Method Article

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany (Danio rerio) ma wyjątkową zdolność do regeneracji różnych organów i przydatków. Regeneracja kości u danio pręgowanego była badana przy użyciu różnych metod, takich jak amputacja płetw, wyrywanie łusek, trepanacja czaszki i podejścia mikroskopowe. Wykorzystując konfokalny skan laserowy wyposażony w laser dwufotonowy, opracowano metodę ablacji laserowej jako paradygmat zmiany chorobowej do ablacji komórek tworzących kości (osteoblastów) w rozwijającej się wieczce larw danio pręgowanego. Opisana tutaj metoda pozwala na ablację komórek w precyzyjny sposób, ponieważ obszar, kształt i głębokość można precyzyjnie regulować. Ponadto metoda ta pozwala na obrazowanie obszaru przed i tuż po ablacji, dzięki czemu można przeanalizować krótkoterminowe skutki urazu. W tym układzie eksperymentalnym badano odpowiedź immunologiczną po ablacji osteoblastów w uszkodzonym obszarze. Po ablacji zaobserwowano wzrost rekrutacji makrofagów, co wskazuje na znaczenie ich obecności podczas regeneracji kości.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany regeneruje różne organy, takie jak siatkówka, mózg, serce i trzustka1. Ponadto danio pręgowany regeneruje elementy szkieletu, dlatego wykorzystano je do badania regeneracji płetw, łusek i kalwarii (czapek czaszki)2. Do badania regeneracji tkanek i kości wykorzystano różne paradygmaty eksperymentalne, takie jak resekcja płetwy (amputacja), złamanie płetwy, trepanacja czaszki3,4, cryoinjury5,6, lub ablacja genetyczna7,8,9. Ostatnio metody ablacji laserowej są szeroko stosowane u danio pręgowanego do badania reakcji na gojenie i regenerację po urazie10,11,12,13,14.

Ablacja za pośrednictwem lasera była stosowana w różnych dziedzinach badań biologicznych, takich jak mechanobiologia, biologia rozwojowa, badania nad regeneracją i chirurgia nowotworów10,11,12,15,16,17,18,19. Istnieją różne metody ablacji laserowej, takie jak użycie laserów YAG (granat itrowo-aluminiowy), UV (ultrafiolet) lub 2p (dwufotonowe)20. Ablacja laserowa pozwala na usunięcie pojedynczych komórek lub większych fragmentów tkanek w bardzo dokładny sposób, umożliwiając badanie różnych procesów, takich jak odpowiedź układu odpornościowego na ablację guza21 lub podczas regeneracji wieczka danio pręgowanego. W tym ostatnim przykładzie ablacja została potwierdzona przez zanik jądrowego i cytoplazmatycznego sygnału fluoroforowego oraz barwienie martwicą10,22.

Dobrze wiadomo, że wrodzona odpowiedź immunologiczna i jej regulowana kinetyka są niezbędne do prawidłowej regeneracji tkanek. Neutrofile i makrofagi są pierwszymi komórkami, które są rekrutowane do miejsca urazu, gdzie pełnią różne role, takie jak uwalnianie cytokin i czynników wzrostu, usuwanie resztek komórkowych i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej23. Tę rekrutację i późniejszą funkcjonalizację makrofagów zaobserwowano również u amputowanych płetw danio pręgowanego24 i rozwijającej się wieczka, która została poddana laserowej "nanodysekcji" prowadzącej do ablacji osteoblastów10. W tym ostatnim eksperymencie po laserze UV i ablacji za pośrednictwem lasera dwufotonowego zaobserwowano odzyskanie liczby osteoblastów, prawidłowy rozwój wieczków i rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych (neutrofili, makrofagów i komórek podobnych do osteoklastów) do uszkodzonego obszaru><. Eksperymenty na danio pręgowanym, u których układ odpornościowy był farmakologicznie tłumiony przez stosowanie glikokortykosteroidów, wykazały upośledzenie regeneracji po nieprawidłowym rozregulowaniu odporności, co potwierdza funkcjonalną rolę układu odpornościowego w naprawie tkanek3,10,xref"25,26.

Tutaj opisana jest metodologia ablacji za pośrednictwem lasera dwufotonowego do badania biologii regeneracji kości w rozwijających się kościach danio pręgowanego. W szczególności wykazano wpływ podejścia do ablacji osteoblastów w wieczku pod względem odpowiedzi immunologicznej, która jest badana poprzez monitorowanie rekrutacji makrofagów do miejsca ablacji.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony przez Landesdirektion Sachsen, numery zezwoleń 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Użyte szczepy danio pręgowanego były utrzymywane zgodnie z prawem krajowym i w znormalizowanych warunkach, jak opisano wcześniej27,28. Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów

  1. Utrzymuj zarodki w pożywce 1x E3. Przygotuj pożywkę 1x E3, rozcieńczając 170 ml 60x E3 w 10 l wody dejonizowanej i dodając 2 ml 0,1% błękitu metylenowego.
    1. Przygotować 60 x E3 materiał z podłożem, mieszając 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl2·2 H2O, 4,90 g MgSO4·7 H2O w 1 l dejonizowanej wody autoklawowanej.
  2. Do osadzania larw należy wcześniej przygotować podwielokrotności 1% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMA) i przechowywać je w temperaturze pokojowej.
    1. Aby przygotować podwielokrotności, rozpuścić LMA w 1 pożywce E3, np. 500 mg LMA w 50 ml 1 x E3 w kolbie Erlenmeyera, podgrzać roztwór w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego rozpuszczenia agarozy i rozlać go na 1 ml porcji w probówkach o pojemności 1,5 ml.

2. Hodowla danio pręgowanego i zbieranie zarodków

UWAGA: Użyto tutaj podwójnie transgenicznych larw danio pręgowanego informujących o obecności zaangażowanych osteoblastów [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 i makrofagi [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] zostały tutaj użyte30 (Rysunek 1A).

  1. Umieść rodzicielskie danio pręgowane z pożądanymi pojedynczymi transgenami w standardowych klatkach godowych wieczorem przed kryciem.
    UWAGA: Standardowe klatki godowe umożliwiają przejście jaj do niższego przedziału, gdzie rodzicielskie danio pręgowane nie mogą do nich dotrzeć.
    1. Samce i samice należy trzymać oddzielnie do momentu krycia za pomocą przegrody w klatce kryjącej. Usuń przegrodę rano następnego dnia, aby rozpocząć krycie.
  2. Najpóźniej w południe należy usunąć rodzicielskie danio pręgowane ze zbiorników hodowlanych i zebrać zarodki, przecedzając wodę z klatki godowej przez sito.
    UWAGA: W przypadku, gdy decydujący jest dokładny wiek larw, należy pobierać zarodki w regularnych odstępach czasu około 30 minut. Wiązania sprzęgła powinny być używane w eksperymentach z różnymi grupami eksperymentalnymi.
  3. Umieść zarodki w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 1x pożywkę E3 i trzymaj je w inkubatorze w temperaturze 28 °C31.
  4. Usuń niezapłodnione jaja i martwe zarodki z naczynia za pomocą plastikowej pipety za pomocą mikroskopu stereoskopowego i zmieniaj 1x pożywkę E3 dziennie.
  5. Przed eksperymentem należy posortować larwy dodatnie pod kątem transgenów reporterowych za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.

3. Larwy zanurzające się w niskotopliwej agarozie

  1. Rozpuść podwielokrotności LMA w termobloku lub łaźni wodnej w temperaturze 65 °C. Po stopieniu LMA utrzymuj go w temperaturze 42 °C do momentu zatopienia (Rysunek 1B). Dodaj 50 μl 0,4% MS-222 do stopionego 1 ml podwielokrotności LMA, aby uzyskać stężenie 0,02% MS-222 do znieczulenia.
  2. Znieczulić 4 dpf (dni po zapłodnieniu) larwy (lub starsze larwy) w 0,02% pożywce MS-222 E3.
  3. Przenieś znieczulone larwy do naczynia mikrostudzienkowego ze szklanym dnem za pomocą plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 ml i usuń nadmiar pożywki E3 tą samą pipetą (Rysunek 1B). Unikać wysychania larw.
    UWAGA: W naczyniu można jednocześnie zanurzyć więcej niż jedną larwę; Zaleca się osadzenie od 3 do 5 larw, aby zapewnić wystarczającą ilość czasu na umieszczenie.
  4. Weź stopioną agarozę LMA z łaźni wodnej/termobloku i dodaj (chłodzącą) kroplę LMA do naczynia, przykrywając szklane dno, na którym umieszczono larwy. Zwróć uwagę, że LMA nie jest zbyt gorący, ale nadal płynny.
  5. Następnie umieść larwy w pożądanej pozycji bocznej, zanim agaroza zastygnie. W tym miejscu należy zapewnić pozycję boczną, w której wieczko znajduje się jak najbliżej szklanego dna naczynia jako przygotowanie do ustawienia mikroskopu odwrotnego (Rysunek 1B).
  6. Pozwól agarozie zestalić się, a następnie dodaj pożywkę E3 (zawierającą maksymalnie 0,02% MS-222) do naczynia, aby uniknąć wysuszenia agarozy (Rysunek 1B).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie procedury osadzania. (A) Podwójnie transgeniczne Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29, wykorzystano 30 larw danio pręgowanego z oznaczonymi na zielono osteoblastami wieczkowymi i makrofagami oznaczonymi na czerwono. (B) Przebieg procedury osadzania, opisany w kroku 3 protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Obrazowanie in vivo larw i ablacja laserowa

  1. Do laserowej ablacji osteoblastów w rozwijającej się wieczce transgenicznego danio pręgowanego Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, użyj odwróconego dwufotonowego laserowego mikroskopu skaningowego z obiektywem wodnym 25x/0,95 lub równoważnym ustawieniem.
  2. Umieść szalkę z osadzonymi larwami na mikroskopijnym stoliku pod mikroskopem odwróconym i umieść żądany obszar do ablacji w środku pola widzenia. Opercle można łatwo zidentyfikować za pomocą sygnału fluorescencyjnego GFP.
  3. Gdy wieczko zostanie zogniskowane i wyśrodkowane w polu widzenia mikroskopu, wybierz ustawienia stosu z (często stosuje się odstępy z 1-2 μm), aby zobrazować całą szerokość wiecka. W tym samym czasie wybierz obszar w określonej płaszczyźnie z, który ma zostać poddany ablacji (zwykle w tylnej strefie wieczka). Dwufotonowa ablacja laserowa jest wywierana tylko w tej płaszczyźnie.
    UWAGA: Wyższa rozdzielczość w wymiarze z doprowadzi do wydłużenia czasu obrazowania, ale umożliwi późniejsze analizy wolumetryczne pozyskanych danych.
  4. Wyobraź sobie obszar zainteresowania wieczka przed ablacją. Do wykrywania GFP należy użyć lasera ze światłem białym o długości fali 488 nm i detektora hybrydowego o długości fali od 495 nm do 550 nm lub równoważnym. Zobrazuj makrofagi za pomocą wzbudzenia laserem światła białego 555 nm, z zakresem wykrywania mCherry od 595 do 780 nm na detektorze hybrydowym (lub równoważnym).
    1. Użyj formatu obrazu 512 x 512, aby uzyskać dobry stosunek jakości do czasu (inne formaty mogą być używane, jeśli wymagana jest wyższa rozdzielczość lub alternatywnie wyższa szybkość).
      UWAGA: Można użyć inkubatora z kontrolowaną temperaturą zainstalowanego przy mikroskopie i wyregulować go np. do 28 °C.
  5. Narysuj okrągły obszar o średnicy 25 μm (w zależności od eksperymentu można wybrać inne kształty i rozmiary) na wybranej płaszczyźnie 2D, skupiając opercle za pomocą narzędzia ROI.
  6. Aby wykonać ablację, należy zastosować moc ablacji (mierzoną bez obiektywu) na poziomie 450 mW i naświetlić wybrany obszar laserem dwufotonowym z prędkością skanowania 400 Hz i łącznym czasem trwania 10 s. Podczas ablacji obszar może być wizualizowany za pomocą detektora hybrydowego w zakresie 401-443 nm lub równoważnym.
  7. Po ablacji potwierdź ablację strukturalnie, ponownie obrazując ten sam stos z tymi samymi ustawieniami, które były używane przed ablacją. Obszar po ablacji nie zawiera już komórek fluorescencyjnych.

5. Odzyskiwanie larw i obrazowanie w celu monitorowania rekrutacji komórek odpornościowych

  1. Jeśli obrazowanie rekrutacji komórek odpornościowych musi zostać wykonane z opóźnieniem, odzyskaj larwy z obrazowania i znieczulenia. Ostrożnie usuń larwy z LMA za pomocą kleszczy lub igły do preparowania.
    1. Najpierw usuń warstwę agarozy pokrywającą larwy. Po drugie, usuń agarozę w bezpośrednim kontakcie z larwami. Pomiń ten krok, jeśli ma miejsce natychmiastowe obrazowanie rekrutacji komórek odpornościowych.
  2. Umieść larwy z powrotem w naczyniu z czystym podłożem E3 i sprawdź ich regenerację. Powrót do zdrowia jest widoczny po pływaniu larw.
  3. Po 4 lub 6 hpl (godziny po zmianie) ponownie zobrazuj obszar wieczka, używając tych samych ustawień pod tym samym mikroskopem, aby sprawdzić wpływ ablacji na rekrutację makrofagów. W tym celu powtórz osadzanie (krok 3) i obrazowanie jak poprzednio (krok 4).
  4. Po zobrazowaniu usuń larwy z LMA. Ofiarowanie larw można przeprowadzić przez inkubację w lodowatej wodzie lub z przedawkowaniem MS-222 w E3, w zależności od wymogów prawnych. Próbki można następnie wykorzystać do badań kontrolnych lub zutylizować.

6. Analiza obrazu i analiza statystyczna

  1. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Fiji32. W zależności od rozdzielczości Z pozyskanych danych, analizy mogą być wykonywane w 2D lub 3D.
  2. Ilościowe określenie makrofagów należy wykonać ręcznie, włączając komórki, które są wyraźnie oddzielone, na przykład poprzez rozpoznanie głównych ciał komórkowych, lub alternatywnie określając ilościowo komórki za pomocą znacznika jądrowego lub mierząc powierzchnię w przypadku, gdy komórki nakładają się na siebie (następny krok).
  3. Aby określić ilościowo obszar, utwórz maskę obejmującą makrofagi. Aby to zrobić, użyj narzędzia Image > Dostosuj próg > i utwórz ROI (Analyze > Tools > ROI Manager > Add) na Fidżi. Wyklucz małe cząstki w tle w celu oceny ilościowej.
    1. Następnie zmierz powierzchnię (Analizuj > Mierz). Zastanów się, czy obszary nakładającej się fluorescencji komórkowej muszą być uwzględnione w pomiarze.
      UWAGA: W tym przypadku obszar ablacji kołowej został pominięty w pomiarach obszaru, ponieważ rekrutowane makrofagi nie mogą być rozróżniane w tym obszarze.
  4. Generuj wykresy przedstawiające wyniki pomiarów za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Aby porównać dane przed i po ablacji, wykonaj odpowiedni test statystyczny (w tym przypadku wykonano sparowany jednostronny test t).
    UWAGA: Rysunki można przygotować za pomocą oprogramowania do edycji zdjęć i projektowania graficznego.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ablacja laserowa została przeprowadzona zgodnie z powyższym protokołem. Sygnał GFP osteoblastów w obszarze poddanym ablacji zniknął natychmiast po ablacji. Aby zbadać odpowiedź ablacji osteoblastów pod względem odpowiedzi immunologicznej, zobrazowano obecność makrofagów w 6 larwach dpf przed i przy 6 hpl. Przed ablacją zaobserwowano bardzo niewiele makrofagów w obszarze wieczka10 (Ryc. 2). Przy 6 hpl wykryto silną akumulację makrofagów w obszarze wieczka po ablacji i zwiększoną liczbę makrofagów w polu widzenia, w tym wieczko i obszar otaczający wieczko10 (Rysunek 2).

figure-results-1
Rysunek 2: Rekrutacja makrofagów przy 6 hpl w 6 dpf larw danio pręgowanego. Obszar wieczka bez ablacji i przy 6 hpl. Osteoblasty wieczkowe są oznaczone na zielono, makrofagi na kolor purpurowy, a przerywane kółko oznacza obszar poddany ablacji laserowej. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rekrutacja makrofagów była również analizowana u 4 larw dpf ze znacznie mniejszymi opercle przy 4 hpl, obserwując podobne wyniki (Rysunek 3). Kwantyfikacja liczby makrofagów (poza bezpośrednim miejscem ablacji laserowej) wykazała wzrost w badanym przedziale czasowym (4,00 ± 2,37 makrofagów przed ablacją w porównaniu z 7,00 ± 2,76 makrofagów przy 4 hpl) (Figura 3B). Podobnie obszar makrofagów (mierzony w μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 przed ablacją w porównaniu z 1553 μm2 ± 869,9 μm2 przy 4 hpl) wzrósł (Rysunek 3C). Ponieważ makrofagi są czasami trudne do odróżnienia, zaleca się pomiar obszaru makrofagów zamiast liczby makrofagów, tak jak to miało miejsce w tym przypadku.

figure-results-2
Rysunek 3: Rekrutacja makrofagów na poziomie 4 hpl w 4 dpf larw danio pręgowanego. (A) Obszar wieczka bez ablacji i przy 4 hpl. Osteoblasty wieczkowe są oznaczone na zielono, makrofagi na kolor purpurowy, a przerywane kółko oznacza obszar poddany ablacji laserowej. Podziałka skali: 50 μm. (B) Kwantyfikacja liczby makrofagów w obszarze wieczka bezpośrednio przed (0 hpl) i po ablacji (4 hpl). (C) Kwantyfikacja obszaru makrofagów (z wyłączeniem miejsca ablacji laserowej). Sparowane jednostronne testy t. Każda kropka reprezentuje dane jednej larwy i pokazana jest średnia ± SD, n = 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ablacja laserowa znalazła zastosowanie w różnych dyscyplinach badań biologicznych. W szczególności okazał się przydatny jako metoda badania regeneracji tkanek 10,11,12. Na przykład rekrutacja i zmiany fenotypowe wrodzonych komórek odpornościowych zostały niedawno przeanalizowane w czasie za pomocą testów ablacji laserem UV lub laserem dwufotonowym, wraz z regeneracją osteoblastów w miejscu ablacji laserowej10. Obrazowanie na żywo rekrutacji komórek odpornościowych przeprowadzono do 12 godzin po zmianie chorobowej (hpl); Można jednak przewidzieć dłuższe okresy obrazowania przy odpowiednim dostosowaniu znieczulenia i uzyskaniu zgody odpowiednich władz. W Geurtzen i wsp. analizy przeprowadzono do kilku dni po ablacji laserowej i pomogły one określić środowisko zapalne w miejscu ablacji, a także ustalić wspomagającą rolę makrofagów w regeneracji kości10. Możliwych jest wiele innych zastosowań, takich jak badanie roli reaktywnych form tlenuuwalniających 33 po śmierci komórki w tkance kostnej.

Jedną z zalet stosowania ablacji komórek za pośrednictwem lasera dwufotonowego jest możliwość połączenia jej z obrazowaniem konfokalnym. Użyte tutaj oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) można ustawić w trybie (Live Data Mode), w którym obrazowanie i ablacja następują po sobie, przyspieszając proces. Kolejną zaletą technologii jest dokładność ablacji. Rozmiar i kształt ablacji można łatwo dostosować w oprogramowaniu w bardzo precyzyjny sposób. W przedstawionym tutaj środowisku eksperymentalnym do ablacji wybrano okrągły obszar o średnicy 25 μm. Jednak w innych eksperymentach ablacyjnych u Drosophila stosowano ablacje liniowe 25 μm w celu zmniejszenia napięcia tkankowego w nabłonku embrionalnym poprzez przecięcie połączeń komórkowych sąsiad-sąsiad34. Ta dokładność pozwala na ablację określonej i kontrolowanej liczby komórek, pojedynczych komórek, a nawet błon komórkowych.

Warto zauważyć, że rodzaj zmiany wykonywanej za pomocą lasera dwufotonowego nie przypomina urazów i śmierci komórek, które występują w sposób naturalny, o czym należy pamiętać w badaniach nad regeneracją, ale także w innych dyscyplinach. W szczególności ablacje laserowe tworzą bardzo skoncentrowane zmiany poprzez całkowite zniszczenie (spalenie) komórek w obszarze zainteresowania20 przy minimalnym uszkodzeniu otaczających tkanek, podczas gdy urazy mechaniczne lub inne rodzaje uszkodzeń mają tendencję do wpływania na kilka typów i warstw tkanek w szerszej skali. Może to prowadzić do wielorakich konsekwencji obejmujących różne rodzaje śmierci komórek (np. martwica, apoptoza, autofagia)35 i różne wyniki regeneracyjne. Co więcej, reakcje na ablację laserową mogą różnić się pod względem komórkowym i molekularnym. Wykazano na przykład, że chociaż komórki otaczające miejsce uszkodzenia lasera mogą utracić integralność błony plazmatycznej, mogą przetrwać uszkodzenie i przywrócić integralność36. Ablacja laserowa prowadzi również do obszarów uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wynikać z "eksplozji termicznych" w samym środku przyłożonej wiązki laserowej, a także silnej ekspozycji na ciepło w bezpośrednio sąsiadujących komórkach10,37. Niemniej jednak komórki otaczające miejsca ablacji laserowej wykazują zwiększoną liczbę ciał apoptotycznych, jak pokazano w przypadku tkanki serca poddanej ablacji laserowej38, i wyzwalana jest odpowiedź immunologiczna, jak pokazano tutaj. Oprócz opisanych różnic, kolejnym ograniczeniem testów ablacji wspomaganej laserowo może być głębokość, na której można wykonać uraz, oraz ograniczony rozmiar próbek. Struktury ukryte w grubych próbkach mogą nie zostać odpowiednio poddane ablacji, a obrazowanie będzie utrudnione. Będzie to jednak w dużej mierze zależało od użytego mikroskopu i lasera, a także od obiektywu i osadzenia.

Osadzenie larw w taki sposób, aby wieczko było umieszczone w bliskiej odległości od szklanego dna naczynia, jest niezbędne w przypadku zastosowania układu odwróconego, jak w przedstawionym protokole. Ponadto bardzo ważne jest, aby przetestować temperaturę LMA przed nałożeniem go w celu pokrycia larw (krok 3.4), ponieważ gorąca agaroza uszkodzi larwy. Aby tego uniknąć, należy wcześnie pobrać podwielokrotność LMA z termobloku, np. podczas wyjmowania resztek pożywki E3 z naczynia ze szklanym dnem, i przetestować temperaturę, np. na skórze nadgarstka. LMA ma być ciepły, ale nie gorący.

Gdy larwy zostaną pokryte LMA, ważne jest, aby szybko umieścić je we właściwej pozycji, zanim LMA zacznie krzepnąć. Pozycja boczna jest najłatwiejsza do osiągnięcia; W prezentowanym badaniu pożądana pozycja była boczna z lekkim przechyleniem w stronę brzuszną. W przypadku, gdy LMA zestala się, zanim larwy zostaną prawidłowo umieszczone, możliwe jest usunięcie LMA (jak w kroku 5.1) i powtórzenie osadzania. Podobnie ważne jest, aby obszar, który ma być obrazowany (i poddawany ablacji laserowej), znajdował się jak najbliżej szklanego dna naczynia, aby zapewnić maksymalną jakość obrazu i ablację komórek, chociaż będzie to również zależeć od odległości roboczej obiektywu.

Możliwe jest osadzenie więcej niż jednej larwy w tym samym naczyniu w celu obrazowania. Pozwoli to zaoszczędzić czas i lepiej wykorzystać LMA. Liczba larw, które można osadzić, będzie zależeć od doświadczenia eksperymentatora, ale zaleca się 3-5 larw.

Ablacja laserowa może być również wykonywana za pomocą pionowych ustawień mikroskopowych wykorzystujących soczewki zanurzeniowe. W takim przypadku ważne jest, aby osadzić larwy w lekko brzusznym widoku (z góry), aby zapewnić dobrą jakość obrazowania i powodzenie ablacji laserowej wieczka. Ponadto tylko cienka warstwa LMA powinna pokrywać larwy, aby umożliwić dobre wzbudzenie i wykrycie sygnałów fluorescencyjnych.

W tym protokole dwufotonowy zestaw do ablacji za pośrednictwem lasera dla osteoblastów jest opisany jako metodologia wykonywania zmian w rozwijających się kościach, w szczególności w wieczce. Metoda ta może być dostosowana do ablacji komórek w innych kościach rozwijającego się danio pręgowanego. Co więcej, jest to ogólnie użyteczne podejście do badania regeneracji uszkodzonych tkanek11,12. Łatwość wykonywania ablacji i cięć tkanek o różnych rozmiarach i kształtach pozwala na jego zastosowanie w różnych konfiguracjach eksperymentalnych i dziedzinach badawczych 15,17,18,19,21,34. Ogólnie rzecz biorąc, ablacja za pośrednictwem lasera dwufotonowego jest metodą bardzo elastyczną - dla różnych tkanek, organizmów, a nawet warunków in vitro - i stanowi ważne narzędzie w badaniach biologicznych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) Transregio 67 (projekt 387653785), DFG SPP 2084 μBone (projekt KN 1102/2-1) do FK. Prace te były wspierane przez Zakład Mikroskopii Świetlnej (DFG project 413875620), który jest głównym ośrodkiem platformy technologicznej CMCB na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. Prace na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie były współfinansowane z wpływów podatkowych na podstawie budżetu uzgodnionego przez parlament Saksonii ("Parlament Krajowy").

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Chlorek wapnia dwuwodny, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Kształt końcówki prosty, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon 6-dołkowa płytkaCorning353502
Naczynie mikrodołkowe ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-CTalerz 35 mm, szkiełko nakrywkowe nr 1,5, średnica szkła 14 mm, niepowlekany
laser wielofotonowy Insight X3Spectra-Physics
Pakiet aplikacji LeicaLAS X, Leica Microsystems
Agaroza niskotopliwa Biozyme840101Biozym Plaque Agaroza
Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Klatki godowewiele odmian, np. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Chlorek potasu, KClPanReac AppliChem131494
Chlorek sodu, NaClCarl Roth3957.1
SP8 SOKÓŁ Leica MicrosystemsWyposażony w wielofotonowy laser Insight X3 i oprogramowanie Leica Application Suite
Igła preparcyjna ze stali nierdzewnejBochem12010140 mm
Mikroskop stereoskopowy SZX16OlympusWyposażony w podstawę podświetlającą LED SZX2-ILLTQ
Szafy termostatyczne TS - WTWksylemTS 608/2-iDo inkubacji (zarodka)
Transfer pipeta, 3,5 mlSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, przezroczysta
Zeiss SteREO Discovery.V12 wersja 4.7.1.0.Zeisswyposażony w kamerę Axiocam MRm i oprogramowanie AxioVision

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles