny być uruchamiane bezpośrednio w interfejsie użytkownika RStudio w kolejności, w jakiej są wymienione. Aby uprościć ten protokół, dołączono plik skryptu R (Dodatkowy plik 1: JoVE_Rscript.R), który można załadować bezpośrednio do sesji użytkownika w RStudio, aby każdy wiersz kodu można było po prostu uruchomić. Dzięki temu użytkownik nie musi wpisywać ani kopiować i wklejać kodu z dokumentu protokołu, co mogłoby prowadzić do błędów. Wszystkie instrukcje protokołu są również zawarte w pliku skryptu R w postaci komentarzy, oznaczonych symbolem hashtagu '#' na początku każdego wiersza komentarza.

1. Instalowanie R, RStudio oraz wymaganych pakietów R dla pojedynczej analizy komórkowej

  1. Pobierz i zainstaluj R (wersja 4.4.1) na komputerze. Użyj łącza odpowiadającego systemowi operacyjnemu komputera.
    1. Jeśli korzystasz z komputera z systemem Microsoft Windows, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/
    2. Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/macosx/
  2. Zainstaluj najnowszą wersję RStudio na komputerze. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami:
    https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
  3. Zainstaluj Rtools (wersja 4.4), które pozwolą R na skompilowanie niektórych pakietów. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami:
    1. Jeśli korzystasz z Windows, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/
    2. Jeśli korzystasz z MacOS, użyj tego linku:
      https://mac.r-project.org/tools/
  4. Ustaw lokalny katalog roboczy; jest to folder na komputerze, z którego wszystkie pliki będą wczytywane i zapisywane. Ustaw katalog roboczy, wybierając Sesja w menu paska narzędzi RStudio i klikając Ustaw katalog roboczy > Wybierz katalog oraz wybierając żądany folder.
    1. Jeśli korzystasz z komputera z systemem Windows, użyj następującego polecenia, aby ustawić katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/"
      setwd("C:/[Katalog]")
    2. Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, następujące polecenie również ustawia katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/"
      setwd("~/[Katalog]")
    3. W dowolnym momencie sesji R sprawdź katalog roboczy, używając następującego wiersza kodu:
      getwd()
    4. W RStudio wizualnie przeglądaj strukturę katalogu roboczego, w tym wszystkie zawarte w nim pliki i foldery, w prawym oknie w zakładce Pliki . Aby przejść do eksploratora plików RStudio do katalogu roboczego, kliknij ikonę koła zębatego -> Przejdź do katalogu roboczego.
  5. Zainstaluj następujące pakiety z repozytorium pakietów R CRAN, które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia.
    install.packages("devtools")
    install.packages("readxl")
    install.packages("openxlsx")
    install.packages("tidyverse")
    install.packages("scCustomize")
    UWAGA: Podczas instalacji pakietów R może się pojawić wiele okien, które znikają. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o skompilowanie pakietu, kliknij TAK. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o ponowne uruchomienie R przed zainstalowaniem pakietu, kliknij NIE.
  6. Zainstaluj następujące pakiety z kuratorskiej bazy pakietów R Bioconductor
    (https://bioconductor.org/), które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia. 
    if (! requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE) )
      install.packages("BiocManager")
    BiocManager::install("NMF", update=F)
    BiocManager::install("ComplexHeatmap", update=F)
    BiocManager::install("BiocNeighbors", update=F)
    BiocManager::install("SingleCellExperiment", update=F)
    BiocManager::install("circlize", update=F)
    BiocManager::install("edgeR", update=

Wyniki

Zaczynając od metody nr 2, protokół przeprowadza przez kolejne etapy ładowania i przeprowadzania kontroli jakości zbioru danych z procesu gojenia ran w pojedynczych komórkach. Po utworzeniu obiektu Seurat (krok 2.6.2), seria kroków łączy dwa analizowane parametry w zbiorze danych (RNA i białko; kroki 2.6.3-2.6.7) i przeprowadza dekompleksowanie analizy białek zgodnie z kodami kreskowymi czasowo-przestrzennymi (kroki 2.6.8-2.6.9). Funkcja dekompleksowania przypisuje kilka etykiet metadanych do każdej komórki w zbiorze danych, w tym „barcodes_maxID”, która identyfikuje najbardziej prawdopodobny czasowo-przestrzenny kod kreskowy każdej komórki (krok 2.6.10). W kroku 2.6.11 wykonuje się funkcję wykresu skrzypcowego, aby zwizualizować rozkład wykrytych genów w komórkach na podstawie ich zmuksylowanych kodów kreskowych. Reprezentatywny wynik tego kroku (Supplementary Figure 1) pokazuje, że rozkład wykrytych genów dla każdego kodu kreskowego jest stosunkowo równomierny, co jest istotne dla integralności zbioru danych i późniejszej analizy punktów czasowych gojenia ran. Po przypisaniu odpowiedniej etykiety do kodów kreskowych białek (krok 2.6.12), protokół pokazuje następnie, jak przeprowadzić kroki kontroli jakości analizy RNA w zbiorze danych, zaczynając od obliczenia procentu genów mitochondrialnych w każdej komórce (krok 2.9). W kroku 2.10 wykonuje się funkcję wykresu rozrzutu cech, aby zwizualizować rozkład wykrytych genów, liczbę RNA oraz procent mitochondrialny we wszystkich komórkach. Reprezentatywne wyniki tego kroku (Supplementary Figure 2) pokazują, że istnieje liczba komórek o dużej zawartości mitochondrialnej, co koreluje z niską liczbą RNA i pozwala zidentyfikować komórki martwe lub obumierające. Po usunięciu komórek o niskiej liczbie RNA i dużej zawartości mitochondrialnej (krok 2.11), w kroku 2.12 kolejna funkcja wykresu rozrzutu cech jest wykonywana na podzbiorze danych, a reprezentatywny wynik tego kroku (Supplementary Figure 3) pokazuje, że rozkład wykrytych genów i procent mitochondrialnego RNA na komórkę jest teraz bardziej normalny, co otwiera drogę do wiarygodnych dalszych analiz. Następnie protokół opisuje użycie funkcji scDblFinder do identyfikacji prawdopodobnych dubletów w zbiorze danych i przypisuje każdej komórce nową metadaną o nazwie „scDblFinder.score” (kroki 2.13-2.14). W kroku 2.15 wykonuje się funkcję wykresu skrzypcowego, aby zwizualizować rozkład wyników dubletów w zbiorze danych, a reprezentatywny wynik tego kroku (Supplementary Figure 4) pokazuje, że istnieje liczba komórek z relatywnie wysokimi wynikami dubletów i że 0,25 wydaje się być naturalnym punktem odcięcia, powyżej którego znajduje się populacja prawdopodobnych dubletów. W związku z tym w następnych krokach parametr ten jest wykorzystywany do ograniczenia zbioru danych do komórek poniżej punktu odcięcia (krok 2.16), co kończy etapy kontroli jakości dla tego zbioru danych z pojedynczych komórek.

Zaczynając od metody nr 3, protokół przeprowadza przez kolejne kroki analizy kontrolowanego pod kątem jakości zbioru danych dotyczącego gojenia ran w pojedynczych komórkach z wykorzystaniem pakietu i przepływu pracy Seurat. Po normalizacji i skalowaniu danych RNA przeprowadzana jest analiza PCA (krok 3.1). W kroku 3.2 wykorzystuje się funkcję wykresu łokciowego (elbow plot) do wizualizacji zakresu zmienności zbioru danych w odniesieniu do pierwszych 50 wymiarów PCA, a reprezentatywny wynik tego kroku (Supplementary Figure 5) pokazuje, że większość głównej zmienności występuje w obrębie pierwszych 13 wymiarów, co zostało zidentyfikowane na podstawie załamania wykresu. Następnie protokół pokazuje, jak znaleźć sąsiadów i przeprowadzić klastrowanie komórek (krok 3.3) oraz redukcję wymiarowości UMAP (krok 3.4) zbioru danych przy użyciu pierwszych 13 wymiarów PCA i stosunkowo niskiego parametru rozdzielczości klastrowania wynoszącego 0.1; oba te parametry wybrano w celu zidentyfikowania najbardziej uogólnionych głównych typów komórek w ranach. W kroku 3.5 wykonuje się funkcję wykresu wymiarowego (dimensional plot), aby zwizualizować klastrowanie komórek na wykresie UMAP, a reprezentatywny wynik tego kroku (Figure 1) pokazuje, że wszystkie komórki w zbiorze danych są zgrupowane wokół 8 głównych, kodowanych kolorami grup klastrów Seurat, przy czym uzyskano nieco różniące się wykresy UMAP z komputera z systemem Windows (lewa strona) i MacOS (prawa strona). W kroku 3.6 wykonuje się kolejną funkcję wykresu wymiarowego, aby zwizualizować adnotację czasu/przestrzeni rany dla komórek, a reprezentatywny wynik tego kroku (Figure 2) pokazuje, że wszystkie komórki w zbiorze danych są rozproszone zgodnie z ich pochodzeniem czasowym/przestrzennym, bez wyraźnego klastrowania zgodnie z adnotacją czasu/przestrzeni. Następnie protokół opisuje, jak uzyskać listy genów różnicowo wyrażanych i zapisać je w pliku tekstowym (krok 3.8), otworzyć tabelę danych w arkuszu kalkulacyjnym i przeprowadzić różne etapy filtrowania w celu uzyskania najwyżej sklasyfikowanych markerów klastra dla każdego klastra komórek (kroki 3.9-3.10.6). Reprezentatywnym wynikiem tych kroków (Supplementary Table 1) jest końcowy plik arkusza zawierający pełną listę sklasyfikowanych genów różnicowo wyrażanych, natomiast innym reprezentatywnym wynikiem (Supplementary Table 2) jest uproszczona tabela przedstawiająca 5 najwyżej nadekspresjonowanych i wyrażonych genów dla każdego klastra Seurat. Następnie protokół opisuje, jak użyć internetowego narzędzia do analizy wzbogacenia funkcjonalnego o nazwie EnrichR w celu zidentyfikowania prawdopodobnych typów komórek na podstawie głównych genów markerowych klastrów (kroki 3.11-3.12), a reprezentatywnymi wynikami tych kroków (Figure 3) są przycięte zrzuty ekranu z wyników EnrichR pokazujące najwyżej wzbogacone typy komórek dla każdego z ośmiu klastrów komórkowych. Protokół przypisuje następnie nową etykietę metadanych o nazwie „cell_types” do wszystkich komórek w odpowiednich klastrach Seurat zgodnie z ich najbardziej wzbogaconymi adnotacjami typów komórek (krok 3.14). W kroku 3.15 wykonuje się funkcję wykresu wymiarowego, aby zwizualizować przemianowane klastry komórek jako adnotacje typów komórek na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (Figure 4) wykazały, że wszystkie komórki w zbiorze danych zgrupowały się wokół głównych, kodowanych kolorami typów komórek. W kroku 3.16 użyto funkcji wykresu cech (feature plot) do wizualizacji lokalizacji głównych genów markerowych klastrów (z Supplementary Table 2) na serii wykresów UMAP, a reprezentatywnymi wynikami (Figure 5) są siatki wykresów UMAP pokazujące wysoką ekspresję głównych genów markerowych komórek w lokalizacjach ich odpowiednich klastrów głównych typów komórek. W krokach 3.17 i 3.18 wykonano funkcję wykresu kropkowego (dot plot), aby zwizualizować względne poziomy ekspresji głównych genów markerowych klastrów w komórkach, najpierw pogrupowanych według ich oryginalnych numerów klastrów Seurat (krok 3.17), a następnie pogrupowanych według adnotowanych etykiet typów komórek (krok 3.18). Reprezentatywne wyniki tych kroków potwierdziły wysoki poziom ekspresji głównych genów markerowych komórek tylko w ich odpowiednich klastrach Seurat (Supplementary Figure 6) i tylko w ich odpowiednich głównych typach komórek (Figure 6). Kolejny krok w protokole upraszcza oryginalne przestrzenno-czasowe etykiety białkowe do ściśle czasowych adnotacji, które identyfikują komórki na podstawie dni po zranieniu (DPW), z których pochodzą. W kroku 3.20 wykonuje się funkcję wykresu wymiarowego, aby zwizualizować komórki jako adnotacje DPW na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (Supplementary Figure 7) pokazały lokalizację adnotacji przebiegu czasowego rany w całym zbiorze danych dotyczącym gojenia ran w pojedynczych komórkach. Zgodnie z oczekiwaniami, adnotacje z dnia 1 (D1) dominowały w klastrach neutrofili i makrofagów, podczas gdy późniejsze punkty czasowe gojenia ran były bardziej reprezentowane w innych typach komórek. Kolejne kroki protokołu wykorzystały skumulowane wykresy słupkowe, aby najpierw zwizualizować proporcje DPW w różnych typach komórek (krok 3.22), a następnie zwizualizować proporcje typów komórek w różnych punktach czasowych (3.23). Reprezentatywnymi wynikami tych kroków są wykresy proporcji pokazujące wzglбольną liczbę komórek DPW w każdej głównej kategorii typów komórek (Supplementary Figure 8) oraz wzglбольną liczbę głównych typów komórek w każdej kategorii DPW (Figure 7). Wyniki te potwierdziły znaną kaskadę komórkową gojenia ran skóry, w której komórki odpornościowe (neutrofile i makrofagi) dominują w wczesnych punktach czasowych podczas fazy zapalnej, a inne typy komórek (komórki nabłonkowe i śródbłonkowe) zaczynają pojawiać się podczas fazy proliferacyjnej, przy czym fibroblasty są szczególnie dominujące w późniejszych punktach czasowych podczas ustępowania rany.

Zaczynając od metody nr 4, protokół opisuje kroki wykorzystania programu Seurat do skupienia się na pojedynczym głównym typie komórek w zbiorze danych z pojedynczych komórek, aby zidentyfikować potencjalne subtypy komórkowe podczas gojenia ran. Protokół koncentruje się na fibroblastach, które początkowo zostały pogrupowane w dwa klastry Seurat, zanim połączono je w jedną kategorię, i opisuje sposób utworzenia nowego obiektu Seurat zawierającego wyłącznie fibroblasty z oryginalnego zbioru danych (krok 4.1). Przepływ pracy Seurat jest wykonywany na tym specyficznym dla fibroblastów zbiorze danych (kroki 4.2-4.4), przy czym krok 4.2 skutkuje wykresem łokciowym (Supplementary Figure 9), wykazującym, że większość głównej zmienności w zbiorze danych fibroblastów występuje w obrębie pierwszych 9 wymiarów PCA. W kroku 4.5 wykonana zostaje funkcja wykresu wymiarowego w celu wizualizacji klastrowania komórek na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (Figure 8) pokazały fibroblasty w zbiorze danych pogrupowane wokół 3 zakodowanych kolorami subtype'ów komórkowych. Wizualizacja zbioru danych fibroblastów zgodnie z ich adnotacją DPW (krok 4.6) zaowocowała wykresem UMAP (Supplementary Figure 10), pokazującym fibroblasty w zbiorze danych rozproszone zgodnie z ich adnotacją DPW. Następnie protokół opisuje, jak uzyskać listy genów różnicowo wyrażonych i zapisać je w pliku tekstowym (krok 4.7), otworzyć tabelę danych w programie Excel i wykonać różne kroki filtrowania w celu uzyskania najwyżej sklasyfikowanych markerów klastrów dla każdego klastra komórkowego (krok 4.8) oraz przypisać nową zmienną wymieniającą najważniejsze geny markerowe fibroblastów o nazwie „FB_type_marker” (krok 4.9). W kroku 4.10 funkcja dot plot jest używana do wizualizacji genów z listy w zbiorze danych zawierającym tylko fibroblasty poprzez wywołanie zmiennej „FB_type_marker” w parametrze features, a reprezentatywnymi wynikami tego kroku (Figure 9) są wykresy punktowe potwierdzające wysoką ekspresję markerów subtype'ów fibroblastów wyłącznie w ich odpowiednich kategoriach klastrów (góra), ale dość równomiernie rozłożoną w kategoriach DPW (dół). W kroku 4.11 ta sama zmienna features jest wywoływana w celu wizualizacji genów markerowych fibroblastów w całym zbiorze danych dotyczących gojenia ran, a reprezentatywnym wynikiem (Supplementary Figure 11) jest wykres punktowy, który potwierdził wysoką ekspresję markerów subtype'ów fibroblastów głównie w oryginalnych fibroblastach. Na koniec kolejne kroki protokołu wykorzystują skumulowane wykresy słupkowe, aby najpierw zwizualizować proporcje DPW w trzech subtype'ach fibroblastów (krok 4.12), a następnie zwizualizować proporcje subtype'ów fibroblastów w różnych punktach czasowych (krok 4.13). Reprezentatywnymi wynikami tych kroków są wykresy proporcji pokazujące wzglbną liczbę komórek DPW w każdej kategorii subtype'u fibroblastów (Supplementary Figure 12) oraz wzglbną liczbę subtype'ów fibroblastów w każdej kategorii DPW (Supplementary Figure 13). Wyniki te wskazują na istotną zmianę w proporcjach subtype'ów fibroblastów w czasie gojenia, gdzie pierwszy subtype fibroblastów (klaster 0) dominuje w ranach we wczesnym stadium (D1 i D3), drugi subtype (klaster 1) dominuje podczas ustępowania rany (D14), a trzeci subtype (klaster 2) osiąga najwyższy poziom podczas fazy proliferacyjnej gojenia rany (D7).

Zaczynając od metody nr 5, protokół prowadzi przez kolejne kroki analizy zbioru danych z gojenia ran w pojedynczych komórkach z wykorzystaniem funkcji oceny modułów (module scoring function) w programie Seurat. Protokół opisuje najpierw kroki wykorzystania pliku tekstowego z separacją tabulatorami do przesyłania zestawów genów do zmiennych w środowisku R (kroki 5.1-5.2), a następnie zastosowanie funkcji oceny modułów do trzech zestawów genów związanych z trzema głównymi fazami gojenia ran (krok 5.3). W kroku 5.4 funkcja wykresu kropkowego (dot plot) jest używana do wizualizacji zagregowanych wyników modułów w obrębie dwóch różnych kategorii metadanych, a reprezentatywne wyniki dla tego kroku (Rysunek 10) to wykresy kropkowe przedstawiające średnią ekspresję modułów głównych faz gojenia w komórkach w kategorii dni po zranieniu (DPW, po prawej) oraz w kategorii głównych typów komórek (po lewej). Wyniki te pokazują, że zastosowanie profili ekspresji genów opartych na sekwencjonowaniu masowym (bulk sequencing) do zbiorów danych ekspresji pojedynczych komórek w sposób pseudo-masowy (pseudo-bulk) jest potężną metodą dla porównawczych podejść bioinformatycznych, wykorzystującą wcześniej opublikowane zbiory danych z dziedziny gojenia ran.

Zaczynając od metody nr 6, protokół opisuje kroki analizy zbioru danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek procesu gojenia ran, opracowanego w programie Seurat, przy użyciu pakietu i przepływu pracy CellChat w celu odpowiedzi na konkretne pytanie badawcze dotyczące porównania komórek pochodzących z wczesnej i późnej fazy gojenia ran. Protokół najpierw dzieli cały zbiór danych Seurat na dwa punkty czasowe po urazie: jeden podczas fazy zapalnej (dzień 1 (D1)) oraz drugi podczas fazy ustępowania rany (dzień 14 (D14)) (krok 6.1). Tworzone są dwa obiekty CellChat, a następnie protokół realizuje wszystkie typowe funkcje programu CellChat, aby obliczyć wszystkie domniemane interakcje między typami komórek zidentyfikowanymi w metodzie nr 3 protokołu (kroki 6.2-6.3). W kroku 6.4 wykonuje się funkcję wykresu rozrzutu sygnalizacji, aby zwizualizować siłę interakcji przychodzących i wychodzących we wszystkich głównych typach komórek w każdym punkcie czasowym gojenia rany. Reprezentatywne wyniki tego kroku (Rycina dodatkowa 14) to wykresy rozrzutu pokazujące siłę interakcji przychodzących (oś y) i wychodzących (oś x) dla głównych typów komórek w punktach czasowych D1 (lewo) i D14 (prawo). Wyniki te wykazały, że komórki odpornościowe, takie jak neutrofile i makrofagi, miały najwyższą siłę interakcji międzykomórkowych podczas fazy zapalnej, natomiast fibroblasty dominowały w interakcjach międzykomórkowych podczas ustępowania rany, co potwierdza wieloletnie badania nad gojeniem ran. Kolejne kroki koncentrują analizę na jednej z istotnie wzbogaconych ścieżek, tj. ścieżce kolagenu (kroki 6.5-6.6). W kroku 6.7 wykonuje się funkcję diagramu kołowego, aby zwizualizować interakcje w ścieżce sygnalizacji kolagenu między typami komórek w dwóch punktach czasowych. Reprezentatywne wyniki tego kroku (Rycina dodatkowa 15) to wykresy kołowe pokazujące domniemane interakcje sygnalizacji ścieżki kolagenu między wszystkimi typami komórek w D1 (lewo) i D14 (prawo). W kroku 6.8 te same interakcje są wizualizowane za pomocą funkcji diagramu chordowego, a reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 16) to diagramy chordowe pokazujące domniemane interakcje sygnalizacji ścieżki kolagenu między wszystkimi typami komórek w każdym punkcie czasowym. Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki te wykazały, że fibroblasty były głównymi komórkami źródłowymi dla ścieżki sygnalizacji kolagenu, choć przepływ informacji był bardziej ograniczony do komórek odpornościowych w D1 w porównaniu do D14. Aby skupić się na fibroblascie jako komórce źródłowej w interakcjach międzykomórkowych, w kroku 6.9 powtórzono funkcję diagramu chordowego, dodając parametr komórki źródłowej; reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 17) to diagramy chordowe pokazujące domniemane interakcje sygnalizacji ścieżki kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdym punkcie czasowym. W kroku 6.10 wykonuje się dwie funkcje w celu wizualizacji wkładu każdej pary ligand-receptor w ścieżce sygnalizacji kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi: jedną z użyciem wykresów bąbelkowych (krok 6.10.1), a drugą z użyciem diagramów chordowych (krok 6.10.2). Reprezentatywne wyniki pokazują domniemany wkład każdej pary ligand-receptor w sygnalizacji ścieżki kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w punktach czasowych D1 (lewo) i D14 (prawo), przy użyciu zarówno wykresów bąbelkowych (Rycina dodatkowa 18), jak i diagramów chordowych (Rycina dodatkowa 19). Wyniki te wykazały, że w D1 ścieżka kolagenu pochodząca z fibroblastów była ograniczona do neutrofili i makrofagów z dominacją receptorów Cd44 i Sdc4, natomiast w D14 inne komórki pełniły rolę odbiorców poprzez różnorodne receptory, w tym integryny. Aby skupić się na interakcji ligand-receptor Col1a1-Cd44, która wykazała wysoką siłę w interakcjach fibroblastów, ustawiono odpowiedni parametr (krok 6.11), a następnie wykorzystano go w kroku 6.12 w funkcji diagramu chordowego do wizualizacji tej konkretnej interakcji ligand-receptor między wszystkimi typami komórek; reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 20) to diagramy chordowe pokazujące domniemane interakcje ligand-receptor Col1a1-Cd44 między wszystkimi typami komórek w punktach czasowych D1 (lewo) i D14 (prawo). Wyniki te wykazały, że o ile w D1 interakcja ta ogranicza się do fibroblastów jako komórek źródłowych, o tyle w D14 makrofagi i komórki mięśni gładkich również pełnią funkcję komórek źródłowych. Następnie protokół opisuje sposób przeprowadzenia różnicowej analizy CellChat, zaczynając od połączenia obiektów CellChat dla D1 i D14 (krok 6.13). W kroku 6.14 wykonuje się funkcję porównania interakcji, aby zwizualizować całkowitą liczbę i względną siłę interakcji międzykomórkowych między dwoma punktami czasowymi gojenia rany; reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 21) to wynikowe wykresy słupkowe pokazujące całkowitą liczbę (lewo) i siłę (prawo) domniemanych interakcji w komórkach tworzących rany w D1 i D14, z większą liczbą interakcji w D14 w przeciwieństwie do większej względnej siły interakcji w D1. W krokach 6.15 i 6.16 zastosowano dwie funkcje do wizualizacji różnic w sile interakcji międzykomórkowych między poszczególnymi typami komórek w miarę przejścia rany z dnia 1. do dnia 14., wraz z odpowiadającymi im reprezentatywnymi wynikami: pierwszą jest wykres kołowy (krok 6.15, Rycina dodatkowa 22), a drugą mapa ciepła (krok 6.16, Rycina dodatkowa 23), gdzie zwiększone interakcje w D14 w porównaniu do D1 są zaznaczone na czerwono, a zmniejszone na niebiesko. Zgodnie z oczekiwaniami, interakcje pośredniczone przez neutrofile i makrofagi są zwiększone w D1, a interakcje pośredniczone przez fibroblasty zwiększone w D14. W kroku 6.17 funkcja rankingu służy do stworzenia wykresu, który szereguje względny wkład poszczególnych ścieżek w interakcje międzykomórkowe z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w D14 w porównaniu do D1; reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 24) pokazują wynikowy wykres rankingowy, na którym D1 jest reprezentowany na górze na czerwono, a D14 na dole na niebiesko, przy czym kilka ścieżek jest reprezentowanych wyłącznie w D1 lub D14, a wiele innych wykazuje gradient aktywacji. Na koniec, w kroku 6.18, zastosowano dwie funkcje wykresów bąbelkowych, aby pokazać względny wkład poszczególnych par ligand-receptor w ścieżce sygnalizacji kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w D14 w porównaniu do D1; odpowiadające im reprezentatywne wyniki (Rycina dodatkowa 25) pokazują zwiększone (lewo) i zmniejszone (prawo) pary sygnałowe w D14 w porównaniu do D1 w wielu interakcjach międzykomórkowych na osi x. Zgodnie z oczekiwaniami, fibroblasty wykazały znacznie więcej zwiększonych interakcji wychodzących par ligand-receptor w wielu komórkach odbiorczych w ranach w D14 w porównaniu do ran w D1, gdzie komunikacja podczas fazy zapalnej była bardziej ograniczona do neutrofili i makrofagów.

Zaczynając od metody nr 7, protokół przeprowadza przez kolejne kroki integracji dwóch zbiorów danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek w procesie gojenia ran przy użyciu oprogramowania Seurat. W pierwszej kolejności protokół opisuje etapy łączenia dwóch partii opublikowanych zbiorów danych single-cell oraz zastosowania standardowego przepływu pracy Seurat do połączonego zbioru danych (kroki 7.1–7.4). W kroku 7.5 funkcja wykresu wymiarowego służy do wizualizacji wykresu UMAP zgodnie z numerami klastrów i partii połączonego, ale niepoddanego jeszcze integracji zbioru danych o gojeniu ran. Reprezentatywne wyniki z tego etapu (Rycina uzupełniająca 26) to wykresy UMAP wizualizujące rozkład klastrów Seurat (po lewej) oraz numerów partii (po prawej), co wskazuje, że przed integracją danych nie występuje żadnych istotnych efektów partii dla tych dwóch zbiorów. Następnie protokół wykonuje integrację danych przy użyciu metody RPCA oraz kolejny etap przepływu pracy Seurat dla zintegrowanego zbioru danych (kroki 7.7–7.8). W kroku 7.9 funkcja wykresu wymiarowego zostaje użyta do wizualizacji wykresu UMAP w zależności od numerów klastrów i partii zintegrowanego zbioru danych o gojeniu ran. Reprezentatywne wyniki z tego etapu (Rycina uzupełniająca 27) to wykresy UMAP wizualizujące rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów partii (po prawej), wykazujące teraz jeszcze większy stopień nakładania się dwóch partii w różnych klastrach. Wyniki pokazują również pojawienie się dodatkowego klastra po integracji danych, co może wskazywać na zwiększoną zdolność do identyfikacji potencjalnie istotnych podtypów komórek po skontrolowaniu technicznych efektów partii danych.

Porównanie klastrów UMAP w systemach Windows i MacOS, seurat_clusters, wykres wizualizacji danych.
Rysunek 1: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zbiorze danych pogrupowane w 8 głównych grup klastrów oznaczonych kolorami. Wyniki uzyskane na komputerze z systemem Windows (po lewej) i MacOS (po prawej). Rysunek ten odpowiada krokowi 3.5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Diagram wyników UMAP; wizualizacja danych po redukcji wymiarowości; klastry rozróżnione kolorami.
Rysunek 2: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zbiorze danych rozłożone zgodnie z ich pochodzeniem czasowym/przestrzennym, bez widocznego klastrowania według adnotacji czasowej/przestrzennej. Ten rysunek odpowiada krokowi 3.6. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy markerów komórkowych, klastry przedstawiają rozkład genów w bazach danych w celu porównania DEG.
Rycina 3: Wykadrowane zrzuty ekranu z wyników EnrichR, przedstawiające najsilniej wzbogacone typy komórek dla każdego klastra komórkowego. Ta rycina odpowiada krokowi 3.13. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Diagram UMAP typów komórek; makrofag, neutrofil, fibroblast. Analiza redukcji wymiarowości.
Rycina 4: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zbiorze danych zgrupowane wokół głównych, zakodowanych kolorami typów komórek. Ta rycina odpowiada krokowi 3.15. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram ekspresji genów UMAP; analiza Arg1, Retnlg, Fgf7, Dsp, Tie1, Cd3g, Cdh4, Rgs5.
Rycina 5: Siatka wykresów UMAP przedstawiająca wysoką ekspresję głównych genów markerowych komórek w obrębie głównych klastrów typów komórek. Ta rycina odpowiada krokowi 3.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres kropkowy ekspresji genów markerowych dla typów komórek, przedstawiający średnią ekspresję oraz procent ekspresji w poszczególnych cechach.
Rysunek 6: Wykresy kropkowe potwierdzające wysoki poziom ekspresji głównych genów markerowych komórek wyłącznie w ich odpowiednich głównych typach komórek. Ten rysunek odpowiada krokowi 3.18. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy proporcji typów komórek; śródbłonkowe, nabłonkowe, fibroblasty, makrofagi, neutrofile, mięśnie gładkie, limfocyty T.
Rysunek 7: Wykres proporcji przedstawiający wzglбольną liczbę głównych typów komórek w każdej kategorii DPW. Ta ilustracja odpowiada krokowi 3.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres klastrowania UMAP; seurat_clusters; wizualizacja danych; redukcja wymiarowości; analiza ekspresji genów.
Rycina 8: Wykres UMAP przedstawiający fibroblasty w zbiorze danych zgrupowane wokół 3 podtypów komórek oznaczonych kolorami. Ta rycina odpowiada krokowi 4.5. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres punktowy ekspresji genów; wizualizacja procentowej i średniej ekspresji; diagram; analiza danych.
Rysunek 9: Wykresy punktowe potwierdzające wysoką ekspresję markerów podtypów fibroblastów wyłącznie w ich odpowiednich kategoriach klastrów, przy jednoczesnym dość równomiernym rozkładzie w kategoriach DPW. Ten rysunek odpowiada krokowi 4.10. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres bąbelkowy poziomów ekspresji komórkowej; cechy: zapalne, proliferacyjne, rozdzielcze; dane: tożsamość, procent ekspresji, średnia ekspresja.
Rysunek 10: Wykresy kropkowe przedstawiające średnią ekspresję głównych modułów fazy gojenia w komórkach w zależności od DPW oraz głównych typów komórek. Ten rysunek odpowiada krokowi 5.4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Wyniki wykazujące dość równomierny rozkład wykrytych genów dla każdego kodu kreskowego, co jest istotne dla integralności zbioru danych i późniejszej analizy punktów czasowych gojenia ran. Ta rycina odpowiada krokowi 2.6.11. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 2: Wykresy rozrzutu wykazujące obecność licznych komórek o dużej zawartości mitochondriów, co koreluje z niską liczbą RNA — są to komórki martwe lub obumierające. Rysunek ten odpowiada krokowi 2.10. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 3: Wykresy rozrzutu wykazujące, że rozkład wykrytych genów oraz procentowa zawartość mitochondrialnego RNA na komórkę są teraz bardziej zbliżone do rozkładu normalnego, co umożliwia przeprowadzenie wiarygodnych analiz w dalszych etapach. Ta rycina odpowiada krokowi 2.12.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 4: Wykres skrzypcowy pokazujący, że istnieje szereg komórek z relatywnie wysokim wskaźnikiem doubletów i że wartość 0,25 wydaje się być naturalnym punktem odcięcia, powyżej którego znajduje się populacja prawdopodobnych doubletów. Rysunek ten odpowiada krokowi 2.15. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 5: Wykres łokciowy pokazujący, że znaczna część głównej wariancji występuje w pierwszych 13 wymiarach.Rycina ta odpowiada krokowi 3.2. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 6: Wykres kropkowy potwierdzający wysoki poziom ekspresji najważniejszych genów markerowych komórek wyłącznie w ich odpowiednich klastrach Seurat.Rysunek ten odpowiada krokowi 3.17. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 7: Wykres UMAP przedstawiający lokalizację adnotacji przebiegu czasowego rany w całym zbiorze danych dotyczącym gojenia ran. Ten rysunek odpowiada krokowi 3.20. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 8: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę komórek DPW w każdej głównej kategorii typów komórek. Ten rysunek odpowiada krokowi 3.22.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 9: Wykres łokcia wskazujący, że większość głównej zmienności w zbiorze danych fibroblastów występuje w obrębie pierwszych 9 wymiarów. Ta rycina odpowiada krokowi 4.2. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 10: Wykres UMAP przedstawiający fibroblasty w zbiorze danych, rozdzielone zgodnie z ich adnotacją DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 4.6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 11: Wykres kropkowy potwierdzający wysoką ekspresję markerów podtypów fibroblastów głównie w oryginalnej grupie fibroblastów. Ten rysunek odpowiada krokowi 4.11. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 12: Wykres proporcji przedstawiający wzglbną liczbę podtypów fibroblastów w każdej kategorii DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 4.12. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 13: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę fibroblastów w każdym podtypie fibroblastów w zależności od DPW. Ten rysunek odpowiada krokowi 4.13. Aby pobrać ten rysunek, kliknij tutaj.

Rycina uzupełniająca 14: Wykresy rozrzutu przedstawiające siłę oddziaływań przychodzących (oś y) i wychodzących (oś x) dla głównych typów komórek w punktach czasowych dzień 1 (D1, lewo) i dzień 14 (D14, prawo). Rycina ta odpowiada krokowi 6.4. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 15: Wykresy kołowe przedstawiające wnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu pomiędzy wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW. Rysunek ten odpowiada krokowi 6.7. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 16: Diagramy strunowe przedstawiające wnioskowane interakcje sygnalizacyjne ścieżki kolagenu pomiędzy wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW. Ten rysunek odpowiada krokowi 6.8. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 17: Diagramy chordowe przedstawiające wnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Rysunek ten odpowiada krokowi 6.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 18: Wykresy bąbelkowe przedstawiające wnioskowane wkłady każdej pary ligand-receptor w sygnałach ścieżki kolagenowej z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 6.10.1. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 19: Diagramy chordowe przedstawiające wnioskowany wkład każdej pary ligand-receptor w sygnalizacji szlaku kolagenowego z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 6.10.2. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 20: Diagramy chordowe przedstawiające wnioskowane oddziaływania ligand-receptor Col1a1-Cd44 pomiędzy wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW.Ta rycina odpowiada krokowi 6.12. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 21: Wykresy słupkowe przedstawiające liczbę (lewo) i siłę (prawo) wnioskowanych interakcji w ranach w 1. i 14. dniu. Rycina ta odpowiada krokowi 6.14. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 22: Wykres kołowy przedstawiający różnice w sile oddziaływań międzykomórkowych pomiędzy poszczególnymi typami komórek w trakcie gojenia rany od 1. dnia (kolor niebieski) do 14. dnia (kolor czerwony) DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 6.15. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 23: Mapa ciepła przedstawiająca różnice w sile interakcji między poszczególnymi typami komórek w miarę gojenia rany od 1. dnia (kolor niebieski) do 14. dnia (kolor czerwony) DPW. Rysunek ten odpowiada krokowi 6.16. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 24: Wykres rangowy przedstawiający względny wkład poszczególnych szlaków w interakcje międzykomórkowe między fibroblastami a innymi typami komórek w 1. kontra 14. dniu DPW. Ta rycina odpowiada krokowi 6.17. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 25: Wykresy bąbelkowe przedstawiające względny wkład poszczególnych par ligand-receptor w ścieżce sygnałowej kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w 1. dniu vs 14. dniu DPW. Ten rysunek odpowiada krokowi 6.18. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 26: Wykresy UMAP przedstawiające rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów serii (po prawej) przed integracją danych. Ta rycina odpowiada krokowi 7.5. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 27: Wykresy UMAP przedstawiające rozkład klastrów Seurat (po lewej) oraz numerów partii (po prawej) po integracji danych. Rycina ta odpowiada krokowi 7.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Plik uzupełniający 1: JoVE_Rscript.R: Główny plik ze skryptem kodu R, który zawiera wszystkie kroki i objaśnienia opisane dla wszystkich części protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt. Plik tekstowy rozdzielany tabulatorami, który zawiera listy genów ładowanych w kroku 5.1 protokołu. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Plik uzupełniający 3: JoVE_Rscript_b3.R. Uzupełniający plik ze skryptem w języku R, który zawiera wszystkie kroki i wyjaśnienia niezbędne do analizy partii nr 3 zbioru danych do wykorzystania w kroku 7.1 protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx. Plik Excel zawierający pełne zestawienie sklasyfikowanych genów o różnej ekspresji wykorzystanych w kroku 3.10 protokołu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: 5 najwyżej upregulowanych i wykazujących ekspresję genów dla każdego klastra Seurat. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tym protokole program RStudio służy do uruchamiania określonych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu usługi Seurat. Przedstawiono kilka metod, które są istotne dla badań nad gojeniem się ran, w tym instalację środowiska kodowania R, pobieranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych, wykonywanie krytycznych etapów kontroli jakości i standardowych przepływów pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje, adnotacje głównych typów komórek, analizy podtypów komórek i analizy integracyjne przy użyciu Seurat oraz wykonywanie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.

Metody przedstawione w niniejszym dokumencie są uproszczonymi winietami typowych przepływów pracy dla analizy pojedynczej komórki przy użyciu języka R i jego popularnych pakietów naukowych typu open source, Seurat21 i CellChat22. Rzeczywiście, przepływ pracy jest tylko jednym z przykładów rodzaju analizy, którą można przeprowadzić za pomocą złożonego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych. Możliwe modyfikacje tej metody są niemal nieograniczone, a jedynym ograniczeniem jest konkretne dociekania naukowe użytkownika. Na przykład użytkownik może zmienić niektóre z kluczowych parametrów, takich jak typy komórek i punkty czasowe, zgodnie z pytaniami badawczymi, które może chcieć zadać temu zestawowi danych. Autorzy mają również nadzieję, że użytkownik czuje się na tyle komfortowo, aby dostosować ten przepływ pracy do własnego zestawu danych jednokomórkowych, który go interesuje; Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z tego przepływu pracy do analizowania innych zestawów danych, ponieważ każdy eksperyment może powodować problemy techniczne i związane z przygotowaniem próbki na same dane. Dlatego konieczne jest, aby użytkownik przeczytał i zrozumiał wszystkie szczegóły eksperymentu przed interpretacją wyników wcześniej opublikowanych i ponownie przeanalizowanych zestawów danych jednokomórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że narzędzia bioinformatyczne są potężną metodą badania procesów biologicznych i generowania hipotez, a wszelkie krytyczne biologiczne interpretacje wyników muszą zostać zweryfikowane w dalszych eksperymentach.

W całym protokole należy pamiętać, że w niektórych obszarach przepływu pracy mogą zostać wprowadzone poważne modyfikacje w celu wykonania innych zadań. Jednak szczegóły dotyczące wszystkich możliwych kombinacji modyfikacji przepływu pracy wykraczają poza zakres tego manuskryptu. Na przykład rozdzielczość używana do grupowania komórek i wymiary używane do analizy UMAP są z konieczności subiektywne, a przedstawione tutaj narzędzia pozwalają zarówno na analizy na dużą skalę (jak wykazano tutaj dla szeroko zdefiniowanych głównych typów komórek), jak i bardzo szczegółowe analizy, które mogą pociągać za sobą subgrupowanie komórek w rzadsze subpopulacje w ramach większego zbioru danych. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego aspektu metody analizy pojedynczej komórki oraz szczegółowe informacje na temat wszystkich innych parametrów, które mogą zostać zmienione w potoku analizy pojedynczej komórki, autorzy odsyłają użytkownika do publikacji Seurat21,26 i strony internetowej (https://satijalab.org/seurat/), gdzie autorzy tego rozwijającego się narzędzia udostępniają szczegółowe wyjaśnienia, winiety i samouczki.

Manuskrypt ten wprowadził niektóre z najczęściej cytowanych i używanych narzędzi w literaturze dotyczącej transkryptomiki pojedynczej komórki, a mianowicie Seurat21 i CellChat22, odpowiednio do analiz interakcji pojedynczych komórek i komórek-komórek. Istnieją jednak inne narzędzia, które wykonują podobne funkcje w nieco inny sposób. Do analizy zestawów danych w pojedynczej komórce dostępne są Scran27, Scater 28 i ScanPy29 oparty na języku Python, które wykorzystują różne metody integracji zestawu danych25. W tym protokole zademonstrowano ręczną adnotację typów komórek, która opiera się na ocenie użytkownika w celu interpretacji wzbogacenia markerów komórek klastrowych, ale obecnie istnieją różne narzędzia umożliwiające automatyczną klasyfikację typów komórek, takie jak między innymi SingleR30 i scGate31. W przypadku analiz komunikacji komórka-komórka, CellChat został zademonstrowany w tym protokole, ale istnieją inne narzędzia do szacowania komunikacji komórka-komórka, w tym CellPhoneDB32, Cytotalk33 i inne bazy danych ligand-receptor, które są zaimplementowane w ramach konsensusu LIANA (LIgand-receptor ANalysis framework)34. Wszystkie narzędzia bioinformatyczne są unikalne i mają swoje własne cechy charakterystyczne i modyfikowalne parametry. Dlatego ważne jest, aby użytkownik uważnie przeczytał powiązaną dokumentację każdego narzędzia, aby zrozumieć jego niuanse przed interpretacją jakichkolwiek danych wyjściowych wygenerowanych w wyniku ich użycia. Wreszcie, niezależnie od tego, jakich narzędzi bioinformatycznych się używa, ważne jest, aby pamiętać, że takie narzędzia stale ewoluują i że różne wersje pakietów mogą dawać różne wyniki.

W R składnia ma kluczowe znaczenie, a źle umieszczona interpunkcja, cudzysłów, nawias kwadratowy, a nawet nieprawidłowo wielka litera spowoduje błąd. Dlatego ważne jest, aby użytkownik zwracał uwagę na szczegóły podczas wpisywania kodu i był szczególnie uważny podczas kopiowania wierszy kodu, aby dostosować go do nowych pytań naukowych i zestawów danych. Aby rozwiązać konkretne błędy, które można napotkać, autorzy zalecają po prostu skopiowanie i wklejenie komunikatu o błędzie do ulubionej wyszukiwarki internetowej użytkownika i przejrzenie wyników z forów bioinformatycznych, takich jak GitHub i Stack Overflow, ponieważ najczęściej spotykane błędy prawdopodobnie zostały już rozwiązane przez doświadczonego zaawansowanego użytkownika. Na niektórych forach najbardziej udane odpowiedzi są "zagłosowane" przez innych użytkowników, którzy uznali rozwiązanie za najlepsze dla danego problemu. Użytkownik musi uważać, aby po prostu nie skopiować i nie wkleić wierszy kodu, które znalazł w Internecie, do własnego komputera (zwłaszcza jeśli rozwiązanie wymaga zmiany ustawień systemowych poza językiem programowania R), ponieważ istnieje ryzyko, że takie programy mogą być złośliwe. Ekscytującą pojawiającą się metodą rozwiązywania problemów z błędami w kodowaniu jest korzystanie z potężnych generatywnych modeli sztucznej inteligencji w dużym języku, takich jak ChatGPT firmy OpenAI, Copilot firmy Microsoft lub Gemini firmy Google. Modele te okazały się szczególnie przydatne w inżynierii oprogramowania w ogóle, a w szczególności w rozwiązywaniu problemów. W tym celu użytkownik może kopiować i wklejać całe wiersze swojego kodu po dostarczeniu prostego monitu do chatbota o zamiarze użytkownika dotyczącego kodu. Zwykle istnieje zastrzeżenie, że modele te nie są niezawodne, a użytkownik może być zmuszony do wypróbowania wielu podpowiedzi w celu wygenerowania odpowiedzi, która jest odpowiednia do rozwiązania problemu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Laboratorium M.S. Wietecha otrzymało dofinansowanie z grantu NIH/NIGMS R35-GM154921, Wound Healing Society Research Grant oraz Wydziału Biologii Jamy Ustnej w UIC College of Dentistry.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laptop lub komputer stacjonarnyN/AN/AUruchamianie systemu Windows lub MacOS 
RN/AWersja 4.4.1Do pobrania za darmo z https://cran.rstudio.com/
Rstudio (rstudio)Oprogramowanie Posit, PBCWersja 2024.09.0Do pobrania za darmo z https://posit.co/download/rstudio-desktop/
Office ExcelFirmy MicrosoftDowolna wersjaDo analizy danych tabelarycznych
Przeglądarka internetowaN/AN/ADo przechodzenia do stron internetowych
R PakietyRepositoryVersion
Narzędzia deweloperskieCRAN2.4.5
readxl (biblioteka readxl)CRAN1.4.3
Biblioteka OpenxlsxCRAN4.2.7.1
tidyverse (Świat Tidy)CRAN2.0.0
scDostosujCRAN2.1.2
BiocManagerBioprzewodnik1.30.25
Sieć NMFBioprzewodnik0.28
ZłożonaMapa ciepłaBioprzewodnik2.20.0
BiocSąsiedziBioprzewodnik1.22.0
Eksperyment z pojedynczą komórkąBioprzewodnik1.26.0
cyrkulacjaBioprzewodnik0.4.16
krawędź RBioprzewodnik4.2.1
scDblFinder powiedział:Bioprzewodnik1.18.0
Seurat powiedział:CRAN5.1.0
Czat komórkowySerwis Github2.1.2

Bibliografia

  1. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
  2. Wietecha, M. S., et al. Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes. Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).
  3. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).
  4. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
  5. Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. (162), e61616(2020).
  6. Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).
  7. Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).
  8. Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).
  9. Leonardo, T. R., et al. Transcriptional changes in human palate and skin healing. Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).
  10. Rognoni, E., et al. Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing. Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).
  11. Bergmeier, V., et al. Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds. Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).
  12. Plikus, M. V., et al. Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing. Science. 355 (6326), 748-752 (2017).
  13. Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), aar2971(2018).
  14. Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), aaa2151(2015).
  15. Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nat Commun. 10 (1), 650(2019).
  16. Gay, D., et al. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing. Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).
  17. Haensel, D., et al. Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics. Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).
  18. Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts. Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).
  19. Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
  20. Hu, K. H., et al. Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer. Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).
  21. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  22. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).
  23. Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder. F1000Research. 10, 979(2021).
  24. Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).
  25. Luecken, M. D., et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).
  26. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  27. Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Research. 5, 2122(2016).
  28. McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).
  29. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19 (1), 15(2018).
  30. Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
  31. Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets. Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).
  32. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  33. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data. Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).
  34. Dimitrov, D., et al. Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data. Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza Seuratprzepływ pracy CellChatzbiór danych skóry myszyadnotacja typów komórekwizualizacja UMAPróżnicowa ekspresja genówkomunikacja międzykomórkowabioinformatyczny przepływ pracy
Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.