Udostępniamy krok po kroku protokół oceny odporności topoli na patogeny raka łodygi za pomocą metody inokulacji in vivo liści. Metoda ta jest szczególnie przydatna do wielkoskalowej oceny odporności na raka Cytospora chrysosperma i Botryosphaeria dothidea u potomstwa hodowlanego topoli w Chinach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Inokulacja liści in vivo: alternatywna metoda oceny odporności klonów hybrydowych na choroby zakaźne w hodowli topoli na raka łodygi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroby raka łodyg wywołane przez patogen Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) i Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. To dwie główne choroby leśne na plantacjach topoli w Chinach, które czasami mogą zniszczyć wszystkie siewki topoli lub poważnie uszkodzić dojrzałe lasy topolowe. Hodowla hybrydowa jest najbardziej bezpośrednią i skuteczną metodą zwalczania i zwalczania chorób drzew. Jednak ocena odporności na chorobę lub wybór klonów odpornych na choroby na podstawie inokulacji in vitro łodyg jest nieefektywna, czasochłonna i kosztowna, co ogranicza rozwój hodowli hybrydowej raka łodygi topoli. W tym badaniu zaproponowaliśmy alternatywną metodę oceny odporności na patogeny raka łodygi poprzez inokulację liści in vivo. Materiałem badawczym stosowanym w tej metodzie mogą być 1-roczne sadzonki topoli lub jednoroczne gałęzie topoli wieloletnich w szklarni lub na polu. Krytycznym krokiem tej alternatywnej metody jest wybór liści do zaszczepiania: 5-7nowo dojrzałych liści może być najbardziej odpowiednie. Drugim krytycznym krokiem metody inokulacji liści jest wykonanie ran na liściach roślin za pomocą igieł, zapewniając wystarczające zmiany do zmierzenia ciężkości choroby. W przypadku odpowiedniej liczby liści wytworzonych we wczesnej fazie rozmnażania topoli, ta inokulacja liści in vivo przyczynia się do szybkiego, dokładnego i zakrojonego na szeroką skalę badania przesiewowego odpornych na choroby klonów topoli pod kątem patogenów raka łodyg. Co więcej, ta metoda inokulacji liści będzie również służyć jako skuteczna metoda badań przesiewowych patotypów patogenu choroby raka łodygi C. chrysosperma, B.dothidea lub innych patogenów raka łodygi topoli.
Wprowadzenie
Choroby raka łodyg topoli, głównie wywoływane przez dwa nekrotroficzne patogeny, Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. i Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not., poważnie zagrażają rozwojowi i przetrwaniu plantacji topoli na północnym wschodzie, północy i północnym zachodzie (Three-north) Chin. Hodowla hybrydowa jest najbardziej bezpośrednią i skuteczną metodą zwalczania i zwalczania chorób drzew; Jednak w porównaniu z postępem w hodowli wysokowydajnych, szybko rosnących lub innych klonów hybrydowych topoli, badania nad hodowlą odpornościową na raka topoli są rzadkie. Zgłoszono jedynie ograniczone badania dotyczące hodowli hybryd odpornych na choroby1,2,3, a w zalesianiu topoli nie wyhodowano żadnego klonu hybrydy odpornego na raka.
Kluczowym krokiem regularnej hodowli hybryd jest selekcja klonów na podstawie fenotypu nabycia potomstwa hybrydowego. Jednak nabywanie patologicznych fenotypów (patotypów) jest procesem czasochłonnym, pracochłonnym, męczącym, kosztownym i zależnym od ekspertów. W przypadku roślin drzewiastych jest to trudniejsze ze względu na czasochłonność, pracochłonność i ekonomię, spowodowaną ich długim cyklem życia, powolnym wzrostem i masywną sylwetką. Na przykład w topoli badanie przesiewowe pod kątem odporności na raka potomstwa hybrydowego przeprowadzono 5-7 lat po hybrydyzacji za pomocą konwencjonalnych metod inokulacji pnia in vitro1,2,3. Co więcej, ograniczeni tą mało wydajną i wysoce oporną na choroby metodą przesiewową, naukowcy ponownie wybrali odporne na raka klony z niewielkiej podgrupy (na przykład wybranych wysokowydajnych lub szybko rosnących klonów topoli), a nie ze wszystkich hybrydowych potomstwa. W związku z tym, przy użyciu zwykłych metod inokulacji łodyg, nie jest pewne, czy uda się zidentyfikować autentyczne odporne klony i nie można ujawnić odpornej na choroby różnorodności potomstwa hodowlanego, ograniczając w ten sposób eksplorację genów lub modułów genowych związanych z odpornością na choroby. W porównaniu z szybkim rozwojem szybko rosnącej/wysokowydajnej hodowli topoli, te programy hodowlane mogą uzyskać hybrydy poprzez selekcję fenotypową lub nawet selekcję genomową w pierwszych dwóch latach hodowli4, hodowla odporna na raka topoli rozwijała się powoli. Odporne na choroby badania przesiewowe (lub wykrywanie) potomstwa hybrydowego, czyli metoda inokulacji patogenów, stały się kluczowym krokiem ograniczającym prędkość w hodowli opornej na raka topoli
.W tym protokole wprowadzamy nową metodę inokulacji patogenów raka łodygi topoli, metodę inokulacji in vivo liści. Za pomocą tej metody możemy szybko i sprawnie w ciągu 5-7 dni zbadać odporność na choroby rakowe kilkudziesięciu gatunków topoli (odmian lub klonów). Test walidacyjny wykazał, że inokulacja liści in vivo jest zgodna z tradycyjną inokulacją łodyg in vitro w zakresie wykrywania oporności na raka łodygi, co sugeruje, że metoda inokulacji liści jest odpowiednia do badań przesiewowych odporności na dużą skalę chorób raka topoli, takich jak cała selekcja genotypu potomstwa odporności w hodowli raka łodygi. Metoda ta rozwiązuje patologiczny problem selekcji odpornego potomstwa w hodowli hybrydowej chorób raka topoli.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Kultura grzybów dla patogenu rakowego
- Przygotować pożywkę z dekstrozą ziemniaczaną (PDA; ekstrakcja ziemniaczana 6,0 g, dekstroza 20,0 g, agar 20,0 g) dla szczepów grzybów; rozpuścić powyższe materiały w wodzie do 1000 ml, całkowicie rozpuścić pożywkę w temperaturze 100 °C przez 10 min.
- Wlać pożywkę PDA do probówek o pojemności 25 ml (każda zawierająca 15,0 ml); sterylizować wszystkie probówki w temperaturze 121,1 °C przez 30 minut. Wlać pożywkę do płytek hodowlanych (o średnicy 9,0 cm) i schłodzić płytki w temperaturze pokojowej (RT).
- Pokrój grzybnię patogenu grzybowego, który jest hodowany w pożywce PDA w temperaturze 28 °C przez 7 dni, na ~0,5 cm kwadratową kostkę; zaszczepij kostki grzyba w środku płytek PDA (boki grzybni są skierowane w stronę pożywki).
- Hodować patogeny grzybowe w inkubatorze termostatycznym (28 °C, w ciemności) przez 7-10 dni.
- Pokrój podłoże PDA z grzybnią w kwadratową kostkę (długość boku 1,0-1,2 cm).
2. Przygotowanie materiałów topolowych
- W przypadku 1-rocznych klonów topoli (uprawianych > 3 miesięcy) wybierz nowo dojrzałe, w pełni rozwinięte liście (zawsze 5-7liści, od wierzchołka drzewka/gałęzi) głównych gałęzi jako zaszczepiony materiał, upewnij się, że są wolne od szkodników, chorób i uszkodzeń mechanicznych.
- W przypadku 1-rocznych gałęzi wieloletnich klonów hybrydowych topoli (uprawianych > 2 miesięcy) wybierz górne 5-7liści wybranych gałęzi jako zaszczepiony materiał. Upewnij się, że liście są zdrowe i mają takie same warunki oświetleniowe (cień lub światło) wśród wszystkich testowanych klonów topoli.
3. Wstępna obróbka liści inokulacyjnych
- Spryskaj liście topoli czystą wodą, a po wyschnięciu przetrzyj wybrane liście 75% alkoholem na 1 godzinę lub 1 dzień przed manipulacjami inokulacji.
4. Inokulacja liści in vivo
- Dla małych liści (szerokość liścia < 8,0 cm), zaszczepić dwie kwadratowe kostki grzybni grzybów i kostki PDA (lub agaru wodnego, WA) (1,0-1,2 cm długości boku) na górnej powierzchni górnych 5-7 liści klonów topoli; grzybnia jest skierowana w stronę liści. Upewnij się, że miejsca inokulacji znajdują się pośrodku półliści, w odległości ~1-2 cm od nerwów centralnych, unikając zasłaniania nerwów wtórnych. Każdy klon zaszczepia 12 miejsc na 6 liściach (10 miejsc dla grzybni i 2 miejsca dla inokulacji PDA).
- W przypadku dużych liści (szerokość liścia ≥ 8,0 cm) należy zaszczepić cztery kwadratowe kostki grzybni grzybów i kostki PDA (lub WA) na górnych 5-7 liściach topoli. Każdy klon zaszczepia 12 miejsc na 3 liściach (10 miejsc dla grzybni i 2 miejsca dla inokulacji PDA).
- Owiń zaszczepione liście przezroczystą taśmą klejącą (6,0 cm szerokości) i delikatnie dociśnij, aby przykleiły się do liści, zapobiegając przesuwaniu się i utracie wody z kostek grzybni (lub PDA) podczas eksperymentu.
- Przekłuj liście i kostki grzybni (lub PDA) w pięciu miejscach, aż igły przebiją kostki od górnej do dolnej powierzchni liści topoli. Jedno miejsce leży w środku, a pozostałe cztery leżą 1-2 mm w pobliżu czterech wierzchołków sześcianów.
UWAGA: Do manipulacji inokulacją grzybów zalecana jest współpraca 3-osobowego zespołu. Manipulacja inokulacją populacji mieszańców topoli (>100 genotypów) może być przeprowadzona w ciągu 4 godzin dzięki pracy zespołowej. Manipulacje przekłuwaniem przeprowadzono po zaszczepieniu i owinięciu wszystkich badanych liści, aby złagodzić wpływ różnych czasów przekłuwania na nasilenie choroby. - Sprawdzić zmianę lokalizacji i utratę wody przez inokulanty grzybni i obserwować początek zmian martwiczych wokół miejsc ran kłutych od dolnej powierzchni liści do 3dnia inokulacji.
- W ciągu 3 dni od inokulacji obserwuj zmianę lokalizacji i utratę wody w kostkach grzybni. Zdefiniuj i oznacz przeniesione i wysuszone kostki grzybni jako nieskuteczne inokulacje i odrzuć je od ostatecznej identyfikacji patotypów, jednocześnie definiując inne kostki jako skuteczne inokulacje.
UWAGA: Niniejszy protokół definiuje badane klony topoli z więcej niż pięcioma skutecznymi kostkami inokulacyjnymi jako nieważne zaszczepione klony; Dlatego każdy klon topoli dostarczył co najmniej 30 skutecznych miejsc zaszczepiania, które rozwiną się w 30 niezależnych nekrotycznych plam.
- W ciągu 3 dni od inokulacji obserwuj zmianę lokalizacji i utratę wody w kostkach grzybni. Zdefiniuj i oznacz przeniesione i wysuszone kostki grzybni jako nieskuteczne inokulacje i odrzuć je od ostatecznej identyfikacji patotypów, jednocześnie definiując inne kostki jako skuteczne inokulacje.
- Zerwij wszystkie zaszczepione liście pod koniec eksperymentu (~5-7 dni po inokulacji), przynieś je z powrotem do laboratorium w plastikowych torebkach na próbki i przechowuj w temperaturze 4 °C.
5. Pozyskiwanie patotypu liści i ocena odporności topoli na choroby raka łodyg w laboratorium
- Ostrożnie usuń przezroczyste taśmy klejące i inokulanty grzybni (lub PDA) z liści.
- Obserwuj i identyfikuj patotypy liści każdego klonu topoli, w tym kształt i kolor nekrotycznych plam, i może obejmować strukturę przypominającą strzępki grzybów, piknidia i konidia, które utworzyły się na powierzchni liści wokół miejsc przekłucia.
- Sfotografuj liście (za pomocą dodatkowej linijki) za pomocą aparatu fotograficznego lub zeskanuj liście (za pomocą dodatkowej linijki) za pomocą skanera, aby uzyskać obrazy o rozdzielczości ponad 300 dpi, a następnie zapisz obrazy w formacie JPEG, TIFF lub PNG.
6. Identyfikacja i analiza statystyczna występowania choroby
- Otwórz obrazy chorych liści w oprogramowaniu ImageJ 1.54g (http://imagj.org).
- Ustaw skalę zgodnie z linijką na obrazach liści.
- Zidentyfikuj i zmierz zmiany za pomocą narzędzia do śledzenia różdżki.
- Rejestruj i eksportuj wartości obszaru jako arkusz kalkulacyjny po zmierzeniu obszarów wszystkich nekrotycznych plam.
- Ustal kryteria określania choroby:
- Jeśli obszar uszkodzenia wokół miejsc przekłucia pokrytych kostkami grzybni jest znacznie większy niż ten pokryty kostkami PDA, to zdefiniuj te miejsca jako miejsca chorobowe.
- Jeśli cechy morfologiczne miejsc przebicia pokrytych kostkami grzybni uległy znaczącym zmianom w porównaniu z miejscami pokrytymi PDA, w tym kolory zmiany, wytwarzające strukturę podobną do strzępek, piknidiów i konidiów, zdefiniuj to miejsce również jako miejsce chorobowe.
- Oblicz średnie obszary efektywnych punktów uszkodzeń PDA każdego klonu hybrydy topoli. Zgodnie ze średnimi obszarami, podziel wszystkie plamy zaszczepione grzybnią jednego klonu topoli na dwie kategorie: początek i brak początku. Następnie oblicz częstość występowania choroby u badanego klonu topoli (wzór 1: Częstość występowania choroby (%) = liczba chorych miejsc nakłucia/Całkowita liczba skutecznych miejsc nakłucia × 100).
- Oblicz średnią powierzchnię chorych miejsc na liściach (n = 50). Zgodnie z wartościami średnich powierzchni chorych plam liści we wszystkich badanych klonach topoli, ustal 5-stopniowy standard klasyfikacji chorób.
- Oblicz wskaźnik choroby każdego klonu topoli (wzór 2) w oparciu o powyższy standard klasyfikacji chorób (wzór 2: Wskaźnik choroby = ∑(Liczba miejsc nakłucia według poziomu × Wartości ciężkości na wszystkich poziomach)/(Wartość najwyższego poziomu dotkliwości × Całkowita liczba skutecznych miejsc nakłucia) × 100).
- Sprawdzić rozkład normalny liczby klonów topoli na różnych poziomach odporności za pomocą testu Shapiro-Wilka przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.
- Zgodnie z indeksem choroby, zidentyfikuj wszystkie badane klony topoli jako pięć (lub siedem) grup: bardzo wysoka odporność (VHR), wysoka odporność (HR), oporność (R), brak oporności i brak wrażliwości (NRNS), podatność (S), wysoka wrażliwość (HS) i bardzo wysoka wrażliwość (VHS) grupa5.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym protokole schematyczna procedura została przeprowadzona na 48 klonach hybryd topoli zainfekowanych patogenem powodującym raka pnia C. chrysosperma (Rysunek 1). Hybrydowe klony topoli stanowią część potomstwa krzyżówkowego P. deltoides, hodowanego w szkółce Chińskiej Akademii Leśnictwa (CAF) w Pekinie.
Izolat CZC patogenu raka pnia C. chrysosperma jest typowym szczepem grzybowym (o umiarkowanej patogenności) wykorzystywanym w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten zapewnia szybką i skuteczną metodę inokulacji patogenów oporności raka topoli, która jest odpowiednia dla dziedzin badawczych wymagających badań przesiewowych oporności na choroby na dużą skalę, takich jak hybrydowa hodowla odporności raka topoli i badania przesiewowe patogenów raka łodygi.
Pierwszym kluczowym punktem metody jest ocena odporności na choroby za pomocą nowo dojrzałej inokulacji liści, a nie dojrzałych łodyg/gałęzi. W rezultacie, selekcja klonów odpornych na raka ło...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Te badania zostały wspólnie sfinansowane przez Centralną Instytucję Naukową Pożytku Publicznego, Fundusz Badawczy Państwowego Kluczowego Laboratorium Genetyki i Hodowli Drzew (grant numer CAFYBB2020ZY001-2) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu 32171776) dla Jiaping Zhao.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Folia aluminiowa | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. izolat chrysosperma | China Forest Culture Collection | CFCC86775 | Separacja i konserwacja przez nasze laboratorium |
| Cytospora chrysosperma | Laboratorium Fizjologii Roślin, Instytut Leśnictwa Nowe Technologie, Chińska Akademia Leśnictwa | Numer dostępu do NCBI: MK994101 dla rRNA-ITS i MN025273 dla EF1α gen Numer CGMCC: 40575 | Separacja i konserwacja przez nasze laboratorium |
| Epson Perfection V370 Photo | Epson | Skaner V370 | ; Zeskanuj liście na obraz |
| PDA (agar ziemniaczany z dekstrozą) | Solarbio | P8931 | Zapewniają składniki odżywcze dla wzrostu grzybów |
| Folia | Do utrwalania grzybów na liściach | ||
| Populus alba var. Pyramidalis | Laboratorium Fizjologii Roślin, Instytut Leśnictwa Nowe Technologie, Chińska Akademia Leśnictwa | Uprawiane przez nasze laboratorium | |
| Oprogramowanie do analizy danych | SPSS | IBM | |
| Inkubator termostatyczny | Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., Ltd | KTD-6000 | Zapewnij środowisko do rozwoju grzybów |
| Wytrzymały aparat TG-6 | OLYMPUS | Aby zrobić zdjęcia chorych liści |
Bibliografia
- Du, K., et al. Genetic analysis and seedling selection of the poplar progenies of Aigeiros section. Journal of Huazhong Agricultural University. 28 (5), 624-630 (2009).
- Shi, Y. Identification of canker resistance to selection poplar clones [Master's thesis]. , Northwest Agriculture and Forestry University. (2014).
- Zhang, L., Zhang, H., Ou, D., Fan, J. Investigation on the resistance to canker of some new leuce hybrids inoculated with Botryosphaeria dothidea. Journal of Northwest Forestry University. 32 (6), 210-213 (2017).
- Du, C., et al. Genomic selection of seedling growth traits in a poplar hybrid population. For Res. 36 (6), 11-19 (2023).
- Li, Z., et al. A rapid and efficient in vivo inoculation method for introducing tree stem canker pathogens onto leaves: Suitable for large-scale assessment of resistance in poplar breeding progeny. BioRxiv. , (2024).
- Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9 (1), 10111(2019).
- Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 112, 101523(2020).
- Xing, J., et al. Comparisons of photosynthetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis Infected by the stem canker pathogen Valsa sodida and Botryosphaeria dothidea at early stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
- Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
- Balendres, M. A., De Torres, R., Dela Cueva, F. Culture storage age and fungal re-isolation from host-tissue influence Colletotrichum spp. virulence to pepper fruits. J Phytopathol. 167 (9), 510-515 (2019).
- Ward, K. T., Ostry, M. E. Variation in Septoria musiva and implications for disease resistance screening of poplars. Plant Dis. 89 (10), 1077-1082 (2005).
- Asalf, B., et al. Ontogenic resistance of leaves and fruit, and how leaf folding influences the distribution of powdery mildew on strawberry plants colonized by Podosphaera aphanis. Phytopathology. 104 (9), 954-963 (2014).
- Dunnell, K. L., Le Boldus, J. M. The correlation between Septoria leaf spot and stem canker resistance in hybrid poplar. Plant Dis. 101 (3), 464-469 (2017).
- Wei, J., Huang, L., Gao, Z., Ke, X., Kang, Z. Laboratory evaluation methods of apple Valsa canker disease caused by Valsa ceratosperma sensu Kobayashi. Acta Phytopathol Sinica. 40 (1), 14-20 (2010).
- Shen, W., et al. Comparative study on the effectiveness of three inoculation methods for Valsa sordida in Populus alba var. pyramidalis. Biology. 13 (4), 251(2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
