Artykuł metodologiczny

Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67279

⸱

6 września 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje dwufotonową ablację laserową przeprowadzaną na larwach danio pręgowanego, która służy jako model do badania regeneracji kości i efektów odpowiedzi immunologicznej na ablację.

Streszczenie

Danio pręgowany (Danio rerio) ma wyjątkową zdolność do regeneracji różnych organów i przydatków. Regeneracja kości u danio pręgowanego była badana przy użyciu różnych metod, takich jak amputacja płetw, wyrywanie łusek, trepanacja czaszki i podejścia mikroskopowe. Wykorzystując konfokalny skan laserowy wyposażony w laser dwufotonowy, opracowano metodę ablacji laserowej jako paradygmat zmiany chorobowej do ablacji komórek tworzących kości (osteoblastów) w rozwijającej się wieczce larw danio pręgowanego. Opisana tutaj metoda pozwala na ablację komórek w precyzyjny sposób, ponieważ obszar, kształt i głębokość można precyzyjnie regulować. Ponadto metoda ta pozwala na obrazowanie obszaru przed i tuż po ablacji, dzięki czemu można przeanalizować krótkoterminowe skutki urazu. W tym układzie eksperymentalnym badano odpowiedź immunologiczną po ablacji osteoblastów w uszkodzonym obszarze. Po ablacji zaobserwowano wzrost rekrutacji makrofagów, co wskazuje na znaczenie ich obecności podczas regeneracji kości.

Wprowadzenie

Danio pręgowany regeneruje różne organy, takie jak siatkówka, mózg, serce i trzustka1. Ponadto danio pręgowany regeneruje elementy szkieletu, dlatego wykorzystano je do badania regeneracji płetw, łusek i kalwarii (czapek czaszki)2. Do badania regeneracji tkanek i kości wykorzystano różne paradygmaty eksperymentalne, takie jak resekcja płetwy (amputacja), złamanie płetwy, trepanacja czaszki3,4, cryoinjury5,6, lub ablacja genetyczna7,8,9. Ostatnio metody ablacji laserowej są szeroko stosowane u danio pręgowanego do badania reakcji na gojenie i regenerację po urazie10,11,12,13,14.

Ablacja za pośrednictwem lasera była stosowana w różnych dziedzinach badań biologicznych, takich jak mechanobiologia, biologia rozwojowa, badania nad regeneracją i chirurgia nowotworów10,11,12,15,16,17,18,19. Istnieją różne metody ablacji laserowej, takie jak użycie laserów YAG (granat itrowo-aluminiowy), UV (ultrafiolet) lub 2p (dwufotonowe)20. Ablacja laserowa pozwala na usunięcie pojedynczych komórek lub większych fragmentów tkanek w bardzo dokładny sposób, umożliwiając badanie różnych procesów, takich jak odpowiedź układu odpornościowego na ablację guza21 lub podczas regeneracji wieczka danio pręgowanego. W tym ostatnim przykładzie ablacja została potwierdzona przez zanik jądrowego i cytoplazmatycznego sygnału fluoroforowego oraz barwienie martwicą10,22.

Dobrze wiadomo, że wrodzona odpowiedź immunologiczna i jej regulowana kinetyka są niezbędne do prawidłowej regeneracji tkanek. Neutrofile i makrofagi są pierwszymi komórkami, które są rekrutowane do miejsca urazu, gdzie pełnią różne role, takie jak uwalnianie cytokin i czynników wzrostu, usuwanie resztek komórkowych i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej23. Tę rekrutację i późniejszą funkcjonalizację makrofagów zaobserwowano również u amputowanych płetw danio pręgowanego24 i rozwijającej się wieczka, która została poddana laserowej "nanodysekcji" prowadzącej do ablacji osteoblastów10. W tym ostatnim eksperymencie po laserze UV i ablacji za pośrednictwem lasera dwufotonowego zaobserwowano odzyskanie liczby osteoblastów, prawidłowy rozwój wieczków i rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych (neutrofili, makrofagów i komórek podobnych do osteoklastów) do uszkodzonego obszaru><. Eksperymenty na danio pręgowanym, u których układ odpornościowy był farmakologicznie tłumiony przez stosowanie glikokortykosteroidów, wykazały upośledzenie regeneracji po nieprawidłowym rozregulowaniu odporności, co potwierdza funkcjonalną rolę układu odpornościowego w naprawie tkanek3,10,xref"25,26.

Tutaj opisana jest metodologia ablacji za pośrednictwem lasera dwufotonowego do badania biologii regeneracji kości w rozwijających się kościach danio pręgowanego. W szczególności wykazano wpływ podejścia do ablacji osteoblastów w wieczku pod względem odpowiedzi immunologicznej, która jest badana poprzez monitorowanie rekrutacji makrofagów do miejsca ablacji.

Protokół

Protokół badania został zatwierdzony przez Landesdirektion Sachsen, numery pozwoleń: 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Użyte szczepy rybek danio były utrzymywane zgodnie z prawem krajowym i w ustandaryzowanych warunkach, zgodnie z wcześniejszym opisem27,28. Szczegóły dotyczące wszystkich odczynników i sprzętu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów

  1. Przechowywać embriony w pożywce 1x E3. Pożywkę 1x E3 przygotować poprzez rozcieńczenie 170 mL roztworu stokowego 60x E3 w 10 L wody dejonizowanej i dodanie 2 mL 0,1% błękitu metylenowego.
    1. Roztwór stokowy pożywki 60x E3 przygotować, mieszając 17,2 g NaCl, 0,76 g KCl, 2,90 g CaCl2·2 H2O oraz 4,90 g MgSO4·7 H2O w 1 L dejonizowanej wody autoklawowanej.
  2. Do zatapiania larw przygotować wcześniej alikwoty 1% niskotopliwej agarozy (LMA) i przechowywać je w temperaturze pokojowej.
    1. W celu przygotowania alikwotów rozpuścić LMA w pożywce 1x E3 (np. 500 mg LMA w 50 mL 1x E3) w kolbie Erlenmeyera, podgrzać roztwór w mikrofalówce do całkowitego rozpuszczenia agarozy, a następnie rozdzielić go na alikwoty po 1 mL do probówek 1,5 mL.

2. Hodowla rybek danio i zbieranie embrionów

UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano podwójnie transgeniczne larwy danio pręgowanego raportujące obecność zdeterminowanych osteoblastów [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 oraz makrofagów [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]30 (Rysunek 1A).

  1. Wieczorem, w przeddzień kopulacji, umieść rodzicielskie rybki zebrafish z pożądanymi pojedynczymi transgenami w standardowych klatkach do rozrodu.
    UWAGA: Standardowe klatki do rozrodu umożliwiają przedostanie się jaj do dolnej komory, do której rodzicielskie rybki zebrafish nie mają dostępu.
    1. Przed kopulacją utrzymuj samce i samice osobno, używając przegrody w klatce do rozrodu. Usuń przegrodę następnego dnia rano, aby zainicjować kopulację.
  2. Najpóźniej w południe usuń rodzicielskie rybki zebrafish ze zbiorników hodowlanych i zbierz zarodki, przeciskając wodę z klatki do rozrodu przez sito.
    UWAGA: W przypadku, gdy dokładny wiek larw jest kluczowy, zbieraj zarodki w regularnych odstępach czasu wynoszących około 30 min. W eksperymentach z różnymi grupami badawczymi należy wykorzystywać rodzeństwo z jednego zniesienia.
  3. Umieść zarodki w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 1x E3 media i przechowuj je w inkubatorze w temperaturze 28 °C31.
  4. Usuń niezapłodnione jaja i martwe zarodki z naczynia za pomocą plastikowej pipety przy użyciu stereomikroskopu i codziennie wymieniaj 1x E3 media.
  5. Przed eksperymentem wyselekcjonuj larwy wykazujące pozytywną ekspresję transgenów reporterowych, korzystając ze stereomikroskopu fluorescencyjnego.

3. Zatapianie larw w agarozy niskotopliwej

  1. Rozpuść alikwoty LMA w termobloku lub kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C. Po rozpuszczeniu LMA utrzymuj go w temperaturze 42 °C aż do momentu zatapiania (Rycina 1B). Do rozpuszczonego 1 mL alikwotu LMA dodaj 50 µL 0,4% MS-222, aby uzyskać stężenie 0,02% MS-222 do znieczulenia.
  2. Znieczul larwy w 4 dpf (dniach po zapłodnieniu) (lub starsze larwy) w podłożu E3 z dodatkiem 0,02% MS-222.
  3. Przenieś znieczulone larwy do szalki z mikrowyciekami o szklanym dnie, używając plastikowej pipety Pasteura o pojemności 3 mL, a następnie usuń nadmiar podłoża E3 tą samą pipetą (Rycina 1B). Unikaj wysuszenia larw.
    UWAGA: W jednej szalce można jednocześnie zatopić więcej niż jedną larwę; zaleca się zatapianie od 3 do 5 larw, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na ich odpowiednie ułożenie.
  4. Wyjmij roztopioną agarozę LMA z kąpieli wodnej/termobloku i dodaj do szalki (stygnową) kroplę LMA, pokrywając szklane dno w miejscu, w którym znajdują się larwy. Upewnij się, że LMA nie jest zbyt gorące, ale wciąż pozostaje w stanie ciekłym.
  5. Następnie, przed zastygnięciem agarozy, ustaw larwy w pożądanej pozycji bocznej. Należy zapewnić pozycję boczną, w której operculum znajduje się jak najbliżej szklanego dna szalki, jako przygotowanie do pracy z mikroskopem odwróconym (Rycina 1B).
  6. Pozostaw agarozę do zastygnięcia, a następnie dodaj do szalki podłoże E3 (zawierające maksymalnie 0,02% MS-222), aby zapobiec wysychaniu agarozy (Rycina 1B).

Schemat przygotowania larw zebrafish; makrofagi znakowane mpeg1:mCherry, opercula z osterix:nGFP.
Rycina 1: Schematyczna prezentacja procedury zatapiania. (A) Wykorzystano podwójnie transgeniczne larwy zebrafish Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 z zielono znakowanymi osteoblastami opercula i makrofagami znakowanymi na czerwono. (B) Schemat procedury zatapiania, zgodnie z opisem w kroku 3 protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Obrazowanie larw in vivo i ablacja laserowa

  1. Aby przeprowadzić ablację laserową osteoblastów w rozwijającej się operkule transgenicznych danio pręgowanych Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, należy użyć odwróconego dwufotonowego skaningowego mikroskopu laserowego z obiektywem wodnym 25x/0,95 lub równoważnego zestawu.
  2. Umieśćy szalkę z zatopionymi larwami na stole mikroskopowym mikroskopu odwróconego i ustaw pożądany obszar ablacji w centrum pola widzenia. Operkulę można łatwo zidentyfikować dzięki sygnałowi fluorescencji GFP.
  3. Po ustawieniu ostrości na operkule i jej wycentrowaniu w polu widzenia mikroskopu, wybierz ustawienia stosu z (często stosuje się odstępy z wynoszące 1-2 µm), aby obrazować całą szerokość operkuli. Jednocześnie wybierz obszar w konkretnej płaszczyźnie z do ablacji (zazwyczaj w strefie tylnej operkuli). Ablacja laserowa dwufotonowa jest przeprowadzana wyłącznie w tej płaszczyźnie.
    UWAGA: Wyższa rozdzielczość w wymiarze z doprowadzi do wydłużenia czasu obrazowania, ale umożliwi późniejsze analizy wolumetryczne uzyskanych danych.
  4. Obrazuj wybrany obszar operkuli przed ablacją. Do detekcji GFP użyj białego lasera o długości fali 488 nm i detektora hybrydowego w zakresie od 495 nm do 550 nm lub odpowiednika. Obrazuj makrofagi przy użyciu wzbudzenia 555 nm (biały laser), z zakresem detekcji mCherry od 595 do 780 nm na detektorze hybrydowym (lub odpowiedniku).
    1. Użyj formatu obrazu 512 x 512 dla dobrego stosunku jakości do czasu (można stosować inne formaty, jeśli wymagana jest wyższa rozdzielczość lub przeciwnie, większa szybkość).
      UWAGA: Można wykorzystać i dostosować zainstalowany przy mikroskopie inkubator z kontrolą temperatury, np. do 28 °C.
  5. Za pomocą narzędzia ROI wyznacz kolisty obszar o średnicy 25 µm (można wybrać inne kształty i rozmiary w zależności od eksperymentu) w wybranej płaszczyźnie 2D, ogniskując operkulę.
  6. Aby przeprowadzić ablację, zastosuj moc ablacji (mierzoną bez obiektywu) wynoszącą 450 mW i poddaj wybrany obszar działaniu lasera dwufotonowego przy prędkości skanowania 400 Hz i całkowitym czasie trwania 10 s. Podczas ablacji obszar ten można wizualizować za pomocą detektora hybrydowego w zakresie 401-443 nm lub odpowiednika.
  7. Po ablacji potwierdź strukturalnie jej przebieg, ponownie obrazując ten sam stos z przy użyciu tych samych ustawień, co przed ablacją. Ablatowany obszar nie zawiera już fluorescencyjnych komórek.

5. Odzyskiwanie larw i obrazowanie w celu monitorowania rekrutacji komórek odpornościowych

  1. Jeśli obrazowanie rekrutacji komórek odpornościowych ma zostać wykonane z opóźnieniem, wybudź larwy z obrazowania i anestezji. Ostrożnie wyjmij larwy z LMA za pomocą pęsety lub igły sekcyjnej.
    1. Najpierw usuń warstwę agarozy pokrywającej larwy. Następnie usuń agarozę znajdującą się w bezpośrednim kontakcie z larwami. Pomiń ten krok, jeśli obrazowanie rekrutacji komórek odpornościowych odbywa się natychmiast.
  2. Umieść larwy z powrotem w naczyniu z czystym medium E3 i sprawdź ich regenerację. O regeneracji świadczy pływanie larw.
  3. W 4. lub 6. hpl (godzinie po uszkodzeniu) ponownie obrazuj obszar operkulum, korzystając z tych samych ustawień i tego samego mikroskopu, aby sprawdzić wpływ ablacji na rekrutację makrofagów. W tym celu powtórz proces zatapiania (krok 3) oraz obrazowanie przeprowadzone wcześniej (krok 4).
  4. Po obrazowaniu wyjmij larwy z LMA. Uśmiercanie larw można przeprowadzić poprzez inkubację w lodowatej wodzie lub podanie przedawkowania MS-222 w medium E3, w zależności od wymogów prawnych. Próbki mogą następnie posłużyć do dalszych badań lub zostać zutylizowane.

6. Analiza obrazu i analiza statystyczna

  1. Przetwórz obrazy przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów, takiego jak Fiji.32W zależności od rozdzielczości w osi z uzyskanych danych, analizy można przeprowadzić w 2D lub 3D.
  2. Przeprowadź manualną kwantyfikację makrofagów, uwzględniając komórki wyraźnie oddzielone (np. poprzez rozróżnienie głównych ciał komórkowych) lub alternatywnie kwantyfikując komórki z markerem jądrowym bądź mierząc powierzchnię w przypadku nakładania się komórek (kolejny krok).
  3. W celu ilościowego oznaczenia powierzchni należy utworzyć maskę obejmującą makrofagi. W tym celu należy użyć Obraz > Dostosuj > Próg narzędzie i utwórz ROI (obszar zainteresowania) (Analizuj > Narzędzia > Menedżer ROI > Dodać) w programie Fiji. W celu przeprowadzenia kwantyfikacji należy wykluczyć małe cząsteczki w tle.
    1. Następnie zmierz powierzchnię (Analiza > Pomiar). Należy rozważyć, czy obszary nakładającej się fluorescencji komórkowej powinny zostać uwzględnione w pomiarze.
      UWAGA: W tym przypadku okrągły obszar ablacji pominięto w pomiarach powierzchni, ponieważ w tym obszarze nie można odróżnić zrekrutowanych makrofagów.
  4. Wygeneruj wykresy przedstawiające wyniki pomiarów przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. W celu porównania danych sprzed i po ablacji przeprowadź odpowiedni test statystyczny (w tym przypadku jednostronny test dla par zależnych). test t-Studenta przeprowadzono).
    UWAGA: Ryciny można przygotować przy użyciu oprogramowania do edycji zdjęć i projektowania graficznego.

Wyniki

Ablację laserową przeprowadzono zgodnie z powyższym protokołem. Sygnał GFP osteoblastów w obszarze poddanym ablacji zanikł natychmiast po zabiegu. Aby zbadać odpowiedź organizmu na ablację osteoblastów pod kątem reakcji immunologicznej, wykonano obrazowanie obecności makrofagów w larwach w 6 dpf przed zabiegiem oraz w 6 hpl. Przed ablacją w obszarze operkulum zaobserwowano bardzo niewielką liczbę makrofagów10 (Rycina 2). W 6 hpl stwierdzono silną akumulację makrofagów w ablowanym regionie operkulum oraz zwiększoną liczbę makrofagów w polu widzenia, obejmującym operkulum i obszar go otaczający10 (Rycina 2).

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające interakcję osteoblastów osterix:nGFP i makrofagów mpeg1:mCherry.
Rycina 2: Rekrutacja makrofagów w 6 hpl u larw zebrafish w 6 dpf. Obszar operkulum bez ablacji oraz w 6 hpl. Osteoblasty operkulum są znakowane na zielono, makrofagi na purpurowo, a przerywany okrąg wskazuje obszar poddany ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analizowano również rekrutację makrofagów u larw w 4. dniu po zapłodnieniu (dpf), które miały znacznie mniejsze opercula; w 4 hpl zaobserwowano podobne wyniki (Rysunek 3). Ilościowe oznaczenie liczby makrofagów (poza bezpośrednim miejscem ablacji laserowej) wykazało wzrost w badanym przedziale czasowym (4,00 ± 2,37 makrofagów przed ablacją w porównaniu do 7,00 ± 2,76 makrofagów w 4 hpl) (Rysunek 3B). Podobnie zwiększyła się powierzchnia makrofagów (mierzona w µm2, 785,8 µm2 ± 723,1 µm2 przed ablacją w porównaniu do 1553 µm2 ± 869,9 µm2 w 4 hpl) (Rysunek 3C). Ponieważ makrofagi są czasami trudne do rozróżnienia, zaleca się pomiar powierzchni makrofagów zamiast ich liczby, co zostało zastosowane w niniejszym badaniu.

Mikroskopia fluorescencyjna zachowania makrofagów u danio pręgowanego, wraz z wykresami ilościowymi liczby i powierzchni komórek.
Rycina 3Rekrutacja makrofagów w 4. godzinie po urazie (hpl) u 4-dniowych (dpf) larw zebrafish. (A) Obszar operculum bez ablacji i w 4 hpl. Osteoblasty opercularne są znakowane na zielono, makrofagi na purpurowo, a przerywana okrągła linia wskazuje obszar poddany ablacji laserowej. Pasek skali: 50 µm. (B) Ilościowe oznaczenie liczby makrofagów w obszarze opercula bezpośrednio przed (0 hpl) i po ablacji (4 hpl). (C) Ilościowe oznaczenie powierzchni makrofagów (z wyłączeniem miejsca ablacji laserowej). Jednostronny test dla par. testy t-StudentaKażda kropka reprezentuje dane jednej larwy; przedstawiono średnią ± SD, n = 6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ablacja laserowa znalazła zastosowanie w różnych dyscyplinach badań biologicznych. W szczególności okazał się przydatny jako metoda badania regeneracji tkanek 10,11,12. Na przykład rekrutacja i zmiany fenotypowe wrodzonych komórek odpornościowych zostały niedawno przeanalizowane w czasie za pomocą testów ablacji laserem UV lub laserem dwufotonowym, wraz z regeneracją osteoblastów w miejscu ablacji laserowej10. Obrazowanie na żywo rekrutacji komórek odpornościowych przeprowadzono do 12 godzin po zmianie chorobowej (hpl); Można jednak przewidzieć dłuższe okresy obrazowania przy odpowiednim dostosowaniu znieczulenia i uzyskaniu zgody odpowiednich władz. W Geurtzen i wsp. analizy przeprowadzono do kilku dni po ablacji laserowej i pomogły one określić środowisko zapalne w miejscu ablacji, a także ustalić wspomagającą rolę makrofagów w regeneracji kości10. Możliwych jest wiele innych zastosowań, takich jak badanie roli reaktywnych form tlenuuwalniających 33 po śmierci komórki w tkance kostnej.

Jedną z zalet stosowania ablacji komórek za pośrednictwem lasera dwufotonowego jest możliwość połączenia jej z obrazowaniem konfokalnym. Użyte tutaj oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) można ustawić w trybie (Live Data Mode), w którym obrazowanie i ablacja następują po sobie, przyspieszając proces. Kolejną zaletą technologii jest dokładność ablacji. Rozmiar i kształt ablacji można łatwo dostosować w oprogramowaniu w bardzo precyzyjny sposób. W przedstawionym tutaj środowisku eksperymentalnym do ablacji wybrano okrągły obszar o średnicy 25 μm. Jednak w innych eksperymentach ablacyjnych u Drosophila stosowano ablacje liniowe 25 μm w celu zmniejszenia napięcia tkankowego w nabłonku embrionalnym poprzez przecięcie połączeń komórkowych sąsiad-sąsiad34. Ta dokładność pozwala na ablację określonej i kontrolowanej liczby komórek, pojedynczych komórek, a nawet błon komórkowych.

Warto zauważyć, że rodzaj zmiany wykonywanej za pomocą lasera dwufotonowego nie przypomina urazów i śmierci komórek, które występują w sposób naturalny, o czym należy pamiętać w badaniach nad regeneracją, ale także w innych dyscyplinach. W szczególności ablacje laserowe tworzą bardzo skoncentrowane zmiany poprzez całkowite zniszczenie (spalenie) komórek w obszarze zainteresowania20 przy minimalnym uszkodzeniu otaczających tkanek, podczas gdy urazy mechaniczne lub inne rodzaje uszkodzeń mają tendencję do wpływania na kilka typów i warstw tkanek w szerszej skali. Może to prowadzić do wielorakich konsekwencji obejmujących różne rodzaje śmierci komórek (np. martwica, apoptoza, autofagia)35 i różne wyniki regeneracyjne. Co więcej, reakcje na ablację laserową mogą różnić się pod względem komórkowym i molekularnym. Wykazano na przykład, że chociaż komórki otaczające miejsce uszkodzenia lasera mogą utracić integralność błony plazmatycznej, mogą przetrwać uszkodzenie i przywrócić integralność36. Ablacja laserowa prowadzi również do obszarów uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej, które mogą wynikać z "eksplozji termicznych" w samym środku przyłożonej wiązki laserowej, a także silnej ekspozycji na ciepło w bezpośrednio sąsiadujących komórkach10,37. Niemniej jednak komórki otaczające miejsca ablacji laserowej wykazują zwiększoną liczbę ciał apoptotycznych, jak pokazano w przypadku tkanki serca poddanej ablacji laserowej38, i wyzwalana jest odpowiedź immunologiczna, jak pokazano tutaj. Oprócz opisanych różnic, kolejnym ograniczeniem testów ablacji wspomaganej laserowo może być głębokość, na której można wykonać uraz, oraz ograniczony rozmiar próbek. Struktury ukryte w grubych próbkach mogą nie zostać odpowiednio poddane ablacji, a obrazowanie będzie utrudnione. Będzie to jednak w dużej mierze zależało od użytego mikroskopu i lasera, a także od obiektywu i osadzenia.

Osadzenie larw w taki sposób, aby wieczko było umieszczone w bliskiej odległości od szklanego dna naczynia, jest niezbędne w przypadku zastosowania układu odwróconego, jak w przedstawionym protokole. Ponadto bardzo ważne jest, aby przetestować temperaturę LMA przed nałożeniem go w celu pokrycia larw (krok 3.4), ponieważ gorąca agaroza uszkodzi larwy. Aby tego uniknąć, należy wcześnie pobrać podwielokrotność LMA z termobloku, np. podczas wyjmowania resztek pożywki E3 z naczynia ze szklanym dnem, i przetestować temperaturę, np. na skórze nadgarstka. LMA ma być ciepły, ale nie gorący.

Gdy larwy zostaną pokryte LMA, ważne jest, aby szybko umieścić je we właściwej pozycji, zanim LMA zacznie krzepnąć. Pozycja boczna jest najłatwiejsza do osiągnięcia; W prezentowanym badaniu pożądana pozycja była boczna z lekkim przechyleniem w stronę brzuszną. W przypadku, gdy LMA zestala się, zanim larwy zostaną prawidłowo umieszczone, możliwe jest usunięcie LMA (jak w kroku 5.1) i powtórzenie osadzania. Podobnie ważne jest, aby obszar, który ma być obrazowany (i poddawany ablacji laserowej), znajdował się jak najbliżej szklanego dna naczynia, aby zapewnić maksymalną jakość obrazu i ablację komórek, chociaż będzie to również zależeć od odległości roboczej obiektywu.

Możliwe jest osadzenie więcej niż jednej larwy w tym samym naczyniu w celu obrazowania. Pozwoli to zaoszczędzić czas i lepiej wykorzystać LMA. Liczba larw, które można osadzić, będzie zależeć od doświadczenia eksperymentatora, ale zaleca się 3-5 larw.

Ablacja laserowa może być również wykonywana za pomocą pionowych ustawień mikroskopowych wykorzystujących soczewki zanurzeniowe. W takim przypadku ważne jest, aby osadzić larwy w lekko brzusznym widoku (z góry), aby zapewnić dobrą jakość obrazowania i powodzenie ablacji laserowej wieczka. Ponadto tylko cienka warstwa LMA powinna pokrywać larwy, aby umożliwić dobre wzbudzenie i wykrycie sygnałów fluorescencyjnych.

W tym protokole dwufotonowy zestaw do ablacji za pośrednictwem lasera dla osteoblastów jest opisany jako metodologia wykonywania zmian w rozwijających się kościach, w szczególności w wieczce. Metoda ta może być dostosowana do ablacji komórek w innych kościach rozwijającego się danio pręgowanego. Co więcej, jest to ogólnie użyteczne podejście do badania regeneracji uszkodzonych tkanek11,12. Łatwość wykonywania ablacji i cięć tkanek o różnych rozmiarach i kształtach pozwala na jego zastosowanie w różnych konfiguracjach eksperymentalnych i dziedzinach badawczych 15,17,18,19,21,34. Ogólnie rzecz biorąc, ablacja za pośrednictwem lasera dwufotonowego jest metodą bardzo elastyczną - dla różnych tkanek, organizmów, a nawet warunków in vitro - i stanowi ważne narzędzie w badaniach biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) Transregio 67 (projekt 387653785), DFG SPP 2084 μBone (projekt KN 1102/2-1) do FK. Prace te były wspierane przez Zakład Mikroskopii Świetlnej (DFG project 413875620), który jest głównym ośrodkiem platformy technologicznej CMCB na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie. Prace na Uniwersytecie Technicznym w Dreźnie były współfinansowane z wpływów podatkowych na podstawie budżetu uzgodnionego przez parlament Saksonii ("Parlament Krajowy").

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek wapnia dwuwodny, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
Naczynie do hodowli komórkowych, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51Kształt końcówki prosty, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm
Falcon 6-dołkowa płytkaCorning353502
Naczynie mikrodołkowe ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-CTalerz 35 mm, szkiełko nakrywkowe nr 1,5, średnica szkła 14 mm, niepowlekany
laser wielofotonowy Insight X3Spectra-Physics
Pakiet aplikacji LeicaLAS X, Leica Microsystems
Agaroza niskotopliwa Biozyme840101Biozym Plaque Agaroza
Siarczan magnezu siedmiowodny, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
Klatki godowewiele odmian, np. Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
Chlorek potasu, KClPanReac AppliChem131494
Chlorek sodu, NaClCarl Roth3957.1
SP8 SOKÓŁ Leica MicrosystemsWyposażony w wielofotonowy laser Insight X3 i oprogramowanie Leica Application Suite
Igła preparcyjna ze stali nierdzewnejBochem12010140 mm
Mikroskop stereoskopowy SZX16OlympusWyposażony w podstawę podświetlającą LED SZX2-ILLTQ
Szafy termostatyczne TS - WTWksylemTS 608/2-iDo inkubacji (zarodka)
Transfer pipeta, 3,5 mlSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, przezroczysta
Zeiss SteREO Discovery.V12 wersja 4.7.1.0.Zeisswyposażony w kamerę Axiocam MRm i oprogramowanie AxioVision

Bibliografia

  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ablacja dwufotonowaablacja osteoblastówregeneracja kościmikroskopia konfokalnarekrutacja makrofagówodpowiedź immunologicznaobrazowanie operculumagaroza niskotopliwatransgeniczne zebrafishy
Dwufotonowa, laserowa ablacja osteoblastów w rozwijających się larwach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.