Artykuł metodologiczny

Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67285

⸱

13 grudnia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł proponuje nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, w oparciu o ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis. Metoda ta ma na celu przyczynienie się do opracowania bardziej etycznych i czułych badań narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego.

Streszczenie

Hemocyty są krążącymi komórkami kompetentnymi immunologicznie u małży i odgrywają kluczową rolę w kilku ważnych funkcjach komórkowej odporności wrodzonej. We wczesnych stadiach odpowiedzi immunologicznej hemocyty aktywnie migrują do miejsca infekcji. Ta wrodzona ruchliwość jest podstawową cechą tych komórek. Reprezentuje kluczową funkcję komórkową, która integruje wiele procesów, takich jak adhezja komórek, sygnalizacja komórkowa, dynamika cytoszkieletu i zmiany objętości komórek. W związku z tym zmiany w ruchliwości komórek w następstwie narażenia na leki lub zanieczyszczenia mogą służyć jako użyteczny toksykologiczny punkt końcowy. Pomimo fundamentalnej roli ruchliwości komórek w fizjologii komórki, została ona słabo zbadana z perspektywy toksykologicznej. W niniejszej pracy zaproponowano nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, opartą na ocenie ruchliwości hemocytów Mytilus galloprovincialis. Opracowaliśmy test ruchliwości komórek na hemocytach przylegających do dna 96-dołkowej mikropłytki polistyrenowej. Po ekspozycji na rosnące stężenia leków, trajektorie i prędkości komórek zostały określone ilościowo poprzez śledzenie komórek pod mikroskopią poklatkową, co pozwoliło nam zmierzyć wpływ na ruchliwość hemocytów. Ze względu na łatwość pobierania hemocytów od zwierząt w stosunkowo nieinwazyjny sposób, proponowana metoda stanowi alternatywny test do badań przesiewowych skutków i mechanizmów działania zanieczyszczeń i leków. Jest on zgodny z kryteriami 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), rozwiązując problemy etyczne i przyczyniając się do zmniejszenia liczby testów na zwierzętach na kręgowcach.

Wprowadzenie

Metody oparte na efektach, takie jak testy biologiczne in vitro i in vivo, reprezentują innowacyjne narzędzia do wykrywania skutków zanieczyszczeń chemicznych środowiska w organizmach żywych i do ich wykorzystania jako narzędzia w monitorowaniu środowiska i ocenie ryzyka1,2,3,4. Uzupełniają one klasyczne podejście chemii analitycznej, pokonując niektóre z jego ograniczeń. Na przykład metody oparte na efektach mogą oceniać biodostępność zanieczyszczeń, ich wpływ na zdrowie organizmu oraz łączne skutki toksykologiczne mieszanin. Te połączone efekty mogą nie być możliwe do przewidzenia wyłącznie na podstawie analizy chemicznej5.

W ostatnich latach ekotoksykologia zanieczyszczeń budzących nowe obawy (nowe zanieczyszczenia) stanowi dziedzinę, w której metody oparte na efektach mogą być użytecznymi narzędziami do wykrywania narażenia i oceny wpływu na faunę i florę1,5,6,7. Kilka metod opartych na efektach wykorzystuje małże jako organizmy testowe w monitorowaniu i ocenie środowiska8,9. Niektóre cechy sprawiają, że organizmy te nadają się do badań ekotoksykologicznych, takie jak ich szerokie rozpowszechnienie, ich filtrujący charakter, siedzący tryb życia, zdolność do bioakumulacji szerokiej gamy zanieczyszczeń środowiska i rozwijania wykrywalnych reakcji na zanieczyszczenia, możliwość pracy na różnych etapach życia i utrzymywanie w warunkach laboratoryjnych7. Są bardzo wrażliwe na narażenie na zanieczyszczenia i wykazują różne reakcje na toksyczne zanieczyszczenia w zależności od gatunku, etapu życia i warunków środowiskowych8,9,10. W związku z tym w kilku wytycznych środowiskowych stosuje się gatunki małży jako znormalizowane gatunki testowe10,11.

Wśród małży, szeroko rozpowszechniony Mytilus galloprovincialis jest jednym z najczęściej używanych gatunków w dziedzinie ekotoksykologicznej ze względu na jego zdolność do rozwijania wcześnie wykrywalnych reakcji na ekspozycję na zanieczyszczenia chemiczne, w tym indukcję metalotioneiny, zmianę enzymu antyoksydacyjnego, destabilizację błony lizosomalnej, peroksydację lipidów, akumulację lipofuscyny, zwiększoną częstotliwość mikrojąder, indukcję anhydrazy węglowej12, 13,14,15. Hemocyty, immunokompetentne komórki hemolimfowe, są szeroko stosowane do badania toksykologicznego wpływu zanieczyszczeń środowiska u małży4,13,16,17. Komórki te mają kluczowe znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej organizmu, pełniąc kilka ważnych funkcji odporności wrodzonej, w której pośredniczy komórka. Obejmują one eliminację drobnoustrojów poprzez fagocytozę i różne reakcje cytotoksyczne, takie jak uwalnianie enzymów lizosomalnych, peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz produkcja metabolitów tlenu podczas wybuchu oddechowego18,19,20. Hemocyty są wewnętrznie ruchliwymi komórkami21,22,23 zdolne do migracji do miejsca infekcji we wczesnym stadium odpowiedzi immunologicznej organizmu. Ogólnie rzecz biorąc, ruchliwość jest podstawową cechą, która charakteryzuje wszystkie komórki odpornościowe, ponieważ umożliwia nadzór immunologiczny nad tymi komórkami w celu ochrony organizmu24. Badania nad różnymi gatunkami pokazują, że ruchliwość hemocytów jest kluczowym elementem ich odpowiedzi immunologicznej, gojenia się ran i interakcji z patogenami. Ta ruchliwość jest regulowana przez specyficzne szlaki molekularne, co podkreśla złożoność i specjalizację funkcji hemocytów u21,25,26,27.

Pomimo fundamentalnego znaczenia ruchliwości w fizjologii hemocytów, bardzo niewiele badań badało wrażliwość ruchliwości hemocytów na chemiczne zanieczyszczenia środowiska23,28,29,30. Ostatnio nasza grupa scharakteryzowała spontaniczny ruch hemocytów Mytilus galloprovincialis w 96-dołkowej mikropłytce polistyrenowej poddanej kulturze tkankowej i zbadała wrażliwość ruchliwości hemocytów na ekspozycję in vitro na paracetamol23. Hemocyty M. galloprovincialis wykazywały losowy ruch komórek oparty na blaszkach i szybkich zmianach kształtu, jak to wcześniej stwierdzono u innego gatunku małży, Mytilus edulis21,22,23,28, i już opisane w ludzkich komórkach odpornościowych31. Niedawno wykazano, że ruchliwość hemocytów jest wrażliwa na stresory chemiczne23,28. Opierając się na tych wcześniejszych odkryciach, w niniejszej pracy zaproponowano nowatorską metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń w oparciu o ocenę ruchliwości hemocytów M. galloprovincialis i jej zmian, poprzez analizę prędkościometryczną ruchliwości komórek (kwantyfikacja średniej prędkości, odległości migracji, odległości euklidesowej i bezpośredniości). Metoda ta daje możliwość badania przesiewowego toksyczności kilku substancji in vitro zarówno w testach krótkoterminowych (trwających 1-4 godziny), jak i w testach przedłużonego narażenia, trwających 24-48 godzin.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z włoską ustawą o dobrostanie zwierząt (D.L.26/2014), która wdrożyła dyrektywę Rady Komitetu Europejskiego (2010/63 EWG). Mytilus galloprovincialis to małż żywiący się filtrem, powszechnie znany jako małż śródziemnomorski. Pochodzi z Morza Śródziemnego i wybrzeża Atlantyku w południowej Europie. Został wprowadzony i jest szeroko rozpowszechniony w zachodniej Ameryce Północnej, Azji i Afryce Południowej. Jest to ważny gatunek rybny w wielu częściach świata. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie sztucznej wody morskiej (ASTM) lub przefiltrowanej naturalnej wody morskiej

  1. Do przygotowania sztucznej wody morskiej ASW zgodnie z ASTM D1141-98 (2021)32, rozpuść następujące sole w wodzie destylowanej (g na 1 L): 27,65 NaCl, 0,133 NaHCO3, 3,33 MgCl2· 6H2O, 2,66 Na2SO4, 0,733 CaCl2 · 2H2O, 0,466 KCl, 0,067 KBr, 0,02 H3BO3, 0,013 SrCl2·6H2O, 0,0019 NaF. Roztwór ASW ma pH 7,80.
  2. Do przygotowania przefiltrowanej naturalnej wody morskiej (FSW) należy przefiltrować naturalną wodę morską 37 PSU, pobraną z miejsca niedotkniętego działalnością antropogeniczną, za pomocą filtrów 0,2 μm.

2. Aklimatyzacja zwierząt

  1. Przed użyciem doświadczalnym należy zaaklimatyzować dorosłe próbki omułków (Mytilus galloprovincialis Lam.) przez 24 godziny w zbiornikach statycznych (w stanie głodu) zawierających napowietrzony ASW lub FSW (1 l/zwierzę) w temperaturze 15 °C w pomieszczeniu termostatycznym.

3. Przygotowanie odczynnika do oceny ruchliwości hemocytów

  1. Przygotuj przefiltrowaną wodę morską (FSW) jak powyżej lub standardową sól fizjologiczną (SPS). Rozpuścić HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowy) 4,77 g, NaCl 25,48 g, MgSO4 13,06 g, KCl 0,75 g, CaCl2 1,47 g w około 800 ml wody destylowanej, a następnie uzupełnić do 1 l przez dodanie większej ilości wody destylowanej. Doprowadzić pH do 7,36 za pomocą 1 M NaOH.
  2. Przygotować obojętny czerwony roztwór podstawowy 20 mg/ml w dimetylosulfotlenku (DMSO).
  3. Przygotować roztwór barwiący o barwieniu na czerwono obojętną: Dodać 5 μl roztworu podstawowego o barwieniu na czerwono obojętną do 995 μl roztworu FSW lub SPS.
  4. Przygotować FSW lub SPS uzupełnione 2 mM L-glutaminy, 40 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny w następujący sposób: Dodaj 100 μl 2 mM L-glutaminy i 100 μl mieszaniny penicyliny/streptomycyny do 10 ml FSW/SPS.
  5. Przygotować 0,4% błękitu trypanowego w kolorze FSW lub SPS.
    UWAGA: Neutralny czerwony roztwór podstawowy został przygotowany zgodnie z Martínez-Gómez et al.33. Roztwór podstawowy Neutral Red wystarcza na około 2-3 tygodnie przy przechowywaniu w temperaturze 4 °C. Roztwór barwiący Neutral Red i 0,4% błękitu trypanowego należy przygotować tuż przed testem.

4. Pobieranie próbek z hemolimfy

  1. Napełnij strzykawkę 0,5 ml przefiltrowanej wody morskiej FSW lub standardowej soli fizjologicznej SPS (w temperaturze 15 °C).
  2. Lekko i ostrożnie rozsuń zawory wzdłuż powierzchni brzusznej za pomocą skalpela. Utrzymuj skalpel na miejscu lub użyj końcówki do pipety. Pozwolić, aby igła strzykawki podskórnej weszła do przestrzeni między zastawkami.
  3. Delikatnie pobrać 0,5 ml hemolimfy z tylnego mięśnia przywodziciela za pomocą ampułkostrzykawki zgodnie z UNEP/RAMOGE34.
  4. Wyjąć igłę ze strzykawki i przenieść zawartość strzykawki do mikroprobówki.
  5. Zebrać hemolimfę z 3-4 małży i zebrać próbki hemolimfy w probówce o temperaturze 15 °C, stosując ten sam stosunek między osobnikami.
    UWAGA: Wstępne napełnienie strzykawki służy do natychmiastowego rozcieńczenia hemolimfy w stosunku 1:1 podczas pobierania próbek. Rozcieńczenie hemolimfy za pomocą FSW lub SPS w stosunku 50:50 jest powszechnie stosowane w celu zapobiegania agregacji hemocytów, zgodnie z Martínez-Gómez et al.33.

5. Posiewanie i hodowla hemocytów

  1. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  2. Rozcieńczyć hemolimfę w stężeniu 1 × 106 komórek/ml za pomocą FSW lub SPS.
  3. Oceń żywotność hemocytów w zawiesinie przez barwienie błękitem trypanowym: Dodaj 100 μl 0,4% błękitu trypanowego rozpuszczonego w FSW lub SPS do 100 μl zawiesiny hemocytów. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 15 °C.
  4. Następnie dodaj kroplę zawiesiny do hemocytometru i policz niebarwione (żywotne) i barwione (nieżywotne) komórki pod obserwacją mikroskopową.
  5. Oceń żywotność hemocytów jako procent żywotnych komórek obliczony na podstawie całkowitej liczby zliczonych komórek35.
  6. Użyj następującego wzoru do oceny żywotności komórki35:
    Komórki żywotne (%) = [liczba komórek żywotnych/całkowita liczba komórek (żywotnych + nieżywotnych)] x 100
  7. Upewnij się, że żywotność hemocytów powinna być wyższa niż 95%, aby przejść dalej w protokole.
  8. Dodać 50 μl rozcieńczonej hemolimfy do każdego dołka 96-dołkowej mikropłytki z płaskiego dna polistyrenu poddanego działaniu TC. Przykryj talerz pokrywką.
  9. Pozostawić hemocyty do przylegania do dna studzienek przez 30 minut w temperaturze 15 °C w celu utworzenia monowarstwy.
  10. Usuń nadmiar hemolimfy, delikatnie zasysając ją mikropipetą.

6. Test krótkoterminowy

  1. W przypadku badań krótkoterminowych (w ciągu 1–4 godzin) należy natychmiast inkubować komórki przylegające do dna studzienek ze 100 μl substancji będącej przedmiotem zainteresowania rozpuszczonej w FSW lub SPS w różnych stężeniach w temperaturze 15 °C. Użyć co najmniej trzech dołków do trzech powtórzonych oznaczeń w każdym warunku doświadczalnym.
  2. Po inkubacji oceń ruchliwość komórek zgodnie z krokiem 8.

7. Test przedłużonej ekspozycji

  1. W przypadku przedłużonych ekspozycji, tj. 24-48 godzinnych testów ekspozycji, należy inkubować hodowane przylegające komórki ze zwiększającymi się stężeniami substancji badanej rozpuszczonej w pożywce hodowlanej (FSW lub ASW) uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 40 j.m./ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 15 °C. Użyć co najmniej trzech dołków do trzech powtórzonych oznaczeń każdego warunku doświadczalnego.
  2. Po inkubacji oceń ruchliwość komórek zgodnie z krokiem 8.

8. Ocena ruchliwości komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej

  1. Włóż płytkę wielodołkową zawierającą przylegające żywe hemocyty do czytnika wielomodowego.
  2. Oceń ruchliwość przylegających żywych komórek poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym na płytce za pomocą mikroskopii poklatkowej: uchwyć obrazy tego samego obszaru zainteresowania (ROI) (wymiar użytego ROI: 720 μm x 720 μm) w każdym dołku z szybkością 1 obrazu co 1 minutę przez 10 minut za pomocą czytnika wielomodowego przy 20-krotnym powiększeniu i wizualizacji kolorowego jasnego pola.
  3. Aby uzyskać lepszą wizualizację hemocytów, zabarwić komórki ważnym barwnikiem Neutral Red tuż przed mikroskopią poklatkową w następujący sposób:
    1. Usunąć pożywkę inkubacyjną z każdej studzienki.
    2. Dodać 100 μl roztworu barwiącego czerwieni obojętnej rozpuszczonego w standardowej soli fizjologicznej zawierającej substancję będącą przedmiotem zainteresowania do studzienek płytki zawierającej przylegające komórki.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 15 °C przez 15 minut. Wypłukać nadmiar barwnika.
    4. Dodać 100 μl substancji będącej przedmiotem zainteresowania rozpuszczonej w FSW lub SPS. Wizualizacja komórek w celu oceny ruchliwości.
      UWAGA: Zastosowanie czytnika wielomodowego pozwala na jednoczesną akwizycję obrazów z dużej liczby odwiertów, co pozwala na jednoczesne wykrywanie ruchliwości wszystkich warunków eksperymentalnych i powtórzeń zawartych w odwiercie. Neutralny czerwony barwnik jest zatrzymywany w lizosomach, które pojawiają się jako małe pomarańczowe plamki w cytoplazmie, podczas gdy jądro pojawia się jako półprzezroczysta, ponieważ barwnik acidophilus vital go nie barwi. Akwizycja obrazu odbywała się przez 10 minut w temperaturze pokojowej 20 °C.

9. Śledzenie komórek i obliczanie parametrów prędkościometrycznych

  1. Przeanalizuj klatki tego samego obszaru zainteresowania uzyskane pod mikroskopią poklatkową za pomocą obrazu J dla każdej studzienki.
  2. Zapisz obrazy w folderze bez spacji w nazwie. Obrazy mogą być w formacie JPEG lub PNG.
  3. Otwórz plik ImageJ. Kliknij Plik> zaimportować > sekwencji obrazów.
  4. Śledzenie pojedynczych komórek można wykonywać za pomocą wtyczki Śledzenie ręczne programu ImageJ. Pozycje poszczególnych komórek są zaznaczone na kolejnych obrazach, co pozwala na śledzenie zmian położenia w czasie.
  5. Przeanalizuj co najmniej 40 komórek na studzienkę, wyłączając komórki, które uciekają z zarejestrowanego pola z analizy.
  6. Importuj zestawy danych z wtyczki ImageJ, "Manual Tracking", do bezpłatnego oprogramowania Chemotaxis i Migration Tool.
  7. Określ ilościowo parametry prędkościometryczne, takie jak średnia prędkość, odległość euklidesowa, migrowana odległość i bezpośredniość, korzystając z oprogramowania Chemotaxis and Migration Tool zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami zawartymi w ogólnodostępnym podręczniku użytkownika oprogramowania36lub wykonując poniższe czynności:
    1. Zaimportuj zestawy danych z wtyczki ImageJ "Manual Tracking" do oprogramowania Chemotaxis and Migration Tool.
    2. Wybierz żądaną liczbę plasterków (np. liczbę obrazów używanych do śledzenia).
    3. Skalibruj oprogramowanie, ustawiając rozmiar piksela x/y i przedział czasu. Kalibracja x/y wskazuje długość krawędzi piksela w μm, podczas gdy przedział czasu reprezentuje czas między każdym wycinkiem.
    4. Po dostosowaniu wartości i parametrów kliknij Zastosuj ustawienia.
    5. Wykreśl trajektorie i wyeksportuj jako obraz. Kliknij przycisk Zmierzone wartości, aby zobaczyć zmierzone wartości. Zapisz to.
    6. Kliknij przycisk Statystyki i zapisz prędkość i bezpośredniość serii utworów.
  8. Porównaj parametry prędkościometryczne obliczone dla komórek kontrolnych z parametrami hemocytów wystawionych na działanie substancji badanej w różnych stężeniach.
    UWAGA: Migrowana odległość (mierzona w μm) odnosi się do długości ścieżki migracji w okresie obserwacji (10 min). Odległość euklidesowa (również mierzona w μm) reprezentuje odległość w linii prostej między punktem początkowym a końcowym komórki. Średnia prędkość (wyrażona w μm min-1) jest obliczana jako stosunek migrowanej odległości do czasu śledzenia komórki dla każdej komórki. Bezpośredniość definiuje się jako stosunek odległości euklidesowej do skumulowanej odległości dla każdej trajektorii.

Wyniki

Badanie wprowadza nową metodę in vitro do szybkiej i czułej oceny toksyczności i ekotoksyczności zanieczyszczeń, wykorzystującą ruchliwość hemocytów Mytilus galloprovincialis . Rysunek 1A-C przedstawia reprezentacyjne obrazy time-lapse hemocytów po 30 min przywierania do dna studni. Komórki na rysunku zostały zabarwione Neutral Red bezpośrednio przed oceną ruchliwości. Ruchy komórek monitorowano za pomocą mikroskopii optycznej z częstotliwością jednego obrazu na minutę przez 10 min, przy powiększeniu 20x, przy użyciu czytnika wielomodułowego. Rysunek 1A-C prezentuje trzy z 11 klatek zarejestrowanych z tego samego obszaru zainteresowania (ROI) w 0 min, 5 min i 10 min. Te same komórki są ponumerowane na wszystkich trzech rysunkach, aby podkreślić ich przemieszczanie się, a numeracja pozostaje spójna między rysunkami, aby wyraźnie zobrazować ich trajektorie.

Komórki wykazują ruchy pojedynczych komórek oparte na aktywności lamellipodiów oraz szybkie zmiany kształtu. Komórki zostały znakowane żywym barwnikiem Neutral Red (czerwienią neutralną), aby poprawić ich wizualizację podczas śledzenia. Neutral Red jest amfifilowym i słabym kationowym barwnikiem, który łatwo przenika przez błonę komórkową. Po dostaniu się do wnętrza komórek barwnik zostaje uwięziony w lizosomach w wyniku protonowania. Hemocyty małży, w szczególności granulocyty, posiadają dobrze rozwinięty układ lizosomalny; w związku z tym są one dobrze widoczne po barwieniu Neutral Red, przy czym cytoplazma jest bogata w liczne czerwone lizosomy, a jądro (nieznakowane przez barwnik) przejawia się jako przezroczysty otwór.

Dzięki zastosowaniu protokołu można zaobserwować dwa główne morfotypy hemocytów zgodnie z Udayan et al.23: (1) rozpostarte komórki o bipolarnym kształcie fasoli i czasem ameboidalnym obrysie oraz mniejsze komórki o okrągłym kształcie gwiazdy (komórki n = 3 i 10). W obu typach komórek ruch charakteryzował się ciągłymi zmianami kształtu, z nieustannym wysuwaniem i cofaniem pseudopodiów oraz filopodiów.

Zastosowanie protokołu umożliwia pomyślną ocenę ruchliwości hemocytów poprzez konstruowanie wykresów trajektorii, przedstawionych na Rysunku 2, oraz obliczanie głównych parametrów velocymetrycznych, takich jak średnia prędkość i wskaźnik bezpośredniości. W warunkach fizjologicznych spoczynkowych, po 30 min przylegania do dna studzienki, wartości te wynosiły odpowiednio 6,46 ± 0,2 µm/min oraz 0,56 ± 0,02 (średnia ± SEM) dla komórek rozprzestrzeniających się oraz 5,18 ± 0,34 µm/min i 0,37 ± 0,03 dla komórek małych. W związku z tym protokół pozwala na klasyfikację różnych populacji hemocytów w oparciu o parametry velocymetryczne.

Dzięki zastosowaniu tego protokołu można wykryć zmiany w parametrze velocymetrycznym ruchliwości hemocytów po ekspozycji na leki lub zanieczyszczenia. Rysunek 3A-D przedstawia reprezentatywne wyniki ekspozycji in vitro hemocytów małży na paracetamol, który jest jednym z farmaceutyków uwalnianych do środowiska (PiE) o najwyższym stężeniu i najwyższej częstotliwości wykrywania w rzekach na całym świecie31.

Zgodnie z badaniami Udayan i wsp.23, w komórkach kontrolnych zaobserwowano istotny wzrost prędkości w czasie dla obu morfotypów komórkowych, co sugeruje aktywację hemocytów podczas 24-godzinnej hodowli, prawdopodobnie wywołaną odpowiedzią zapalną indukowaną eksperymentalnie przez pobranie i wysianie w środowisku hodowlanym. Po wystawieniu komórek na działanie leku, aktywacja ruchliwości hemocytów była znacznie zredukowana w komórkach rozprzestrzenionych (Rycina 3A) po 24 h, ale nie w małych komórkach okrągłych (Rycina 3C), które charakteryzowały się niższą średnią prędkością podstawową (ocenioną w czasie 0). Ponadto protokół umożliwił wykrycie zmian w trajektorii komórek po ekspozycji na lek, co objawiło się istotnym wzrostem kierunkowości małych komórek po 24 h oraz spadkiem kierunkowości po 1 h ekspozycji w komórkach rozprzestrzenionych (Rycina 3C,D).

Obraz mikroskopowy transformacji komórek w czasie, pokazujący ponumerowane skupiska; skala 100 µm.
Rycina 1: Reprezentacyjne obrazy time-lapse hemocytów barwionych czerwienią neutralną po 30 min przywierania do dna dołka. Komórki zabarwiono barwnikiem witalnym Neutral Red bezpośrednio przed oceną motylności. Ruchy komórek monitorowano za pomocą mikroskopii optycznej przy częstotliwości jednego obrazu na minutę przez 10 min przy powiększeniu 20x. Dla zwięzłości panele A, B oraz C przedstawiają trzy z 11 klatek zarejestrowanych z tego samego obszaru zainteresowania (ROI) w 0 min, 5 min i 10 min. Te same komórki są ponumerowane na wszystkich trzech rycinach, aby zobrazować ich ruch, a strzałki wskazują odstępy czasowe. Paski skali odpowiadają 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres analizy śledzenia; schemat ścieżek z trajektoriami 25 cząsteczek, osie x/y w mikrometrach.
Rysunek 2: Reprezentatywny wykres trajektorii hemocytów M. galloprovincialis. Przedstawione trajektorie pochodzą z jednej dołki. Pokazano trajektorie 25 komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wpływ paracetamolu na ruchliwość, prędkość i kierunkowość komórek; wykresy, kontrola vs 2 mg/L w ciągu 24 h.
Rycina 3: Wpływ ekspozycji na paracetamol (24 h) na prędkość i kierunkowość komórek rozpostartych (A,B) oraz małych, okrągłych komórek w kształcie gwiazdy (C,D). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Istotność statystyczną danych oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) i testu post-hoc Tukeya. *p < 0,05 vs. kontrola (p < 0,05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół opisany w tej pracy stanowi nowatorską metodę in vitro odpowiednią do szybkiej i czułej oceny toksyczności leków i zanieczyszczeń w oparciu o ocenę ruchliwości hemocytów M. galloprovincialis i jej zmian. Ruchliwość jest szczególnym aspektem funkcji immunologicznej tych komórek 21,22,23,37,38, dlatego każda zmiana w ruchliwości komórek może zwiastować zmiany w funkcji immunologicznej tych komórek. Ruchliwość jest podstawową funkcją komórkową, która integruje kilka procesów komórkowych, takich jak adhezja komórek, sygnalizacja komórkowa, aktywność cytoszkieletu, sygnalizacja wewnątrzkomórkowa i regulacja objętości komórki, a także wymaga integracji i koordynacji złożonych sygnałów biochemicznych i biomechanicznych 39,40,41. Każdy z tych procesów lub elementy składowe każdego procesu mogą być potencjalnymi celami toksycznego działania leków i zanieczyszczeń. W związku z tym zmiany w ruchliwości komórki, zarówno w prędkości, jak i trajektorii, stanowią wrażliwe punkty końcowe integrujące wpływ na wiele celów komórkowych.

Protokół jest odpowiedni do oceny in vitro skutków badanych substancji zarówno w testach krótkoterminowych (trwających 1-4 godziny), jak i testach przedłużonego narażenia, trwających 24-48 godzin, umożliwiając szybkie badanie przesiewowe zanieczyszczeń i leków pod kątem potencjalnych skutków toksycznych. Dzięki zastosowaniu płytki 96-dołkowej metoda ułatwia jednoczesne testowanie wielu substancji lub różnych stężeń jednej substancji, oszczędzając w ten sposób czas i odczynniki. Ponadto protokół można również dostosować do użytku z innym sprzętem, takim jak mikroskop z kontrastem fazowym lub mikroskop fluorescencyjny. W tym przypadku komórki można było obrazować bez barwienia lub przy użyciu fluorescencyjnych barwników życiowych.

Chociaż metoda ta oferuje nowatorskie i czułe alternatywy dla toksykologicznych badań przesiewowych, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia metody w przypadku szerszych zastosowań. Po pierwsze, krytycznym aspektem aplikacji protokołu jest temperatura. Wiadomo, że hemocyty małży są wrażliwe na zmiany temperatury. Wpływ temperatury na hemocyty jest złożony, a wysokie i niskie temperatury negatywnie wpływają na ich funkcje odpornościowe 42,43,44. Jak zaobserwowano podczas opracowywania metody, fazą krytyczną dotyczącą wpływu temperatury na ruchliwość komórek jest faza wstępna zbierania komórek, adhezji i hodowli na podłożu, który musi podążać za temperaturą aklimatyzacji organizmów. Wzrost temperatury o kilka stopni podczas tej pierwszej fazy powyżej temperatury aklimatyzacji może mieć kluczowe znaczenie dla uzyskania kształtu i ruchliwości komórek rozproszonych. Dlatego do hodowli hemocytów zalecana jest temperatura 15 °C. Akwizycja obrazu poklatkowego w celu oceny ruchliwości trwała 10 minut w temperaturze pokojowej 20 °C. Na podstawie wstępnych obserwacji podczas konfiguracji metody, ekspozycja hodowanych komórek w tym przedziale czasu w temperaturze 20 °C nie zmienia znacząco ruchliwości hemocytów. Innym ograniczeniem metody jest ręczne śledzenie hemocytów, które może wprowadzać zmienność zależną od użytkownika i wymagać znacznego czasu i dbałości o szczegóły. Jednak zastosowanie barwnika neutralnego dla życia poprawia wizualizację komórek, a co za tym idzie, śledzenie komórek poprzez wizualizację dobrze rozwiniętego systemu lizosomalnego. Jądro nie jest barwione barwnikiem i wygląda jak pusta, która jest łatwo rozpoznawalna i łatwo wskazująca podczas ręcznego śledzenia komórki. Kolejnym ograniczeniem metody jest jej charakter in vitro. Chociaż warunki in vitro zapewniają kontrolowane środowisko do oceny ruchliwości, mogą nie w pełni replikować złożonych interakcji i odpowiedzi zachodzących in vivo, szczególnie w odpowiedzi immunologicznej całego organizmu.

W ostatnich latach nowe podejścia i metodologie weszły do powszechnego stosowania w naukach przyrodniczych, mając na celu poprawę wyników i zmniejszenie zależności od testów na zwierzętach45 . W protokole przedstawiono alternatywny, czuły test do badań przesiewowych in vitro skutków i mechanizmów działania zanieczyszczeń i leków w celu szybkiego badania toksykologicznego skutków zanieczyszczeń chemicznych obecnych, pojedynczo lub w mieszaninach, w matrycach środowiskowych. Koncentruje się na nowym punkcie końcowym, ruchliwości komórek układu odpornościowego, które mogą zapewnić zintegrowaną odpowiedź na skutki toksykologiczne wywierane przez leki i zanieczyszczenia na różne cele komórkowe. W tym sensie rozszerza zakres badań in vitro dostępnych w literaturze, również z perspektywy zintegrowanego podejścia opartego na wielu testach do zastosowania w biomonitoringu środowiska. Niektóre cechy protokołu dostosowują go do kryteriów 3R (Replacement, Reduction, and Refinement), przyczyniając się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach na kręgowcach in vivo oraz do opracowania bardziej etycznych i skutecznych testów toksyczności narażenia toksykologicznego i ekotoksykologicznego. Cechy te obejmują łatwe pobieranie hemolimfy z małży w mało inwazyjny sposób, niewielką ilość hemolimfy wymaganą do badania oraz użycie płytki wielodołkowej, która umożliwia jednoczesne narażenie na wiele stężeń toksycznych i powtórzeń, oferując znaczne oszczędności czasu i odczynników.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania zostały sfinansowane przez projekt "Dipartimento di Eccellenza" przyznany DiSTeBA przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa i Badań, CUP: F85D18000130001, oraz przez NBFC (National Biodiversity Future Center) finansowany przez Unię Europejską NextGenerationEU, PNRR, projekt nr CN00000033. Dziękujemy również infrastrukturze BIOforIU na Wydziale Nauk i Technologii Biologicznych i Środowiskowych Uniwersytetu w Salento.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr (średnica 25 mm)ABLUO sprzęt laboratoryjny
2,5 ml igła do strzykawki podskórnej 22GRays2522CM32sprzęt laboratoryjny
96-dołkowa płaska płytka z polistyrenu polistyrenowego poddanego działaniu TCCorning3916przybory laboratoryjne
CaCl2.2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KGOprogramowanie narzędzia do
chemotaksji chemicznej i migracji (Ibidi GmbH)software
Cytat 5 Agilent BioTeckCytation 5Sprzęt: Czytnik wielomodowy do obrazowania komórek
Dimetylosulfotlenek (DMSO) Merk (Sigma - Aldrich) 472301Solvent
Falcon 15 mL Tubka Stożkowe dnoCorning352196sprzęt laboratoryjny
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394
Hemocytometr chemiczny Szybki odczyt 102BiosigmaBVS100sprzęt laboratoryjny
HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazyno-etanosulfonowy)Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500GOprogramowanie
obrazowaniaOprogramowanieNIH
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881Chemiczny
KClMerk 104936Chemiczna
L-glutaminaMerk (Sigma - Aldrich) G7513Aminokwas egzogenny do pożywki do hodowli komórkowych
MgCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670
Chemiczny MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) Mikroskop chemicznyM7506
Nikon Eclipse E600NikonSprzęt: Obrazowanie komórek 
Na2SO4Riedel-de Haen31481Chemical
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-RChemiczny
NaFFluka71519 500gChemiczny
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KGNeutralny chemicznie
czerwonyMerk (Sigma - Aldrich) N4638-1GBarwnik witalny
Penicylina/StreptomycynaMerk (Sigma - Aldrich) P0781-100MLAntybiotyki do hodowli komórkowych
SrCl2· 6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521
Chemiczny błękit trypanowy Merk (Sigma - Aldrich) T8154Barwnik komórkowy
do chemikaliów

Bibliografia

  1. Di Paolo, C., et al. Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring. Water Res. 104, 473-484 (2016).
  2. Brack, W., et al. Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality. Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).
  3. Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies. Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).
  4. Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives. Water. 13 (13), 1847(2021).
  5. Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment. Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).
  6. Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).
  7. Lionetto, F., et al. Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies. Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).
  8. Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels. Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).
  9. Ogidi, O. I., Onwuagba, C. G., Richard-Nwachukwu, N. Biomonitoring tools, techniques and approaches for environmental assessments. Biomonitoring of Pollutants in the Global South. Izah, S. C., Ogwu, M. C., Hamidifar, H. , Springer. Singapore. (2024).
  10. Rosner, A., et al. A broad-taxa approach as an important concept in ecotoxicological studies and pollution monitoring. Biol Rev. 99 (1), 131-176 (2024).
  11. Gagné, F., Burgeot, T. Bivalves in ecotoxicology. Encyclopedia of Aquatic Ecotoxicology. , 247-258 (2013).
  12. Caricato, R., et al. Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study. Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).
  13. Calisi, A., et al. Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites. Mar Environ Res. 188, 105988(2023).
  14. Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring. Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).
  15. Bocchetti, R., et al. Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas. Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).
  16. Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker. Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).
  17. Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects. Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).
  18. Canesi, L., et al. Tyrosine kinase-mediated cell signaling in the activation of Mytilus hemocytes: Possible role of STAT-like proteins. Biol Cell. 95 (9), 603-613 (2003).
  19. Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations. Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).
  20. Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components. Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).
  21. Le Foll, F., et al. Characterization of Mytilus edulis hemocyte subpopulations by single-cell time-lapse motility imaging. Fish Shellfish Immunol. 28 (2), 372-386 (2010).
  22. Rioult, D., Lebel, J. -M., Le Foll, F. Cell tracking and velocimetric parameters analysis as an approach to assess activity of mussel (Mytilus edulis) hemocytes in vitro. Cytotechnology. 65 (5), 749-758 (2013).
  23. Udayan, G., Giordano, M. E., Pagliara, P., Lionetto, M. G. Motility of Mytilus galloprovincialis hemocytes: Sensitivity to paracetamol in vitro exposure. Aquat Toxicol. 265, 106779(2023).
  24. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  25. Ivanina, A., Falfushynska, H., Beniash, E., Piontkivska, H., Sokolova, I. Biomineralization-related specialization of hemocytes and mantle tissues of the Pacific oyster Crassostrea gigas. J Exp Biol. 220 (18), 3209-3221 (2017).
  26. Furukawa, F., et al. Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai. Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).
  27. Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection. Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).
  28. Gendre, H., et al. Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha. Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).
  29. Kaloyianni, M., et al. Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels. Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).
  30. Sendra, M., et al. Nanoplastics: From tissue accumulation to cell translocation into Mytilus galloprovincialis hemocytes. Resilience of immune cells exposed to nanoplastics and nanoplastics plus Vibrio splendidus combination. J Hazard Mater. 388, 121788(2020).
  31. Pizzagalli, D. U., Pulfer, A., Thelen, M., Krause, R., Gonzalez, S. F. In vivo motility patterns displayed by immune cells under inflammatory conditions. Front Immunol. 12, 804159(2021).
  32. ASTM D1141-98. Standard Practice for Preparation of Substitute Ocean Water. , (2021).
  33. Martínez-Gómez, C., Bignell, J., Lowe, D. Lysosomal membrane stability in mussels. ICES Techniques in Marine Environmental Sciences. 56, 1-41 (2015).
  34. UNEP/RAMOGE. Manual on the biomarkers recommended for the MED POL Biomonitoring Programme. UNEP. , Athens. (1999).
  35. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  36. Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0 Version 1.1. , (2013).
  37. Wilkinson, J. L., et al. Pharmaceutical pollution of the world's rivers. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (8), e2113947119(2022).
  38. Parisi, M. G., Pirrera, J., La Corte, C. Effects of organic mercury on Mytilus galloprovincialis hemocyte function and morphology. J Comp Physiol B. 191 (1), 143-158 (2021).
  39. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
  40. Bailly, M., Condeelis, J. Cell motility: Insights from the backstage. Nat Cell Biol. 4 (5), E292-E294 (2002).
  41. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev. 94 (1), 235-263 (2014).
  42. Mosca, F., et al. Effects of high temperature and exposure to air on mussel (Mytilus galloprovincialis, Lmk 1819) hemocyte phagocytosis: Modulation of spreading and oxidative response. Tissue Cell. 45 (3), 198-203 (2013).
  43. Beaudry, A., et al. Effect of temperature on immunocompetence of the blue mussel (Mytilus edulis). J Xenobiot. 6 (1), 5889(2016).
  44. Wu, F., et al. Combined effects of seawater acidification and high temperature on hemocyte parameters in the thick shell mussel Mytilus coruscus. Fish Shellfish Immunol. 56, 554-562 (2016).
  45. Schmeisser, S., et al. New approach methodologies in human regulatory toxicology - Not if, but how and when. Environ Int. 178, 108082(2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ruchliwo hemocyt whemocyty ma ytest toksyczno citest ekotoksykologicznyledzenie kom rekmikroskopia poklatkowabiomonitoring rodowiskowymigracja kom rekodpowied immunologiczna
Test toksykologiczny i ekotoksykologiczny oparty na ruchliwości hemocytów omułka (Mytilus galloprovincialis)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.