Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Streszczenie

Hydrożele peptydowe to wysoce hydrofilowe, trójwymiarowe żele sieciowe powstałe w wyniku samoorganizacji nanowłókien lub polimerów, tworzących sieci blokujące wodę. Ich morfologia jest bardzo podobna do morfologii macierzy zewnątrzkomórkowej, dzięki czemu mogą wykazywać zarówno biologiczne funkcje peptydów, jak i responsywne właściwości żelowania. Te unikalne cechy doprowadziły do ich szerokiego zastosowania w inżynierii tkankowej, trójwymiarowych hodowlach komórkowych, terapii nowotworów, medycynie regeneracyjnej i innych dziedzinach biomedycznych. W artykule opisano trzy metody wytwarzania hydrożeli peptydowych ECF-5 przy użyciu samoorganizujących się peptydów z procesami żelowania reagującymi na środowisko: (1) żelowanie reagujące na pH: różne poziomy pH indukują protonację lub deprotonację reszt aminokwasowych, zmieniając oddziaływania elektrostatyczne między cząsteczkami peptydów i promując ich samoorganizację w hydrożele; (2) Dodatek jonów metali: chelat wielowartościowych jonów metali z ujemnie naładowanymi resztami aminokwasowymi, działającymi jako mostki między peptydami, tworząc hydrożel sieciowy; (3) Wymiana rozpuszczalnika: peptydy hydrofobowe są początkowo rozpuszczane w niepolarnych rozpuszczalnikach organicznych, a następnie indukują samoorganizację w hydrożele po przejściu do polarnego środowiska wodnego. Metody te wykorzystują konwencjonalne procedury eksperymentalne w celu ułatwienia samoorganizacji peptydów w hydrożele. Projektując sekwencje peptydowe w taki sposób, aby dostosowały się do określonych warunków indukujących żelowanie, możliwe jest uzyskanie precyzyjnie dostrojonych mikro/nanostruktur i funkcji biologicznych, podkreślając znaczący potencjał hydrożeli peptydowych w dziedzinie biomedycyny.

Wprowadzenie

Poprzez projektowanie sekwencji peptydowych, niekowalencyjne interakcje między peptydami wywołują samoorganizację, prowadząc do powstania uporządkowanych struktur mikro- i nanometrowych, w tym nanorurek, nanowstążek, nanowłókien i struktur sferycznych¹. Po samodzielnym złożeniu w mikro- i nanometrowe włókna/wstęgi, struktury te makroskopowo wykazują właściwości hydrożelowe. Samoorganizujące się hydrożele peptydowe różnią się od hydrożeli polimerowych tym, że samoorganizują się poprzez oddziaływania niekowalencyjne, ich forma żelowa jest odwracalna i łatwo reagują na określone warunki przejścia między fazą roztworu i żelu². Na przykład, peptydy aminokwasów aromatycznych mogą być indukowane do żelatynizacji w oparciu o przełączanie rozpuszczalników^3,4,5, peptydy RADA16 tworzą żele poprzez kationowe i anionowe oddziaływania elektrostatyczne⁶, a peptyd E1Y9 jest indukowany do tworzenia hydrożelu za pomocą jonów Ca²⁺⁷. Naturalne aminokwasy mogą być metabolizowane przez organizm ludzki i oferują doskonałą biokompatybilność, cechę, której hydrożele polimerowe nie mogą osiągnąć⁸. Białka to cząsteczki, które pełnią funkcje biologiczne, a różnice w sekwencjach peptydowych tworzą ich specyficzne funkcje biologiczne. Dlatego osadzenie określonych biofunkcjonalnych sekwencji peptydowych i nadanie im właściwości samoorganizujących się może zaprojektować samoorganizujące się hydrożele peptydowe o unikalnych funkcjach biologicznych i morfologiach^9,10,11. W artykule przedstawiono trzy metody przygotowania hydrożeli peptydowych, w których proces żelowania jest wywoływany przez reakcję środowiska. Pokrótce omówiono również metody charakterystyki właściwości mechanicznych i morfologii hydrożeli peptydowych.

pH reguluje ładunek aminokwasów, wywołując żelowanie niektórych peptydów. Na przykład dodatnio naładowane aminokwasy (np. arginina, lizyna, histydyna) są regulowane przez pH w celu osiągnięcia stanu dodatniego lub obojętnego. Ujemnie naładowane aminokwasy są regulowane przez pH w celu osiągnięcia stanu ujemnego lub obojętnego, oddalając się od swojego punktu izoelektrycznego, a tym samym zmieniając ich hydrofilowość w roztworach wodnych. Dlatego kontrolowanie oddziaływań elektrostatycznych i hydrofobowych między peptydami ułatwia ich uporządkowany samoorganizowanie. Zhang i in. zaprojektowali amfifilowy, samoorganizujący się peptyd reagujący na pH, sprzężony z metotreksatem KKFKFEFEF, który reaguje na lekko kwaśne środowisko zarówno in vitro, jak i in vivo, umożliwiając przejście fazowe zol do żelu. Prowadzi to do wydajnego wychwytu komórkowego i endocytozy, dostarczając w ten sposób leków przeciwnowotworowych i poprawiając skuteczność chemioterapii¹². Shen et al.¹³ zaprojektowali peptyd FF8 (KRRFFRRK), który łatwo sam się organizuje we włókna przy pH wyższym niż 9,4. W neutralnych warunkach mikroorganizmy neutralizują swoje ładunki dodatnie w wyniku oddziaływań elektrostatycznych z ujemnie naładowanymi błonami fosfolipidowymi, koordynując się z cząsteczkami fosfolipidów w celu samoorganizacji, powodując pęknięcie błony i wzmacniając działanie bakteriobójcze¹³.

Wywoływanie supramolekularnego samomontażu peptydów w hydrożele za pomocą metali koordynacyjnych jest stosunkowo rzadką metodą¹⁴. Kiedy jony metali oddziałują elektrostatycznie z peptydami, tworzą mostki solne, które łączą cząsteczki peptydów, prowadząc do oddziaływań niekowalencyjnych i samoorganizacji, co skutkuje właściwościami żelowania. Na przykład Abul-Haija et al.¹⁵ zaprojektowali tripeptyd FFD, który przechodzi z cieczy w hydrożel po dodaniu jonów miedzi. Tao i wsp.¹⁶ opracowali kwas glutaminowy i peptyd bogaty w fenyloalaninę E3F3, który samoorganizuje się w włókniste hydrożele w obecności jonów i jest używany do dostarczania leków na prostatę.

Powstawanie hydrożeli peptydowych powodujące wymianę rozpuszczalnika jest najczęstszym warunkiem wyzwalania samoorganizacji supramolekularnej. Po rozpuszczeniu peptydów hydrofobowych w rozpuszczalnikach organicznych, ich grupy hydrofobowe są w pełni odsłonięte. Po przeniesieniu do fazy wodnej grupy hydrofobowe zbliżają się do siebie, a cząsteczki wody ułatwiają tworzenie peptydowych wiązań wodorowych, co prowadzi do szybkiej samoorganizacji i łatwego tworzenia hydrożeli. Na przykład Zhang et al.¹⁷ zaprojektowali peptyd, który mógł stabilnie rozpuszczać się w wysokich stężeniach w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, a po rozcieńczeniu wodą samoorganizować się w struktury β-arkuszowe, tworząc hydrożele z włókien peptydowych. Shen et al.¹³ zaprojektowali redukcyjny peptyd ECF-5 (ECAFF), wstępnie rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO), a następnie wstrzyknięty do fazy wodnej w celu utworzenia redukcyjnego hydrożelu, używanego do celowego usuwania reaktywnych form tlenu wytwarzanych przez niedokrwienie-reperfuzję, które następnie rozkładały się do roztworu po zmiataniu.

To badanie wybrało trzy proste, szybkie i wysoce uogólnione strategie przygotowania hydrożelu peptydowego na podstawie wcześniejszych doświadczeń: (1) metoda odpowiedzi pH: peptydy są rozpuszczane w roztworze o pH dalekim od ich punktu izoelektrycznego, a następnie pH jest dostosowywane do blisko punktu izoelektrycznego. Ta zmiana pozwala niektórym samoorganizującym się peptydom tworzyć włókna i tworzyć hydrożele peptydowe; (2) Metoda dodawania jonów metali: kationy koordynacyjne dodaje się do rozpuszczalnych w wodzie, ujemnie naładowanych peptydów samoorganizujących się. Chelatacja koordynacyjna metali między peptydami prowadzi do ich samoorganizacji w hydrożele; (3) Metoda wymiany rozpuszczalnika: peptydy o wysokim stężeniu rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych, a następnie rozcieńcza do fazy wodnej, wywołując żelowanie.

Protokół

Szczegóły dotyczące plazmidów, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Metoda odpowiedzi pH

1. Dodać 5 mg peptydów ECF-5 do 400 μl wody dejonizowanej. Sonikować przy 40 kHz przez 30 minut i dokładnie wymieszać.
2. Dodać 40 μl wodorotlenku sodu (1 M, przefiltrowanego przez filtr 0,22 μm) do roztworu peptydu. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Kontynuuj sonikację przez 15 minut, aż roztwór całkowicie się wyklaruje.
3. Dodać 60 μl kwasu solnego. Szybko zwiruj i zapewnij dokładne wymieszanie. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na ponad 30 minut, aby ułatwić tworzenie hydrożelu.
   UWAGA: W razie potrzeby zastąp wodę dejonizowaną żądanym roztworem buforowym. Jeśli cząstki stałe są duże, należy je wcześniej sproszkować. Sonikować w celu uzyskania jednorodnej mieszaniny cząstek w cieczy. Jeśli peptyd nie toleruje warunków zasadowych, najpierw dodaj 1 M roztwór kwasu solnego i powtórz powyższe kroki. W razie potrzeby dostosuj ilości kwasu i zasady, aby osiągnąć blisko punktu izoelektrycznego lub pożądanego pH, zapewniając zachowanie właściwości żelotwórczych.

2. Metoda dodawania jonów metali

1. Przygotowanie materiału
   1. Przygotować 0,15 m Tris i 0,1 M buforu NaCl o pH 7,4. Przefiltrować przez filtr 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
   2. Przygotować samoorganizujący się roztwór peptydowy ECF-5 o stężeniu 10 mg/ml przy użyciu buforu przygotowanego w kroku 1.1.1. Rozpuścić metodą sonikacji i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   3. Przygotować roztwór chlorku wapnia o stężeniu 50 mg/ml przy użyciu wody dejonizowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Tworzenie hydrożelu peptydowego indukowane addycją jonów metali
   1. Dodać 40 μl roztworu chlorku wapnia do 460 μl roztworu peptydu ECF-5. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Pozostaw mieszaninę w temperaturze pokojowej na ponad 2 godziny < br /> UWAGA: Unikaj stosowania buforu fosforanowego, ponieważ może to prowadzić do wytrącania się jonów wapnia.

3. Metoda wymiany rozpuszczalnika

1. Przygotowanie materiałów
   1. Odważyć 10 mg liofilizowanego proszku peptydu ECF-5. Dodaj go do 100 μl DMSO. Dokładnie wymieszać za pomocą ultradźwięków i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Przygotować 10 mM roztworu buforowego PBS. Przefiltruj i sterylizuj. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia.
2. Tworzenie hydrożelu peptydowego indukowanego rozpuszczalnikiem
   1. Szybko wprowadź 1 ml PBS do peptydu rozpuszczonego w DMSO. Zmieszaj i dokładnie wymieszaj. Odstaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.
   2. Dodać 500 μl PBS, odstawić na 15 minut, wyrzucić supernatant i zachować dolny żel. Powtórz ten proces trzy razy, aby usunąć DMSO.
      UWAGA: Jeśli DMSO wpływa na kolejne eksperymenty, rozważ rozpuszczenie peptydu w wyższym stężeniu DMSO, aby zminimalizować jego wpływ.

4. Reomechaniczna charakterystyka hydrożelu

1. Analiza reologiczna
   1. Nałóż hydrożel na aluminiową płytkę równoległą o średnicy 25 mm. Wykonaj dynamiczną analizę reologiczną hydrożeli peptydowych w czasie za pomocą reometru¹⁸.
2. Analizy częstotliwości i przemiatania odkształceń
   1. Przeprowadzaj systematycznie analizy częstotliwości i przemiatania odkształceń¹⁸, używając kontrolowanego odkształcenia 0,3% i częstotliwości 10 rad/s. Upewnij się, że kontrola temperatury jest ustawiona na 25 °C.

5. Mikroskopia sił atomowych (AFM) charakterystyka morfologii włókien

1. Przygotowanie materiałów
   1. Przygotuj roztwór 95% etanolu i dodaj 5% APTES. Przechowywać w temperaturze -20 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.
   2. Nałóż dwustronny klej, aby usunąć warstwę miki. Przyklej powierzchnie miki za pomocą roztworu APTES i odstaw na 5 minut. Przed użyciem dokładnie spłucz czystą wodą.
   3. Rozcieńczyć i dokładnie wymieszać hydrożel. Upuść go na zmodyfikowaną powierzchnię miki i pozwól na adsorpcję statyczną przez 5 minut. Spłucz powierzchnię czystą wodą i wysusz przed użyciem.
2. Metoda wykrywania
   1. Wykorzystaj wielomodowy AFM wyposażony w skaner do badania morfologii włókien peptydowych lub hydrożelu. Stosować wsporniki krzemowe o nominalnej stałej sprężystości 48 N/m.
   2. Zainicjuj instrument, aby ustawić igłę. Wybierz tryb stukania, aby zeskanować próbkę w celu uzyskania obrazów.

Wyniki

Trzy opisane w niniejszym artykule metody przygotowywania hydrożeli peptydowych umożliwiają szybką, niedrogą i prostą produkcję. Funkcja hydrożelu jest zależna od jego sekwencji peptydowej. W niniejszej pracy wykorzystano peptyd ECF-5 jako reprezentatywny przykład w celu zademonstrowania jego właściwości fizycznych, w tym morfologii mikroskopowej oraz właściwości mechanicznych.

Jak pokazano w Rycina 1A i Rycina uzupełniająca 1peptyd ECF-5 zawiera ...

Dyskusja

W ciągu ostatnich kilku dekad, po odkryciu samoorganizujących się sekwencji peptydowych pochodzących z białek amyloidowych, zaprojektowano wiele samoorganizujących się peptydów w oparciu o ich właściwości, wykazując znaczny potencjał zastosowań w biomedycynie i materiałoznawstwie¹⁹. Hydrożele peptydowe wykazały wyjątkowe zdolności biofunkcjonalizacji w hodowli tkankowej, dostarczaniu leków i leczeniu nowotworów²⁰.

W artykule opisano proste i szyb...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-aminopropylo)trietoksysilan	Aladyn	A107147	/
Mikroskopia sił atomowych	Wielomodowy nanoskop Bruker	VIII	/
CaCl < sub> 2< / sub>	Aladyn	C290953	/
Difenyloalanina (FF)	Chiński peptyd	konfigurowalny	Czystość > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
Peptydy ECF-5 Sekwencja	chińskich peptydów	: ECAFF	Czystość > 95%
Kwas solny	Aladyn	H399657	/
Mica	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Aladdin	P492453	/
Reometr	Anton Paar GmbH	MCR302	/
Wsporniki krzemowe	MikroMasch	XSC11	/
Chlorek sodu	Aladdin	C111549	/
Wodorotlenek sodu	Aladdin	S140903	/
TRIS Chlorowodorek	Aladdin	T431531	/