Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar czterech podtypów komórek NK macicy za pomocą multipleksowanego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego u kobiet z powtarzającym się niepowodzeniem implantacji

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67284

⸱

25 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia pionierską metodę ilościowego oznaczania podzbiorów komórek NK macicy podczas okna implantacji przy użyciu zaawansowanych technik barwienia immunohistochemicznego multipleksowanego fluorescencyjnego.

Streszczenie

Immunohistochemia (IHC) odgrywa kluczową rolę w badaniach biologicznych i diagnostyce klinicznej, służąc jako najczęściej stosowana metoda identyfikacji i wizualizacji antygenów tkankowych. Jednak tradycyjne metody barwienia IHC mają ograniczenia w rozróżnianiu różnych podtypów komórek odpornościowych. Wyzwanie to skłoniło naukowców do zbadania nowych technologii i metodologii precyzyjnej identyfikacji i różnicowania podtypów komórek odpornościowych. W ostatnich latach multiplex IHC pojawił się jako rozwiązanie, umożliwiające jednoczesne wykrywanie wielu antygenów i ich wizualizację w tej samej próbce tkanki. Komórki naturalnych zabójców macicy (uNK) odgrywają kluczową rolę we wczesnych procesach ciąży, w tym w decydualizacji, przebudowie tętnic spiralnych macicy i implantacji zarodka. Różne podtypy komórek uNK wykazują różne funkcje, co pozwala im koordynować różne zdarzenia biologiczne w celu pomyślnego rozwoju zarodka i ciąży. Dlatego dogłębne badania nad podtypami komórek uNK są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów regulacji immunologicznej w czasie ciąży. Takie badania dostarczają cennych spostrzeżeń i nowatorskich podejść do radzenia sobie z powiązanymi schorzeniami, takimi jak niepłodność i nawracające zaburzenia rozrodu. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół barwienia multipleksowego IHC do badania gęstości czterech podtypów komórek uNK w próbkach endometrium podczas okna implantacji (WOI). Protokół obejmuje przygotowanie próbki, optymalizację markerów podtypów, obrazowanie mikroskopowe i analizę danych. Ten multipleksowy protokół barwienia IHC oferuje wysoką specyficzność i czułość, umożliwiając jednoczesne wykrywanie różnych podtypów komórek uNK, zapewniając w ten sposób naukowcom potężne narzędzie do badania zawiłości i mechanizmów regulacji immunologicznej podczas ciąży.

Wprowadzenie

Pierwszy udokumentowany żywy poród po zapłodnieniu in vitro-transferze zarodków (IVF-ET) został zgłoszony w 1978 roku. W ciągu ostatnich 40 lat pojawiło się duże zapotrzebowanie na pomoc IVF-ET wśród niepłodnych par1. W 2021 roku 238 126 pacjentów zainicjowało łącznie 413 776 cykli IVF w Stanach Zjednoczonych. Oznacza to wzrost o 25% w stosunku do 2 lat wcześniej i o 135% w stosunku do 20122. Wzrost ten przypisuje się głównie rosnącemu rozpowszechnieniu niepłodności i opóźnionemu planowaniu ciąży. Postęp w technikach hodowli zarodków i protokołach superowulacji doprowadził do wzrostu wskaźnika żywych urodzeń na cykl ET, osiągając 30%-50% u kobiet poniżej 40 roku życia i mniej niż 30% u kobiet w wieku powyżej 40 lat2. Jednak pomimo tych postępów ponad połowa przenoszonych zarodków nadal nie udaje się zagnieździć. Powtarzające się niepowodzenie implantacji (RIF), zwykle definiowane jako niepowodzenie po trzech lub więcej kolejnych próbach transferu wysokiej jakości zarodków, dotyka 15% kobiet, które poddają się IVF-ET3. Pary z RIF są wyjątkowo wrażliwe i bardziej podatne na kosztowne i niepotrzebne zabiegi, które mogą narazić je na nadmierne ryzyko4. Dlatego zrozumienie przyczyn RIF i poprawa implantacji zarodków ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia sukcesu IVF-ET, szczególnie w przypadku kobiet z RIF. Przygotowanie endometrium ma kluczowe znaczenie dla udanej implantacji zarodka. Proces ten charakteryzuje się znaczną akumulacją komórek NK (uNK) macicy, które przechodzą od stanowiących 30% wszystkich limfocytów w endometrium w środkowej fazie wydzielniczej do 70%-80% w decidua we wczesnej ciąży5. Warto zauważyć, że komórki uNK różnią się od obwodowych komórek NK, które są cytotoksycznymi limfocytami, które mają kluczowe znaczenie dla wrodzonego układu odpornościowego do powodowania śmierci zakażonych komórek w wyniku lizy lub apoptozy. Chociaż dokładne funkcje komórek uNK nie są jeszcze w pełni poznane, kilka linii dowodów sugeruje, że są one zaangażowane w przebudowę angiogenezy, inwazję trofoblastu i rozwój płodu6. Związek między odsetkiem komórek uNK w komórkach zrębu a RIF zyskał dużą atrakcyjność w ciągu ostatnich 20 lat. Niedawna metaanaliza, która obejmowała 8 badań z udziałem 604 kobiet, wykazała, że gęstość komórek CD56+uNK w środkowej fazie lutealnej jest znacznie zwiększona u kobiet z RIF w porównaniu z płodnymi grupą kontrolną7. Należy jednak zauważyć, że charakterystyka komórek uNK w środkowej fazie lutealnej różni się znacznie od cech komórek NK z wynikiem dziesiętnym (dNK). Chociaż komórki uNK mogą dalej różnicować się w różne podzbiory komórek dNK po ciąży, sam pomiar komórek uNK nie reprezentuje dokładnie komórek dNK8. Komórki uNK ulegają dynamicznemu różnicowaniu i odgrywają różne role w cyklu menstruacyjnym i procesach decydualizacji, co czyni je bardziej złożonymi, niż można je zidentyfikować na podstawie samego CD56. Do osiągnięcia pełnego zrozumienia zachowania komórek uNK podczas preparacji endometrium wymaganych jest wiele markerów. W naszym ostatnim badaniu wykorzystaliśmy sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu zidentyfikowania różnorodności komórek uNK w cyklach menstruacyjnych. Wyniki, zweryfikowane za pomocą cytometrii przepływowej, wykazały obecność czterech odrębnych podtypów komórek uNK, z których każdy wykazuje dynamiczne zmiany podczas cyklu miesiączkowego9. Analiza wzbogacenia genów i funkcjonalne wzbogacenie ontologii genów wskazują, że te podzbiory uNK pełnią różne funkcje na różnych etapach menstruacji. Niemniej jednak cytometria przepływowa nie jest powszechnie dostępna w laboratoriach klinicznych, a natychmiastowe przetwarzanie świeżej tkanki endometrium do trawienia enzymatycznego uniemożliwia powtórzenie kroków eksperymentalnych w przypadku błędów.

Celem tego badania było zatem zbadanie pomiaru tych czterech subpopulacji komórek NK za pomocą testu barwienia multipleksowego, który zapewnia bardziej praktyczne podejście diagnostyczne. W barwieniu wielokrotnym różne specyficzne przeciwciała przeciwko każdemu celowi są połączone z różnymi etykietami fluoroforowymi, które emitują różne długości fal światła, gdy są wzbudzane przez określoną długość fali światła. W porównaniu z tradycyjną metodą barwienia IHC, metoda ta może ilościowo porównać względną obfitość i rozmieszczenie wielu celów w próbce oraz dostarczyć informacji na temat interakcji i kolokalizacji różnych celów, umożliwiając nam identyfikację różnych podtypów komórek uNK. Podejście to nie tylko pogłębi naszą wiedzę na temat związku między komórkami uNK a RIF, ale także dostarczy informacji do badania innych subpopulacji komórek odpornościowych w chorobach związanych z endometrium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Research Committee (CREC ref no: 2022.581). Kobiety z RIF zostały zrekrutowane z Centrum Technologii Wspomaganego Rozrodu, Szpitala Księcia Walii, Chińskiego Uniwersytetu w Hongkongu. RIF zdefiniowano jako niemożność uzyskania ciąży klinicznej po transferze co najmniej 4 dobrej jakości zarodków w co najmniej 3 cyklach świeżych lub mrożonych u kobiety w wieku poniżej 40 lat10. Uzyskano świadomą zgodę uczestniczek przed pobraniem biopsji endometrium.

1. Pobieranie i przetwarzanie próbek endometrium

  1. Czas pobrania próbki endometrium
    1. Pobieraj próbki endometrium zgodnie ze ścisłym protokołem, aby zapewnić spójność wśród uczestniczek badania. W przypadku pacjentek z naturalnymi cyklami należy przeprowadzić analizę moczu od 9dnia cyklu miesiączkowego i wykonać biopsję endometrium w 7 dniu po wyrzucie LH (LH+7)11 . W przypadku pacjentek poddawanych cyklom hormonalnej terapii zastępczej (HTZ) należy podawać doustnie 6 mg walerianianu estradiolu dziennie, począwszy od 2. dnia cyklu miesiączkowego.
    2. Oceń grubość endometrium za pomocą ultrasonografii w 13 dniu cyklu miesiączkowego. Gdy grubość endometrium osiągnie lub przekroczy 8 mm, podaj progesteron przezpochwowo i przeprowadź biopsję endometrium 5 dni po podaniu progesteronu12.
  2. Pobieranie i utrwalanie próbki endometrium: wprowadzić próbnik z pipetą do jamy macicy, przesuwając go do okolicy dna; zastosować ssanie, pociągając w dół wewnętrzny tłok, jednocześnie zeskrobując powierzchnię endometrium poprzez ruchy obrotowe i pionowe w jamie macicy. Zebrane próbki spłucz zwykłą solą fizjologiczną, aby wyeliminować wydzielinę z szyjki macicy i macicy. Zmierz próbki i oceń wielkość. W przypadku próbek o wymiarach 3 mm x 15-25 mm należy je natychmiast zanurzyć w 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny i utrwalić w temperaturze pokojowej na 24-48 godzin.
  3. Odwodnienie: Po zakończeniu utrwalania należy poddać próbki sekwencji odwadniania mającej na celu zastąpienie wody etanolem. Aby to zrobić, zanurz tkanki w kąpielach 70%, 80%, 90% i 100% etanolowych, aby zapewnić całkowite odwodnienie. Po końcowej kąpieli etanolowej oczyścić próbki z ksylenu w celu usunięcia pozostałości alkoholu i przygotować je do infiltracji parafiny.
  4. Osadzanie: Po umieszczeniu tkanki płasko na dnie formy, rozpuść parafinę i ostrożnie dodaj ją do próbek, aby upewnić się, że tkanka endometrium jest całkowicie zamknięta w matrycy parafinowej. Po napełnieniu form woskiem parafinowym schłodzić je na stole zamrażarki, aby ułatwić zestalenie wosku parafinowego. Po stwardnieniu bloków parafiny przechowywać w temperaturze pokojowej do czasu, gdy wymagana jest dalsza obróbka.
    UWAGA: Zastosowane formy zostały specjalnie dobrane, aby dostosować się do wielkości uzyskanych próbek endometrium, aby umożliwić tkance endometrium ułożenie się płasko na dnie bez fałdowania, zapewniając w ten sposób optymalną orientację do późniejszego cięcia i bez tworzenia zbędnego nadmiaru.
  5. Dzielenie na sekcje: Aby przygotować się do dzielenia, należy schłodzić bloki parafiny w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Próbki należy podzielić na odcinki o wielkości 4 μm za pomocą mikrotomu, a następnie spłaszczyć plastry na powierzchni wody destylowanej podgrzanej do temperatury 42 °C i umieścić je na szkiełkach samoprzylepnych. Umieść plastry na noc w suszarce do szkiełków i przechowuj w temperaturze pokojowej przed użyciem.

2. Optymalizacja warunków immunohistochemicznych multipleksu

  1. Walidacja IHC: W celu walidacji parametrów barwienia IHC należy przyjąć systematyczne podejście do precyzyjnego dostrojenia warunków pobierania antygenu, stężenia przeciwciał i czasu inkubacji.
    1. W zalecanych przez producenta zakresach rozcieńczeń należy przeprowadzić test 2-3 stężeń dla każdego przeciwciała. Zoptymalizuj pobieranie antygenu, porównując o pH 6 i pH 9 i oceń protokoły inkubacji zarówno w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, jak i przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Oceń skrupulatnie każdy warunek, koncentrując się na intensywności barwienia, specyficzności i szumie tła. Wybierz optymalną kombinację, która uzyska najczystsze, najbardziej specyficzne barwienie przy minimalnym niespecyficznym wiązaniu. Ta rygorystyczna walidacja zapewniła najwyższą dokładność i odtwarzalność protokołu IHC.
  2. Barwienie monopleksowe z wzmocnieniem sygnału tyramidowego (TSA): Po określeniu optymalnych parametrów barwienia dla poszczególnych przeciwciał, zoptymalizuj parowanie przeciwciał z różnymi barwnikami TSA. Połącz marker o wyższej ekspresji z barwnikiem o niższym poziomie intensywności fluorescencji lub odwrotnie. Podczas tej fazy należy dostosować stężenie przeciwciał i czas inkubacji zgodnie z obserwowaną siłą sygnału fluorescencji. Jeśli zaobserwuje się znaczne zabarwienie tła lub niespecyficzne zabarwienie, zmień sparowany dye13.
  3. Barwienie multipleksowe TSA: W przypadku protokołu immunohistochemii multipleksowej (m-IHC) sekwencyjna kolejność barwienia została dokładnie określona zgodnie z ustalonymi zasadami. Aby upewnić się, że proces multipleksowania odzwierciedla czułość i swoistość barwienia jednomarkerowego, priorytetowo traktowano przeciwciała o niższych poziomach ekspresji na początku sekwencji barwienia. Umieść przeciwciała, które wymagają naprawy zasady w celu pobrania antygenu na końcu sekwencji barwienia, ponieważ naprawa zasady jest solidna w porównaniu z metodami opartymi na kwasach, które mogą w niektórych przypadkach wzmacniać niespecyficzne artefakty barwienia.
  4. Korzystając z wyników kroków 2.1 i 2.2, zdecyduj, jakie przeciwciała mają być użyte i na jakim etapie, w oparciu o ich wymagania dotyczące pobierania antygenu i gęstości ekspresji. Na przykład przeciwciało CXCR4, które wymaga naprawy zasady w celu pobrania antygenu, zostało umieszczone w końcowych etapach barwienia. I odwrotnie, przeciwciało CD49a, które charakteryzuje się mniejszą gęstością ekspresji, otrzymało pierwszą pozycję w sekwencji barwienia. Zmaksymalizuj szanse na pomyślne wykrycie i zminimalizuj wszelkie efekty maskowania, które mogą wystąpić na późniejszych etapach procedury multipleksowania.
  5. W przypadku pozostałych przeciwciał należy przetestować różne kombinacje w fazie optymalizacji, aby określić najskuteczniejszą sekwencję, która równoważy zarówno czułość, jak i swoistość. Wyniki tych analiz porównawczych posłużą do ostatecznego składu panelu multipleksowego, zgodnie z tabelą 1, zapewniając, że wybrany panel zapewnia optymalną wydajność przy jednoczesnej minimalizacji tła.

3. Proces m-IHC

  1. Deparafinowanie, nawilżanie i utrwalanie: Wypalać skrawki tkanek w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, a następnie sekwencyjnie zanurzać w ksylenie I (10 min), ksylenie II (10 min), 100% etanolu (5 min), 95% etanolu (5 min), 80% etanolu (5 min), 75% etanolu (5 min), ddH2O (2 min dla 3x), 10% neutralnej buforowanej formaliny (co najmniej 20 min), i ddH2O (2 min dla 3x).
  2. Pobieranie antygenu: Dodać 200 ml odpowiedniego buforu AR6 lub AR9, jak podano w tabeli 1 dla każdego przeciwciała, do żaroodpornej kasety do pobierania antygenu. Umieść skrawki w odpowiednim buforze do odzyskiwania antygenu i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej na dużej mocy przez około 2 minuty, aż się zagotują. Następnie przykryj luźno kasetę, podgrzewaj na małej mocy przez 15 minut i ostudź do temperatury pokojowej. Przepłukać skrawki za pomocąddH2O i PBST.
  3. Rysowanie bariery hydrofobowej: Po usunięciu nadmiaru roztworu za pomocą papieru chłonnego, narysuj pełne koło wokół tkanki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
  4. Inaktywacja endogennej aktywności enzymatycznej: Potraktuj skrawki 3% nadtlenkiem wodoru i inkubuj przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Myć PBST 3x po 2 minuty.
  5. Blokowanie miejsc niespecyficznych: Po wysuszeniu papierem absorpcyjnym nałożyć roztwór blokujący (1x Rozcieńczalnik przeciwciał/Blok) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym: Po usunięciu roztworu blokującego, nanieść 150 μl pierwszego przeciwciała pierwszorzędowego, CD49a, na każde szkiełko w rozcieńczeniu 1:1000 w 1x Rozcieńczalnik przeciwciał. Inkubować zgodnie z wcześniejszymi optymalizacjami w sekcji 2. Po inkubacji przemyć szkiełka PBST 3x przez 2 minuty każde. Dla pozostałych przeciwciał, patrz Tabela 1 dla określonych proporcji rozcieńczenia.
  7. Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym: Przed nałożeniem przeciwciała drugorzędowego należy użyć papieru chłonnego, aby usunąć nadmiar wilgoci, aby zapobiec rozcieńczeniu odczynnika. Dodać 4-5 kropli (około 150 μl) 1x przeciwciała drugorzędowego Anti-Ms + Rb HRP na każde szkiełko, a następnie 10 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy płukania PBST przez 2 minuty po inkubacji.
    UWAGA: Należy pamiętać, że przeciwciało drugorzędowe 1x Anti-Ms + Rb HRP jest specyficzne dla przeciwciał pierwszorzędowych królików i myszy.
  8. Wzmocnienie sygnału barwnikiem TSA: Po osuszeniu nadmiaru wilgoci rozcieńczyć barwnik TSA w stosunku 1:100 w rozcieńczalniku do amplifikacji. Dodać 150 μl tego rozcieńczonego roztworu barwnika TSA do każdego szkiełka. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Myć PBST 3x po 2 minuty.
  9. Powtórz kroki 3.2 i 3.5-3.8 dla procedury TSA, używając odpowiedniego przeciwciała i barwnika.
  10. Barwienie jąder: Po wybarwieniu ostatniego przeciwciała wyeliminuj niezwiązane fluorofory za pomocą podgrzewania skrawków w kuchence mikrofalowej w 200 ml buforu AR6 w żaroodpornej kasecie, gotując przez 2 minuty, a następnie ogrzewając małą mocą przez 15 minut. Schłodzić próbki do temperatury pokojowej i spłukać ddH2O i PBST. Dodać kroplami 150 μl roztworu roboczego DAPI rozcieńczonego w PBST (1:10), inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i spłukać 2x ddH2O.
  11. Montaż: Po całkowitym wysuszeniu skrawków na powietrzu w ciemnym miejscu przez około 30 minut, nałóż jedną kroplę (około 30 μl) anty-gaszącego fluorescencyjnego środka i umieść szkiełka nakrywkowe.
    UWAGA: Chroń wszystkie operacje przed światłem po pierwszym zastosowaniu barwnika TSA. Szybka obserwacja i uchwycenie obrazu były niezbędne do zakończenia po barwieniu, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji.

4. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Czas naświetlania: Rejestruj obrazy za pomocą imagera, który dziedziczy długości fal wzbudzenia i emisji odpowiadające fluoroforom. Podczas ustawiania czasów naświetlania sprawdzaj slajdy z szerokim zakresem wyrażeń znaczników, aby zapewnić dokładność. Dla każdej kombinacji znacznika/filtra ręcznie ustaw ostrość na różnych obszarach slajdu. Użyj funkcji Automatyczna ekspozycja, aby ustawić czas ekspozycji.
  2. Wybierz filtry zgodnie z barwnikami TSA i zbadaj wiele szkiełek, aby określić optymalne czasy ekspozycji na kanał. Stosuj te ustawienia konsekwentnie do wszystkich kolejnych przejęć, aby zachować porównywalność podczas obrazowania.
  3. Wybór obszarów przechwytywania: Aby zapewnić bezstronne pobieranie próbek z różnych odcinków tkanek i konsekwentne włączanie nabłonka światła do każdego analizowanego pola, losowo wybierz początkowy obszar do akwizycji obrazu, przy czym krytycznym kryterium jest obecność granicy nabłonka światła.
  4. Po przechwyceniu tego początkowego pola systematycznie wybieraj kolejne obszary, przesuwając jedno pole w lewo lub w prawo od punktu początkowego (pomijając jedno pole między każdym przechwyconym obrazem), zachowując jednocześnie granicę nabłonka świetlnego w kadrze. Powtórz ten proces, aby uchwycić co najmniej pięć różnych obszarów, z których każdy zawiera co najmniej część nabłonka świetlnego, aby utrzymać stałą głębię analizy przez cały czas14. Podejście to miało na celu uwzględnienie co najmniej około 10 000 komórek zrębu we wszystkich przechwyconych polach, aby zapewnić kompleksowe i reprezentatywne gromadzenie danych.
  5. Analiza obrazu
    1. Przygotowanie obrazu: Aby zaimportować i przeanalizować obrazy wielospektralne, najpierw przejdź do Plik > Otwórz obraz w interfejsie oprogramowania, aby załadować pliki i slajd autofluorescencji (AF). Po przesłaniu obrazów przystąp do rozmieszania fluoroforów, klikając przycisk Wybierz fluors i wybierając odpowiednią bibliotekę spektralną. Po wybraniu wszystkich fluoroforów kliknij przycisk OK, aby potwierdzić wybór. Aby wyizolować widmo AF, użyj narzędzia Kroplomierz AF w celu pobrania próbki reprezentatywnego obszaru tkanki z obrazu AF, uważając, aby wykluczyć wszelkie piksele niebędące tkankami. Po próbkowaniu kliknij przycisk Prepare Image (Przygotuj obraz) lub Prepare All (Przygotuj wszystko) w lewym dolnym rogu interfejsu15.
    2. Segmentacja tkanek: Zainicjuj proces segmentacji, ręcznie wyznaczając linię bazową 3-5 regionów na typ tkanki na obrazie, w tym obszary nabłonka zawierające komórki nabłonkowe, obszary zrębu zawierające komórki zrębu i puste obszary bez zawartości komórkowej. Jeśli początkowe wyniki segmentacji nie są zadowalające, ręcznie dodaj adnotacje do dodatkowych regionów, aby ulepszyć zestaw danych treningowych, zwiększając w ten sposób dokładność i wiarygodność kolejnych analiz. Ta dynamiczna regulacja regionów i parametrów zapewnia, że oprogramowanie może automatycznie identyfikować podobne struktury na bieżących i innych importowanych obrazach ze zwiększoną dokładnością.
      UWAGA: Początkowa adnotacja służy jako zestaw danych treningowych dla oprogramowania, aby poznać charakterystykę każdego składnika tkanki. Możliwości segmentacji oprogramowania są następnie iteracyjnie udoskonalane w oparciu o złożoność i zmienność tkanki.
    3. Segmentacja komórek: Kliknij opcję Segmentuj komórki, aby rozpocząć segmentację komórek. W ustawieniu Cell Segmentation (Segmentacja komórki) wybierz opcję Nuclei and Membrane (Jądra i błona). Wybierz DAPI, aby zidentyfikować jądra komórkowe i dostosuj ustawienie intensywności, aby wykryć wszystkie jądra komórkowe bez szumu tła. Wybierz sygnały CD16, CD49a i CD56, aby znaleźć membranę i użyć tego sygnału, aby pomóc w rozszczepieniu jądrowym. Użyj funkcji podziału składowej jądrowej, aby rozróżnić blisko położone jądra.
      UWAGA: DAPI podświetla wnętrze komórek. Funkcja podziału komponentów jądrowych pomaga rozróżnić jądra komórkowe, gdy są blisko siebie lub wyglądają na połączone. Ten krok jest ważny dla uzyskania wiarygodnej liczby komórek i utrzymania integralności analizy.
    4. Fenotypowanie komórek: Zastosuj cztery różne markery powierzchni komórek, w tym CD56, CD49a, CXCR4 i CD16, aby różnicować różne podtypy komórek NK. W schemacie fenotypowania oznacz te cztery markery jako fenotypy, które mają być kontynuowane. W sekcji Widok skojarzyj przypisz określone kolory do każdego z fenotypów w celu identyfikacji. Za pomocą przycisku Dodaj kategoryzuj komórki jako pozytywnie lub negatywnie wyrażające znaczniki; na przykład w fenotypie CD56 komórki mogą być oznaczone jako CD56+ lub CD56-. Ręcznie oznacz co najmniej pięć komórek dla każdego fenotypu podczas procesu trenowania. Wykonaj dodatkowe ręczne etykietowanie, jeśli początkowe szkolenie nie przyniesie skutecznych wyników.
    5. Po ustawieniu konfiguracji fenotypowania komórek każda komórka na obrazie wskaże, czy cztery markery powierzchniowe są wyrażone dodatnio, czy negatywnie. Wyeksportuj wynikowe dane do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
    6. Przetwarzanie danych: Zaimportuj dane uzyskane ze wszystkich obrazów do arkusza kalkulacyjnego w celu przetworzenia. Obliczanie wartości procentowych wszystkich podtypów komórek uNK w stosunku do całkowitej liczby komórek na obrazie. Ostateczna liczba komórek reprezentuje średnią liczbę na wielu obrazach, zapewniając kompleksowy przegląd populacji różnych podtypów komórek uNK w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zachować spójność w czasie pobierania próbek endometrium u kobiet w cyklu naturalnym, wykonano test z moczu w celu precyzyjnego wykrycia wyrzutu hormonu luteinizującego (LH), a biopsje endometrium przeprowadzono 7 dni po wyrzucie LH. W przypadku kobiet w cyklach HRT próbki zaplanowano dokładnie na 5 dni po rozpoczęciu suplementacji progesteronem. Do ilościowego oznaczenia różnych podtypów komórek NK w endometrium zastosowano barwienie m-IHC. Schemat procedury eksperymentalnej przedstawiono na Rys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Implantacja zarodka wiąże się ze złożoną interakcją między zarodkiem a błoną śluzową macicy. Status immunologiczny homeostazy endometrium odgrywa kluczową rolę w określaniu receptywności endometrium. Podczas WOI dominującą populacją leukocytów w błonie śluzowej macicy są komórki NK. Około 90% komórek uNK wykazuje wysoką ekspresję CD56, ale brakuje im CD16. Jednak niewielki podzbiór komórek uNK przypomina komórki NK krwi obwodowej, wykazując niską ekspresję CD56, ale dodatnią ekspresjęCD16 18. Te d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Niniejsze badanie było wspierane przez Fundusz Badań Zdrowotnych i Medycznych (10210956).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478Przeciwciała pierwszorzędowe
CD56LeicaNCL-L-CD56-504Przeciwciała pierwszorzędowe
CD16abcamab183354Przeciwciała pierwszorzędowe
CXCR4R& DMAB172Przeciwciała pierwszorzędowe
Rozcieńczalnik do amplifikacjiAkoya BiosciencesFP1498seria Bufor do rozcieńczania fluoroforów
Rozcieńczalniki przeciwciałAkoya BiosciencesARD1001EARozcieńczyć przeciwciało
Roztwór buforowany cytrynianem, pH 6,0 / 9,0 (10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001Roztwór do odzyskiwania antygenów
w zaawansowanym oprogramowaniu do analizy obrazuOprogramowanie Akoya BiosciencesinForm Tissue Finder 2.2.6Oprogramowanie do analizy danych
Stacje robocze MantraAkoya BiosciencesCLS140089Mikrofalowe obrazowanie spektralne
Akoya BiosciencesinwerterMikrofalowe usuwanie
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001KOdpowiednie odczynniki fluorescencyjne na bazie tyramidu
TSA 620Akoya Nauki biologiczneFP1495001KOdpowiednie odczynniki fluorescencyjne na bazie tyramidu
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001KOdpowiednie odczynniki fluorescencyjne na bazie tyramidu
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001KOdpowiednie odczynniki fluorescencyjne na bazie tyramidu
Szkiełka powlekane poli-L-lizynąFisher Technologies120-550-15Szkiełka do rutynowego użytku histologicznego
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EAPrzeciwciała drugorzędowe
Invitrogen™   Fluoromount-G&handel; Medium montażoweThemoFisher Science495802Instalacja
Spectral DAPIAkoya BiosciencesFP1490ABarwienie kwasami nukleinowymi

Bibliografia

  1. De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
  2. State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
  3. Busnelli, A., et al. How common is real repeated implantation failure? An indirect estimate of the prevalence. Reprod Biomed Onl. 40 (1), 91-97 (2020).
  4. Ben Rafael, Z. Repeated implantation failure (RIF): an iatrogenic meaningless definition that generates unnecessary and costly use of add-on procedures. Human Reprod. 35 (7), 1479-1483 (2020).
  5. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  6. Vento-Tormo, R., et al. Single-cell reconstruction of the early maternal-fetal interface in humans. Nature. 563 (7731), 347-353 (2018).
  7. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  8. Manaster, I., et al. Endometrial NK cells are special immature cells that await pregnancy. J Immunol. 181 (3), 1869-1876 (2008).
  9. Lai, Z. Z., et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. 12 (15), 6527-6547 (2022).
  10. Coughlan, C., et al. Recurrent implantation failure: definition and management. Reprod BioMed Onl. 28 (1), 14-38 (2014).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. Am J Obst Gyneco. 217 (6), 680.e1-680.e6 (2017).
  12. Yang, W. J., et al. A comparison of uterine natural killer cell density in the peri-implantation period between natural cycles and hormone replacement therapy cycles. Am J Reprod Immunol. 82 (3), e13156(2019).
  13. Syed, J., et al. Multiplex immunohistochemistry: The importance of staining order when producing a validated protocol. Immunother. 5 (2), 1-9 (2019).
  14. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. J Reprod Immunol. 116, 50-59 (2016).
  15. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging. J Biomed Optics. 10 (4), 41207(2005).
  16. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: Forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  17. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  18. Lee, J. Y., Lee, M., Lee, S. K. Role of endometrial immune cells in implantation. Clin Exp Reprod Med. 38 (3), 119-125 (2011).
  19. Gothe, J. P., de Mattos, A. C., Silveira, C. F., Malavazi, K. C. Exploring natural killer cell testing in embryo implantation and reproductive failure: An overview of techniques and controversies. Reprod Sci. 31 (3), 603-632 (2024).
  20. Russell, P., et al. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure: I: Techniques. J Reprod Immunol. 91 (1), 90-102 (2011).
  21. Wang, W., Sung, N., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. T. Helper (Th) cell profiles in pregnancy and recurrent pregnancy losses: Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh cells. Front Immunol. 11, 2025(2020).
  22. Nagamatsu, T., Schust, D. J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 460-471 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komórki NK macicywielokrotna immunohistochemiapodtypy komórek odpornościowychbarwienie fluorescencyjnetkanka endometriumfenotypowanie komórekmarker CD49amarker CXCR4segmentacja tkanki
Pomiar czterech podtypów komórek NK macicy za pomocą multipleksowanego fluorescencyjnego barwienia immunohistochemicznego u kobiet z powtarzającym się niepowodzeniem implantacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.