Method Article

Używanie R, Seurat i CellChat do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczych komórek gojenia się ran skóry myszy

DOI:

10.3791/67266

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Oral Biology, College of Dentistry, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku, wizualny przepływ pracy do analizy zestawu danych transkryptomicznych pojedynczej komórki w czasie gojenia się ran skóry myszy przy użyciu R. Protokół obejmuje standardowy potok do pobierania zestawów danych, kontroli jakości, wizualizacji i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat oraz analizy interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces gojenia się ran jest regulowany przez złożone interakcje między różnymi typami komórek w przestrzeni i czasie. Poprzez profilowanie pojedynczych komórek w ich złożonym środowisku, metody transkryptomiki pojedynczej komórki umożliwiają badanie heterogeniczności komórkowej, sieci komunikacji komórkowej i interakcji komórka-komórka zaangażowanych w proces gojenia się ran. Jednak wiele narzędzi do analizy pojedynczych komórek jest uruchamianych w środowisku kodowania komputerowego, a ich szersze zastosowanie przez naukowców zajmujących się leczeniem ran jest udaremnione przez pozorny brak wiedzy bioinformatycznej. W związku z tym przedstawiono przepływ pracy krok po kroku pokazujący, jak używać graficznego środowiska kodowania o nazwie RStudio do wykonywania podstawowej analizy pojedynczej komórki zestawu danych czasowego gojenia ran skóry myszy wycinających. Ten wizualny i kierowany protokół umożliwi naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego pobranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran, wykonanie krytycznych kroków kontroli jakości, uruchomienie standardowego przepływu pracy analizy pojedynczej komórki, w tym wizualizacji zestawów danych i adnotacji typów komórek za pomocą Seurat, przeprowadzenie analiz podtypów komórek, przeprowadzenie analiz punktacji modułów, przeprowadzenie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat oraz przeprowadzenie integracyjnych analiz wielu zestawów danych za pomocą Seurat. Wyjaśnienia narracyjne są dostarczane dla każdego kroku w protokole, a wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są prezentowane, aby bezpiecznie przeprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Celem tego wizualnego wprowadzenia do procesu analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran korzystania z narzędzi bioinformatycznych bezpośrednio w ich własnych laboratoriach, aby ułatwić głębsze analizy własnych zestawów danych jednokomórkowych, a także bardziej powszechne ponowne analizy wcześniej opublikowanych zestawów danych jednokomórkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gojenie się ran jest jednym z najbardziej złożonych procesów w biologii ssaków i obejmuje spektrum trzech faz gojenia: zapalnej, proliferacyjnej i rozdzielczości 1,2. Te fazy gojenia szeroko klasyfikują skoordynowane działania dziesiątek typów komórek i setek ich produktów molekularnych w przestrzeni i czasie gojenia się ran3. Kilka dekad badań histologicznych i molekularnych opartych na próbkach tkanek ran w całym okresie gojenia wyjaśniło nadrzędne wzorce komórkowe naprawy tkanek3, szczególnie w odtwarzalnych mysich modelach gojenia się ran skóry 4,5,6. Dopiero w ciągu ostatnich dwóch dekad możliwe stało się pełniejsze docenienie złożoności gojenia się ran, począwszy od pojawienia się wysokoprzepustowych analiz transkryptomicznych ran w skali tkanekmasowych 7,8,9 i komórek 10,11,12,13,14. Ostatnio w kilku badaniach sprofilowano transkrypcyjnie rany skóry na poziomie pojedynczych komórek, identyfikując nowe podtypy komórek rany i pokazując, w jaki sposób mogą one wchodzić ze sobą w interakcje podczas gojenia 15,16,17,18,19,20. Hu i in. wykorzystali innowacyjne podejście do sekwencjonowania przestrzennego jednokomórkowego RNA do profilowania ran skóry w czasie gojenia w kilku promieniowych odległościach od centrum rany, co ujawniło nowe "ruchy" międzykomórkowe i molekularne w przestrzeni i czasie20. Takie badania odkrywają złożoność gojenia się ran w niespotykanych dotąd szczegółach i zaczynają malować obraz ogromnej różnorodności komórkowej i molekularnej.

Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie metod analizy bioinformatycznej umożliwiają biologiczne zrozumienie złożonych multiomicznych zestawów danych generowanych w dziedzinie badań nad gojeniem się ran. Pakiety do analizy pojedynczych komórek, takie jak Seurat, zapewniają narzędzia do solidnej analizy i integracji zestawów danych, w tym klasyfikacji typów komórek w złożonych tkankach, takich jak rany21. Do dalszej interpretacji danych z pojedynczych komórek narzędzia takie jak CellChat są używane do identyfikacji przypuszczalnych programów interakcji komórka-komórka, które mogą wyjaśnić, w jaki sposób komórki koordynują się w celu naprawy ran22. Chociaż narzędzia te są dobrze udokumentowane i dobrze cytowane, muszą być uruchamiane w środowisku kodowania komputerowego, takim jak R, statystyczny i graficzny język programowania, który jest najczęściej używany w dziedzinach bioinformatyki genomiki i transkryptomiki. Podczas gdy biolodzy i klinicyści zajmujący się gojeniem ran coraz częściej stosują podejścia jednokomórkowe do badania naprawy tkanek, niewielu z nich ma wykształcenie bioinformatyczne wymagane do korzystania z narzędzi takich jak Seurat i CellChat bezpośrednio we własnych laboratoriach. Taka bariera w korzystaniu z tych narzędzi bioinformatycznych nie tylko uniemożliwia naukowcom głębszą analizę własnych zbiorów danych bez pomocy bioinformatyków, ale także uniemożliwia naukowcom wiarygodną ponowną analizę bogactwa danych z pojedynczych komórek, które zostały już opublikowane przez inne grupy.

W związku z tym przedstawiono tutaj przepływ pracy krok po kroku, aby umożliwić naukowcom bez doświadczenia bioinformatycznego analizę wcześniej opublikowanego i publicznie dostępnego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych20. Protokół korzysta z powszechnego i bezpłatnego graficznego środowiska kodowania języka R o nazwie RStudio i pokazuje, jak poruszać się po tym środowisku w celu uruchamiania zalecanych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu Seurat i CellChat. W ramach tego protokołu przedstawiono siedem głównych metod istotnych dla badań nad gojeniem się ran, w tym: 1) instalację środowiska kodowania, 2) pobieranie zestawu danych i krytycznych etapów kontroli jakości, 3) przepływy pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje i adnotacje typów komórek, 4) analizy podtypów komórek, 5) analizy punktacji modułów, 6) analizy interakcji komórka-komórka oraz 7) analizy integracyjne wielu zestawów danych. W ramach każdej metody dostarczany jest rzeczywisty kod, który użytkownik może uruchamiać równolegle z protokołem, a rzeczywiste wyniki graficzne z każdego wiersza kodu są wyświetlane, aby poprowadzić użytkownika przez przepływ pracy. Głównym celem tego wizualnego wprowadzenia do RStudio i podstawowego przepływu pracy analizy pojedynczych komórek jest umożliwienie większej liczbie naukowców zajmujących się gojeniem ran bezpośredniego korzystania z tych potężnych narzędzi, aby umożliwić szybszy postęp w dziedzinie badań.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWIEJ: W poniższych przepływach pracy szczegółowo opisano siedem metod bioinformatycznych, przy czym wszystkie kroki protokołów są dostępne jako odpowiednie fragmenty kodu, które powinny być uruchamiane bezpośrednio w interfejsie użytkownika RStudio w kolejności, w jakiej są wymienione. Aby uprościć ten protokół, dołączono plik skryptu R (Dodatkowy plik 1: JoVE_Rscript.R), który można załadować bezpośrednio do sesji użytkownika w RStudio, aby każdy wiersz kodu można było po prostu uruchomić. Dzięki temu użytkownik nie musi wpisywać ani kopiować i wklejać kodu z dokumentu protokołu, co mogłoby prowadzić do błędów. Wszystkie instrukcje protokołu są również zawarte w pliku skryptu R w postaci komentarzy, oznaczonych symbolem hashtagu '#' na początku każdego wiersza komentarza.

1. Instalowanie R, RStudio oraz wymaganych pakietów R dla pojedynczej analizy komórkowej

  1. Pobierz i zainstaluj R (wersja 4.4.1) na komputerze. Użyj łącza odpowiadającego systemowi operacyjnemu komputera.
    1. Jeśli korzystasz z komputera z systemem Microsoft Windows, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/
    2. Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/macosx/
  2. Zainstaluj najnowszą wersję RStudio na komputerze. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami:
    https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/#download
  3. Zainstaluj Rtools (wersja 4.4), które pozwolą R na skompilowanie niektórych pakietów. Kliknij na następujący link i postępuj zgodnie z instrukcjami:
    1. Jeśli korzystasz z Windows, użyj tego linku: https://cran.rstudio.com/bin/windows/Rtools/
    2. Jeśli korzystasz z MacOS, użyj tego linku:
      https://mac.r-project.org/tools/
  4. Ustaw lokalny katalog roboczy; jest to folder na komputerze, z którego wszystkie pliki będą wczytywane i zapisywane. Ustaw katalog roboczy, wybierając Sesja w menu paska narzędzi RStudio i klikając Ustaw katalog roboczy > Wybierz katalog oraz wybierając żądany folder.
    1. Jeśli korzystasz z komputera z systemem Windows, użyj następującego polecenia, aby ustawić katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/"
      setwd("C:/[Katalog]")
    2. Jeśli korzystasz z komputera z systemem MacOS, następujące polecenie również ustawia katalog roboczy. Zmień [Katalog] w poniższym wierszu kodu na rzeczywistą strukturę katalogu. Pamiętaj, że separatorem katalogów w R jest znak "/"
      setwd("~/[Katalog]")
    3. W dowolnym momencie sesji R sprawdź katalog roboczy, używając następującego wiersza kodu:
      getwd()
    4. W RStudio wizualnie przeglądaj strukturę katalogu roboczego, w tym wszystkie zawarte w nim pliki i foldery, w prawym oknie w zakładce Pliki . Aby przejść do eksploratora plików RStudio do katalogu roboczego, kliknij ikonę koła zębatego -> Przejdź do katalogu roboczego.
  5. Zainstaluj następujące pakiety z repozytorium pakietów R CRAN, które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia.
    install.packages("devtools")
    install.packages("readxl")
    install.packages("openxlsx")
    install.packages("tidyverse")
    install.packages("scCustomize")
    UWAGA: Podczas instalacji pakietów R może się pojawić wiele okien, które znikają. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o skompilowanie pakietu, kliknij TAK. Jeśli pojawi się okno z pytaniem o ponowne uruchomienie R przed zainstalowaniem pakietu, kliknij NIE.
  6. Zainstaluj następujące pakiety z kuratorskiej bazy pakietów R Bioconductor
    (https://bioconductor.org/), które są koniecznymi zależnościami dla protokołu. Aby zainstalować te pakiety, uruchom następujące polecenia. 
    if (! requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE) )
      install.packages("BiocManager")
    BiocManager::install("NMF", update=F)
    BiocManager::install("ComplexHeatmap", update=F)
    BiocManager::install("BiocNeighbors", update=F)
    BiocManager::install("SingleCellExperiment", update=F)
    BiocManager::install("circlize", update=F)
    BiocManager::install("edgeR", update=

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Począwszy od metody #2, protokół przechodzi przez kolejne etapy ładowania i wykonywania kroków kontroli jakości na jednokomórkowym zestawie danych gojenia się ran. Po utworzeniu obiektu Seurat (krok 2.6.2), seria kroków łączy dwa testy w zbiorze danych (RNA i białko; kroki 2.6.3-2.6.7) i przeprowadza dekompleksację testu białkowego zgodnie z czasoprzestrzennymi kodami kreskowymi (kroki 2.6.8-2.6.9). Funkcja dekompleksowania przypisuje kilka etykiet metadanych do każdej komórki w zestawie danych, w tym "barcodes_maxID", która identyfikuje najbardziej prawdopodobny czasoprzestrzenny kod kreskowy każdej komórki (krok 2.6.10). W kroku 2.6.11 wykonywana jest funkcja wykresu skrzypcowego w celu wizualizacji rozmieszczenia wykrytych genów w komórkach na podstawie ich multipleksowanych kodów kreskowych. Reprezentatywny wynik tego etapu (rysunek uzupełniający 1) pokazuje, że istnieje dość równomierny rozkład wykrytych genów dla każdego kodu kreskowego, co jest ważne dla integralności zestawu danych i dalszej analizy punktów czasowych gojenia się ran. Po przypisaniu odpowiedniej etykiety do kodów kreskowych białek (krok 2.6.12), protokół pokazuje, jak przeprowadzić kroki kontroli jakości testu RNA w zbiorze danych, zaczynając od obliczenia procentowej zawartości genów mitochondrialnych w każdej komórce (krok 2.9). W kroku 2.10 wykonywana jest funkcja wykresu punktowego cech w celu wizualizacji rozkładu wykrytych genów, liczby RNA i procentu mitochondriów we wszystkich komórkach. Reprezentatywne wyniki tego etapu (rysunek uzupełniający 2) pokazują, że istnieje pewna liczba komórek o dużej zawartości mitochondriów, która koreluje z niską liczbą RNA i identyfikuje martwe lub umierające komórki. Po usunięciu komórek o niskiej liczbie RNA i dużej zawartości mitochondriów (krok 2.11), w kroku 2.12 wykonywana jest kolejna funkcja wykresu punktowego cech na zbiorze danych podzbioru, a reprezentatywny wynik tego kroku (rysunek uzupełniający 3) pokazuje, że rozkład wykrytych genów i procentowy procent mitochondrialnego RNA na komórkę jest teraz bardziej normalny, torując drogę do solidnych dalszych analiz. Następnie protokół opisuje użycie funkcji scDblFinder do identyfikowania prawdopodobnych dubletów w zbiorze danych i przypisuje nowe metadane o nazwie "scDblFinder.score" do każdej komórki (kroki 2.13-2.14). W kroku 2.15 funkcja wykresu skrzypiec jest wykonywana w celu wizualizacji rozkładu wyników dubletów w zbiorze danych, a reprezentatywny wynik tego kroku (rysunek uzupełniający 4) pokazuje, że istnieje pewna liczba komórek ze stosunkowo wysokimi wynikami dubletów i że 0,25 wydaje się być naturalnym punktem odcięcia, powyżej którego znajduje się populacja prawdopodobnych dubletów. W związku z tym w poniższych krokach ten parametr służy do tworzenia podzbioru danych do komórek poniżej punktu odcięcia (krok 2.16), kończąc w ten sposób kroki kontroli jakości dla tego jednokomórkowego zestawu danych.

Począwszy od metody #3, protokół przechodzi przez kolejne etapy analizy zestawu danych gojenia się ran jednokomórkowych o kontrolowanej jakości przy użyciu pakietu Seurat i przepływu pracy. Po normalizacji i przeskalowaniu danych RNA przeprowadzana jest analiza PCA (krok 3.1). W kroku 3.2 funkcja wykresu łokcia jest używana do wizualizacji wielkości zmienności zestawu danych w odniesieniu do pierwszych 50 wymiarów PCA, a reprezentatywny wynik tego kroku (rysunek uzupełniający 5) pokazuje, że większość głównych zmian występuje w pierwszych 13 wymiarach, jak określono za pomocą zagięcia na wykresie. Protokół następnie pokazuje, jak znaleźć sąsiadów i przeprowadzić grupowanie komórek (krok 3.3) oraz redukcję wymiarów UMAP (krok 3.4) zestawu danych przy użyciu pierwszych 13 wymiarów PCA i stosunkowo niskiego parametru rozdzielczości grupowania wynoszącego 0,1, z których oba zostały wybrane w celu zidentyfikowania najbardziej uogólnionych głównych typów komórek w ranach. W kroku 3.5 funkcja wykresu wymiarowego jest wykonywana w celu wizualizacji grupowania komórek na wykresie UMAP, a reprezentatywny wynik tego kroku (Rysunek 1) pokazuje, że wszystkie komórki w zestawie danych są zgrupowane wokół 8 głównych grup klastrów Seurat oznaczonych kolorami, z nieco różnymi wykresami UMAP uzyskanymi z komputera z systemem Windows (po lewej) i MacOS (po prawej). W kroku 3.6 wykonywana jest inna funkcja wykresu wymiarowego w celu wizualizacji nawiniętej adnotacji czasoprzestrzennej komórek, a reprezentatywny wynik tego kroku (Rysunek 2) pokazuje, że wszystkie komórki w zestawie danych są rozmieszczone zgodnie z ich początkiem czasoprzestrzennym, bez widocznego grupowania zgodnie z adnotacją czasoprzestrzenną. Protokół opisuje następnie, jak uzyskać listy genów o zróżnicowanej ekspresji i zapisać je w pliku tekstowym (krok 3.8), otworzyć tabelę danych w arkuszu kalkulacyjnym i wykonać różne kroki filtrowania w celu uzyskania najwyżej sklasyfikowanych znaczników klastrów dla każdego klastra komórkowego (kroki 3.9-3.10.6). Reprezentatywnym wynikiem tych kroków (Tabela uzupełniająca 1) jest końcowy plik arkusza kalkulacyjnego zawierający pełne wyniki uszeregowanych genów o zróżnicowanej ekspresji, podczas gdy innym reprezentatywnym wynikiem (Tabela uzupełniająca 2) jest uproszczona tabela przedstawiająca 5 najważniejszych genów regulowanych w górę i eksprymowanych dla każdego klastra Seurat. Protokół następnie opisuje, w jaki sposób używać internetowego narzędzia do analizy wzbogacania funkcjonalnego o nazwie EnrichR do identyfikacji przypuszczalnych typów komórek zgodnie z głównymi genami markerów klastrowych (kroki 3.11-3.12), a reprezentatywne wyniki tych kroków (Rysunek 3) to przycięte zrzuty ekranu wyników EnrichR pokazujące najwyższe wzbogacone typy komórek dla każdego z ośmiu klastrów komórek. Następnie protokół przypisuje nową etykietę metadanych o nazwie "cell_types" do wszystkich komórek w odpowiednich klastrach Seurat zgodnie z ich najbardziej wzbogaconymi adnotacjami typu komórki (krok 3.14). W kroku 3.15 funkcja wykresu wymiarowego jest wykonywana w celu wizualizacji klastrów komórek o zmienionej nazwie jako adnotacji typu komórki na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (rysunek 4) pokazały, że wszystkie komórki w zestawie danych są skupione wokół głównych typów komórek oznaczonych kolorami. W kroku 3.16 funkcja wykresu cech została użyta do wizualizacji lokalizacji genów markera górnego klastra (z tabeli uzupełniającej 2) na serii wykresów UMAP, a reprezentatywne wyniki (ryc. 5) są siatką wykresów UMAP pokazujących wysoką ekspresję genów markera komórkowego w odpowiednich lokalizacjach klastrów głównych typów komórek. W krokach 3.17 i 3.18 wykonano funkcję wykresu kropkowego w celu wizualizacji względnych poziomów ekspresji genów markerów górnych klastrów w komórkach, najpierw pogrupowanych według ich oryginalnych numerów klastrów Seurat (krok 3.17), a następnie pogrupowanych według adnotowanych etykiet typu komórki (krok 3.18). Reprezentatywne wyniki tych etapów potwierdziły wysoki poziom ekspresji genów markerów komórkowych tylko w ich odpowiednich klastrach Seurat (rysunek uzupełniający 6) i tylko w ich odpowiednich głównych typach komórek (ryc. 6). Kolejny krok w protokole upraszcza oryginalne przestrzenno-czasowe etykiety oparte na białkach do ściśle czasowych adnotacji, które identyfikują komórki na podstawie dni po zranieniu (DPW), z których pochodzą. W kroku 3.20 funkcja wykresu wymiarowego jest wykonywana w celu wizualizacji komórek jako adnotacji DPW na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (rysunek uzupełniający 7) pokazały lokalizację adnotacji o przebiegu rany w czasie w zestawie danych gojenia się ran jednokomórkowych. Zgodnie z oczekiwaniami, adnotacje dnia 1 (D1) zdominowały klastry neutrofili i makrofagów, podczas gdy późniejsze punkty czasowe gojenia się ran były bardziej reprezentowane w innych typach komórek. W kolejnych krokach protokołu wykorzystano skumulowane wykresy słupkowe, aby najpierw zobrazować proporcje DPW w różnych typach komórek (krok 3.22), a następnie zwizualizować proporcje typów komórek w różnych punktach czasowych (3.23). Reprezentatywnymi wynikami tych etapów są wykresy proporcji przedstawiające względną liczbę komórek DPW w każdej kategorii głównych typów komórek (rysunek uzupełniający 8) oraz względną liczbę głównych typów komórek w każdej kategorii DPW (rysunek 7). Wyniki te potwierdziły znaną kaskadę komórkową gojenia się ran skóry, w której komórki odpornościowe (neutrofile i makrofagi) dominują we wczesnych punktach czasowych podczas fazy zapalnej, a inne typy komórek (komórki nabłonkowe i komórki śródbłonka) zaczynają pojawiać się w fazie proliferacyjnej, przy czym fibroblasty są szczególnie dominujące w późniejszych punktach czasowych podczas gojenia się rany.

Począwszy od metody #4, protokół przedstawia kroki korzystania z Seurat w celu skupienia się na pojedynczym głównym typie komórek w zbiorze danych pojedynczych komórek w celu zidentyfikowania potencjalnych podtypów komórkowych podczas gojenia się ran. Protokół koncentruje się na fibroblastach, które początkowo zgrupowały się w dwa klastry Seurat, zanim zostały połączone w jedną kategorię, i opisuje, jak utworzyć nowy obiekt Seurat, który zawiera tylko fibroblasty z oryginalnego zestawu danych (krok 4.1). Przepływ pracy Seurat jest wykonywany na tym specyficznym dla fibroblastów zestawie danych (kroki 4.2-4.4), przy czym krok 4.2 skutkuje wykresem łokcia (rysunek uzupełniający 9) pokazującym, że większość głównych zmian w zestawie danych fibroblastów występuje w pierwszych 9 wymiarach PCA. W kroku 4.5 funkcja wykresu wymiarowego jest wykonywana w celu wizualizacji grupowania komórek na wykresie UMAP, a reprezentatywne wyniki tego kroku (ryc. 8) pokazały, że fibroblasty w zestawie danych są skupione wokół 3 podtypów komórek oznaczonych kolorami. Wizualizacja zestawu danych fibroblastów zgodnie z ich adnotacją DPW (krok 4.6) zaowocowała wykresem UMAP (rysunek uzupełniający 10) przedstawiającym fibroblasty w zestawie danych rozmieszczone zgodnie z ich adnotacją DPW. Protokół opisuje następnie, jak uzyskać listy genów o zróżnicowanej ekspresji i zapisać je w pliku tekstowym (krok 4.7), otworzyć tabelę danych w programie Excel i wykonać różne kroki filtrowania w celu uzyskania najwyżej sklasyfikowanych markerów klastrów dla każdego klastra komórkowego (krok 4.8) i przypisać nową zmienną z listą najważniejszych genów markera fibroblastów o nazwie "FB_type_marker" (krok 4.9). W kroku 4.10 funkcja wykresu kropkowego jest używana do wizualizacji genów na liście w zestawie danych tylko dla fibroblastów poprzez wywołanie zmiennej "FB_type_marker" w parametrze cech, a reprezentatywne wyniki tego kroku (ryc. 9) to wykresy kropkowe potwierdzające wysoką ekspresję markerów podtypu fibroblastów tylko w odpowiednich kategoriach klastrów (na górze), ale sprawiedliwie rozłożone w kategoriach DPW (na dole). W kroku 4.11 ta sama zmienna cech jest wywoływana w celu wizualizacji genów markerów fibroblastów w ogólnym zestawie danych gojenia się ran, a reprezentatywny wynik (rysunek uzupełniający 11) to wykres kropkowy, który potwierdził wysoką ekspresję markerów podtypu fibroblastów, głównie w oryginalnym fibroblastach. Wreszcie, w kolejnych krokach protokołu wykorzystano skumulowane wykresy słupkowe, aby najpierw zobrazować proporcje DPW w trzech podtypach fibroblastów (krok 4.12), a następnie zwizualizować proporcje podtypów fibroblastów w różnych punktach czasowych (krok 4.13). Reprezentatywnymi wynikami tych etapów są wykresy proporcji przedstawiające względną liczbę komórek DPW w każdej kategorii podtypu fibroblastów (rysunek uzupełniający 12) oraz względną liczbę podtypów fibroblastów w każdej kategorii DPW (rysunek uzupełniający 13). Wyniki te wskazują na istotną zmianę proporcji podtypu fibroblastów w całym czasie gojenia, przy czym pierwszy podtyp fibroblastów (klaster 0) silnie dominuje we wczesnym stadium ran (D1 i D3), drugi podtyp (klaster 1) dominuje podczas ustępowania ran (D14), a trzeci podtyp (klaster 2) jest najwyższy w fazie proliferacyjnej gojenia się ran (D7).

Począwszy od metody #5, protokół przechodzi przez kolejne etapy analizy zestawu danych gojenia się ran w pojedynczej komórce przy użyciu funkcji oceniania modułu w Seurat. Protokół najpierw opisuje etapy korzystania z pliku tekstowego z zakładkami do przesyłania zestawów genów do zmiennych w R (kroki 5.1-5.2), a następnie zastosowanie funkcji punktacji modułu do trzech zestawów genów odnoszących się do trzech głównych faz gojenia się ran (krok 5.3). W kroku 5.4 funkcja wykresu kropkowego służy do wizualizacji zagregowanych wyników modułów w dwóch różnych kategoriach metadanych, a reprezentatywne wyniki dla tego kroku (Rysunek 10) to wykresy kropkowe przedstawiające średnią ekspresję modułów głównej fazy gojenia w komórkach w kategorii dni po zranieniu (DPW, po prawej) i w kategorii głównych typów komórek (po lewej). Wyniki te pokazują, że zastosowanie profili ekspresji genów opartych na sekwencjonowaniu masowym do zestawów danych dotyczących ekspresji pojedynczej komórki w sposób pseudomasowy jest potężną metodą porównawczych podejść bioinformatycznych poprzez wykorzystanie wcześniej opublikowanych zestawów danych w dziedzinie gojenia się ran.

Zaczynając od metody #6, protokół przechodzi przez kolejne etapy analizy zestawu danych gojenia się ran jednokomórkowych pochodzących z Seurat przy użyciu pakietu CellChat i przepływu pracy zgodnie z konkretnym pytaniem naukowym dotyczącym porównywania komórek pochodzących z ran wczesnej i późnej fazy. Protokół najpierw dzieli cały zestaw danych Seurat na dwa punkty czasowe po urazie, jeden podczas fazy zapalnej (dzień 1 (D1)), a drugi podczas ustępowania rany (dzień 14 (D14)) (krok 6.1). Tworzone są dwa obiekty CellChat, a protokół przechodzi przez wszystkie typowe funkcje protokołu CellChat w celu obliczenia wszystkich przypuszczalnych interakcji między typami komórek zidentyfikowanymi w metodzie #3 protokołu (kroki 6.2-6.3). W kroku 6.4 wykonywana jest funkcja sygnalizacyjnego wykresu punktowego w celu wizualizacji siły interakcji przychodzących i wychodzących we wszystkich głównych typach komórek w każdym punkcie czasowym gojenia się ran. Reprezentatywnymi wynikami tego kroku (rysunek uzupełniający 14) są wykresy punktowe, które pokazują siłę oddziaływań przychodzących (oś y) i wychodzących (oś x) dla głównych typów komórek w punktach czasowych D1 (po lewej) i D14 (po prawej). Wyniki te wykazały, że komórki odpornościowe, takie jak neutrofile i makrofagi, miały najwyższą siłę interakcji komórka-komórka podczas fazy zapalnej, ale fibroblasty zdominowały interakcje komórka-komórka podczas gojenia się ran, co potwierdza dziesięciolecia badań nad gojeniem się ran. Poniższe kroki koncentrują się na analizie jednego ze znacznie wzbogaconych szlaków, szlaku kolagenowego (kroki 6.5-6.6). W kroku 6.7 funkcja diagramu kołowego jest wykonywana w celu wizualizacji interakcji szlaku sygnałowego kolagenu między typami komórek w dwóch punktach czasowych. Reprezentatywnymi wynikami tego kroku (rysunek uzupełniający 15) są wykresy kołowe, które pokazują wywnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu między wszystkimi typami komórek w D1 (po lewej) i D14 (po prawej). W kroku 6.8 te same interakcje są wizualizowane za pomocą funkcji diagramu strunowego, przy czym reprezentatywne wyniki (rysunek uzupełniający 16) to diagramy strunowe przedstawiające wywnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu między wszystkimi typami komórek w każdym punkcie czasowym. Zgodnie z oczekiwaniami, wyniki te wykazały, że fibroblasty były głównymi komórkami źródłowymi szlaku sygnałowego kolagenu, chociaż przepływ informacji był bardziej ograniczony do komórek odpornościowych w D1 w porównaniu z D14. Aby skupić się na fibroblastach jako komórce źródłowej w interakcjach komórka-komórka, krok 6.9 powtarza funkcję diagramu strunowego, dodając parametr komórki źródłowej, a reprezentatywne wyniki (rysunek uzupełniający 17) to diagramy strunowe pokazujące wywnioskowany szlak kolagenu sygnalizujący interakcje z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdym punkcie czasowym. W kroku 6.10 wykonywane są dwie funkcje w celu wizualizacji udziału każdej pary ligand-receptor w szlaku sygnałowym kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi, jedna za pomocą wykresów bąbelkowych (krok 6.10.1), a druga za pomocą diagramów strunowych (krok 6.10.2). Reprezentatywne wyniki pokazują wywnioskowany wkład każdej pary ligand-receptor w sygnalizacji szlaku kolagenowego z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w punktach czasowych D1 (po lewej) i D14 (po prawej) przy użyciu zarówno wykresów bąbelkowych (rysunek uzupełniający 18), jak i diagramów strunowych (rysunek uzupełniający 19). Wyniki te wykazały, że w D1 szlak kolagenowy pochodzący z fibroblastów był ograniczony do neutrofili i makrofagów z dominacją receptorów Cd44 i Sdc4, ale w D14 inne komórki działały jako odbiorniki poprzez różne receptory, w tym integryny. Aby skupić się na interakcji ligand-receptor Col1a1-Cd44, która wykazała silną siłę w interakcjach fibroblastów, ustawia się parametr (krok 6.11), a następnie używa się go w kroku 6.12 w funkcji diagramu strunowego w celu wizualizacji tej konkretnej interakcji ligand-receptor między wszystkimi typami komórek, przy czym reprezentatywne wyniki (rysunek uzupełniający 20) to diagramy strunowe pokazujące wywnioskowane interakcje ligand-receptor Col1a1-Cd44 między wszystkimi typami komórek w czasie D1 (po lewej) i D14 (po prawej) Punktów. Wyniki te wykazały, że podczas gdy w D1 ta interakcja jest ograniczona do fibroblastów jako komórek źródłowych, w D14 makrofagi i komórki mięśni gładkich działają również jako komórki źródłowe. Następnie w protokole opisano, jak przeprowadzić różnicową analizę CellChat, łącząc najpierw obiekty CellChat D1 i D14 (krok 6.13). W kroku 6.14 wykonywana jest funkcja porównywania interakcji w celu wizualizacji całkowitej liczby i względnej siły interakcji komórka-komórka między dwoma punktami czasowymi gojenia się ran, a reprezentatywne wyniki (rysunek uzupełniający 21) to wynikowe wykresy słupkowe pokazujące całkowite liczby (po lewej) i siły (po prawej) wywnioskowanych interakcji w komórkach składających się z ran D1 i D14, z większą liczbą oddziaływań w D14 w przeciwieństwie do wyższych względnych sił oddziaływań w D1. W krokach 6.15 i 6.16 wykorzystano dwie funkcje do wizualizacji zróżnicowanej siły interakcji komórka-komórka między każdym typem komórki w miarę przejścia rany od dnia 1 do dnia 14 wraz z odpowiednimi reprezentatywnymi wynikami, pierwsza to wykres kołowy (krok 6.15, rysunek uzupełniający 22), a druga to mapa cieplna (krok 6.16, rysunek uzupełniający 23), gdzie zwiększone interakcje w D14 w porównaniu z D1 pokazane na czerwono i te, które są zmniejszone, pokazano na niebiesko. Zgodnie z oczekiwaniami, interakcje za pośrednictwem neutrofili i makrofagów są zwiększone w D1, a interakcje za pośrednictwem fibroblastów są zwiększone w D14. W kroku 6.17 funkcja klasyfikacji jest używana do utworzenia wykresu, który klasyfikuje względny wkład poszczególnych szlaków w interakcje komórka-komórka z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w D14 w porównaniu z D1, a reprezentatywne wyniki (rysunek uzupełniający 24) pokazują wynikowy wykres rang z D1 reprezentowanym na górze na czerwono i D14 na dole na niebiesko, przy czym kilka ścieżek jest reprezentowanych wyłącznie w D1 lub D14, a wiele innych wykazuje gradient aktywacji. Wreszcie, w kroku 6.18, dwie funkcje wykresu bąbelkowego są używane do pokazania względnego wkładu poszczególnych par ligand-receptor w kolagenowym szlaku sygnałowym z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w D14 w porównaniu z D1, z odpowiednimi reprezentatywnymi wynikami (rysunek uzupełniający 25) pokazującymi zwiększone (po lewej) i zmniejszone (po prawej) pary sygnałowe w D14 w porównaniu z D1 w wielu interakcjach komórka-komórka na osi x. Zgodnie z oczekiwaniami, fibroblasty miały znacznie więcej zwiększonych interakcji wychodzących par ligand-receptor w kilku komórkach odbiorczych w ranach D14 w porównaniu z ranami D1, gdzie komunikacja była bardziej ograniczona w kierunku neutrofili i makrofagów w fazie zapalnej.

Zaczynając od metody #7, protokół przechodzi przez kolejne etapy integracji dwóch zestawów danych gojenia się ran jednokomórkowych za pomocą Seurat. W protokole najpierw opisano kroki scalania dwóch partii opublikowanych jednokomórkowych zestawów danych i stosowania standardowego przepływu pracy Seurat do scalonego zestawu danych (kroki 7.1–7.4). W kroku 7.5 funkcja wykresu wymiarowego jest używana do wizualizacji wykresu UMAP zgodnie z numerami klastrów i partii scalonego, ale jeszcze niezintegrowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran. Reprezentatywnymi wynikami tego kroku (rysunek uzupełniający 26) są wykresy UMAP, które wizualizują rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów partii (po prawej), pokazując, że nie wydaje się, aby istniały jakiekolwiek znaczące efekty wsadowe dla tych dwóch zestawów danych przed integracją danych. Następnie protokół przeprowadza integrację danych przy użyciu metody RPCA i następującego przepływu pracy Seurat zintegrowanego zestawu danych (kroki 7.7-7.8). W kroku 7.9 funkcja wykresu wymiarowego jest używana do wizualizacji wykresu UMAP zgodnie z numerami klastrów i partii zintegrowanego zestawu danych gojenia się ran. Reprezentatywnymi wynikami tego kroku (Rysunek Uzupełniający 27) są wykresy UMAP, które wizualizują rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów partii (po prawej), pokazując, że teraz nastąpiło jeszcze większe nakładanie się tych dwóch partii w różnych klastrach. Wyniki wskazują również na pojawienie się dodatkowego klastra po integracji danych, co może wskazywać na zwiększoną zdolność do identyfikacji potencjalnie istotnych podtypów komórek po kontrolowaniu skutków technicznych partii danych.

figure-results-1
Rysunek 1: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zestawie danych skupione wokół 8 głównych grup klastrów oznaczonych kolorami. Wyniki uzyskane na komputerze z systemem Windows (po lewej) i MacOS (po prawej). Liczba ta odpowiada krokowi 3.5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zestawie danych rozmieszczone zgodnie z ich początkiem czasoprzestrzennym, bez widocznego grupowania zgodnie z adnotacją czasoprzestrzenną. Liczba ta odpowiada krokowi 3.6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przycięte zrzuty ekranu danych wyjściowych EnrichR, przedstawiające najbardziej wzbogacone typy komórek dla każdego klastra komórek. Liczba ta odpowiada krokowi 3.13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wykres UMAP przedstawiający wszystkie komórki w zestawie danych skupione wokół głównych typów komórek oznaczonych kolorami. Liczba ta odpowiada krokowi 3.15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Siatka wykresów UMAP pokazująca wysoką ekspresję najwyższych genów markerów komórkowych w głównych klastrach typów komórek. Liczba ta odpowiada krokowi 3.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Wykresy kropkowe potwierdzające wysoki poziom ekspresji genów markerów komórkowych tylko w ich odpowiednich głównych typach komórek. Liczba ta odpowiada krokowi 3.18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę głównych typów komórek w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 3.23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Wykres UMAP przedstawiający fibroblasty w zestawie danych skupione wokół 3 podtypów komórek oznaczonych kolorami. Liczba ta odpowiada krokowi 4.5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Wykresy kropkowe potwierdzające wysoką ekspresję markerów podtypu fibroblastów tylko w odpowiednich kategoriach klastrów, ale sprawiedliwie rozłożone we wszystkich kategoriach DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 4.10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Wykresy kropkowe przedstawiające średnią ekspresję głównych modułów fazy gojenia w komórkach na DPW i na główne typy komórek. Liczba ta odpowiada krokowi 5.4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Wyniki pokazujące, że istnieje dość równomierny rozkład wykrytych genów dla każdego kodu kreskowego, co jest ważne dla integralności zestawu danych i dalszej analizy punktów czasowych gojenia się ran. Liczba ta odpowiada krokowi 2.6.11. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Wykresy punktowe pokazujące, że istnieje pewna liczba komórek o dużej zawartości mitochondriów, co koreluje z niską liczbą RNA --- są to komórki martwe lub umierające. Liczba ta odpowiada krokowi 2.10. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3: Wykresy punktowe pokazujące, że rozkład wykrytych genów i procentowej zawartości mitochondrialnego RNA na komórkę jest teraz bardziej normalny, co otwiera drogę do solidnych dalszych analiz. Liczba ta odpowiada krokowi 2.12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 4: Wykres skrzypiec pokazujący, że istnieje pewna liczba komórek o stosunkowo wysokim wyniku dubletowym i że 0,25 wydaje się być naturalnym punktem odcięcia, powyżej którego znajduje się populacja prawdopodobnych dubletów. Liczba ta odpowiada krokowi 2.15. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 5: Wykres łokcia pokazujący, że większość głównych zmian występuje w obrębie pierwszych 13 wymiarów. Liczba ta odpowiada krokowi 3.2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 6: Wykres punktowy potwierdzający wysoki poziom ekspresji genów markerów górnych komórek tylko w ich odpowiednich klastrach Seurat. Liczba ta odpowiada krokowi 3.17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 7: Wykres UMAP przedstawiający lokalizację adnotacji o przebiegu rany w czasie w zestawie danych dotyczących gojenia się ran. Liczba ta odpowiada krokowi 3.20. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 8: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę komórek DPW w każdej głównej kategorii typów komórek. Liczba ta odpowiada krokowi 3.22. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 9: Wykres łokcia pokazujący, że znaczna część głównych zmian w zbiorze danych fibroblastów występuje w obrębie pierwszych 9 wymiarów. Liczba ta odpowiada krokowi 4.2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 10: Wykres UMAP przedstawiający fibroblasty w zestawie danych rozmieszczone zgodnie z ich adnotacją DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 4.6. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 11: Wykres punktowy potwierdzający wysoką ekspresję markerów podtypu fibroblastów, głównie w pierwotnym klastrze fibroblastów. Liczba ta odpowiada krokowi 4.11. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 12: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę podtypów fibroblastów w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 4.12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 13: Wykres proporcji przedstawiający względną liczbę fibroblastów w DPW w każdej podtypie fibroblastów. Liczba ta odpowiada krokowi 4.13. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 14: Wykresy punktowe przedstawiające siłę interakcji przychodzących (oś y) i wychodzących (oś x) dla głównych typów komórek w punktach czasowych 1 (D1, po lewej) i 14 (D14, po prawej). Liczba ta odpowiada krokowi 6.4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 15: Wykresy kołowe przedstawiające wywnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu między wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.7. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 16: Diagramy strunowe przedstawiające wywnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenu między wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 17: Diagramy strunowe przedstawiające wnioskowane interakcje sygnalizacyjne szlaku kolagenowego z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 18: Wykresy bąbelkowe przedstawiające wywnioskowany wkład każdej pary ligand-receptor w sygnalizacji szlaku kolagenowego z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.10.1. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 19: Diagramy strunowe przedstawiające wywnioskowany wkład każdej pary ligand-receptor w sygnalizacji szlaku kolagenowego z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w każdej kategorii DPW. Rysunek ten odpowiada krokowi 6.10.2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 20: Diagramy strunowe przedstawiające wywnioskowane interakcje ligand-receptor Col1a1-Cd44 między wszystkimi typami komórek w każdej kategorii DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.12. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 21: Wykresy słupkowe przedstawiające liczbę (po lewej) i siłę (po prawej) wnioskowanych interakcji w ranach dnia 1 i 14. Liczba ta odpowiada krokowi 6.14. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 22: Wykres kołowy przedstawiający różnicową siłę interakcji komórka-komórka między każdym typem komórki w miarę przejścia rany z dnia 1 (niebieski) do dnia 14 (czerwony) DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.15. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 23: Mapa cieplna przedstawiająca różnicową siłę interakcji komórka-komórka między każdym typem komórki w miarę przejścia rany z dnia 1 (niebieski) do dnia 14 (czerwony) DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.16. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 24: Wykres rangi przedstawiający względny wkład poszczególnych szlaków w interakcje komórka-komórka między fibroblastami a innymi typami komórek w dniu 1 w porównaniu z dniem 14 DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 25: Wykresy bąbelkowe przedstawiające względny wkład poszczególnych par ligand-receptor w szlaku sygnałowym kolagenu z fibroblastami jako komórkami źródłowymi w dniu 1 w porównaniu z dniem 14 DPW. Liczba ta odpowiada krokowi 6.18. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 26: Wykresy UMAP przedstawiające rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów partii (po prawej) przed integracją danych. Liczba ta odpowiada krokowi 7.5. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 27: Wykresy UMAP przedstawiające rozkład klastrów Seurat (po lewej) i numerów partii (po prawej) po integracji danych. Liczba ta odpowiada krokowi 7.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Plik uzupełniający 1: JoVE_Rscript.R: Główny plik skryptu kodu języka R, który zawiera wszystkie kroki i wyjaśnienia opisane dla wszystkich części protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: JoVE_PhaseSpecificGenes.txt. Plik tekstowy rozdzielany tabulatorami, który zawiera listy genów, które są ładowane w kroku 5.1 protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: JoVE_Rscript_b3.R. Dodatkowy plik skryptu kodu języka R, który zawiera wszystkie kroki i wyjaśnienia wymagane do przeanalizowania partii #3 zestawu danych do użycia w kroku 7.1 protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: JoVE_DEGs_cellMarkers.xlsx. Plik Excel, który zawiera pełne dane wyjściowe uszeregowanych genów o zróżnicowanej ekspresji użytych w kroku 3.10 protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: 5 najważniejszych genów regulowanych w górę i ulegających ekspresji dla każdego klastra seratów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole program RStudio służy do uruchamiania określonych wierszy kodu, które umożliwiają podstawową analizę złożonego zestawu danych z pojedynczą komórką przy użyciu usługi Seurat. Przedstawiono kilka metod, które są istotne dla badań nad gojeniem się ran, w tym instalację środowiska kodowania R, pobieranie wcześniej opublikowanego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych, wykonywanie krytycznych etapów kontroli jakości i standardowych przepływów pracy analizy pojedynczych komórek, w tym wizualizacje, adnotacje głównych typów komórek, analizy podtypów komórek i analizy integracyjne przy użyciu Seurat oraz wykonywanie analiz interakcji komórka-komórka za pomocą CellChat.

Metody przedstawione w niniejszym dokumencie są uproszczonymi winietami typowych przepływów pracy dla analizy pojedynczej komórki przy użyciu języka R i jego popularnych pakietów naukowych typu open source, Seurat21 i CellChat22. Rzeczywiście, przepływ pracy jest tylko jednym z przykładów rodzaju analizy, którą można przeprowadzić za pomocą złożonego zestawu danych dotyczących gojenia się ran jednokomórkowych. Możliwe modyfikacje tej metody są niemal nieograniczone, a jedynym ograniczeniem jest konkretne dociekania naukowe użytkownika. Na przykład użytkownik może zmienić niektóre z kluczowych parametrów, takich jak typy komórek i punkty czasowe, zgodnie z pytaniami badawczymi, które może chcieć zadać temu zestawowi danych. Autorzy mają również nadzieję, że użytkownik czuje się na tyle komfortowo, aby dostosować ten przepływ pracy do własnego zestawu danych jednokomórkowych, który go interesuje; Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z tego przepływu pracy do analizowania innych zestawów danych, ponieważ każdy eksperyment może powodować problemy techniczne i związane z przygotowaniem próbki na same dane. Dlatego konieczne jest, aby użytkownik przeczytał i zrozumiał wszystkie szczegóły eksperymentu przed interpretacją wyników wcześniej opublikowanych i ponownie przeanalizowanych zestawów danych jednokomórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że narzędzia bioinformatyczne są potężną metodą badania procesów biologicznych i generowania hipotez, a wszelkie krytyczne biologiczne interpretacje wyników muszą zostać zweryfikowane w dalszych eksperymentach.

W całym protokole należy pamiętać, że w niektórych obszarach przepływu pracy mogą zostać wprowadzone poważne modyfikacje w celu wykonania innych zadań. Jednak szczegóły dotyczące wszystkich możliwych kombinacji modyfikacji przepływu pracy wykraczają poza zakres tego manuskryptu. Na przykład rozdzielczość używana do grupowania komórek i wymiary używane do analizy UMAP są z konieczności subiektywne, a przedstawione tutaj narzędzia pozwalają zarówno na analizy na dużą skalę (jak wykazano tutaj dla szeroko zdefiniowanych głównych typów komórek), jak i bardzo szczegółowe analizy, które mogą pociągać za sobą subgrupowanie komórek w rzadsze subpopulacje w ramach większego zbioru danych. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego aspektu metody analizy pojedynczej komórki oraz szczegółowe informacje na temat wszystkich innych parametrów, które mogą zostać zmienione w potoku analizy pojedynczej komórki, autorzy odsyłają użytkownika do publikacji Seurat21,26 i strony internetowej (https://satijalab.org/seurat/), gdzie autorzy tego rozwijającego się narzędzia udostępniają szczegółowe wyjaśnienia, winiety i samouczki.

Manuskrypt ten wprowadził niektóre z najczęściej cytowanych i używanych narzędzi w literaturze dotyczącej transkryptomiki pojedynczej komórki, a mianowicie Seurat21 i CellChat22, odpowiednio do analiz interakcji pojedynczych komórek i komórek-komórek. Istnieją jednak inne narzędzia, które wykonują podobne funkcje w nieco inny sposób. Do analizy zestawów danych w pojedynczej komórce dostępne są Scran27, Scater 28 i ScanPy29 oparty na języku Python, które wykorzystują różne metody integracji zestawu danych25. W tym protokole zademonstrowano ręczną adnotację typów komórek, która opiera się na ocenie użytkownika w celu interpretacji wzbogacenia markerów komórek klastrowych, ale obecnie istnieją różne narzędzia umożliwiające automatyczną klasyfikację typów komórek, takie jak między innymi SingleR30 i scGate31. W przypadku analiz komunikacji komórka-komórka, CellChat został zademonstrowany w tym protokole, ale istnieją inne narzędzia do szacowania komunikacji komórka-komórka, w tym CellPhoneDB32, Cytotalk33 i inne bazy danych ligand-receptor, które są zaimplementowane w ramach konsensusu LIANA (LIgand-receptor ANalysis framework)34. Wszystkie narzędzia bioinformatyczne są unikalne i mają swoje własne cechy charakterystyczne i modyfikowalne parametry. Dlatego ważne jest, aby użytkownik uważnie przeczytał powiązaną dokumentację każdego narzędzia, aby zrozumieć jego niuanse przed interpretacją jakichkolwiek danych wyjściowych wygenerowanych w wyniku ich użycia. Wreszcie, niezależnie od tego, jakich narzędzi bioinformatycznych się używa, ważne jest, aby pamiętać, że takie narzędzia stale ewoluują i że różne wersje pakietów mogą dawać różne wyniki.

W R składnia ma kluczowe znaczenie, a źle umieszczona interpunkcja, cudzysłów, nawias kwadratowy, a nawet nieprawidłowo wielka litera spowoduje błąd. Dlatego ważne jest, aby użytkownik zwracał uwagę na szczegóły podczas wpisywania kodu i był szczególnie uważny podczas kopiowania wierszy kodu, aby dostosować go do nowych pytań naukowych i zestawów danych. Aby rozwiązać konkretne błędy, które można napotkać, autorzy zalecają po prostu skopiowanie i wklejenie komunikatu o błędzie do ulubionej wyszukiwarki internetowej użytkownika i przejrzenie wyników z forów bioinformatycznych, takich jak GitHub i Stack Overflow, ponieważ najczęściej spotykane błędy prawdopodobnie zostały już rozwiązane przez doświadczonego zaawansowanego użytkownika. Na niektórych forach najbardziej udane odpowiedzi są "zagłosowane" przez innych użytkowników, którzy uznali rozwiązanie za najlepsze dla danego problemu. Użytkownik musi uważać, aby po prostu nie skopiować i nie wkleić wierszy kodu, które znalazł w Internecie, do własnego komputera (zwłaszcza jeśli rozwiązanie wymaga zmiany ustawień systemowych poza językiem programowania R), ponieważ istnieje ryzyko, że takie programy mogą być złośliwe. Ekscytującą pojawiającą się metodą rozwiązywania problemów z błędami w kodowaniu jest korzystanie z potężnych generatywnych modeli sztucznej inteligencji w dużym języku, takich jak ChatGPT firmy OpenAI, Copilot firmy Microsoft lub Gemini firmy Google. Modele te okazały się szczególnie przydatne w inżynierii oprogramowania w ogóle, a w szczególności w rozwiązywaniu problemów. W tym celu użytkownik może kopiować i wklejać całe wiersze swojego kodu po dostarczeniu prostego monitu do chatbota o zamiarze użytkownika dotyczącego kodu. Zwykle istnieje zastrzeżenie, że modele te nie są niezawodne, a użytkownik może być zmuszony do wypróbowania wielu podpowiedzi w celu wygenerowania odpowiedzi, która jest odpowiednia do rozwiązania problemu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratorium M.S. Wietecha otrzymało dofinansowanie z grantu NIH/NIGMS R35-GM154921, Wound Healing Society Research Grant oraz Wydziału Biologii Jamy Ustnej w UIC College of Dentistry.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Laptop lub komputer stacjonarnyN/AN/AUruchamianie systemu Windows lub MacOS 
RN/AWersja 4.4.1Do pobrania za darmo z https://cran.rstudio.com/
Rstudio (rstudio)Oprogramowanie Posit, PBCWersja 2024.09.0Do pobrania za darmo z https://posit.co/download/rstudio-desktop/
Office ExcelFirmy MicrosoftDowolna wersjaDo analizy danych tabelarycznych
Przeglądarka internetowaN/AN/ADo przechodzenia do stron internetowych
R PakietyRepositoryVersion
Narzędzia deweloperskieCRAN2.4.5
readxl (biblioteka readxl)CRAN1.4.3
Biblioteka OpenxlsxCRAN4.2.7.1
tidyverse (Świat Tidy)CRAN2.0.0
scDostosujCRAN2.1.2
BiocManagerBioprzewodnik1.30.25
Sieć NMFBioprzewodnik0.28
ZłożonaMapa ciepłaBioprzewodnik2.20.0
BiocSąsiedziBioprzewodnik1.22.0
Eksperyment z pojedynczą komórkąBioprzewodnik1.26.0
cyrkulacjaBioprzewodnik0.4.16
krawędź RBioprzewodnik4.2.1
scDblFinder powiedział:Bioprzewodnik1.18.0
Seurat powiedział:CRAN5.1.0
Czat komórkowySerwis Github2.1.2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).">Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
  2. Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes. Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).">Wietecha, M. S., et al. Phase-specific signatures of wound fibroblasts and matrix patterns define cancer-associated fibroblast subtypes. Matrix Biol. 119, 19-56 (2023).
  3. Wound healing: a cellular perspective. Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).">Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: a cellular perspective. Physiol Rev. 99 (1), 665-706 (2019).
  4. The murine excisional wound model: contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).">Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
  5. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. (162), e61616(2020).">Rhea, L., Dunnwald, M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. (162), e61616(2020).
  6. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).">Fischer, K. S., et al. Protocol for the splinted, human-like excisional wound model in mice. Bio-Protocol. 13 (3), e4606(2023).
  7. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).">Iglesias-Bartolome, R., et al. Transcriptional signature primes human oral mucosa for rapid wound healing. Sci Transl Med. 10 (451), aap8798(2018).
  8. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).">Chen, L., Arbieva, Z. H., Guo, S., Marucha, P. T., Mustoe, T. A., DiPietro, L. A. Positional differences in the wound transcriptome of skin and oral mucosa. BMC Genomics. 11, 471(2010).
  9. Transcriptional changes in human palate and skin healing. Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).">Leonardo, T. R., et al. Transcriptional changes in human palate and skin healing. Wound Repair. 31 (2), 156-170 (2023).
  10. Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing. Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).">Rognoni, E., et al. Fibroblast state switching orchestrates dermal maturation and wound healing. Mol Syst Biol. 14 (8), e8174(2018).
  11. Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds. Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).">Bergmeier, V., et al. Identification of a myofibroblast-specific expression signature in skin wounds. Matrix Biol. 65, 59-74 (2018).
  12. Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing. Science. 355 (6326), 748-752 (2017).">Plikus, M. V., et al. Regeneration of fat cells from myofibroblasts during wound healing. Science. 355 (6326), 748-752 (2017).
  13. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), aar2971(2018).">Shook, B. A., et al. Myofibroblast proliferation and heterogeneity are supported by macrophages during skin repair. Science. 362 (6417), aar2971(2018).
  14. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), aaa2151(2015).">Rinkevich, Y., et al. Skin fibrosis. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), aaa2151(2015).
  15. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nat Commun. 10 (1), 650(2019).">Guerrero-Juarez, C. F., et al. Single-cell analysis reveals fibroblast heterogeneity and myeloid-derived adipocyte progenitors in murine skin wounds. Nat Commun. 10 (1), 650(2019).
  16. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing. Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).">Gay, D., et al. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing. Sci Adv. 6 (12), eaay3704(2020).
  17. Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics. Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).">Haensel, D., et al. Defining epidermal basal cell states during skin homeostasis and wound healing using single-cell transcriptomics. Cell Rep. 30 (11), 3932-3947.e6 (2020).
  18. Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts. Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).">Phan, Q. M., Sinha, S., Biernaskie, J., Driskell, R. R. Single-cell transcriptomic analysis of small and large wounds reveals the distinct spatial organization of regenerative fibroblasts. Exp Dermatol. 30 (1), 92-101 (2021).
  19. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).">Foster, D. S., et al. Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118(2021).
  20. Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer. Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).">Hu, K. H., et al. Transcriptional space-time mapping identifies concerted immune and stromal cell patterns and gene programs in wound healing and cancer. Cell Stem Cell. 30 (6), 885-903.e10 (2023).
  21. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).">Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  22. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).">Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nat Commun. 12 (1), 1088(2021).
  23. Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder. F1000Research. 10, 979(2021).">Germain, P. -L., Lun, A., Garcia Meixide, C., Macnair, W., Robinson, M. D. Doublet identification in single-cell sequencing data using scDblFinder. F1000Research. 10, 979(2021).
  24. CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).">Jin, S., Plikus, M. V., Nie, Q. CellChat for systematic analysis of cell-cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 20 (1), 180-219 (2024).
  25. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).">Luecken, M. D., et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 19 (1), 41-50 (2022).
  26. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).">Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  27. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Research. 5, 2122(2016).">Lun, A. T. L., McCarthy, D. J., Marioni, J. C. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with Bioconductor. F1000Research. 5, 2122(2016).
  28. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).">McCarthy, D. J., Campbell, K. R., Lun, A. T. L., Wills, Q. F. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics (Oxford, England). 33 (8), 1179-1186 (2017).
  29. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19 (1), 15(2018).">Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19 (1), 15(2018).
  30. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).">Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
  31. scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets. Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).">Andreatta, M., Berenstein, A. J., Carmona, S. J. scGate: marker-based purification of cell types from heterogeneous single-cell RNA-seq datasets. Bioinformatics. 38 (9), 2642-2644 (2022).
  32. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).">Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nat Protoc. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  33. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data. Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).">Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell transcriptomic data. Sci Adv. 7 (16), eabf1356(2021).
  34. Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data. Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).">Dimitrov, D., et al. Comparison of methods and resources for cell-cell communication inference from single-cell RNA-Seq data. Nat Commun. 13 (1), 3224(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell TranscriptomicsWound HealingSeurat AnalysisCellChat WorkflowMouse Skin DatasetCell Type AnnotationUMAP VisualizationDifferential Gene ExpressionCell CommunicationBioinformatics Workflow

Related Articles