Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.
Artykuł metodologiczny
Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
System CRISPR-Cas9 do edycji genomu zrewolucjonizował badania funkcji genów w komórkach ssaków, w tym w komórkach macierzystych. Jednak praktyczne zastosowanie tej techniki, szczególnie w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, wiąże się z pewnymi wyzwaniami, takimi jak czasochłonność i pracochłonność oraz niska wydajność edycji. W tym miejscu opisujemy generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) stabilnie eksprymujących sgRNA dla genu L2HGDH, przy użyciu wysoce wydajnego i stabilnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa. SgRNA ukierunkowane na ekson 1 genu L2HGDH zostały chemicznie zsyntetyzowane i sklonowane do wektora lentiCRISPR v2-puro, który łączy konstytutywną ekspresję sgRNA z Cas9 w wysoce wydajnym systemie jednowektorowym w celu uzyskania wyższych mian lentiwirusa dla zakażenia hESC i stabilnej selekcji przy użyciu puromycyny. Komórki wybrane za pomocą puromycyny poddano dalszej namnażce, a klony jednokomórkowe uzyskano przy użyciu metody ograniczonego rozcieńczenia. Pojedyncze klony zostały namnażone i uzyskano kilka homozygotycznych klonów nokautujących dla genu L2HGDH, co potwierdzono 100% redukcją ekspresji L2HGDH przy użyciu analizy Western blot. Ponadto, za pomocą MSBSP-PCR, zmapowano miejsce mutacji CRISPR przed sekwencją rozpoznającą PAM Cas9 w wybranych homozygotycznych klonach. Przeprowadzono sekwencjonowanie Sangera w celu przeanalizowania dokładnych insercji/delecji oraz przeprowadzono charakterystykę funkcjonalną klonów. Metoda ta spowodowała znacznie wyższy odsetek homozygotycznych delecji w porównaniu z wcześniej opisanymi niewirusowymi metodami dostarczania genów. Chociaż niniejszy raport koncentruje się na genie L2HGDH, to solidne i opłacalne podejście może być wykorzystane do stworzenia homozygotycznych nokautów dla innych genów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych do badań funkcji genów.
Wprowadzenie
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są komórkami macierzystymi z potencjałem różnicowania się we wszystkie typy komórek w organizmie. Komórki te służą jako cenne narzędzia do badania rozwoju człowieka, a także do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw różnych chorób, oferując w ten sposób ogromną obietnicę dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i odkrywania leków. Takie badania polegają na zbadaniu sposobu, w jaki określone geny przyczyniają się do rozwoju, funkcjonowania i regulacji organizmów1,2.
Do rozszyfrowania funkcji genów stosuje się różne techniki i podejścia, w tym manipulacje genetyczne, takie jak nokaut lub nadekspresja genów, oraz edycję genomu. Wśród nich technologia CRISPR-Cas9 okazała się najbardziej efektywnym podejściem do badań nad nokautem genów i edycją genów1,2,3. System CRISPR-Cas9 działa poprzez wykorzystanie pojedynczej cząsteczki przewodnika RNA (sgRNA) zaprojektowanej specjalnie do identyfikacji i wiązania się z określoną sekwencją DNA. Działając jako przewodnik molekularny, sgRNA kieruje enzym Cas9 do precyzyjnego miejsca w genomie, które wymaga modyfikacji. Po związaniu Cas9 inicjuje dwuniciowe pęknięcie DNA w wyznaczonym miejscu. Po rozszczepieniu DNA aktywowane są wrodzone mechanizmy naprawcze komórki. Należą do nich dwie główne ścieżki naprawy: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR). NHEJ często powoduje insercje lub delecje (indelecja) w miejscu pęknięcia, co prowadzi do zakłócenia lub inaktywacji genu. I odwrotnie, HDR umożliwia wstawienie nowych sekwencji DNA w miejscu pęknięcia, ułatwiając wprowadzenie ukierunkowanych zmian genetycznych4.
Biorąc pod uwagę znaczenie delecji genów w pluripotencjalnych komórkach macierzystych, opublikowano kilka protokołów dotyczących nokautów genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w hESC/iPSC. Jednak wiele z tych protokołów napotyka na poważne ograniczenia, takie jak niezwykle czasochłonność, pracochłonność i niska skuteczność ze względu na stosowanie metod dostarczania genów innych niż wirusowe5. Wyzwania te są jeszcze bardziej widoczne w przypadku komórek hESC/iPSC, ponieważ wiadomo, że komórki te mają niższą wydajność edycji w porównaniu z innymi typami komórek5. Niektóre z tych ograniczeń można rozwiązać, zwiększając wydajność dostarczania plazmidu zawierającego Cas9 i sgRNA. Można to z powodzeniem osiągnąć za pomocą systemu wektorów lentiwirusowych, który może znacznie poprawić wyniki edycji genów. Protokoły pakowania lentiwirusów są dobrze ugruntowane i proste, co pozwala na łatwe zastosowanie w laboratoriach, nawet przez badaczy o ograniczonym doświadczeniu. Lentiwirusy wykazują wysoką skuteczność infekcji w różnych typach komórek, w tym w hESC i iPSC. Dlatego wykorzystanie systemu lentiwirusowego do ekspresji Cas9-sgRNA jest idealne do rutynowych eksperymentów z edycją genów w hESC/iPSC do badań funkcji genów.
Tutaj oferujemy prostą i nieskomplikowaną metodę wysoce efektywnych delecji genów opartych na CRISPR-Cas9 w hESC w stosunkowo krótszym czasie niż konwencjonalne protokoły (Rysunek 1). Chociaż zastosowano wektor lentiwirusowy z konstytutywną ekspresją Cas9 i sgRNA, można go łatwo zastąpić indukowaną lekiem ekspresją Cas9 w celu kontrolowania ekspresji Cas9.
Protokół
Szczegóły dotyczące sekwencji genów, odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Projektowanie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), klonowanie i produkcja wektorów lentiwirusowych
UWAGA: Używane są dwie różne sekwencje sgRNA ukierunkowane na ekson 1 genu L2HGDH, obie zaadaptowane z Qiu et al.6z miejscami PAM AGG i TGG odpowiednio dla sekwencji 1 i 2. Oba sgRNA miały długość 20 pz, a ich końce zostały zmodyfikowane w celu dodania sekwencji łącznikowych dla enzymu restrykcyjnego Bsmb1, który ma zostać sklonowany w wektorze docelowym (LentiCRISPRv2), jak opisano w poprzednim raporcie6. Sekwencje łącznikowe zostały dodane podczas projektowania sgRNA do celów klonowania.
- Wyżarzanie chemicznie zsyntetyzowane sgRNAs6 i sklonowane do wektora lentiwirusowego Bsmb1 z pojedynczym cięciem, LentiCRISPRv2 przy użyciu zoptymalizowanego protokołu, jak wcześniej zgłoszono7.
- Kontynuuj pakowanie i zagęszczanie lentiwirusa przy użyciu ustandaryzowanego i zoptymalizowanego protokołu7.
- Do produkcji lentiwirusa należy HEK293T nasienne komórki (1 × 105 komórek/cm2) przy użyciu DMEM, 10% FBS i 1x penicyliny/streptomycyny (P/S) i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w wilgotnych warunkach.
- Gdy 90% zlewają się, współtransfekują komórki HEK293T z wektorem wejściowym (pusty szkielet lub plazmidy eksprymujące sgRNA) i plazmidami pakującymi za pomocą taniego polimeru kationowego PEI, jak opisano wcześniej7.
- Zebrać kondycjonowane pożywki zawierające cząstki supernatantu lentiwirusowego (LVS) po 48 godzinach i 72 godzinach po transfekcji i przystąpić do ultrawirowania z użyciem poduszki sacharozowej i wirować probówki w temperaturze 1,25 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
- Kontynuować zagęszczanie cząstek LVS do co najmniej 200-krotności pierwotnej objętości w PBS, podwielokrotności, i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
- Oznaczyć miano cząstek lentiwirusa za pomocą zestawu do miana lentiwirusa qPCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
2. Infekcje lentiwirusowe i rozmnażanie klonów jednokomórkowych
- W przypadku zakażeń cząstkami LVS zawiesinę komórek nasiennych hESC (H9) zawierającą 1 × 105 komórek/0,5 ml pożywki hodowlanej hESC (pożywka podstawowa + P/S + 10 μM inhibitora skały) na kompletnych płytkach dołkowych Matrigel (1:50) pokrytych 500 μl pożywki i inkubować przez noc, aby umożliwić komórkom przyczepienie się. Nasiona dodatkowych dołków, które nie byłyby zakażone LVS, ale potraktowane puromycyną, aby służyły jako niezakażona kontrola.
UWAGA: Zliczanie komórek można przeprowadzić za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. - Następnego dnia należy zainfekować komórki przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10 wraz z 8 μg/ml polibrenu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 godzin, a następnie zastąpić pożywkę świeżą pożywką hESC + P/S bez inhibitora skał i kontynuować hodowlę, aż komórki będą zlewać się w 90%.
- Rozpocznij selekcję puromycyny od uzupełnienia pożywki stężeniem 0,8 μg/ml puromycyny, gdy komórki osiągną 90% konfluencji, co zwykle ma miejsce 48-72 godziny po zakażeniu, i kontynuuj selekcję, aż wszystkie komórki umrą w komórkach niezakażonych (grupa kontrolna).
- Po zakończeniu selekcji (zwykle 4-6 dni) podziel stabilne komórki (1:4) i rozszczep je w celu kriokonserwacji i dalszej analizy.
- Przeprowadź selekcję pojedynczej komórki i ekspansję klonalną przy użyciu komórek eksprymujących L2HGDH-sgRNA-16.
- W tym celu należy przygotować zawiesinę komórkową odpowiadającą 500 komórkom/10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i zasiać 100 μl tej zawiesiny w każdym dołku na 96-dołkowej płytce.
- Pozostaw komórki w spokoju przez 3 dni, a następnie obserwuj.
- Zaznacz studzienki, w których powstają pojedyncze klony i zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż do osiągnięcia wystarczającej wielkości, aby kolonie (zwykle 2 tygodnie) mogły się dalej rozwijać, kriorezerwować i analizować.
3. Ekstrakcja gDNA, MS-BSP PCR i sekwencjonowanie Sangera
- Wyizolować gDNA z komórek za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
- Kontynuuj mapowanie miejsc mutacji przed sekwencjami rozpoznawania PAM za pomocą analizy MS-BSP (Mutation Sites Based Specific Starters)8.
- W tym celu bezstronny prawy starter L2H-UMSBSP-R1 został zaprojektowany do wzmacniania obszaru poza Exonem1 w celu wzmocnienia dowolnych celów.
- Zaprojektuj tendencyjny lewy starter L2H-BMSBSP-F1 o identycznej sekwencji do sgRNA, aby wzmocnić sekwencję docelową w pobliżu sekwencji rozpoznawania PAM.
UWAGA: W bardzo rygorystycznych warunkach PCR produkt będzie obserwowany na żelu w niezmutowanych klonach. Nie zaobserwowano żadnego produktu w klonach z nokautem CRISPR, które wykazywały mutacje zbliżone do sekwencji rozpoznawania PAM. - W celu zmapowania mutacji pojedynczej pary zasad, PCR amplifikuje sekwencję 468 pz obejmującą cały ekson 1 L2HGDH i poddaje sekwencjonowaniu Sangera, a następnie analizie dopasowania wielu sekwencji przy użyciu clustalw8.
4. Test różnicowania hESC i tworzenia ciał zarodkowych (EB)
- Kontynuuj ukierunkowane różnicowanie kontroli i różnych klonów CRISPR hESC (H9) w kierunku losu neuro-ektodermy zgodnie z ustalonymi protokołami, jak opisano wcześniej, przy użyciu metody podwójnego hamowania smad9,10,11.
- Przy 90% konfluencji należy potraktować komórki LDN193189 (200 nM) i SB431542 (10 μM) przez początkowe 24 godziny w pożywce 100% KSR, a następnie dodać XAV939 (2 μM) przez dodatkowe 2 dni.
- Po 3 dniach zmniejsz procentową zawartość pożywek KSR (Knockout DMEM uzupełnionych 15% (v/v) KSR, 1% (v/v) L-glutaminy, 1% (v/v) P/S, 1% (v/v) 10 mM MEM i 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanolu (75%, 50%, 25%) poprzez połączenie z pożywką N2 (DMEM/F12 uzupełnioną 1x suplementem N2, 1x P/S, ) do 100% nośników N2 przez okres 8 dni.
- Na początku 12 dnia utrwal komórki do barwienia immunologicznego za pomocą PAX6 jako markera neuro-ektodermy.
- W badaniach nad określaniem losów mezodermy i endodermy należy zastosować podejście oparte na CHIR99021 małych cząsteczek opisane w poprzednich publikacjach12,13.
- W tym celu, gdy komórki osiągną 70% zbieżności, należy potraktować 3 μM CHIR99021 w pożywce Definitive Endoderm (DE) przez 24 godziny, a następnie utrwalić w celu barwienia immunologicznego przy użyciu Brachuary jako markera specyficznego dla mezodermy.
- Na etapie endodermalnym należy hodować komórki przez dodatkowe 24 godziny w samym pożywce DE bez dodawania CHIR99021 przed utrwaleniem do barwienia immunologicznego za pomocą FOXA2.
- W przypadku testu tworzenia EB, przed wykonaniem mikrofotografii należy wysiać komórki na niskich powierzchniach komórek przyłączeniowych bez użycia Matrigelu do hodowli komórek w warunkach zawieszenia przez 24 godziny.
5. Analiza Western blot
- Umyj komórki dwukrotnie za pomocą PBS i lizuj za pomocą 1x buforu RIPA zawierającego 1% SDS i 1x koktajlu inhibitorów proteazy i fosfatazy.
- Oczyścić lizaty przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie zebrać supernatanty.
- Określ ilościowo całkowite białko komórkowe za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosować próbki do 2 μg/μl za pomocą 4× ładowania buforu próbki barwnika.
- Denaturować próbki białek w temperaturze 70 °C przez 10 minut, załadować równe ilości każdej próbki i rozpuścić za pomocą żeli SDS-PAGE o gradiacji 4%-12%, 7, a następnie przenieść do membrany PVDF przy stałym napięciu 100 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
- Zablokować błony za pomocą 5% mleka beztłuszczowego i inkubować w rozcieńczeniach przeciwciał pierwotnych w temperaturze 4 °C przez noc z rotacją.
- Następnie przemyć błony 5x za pomocą buforu PBST i inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Ponownie przemyć membrany PBST 5x, inkubować z podłożem chemiluminescencyjnym i wywołać za pomocą klisz rentgenowskich.
6. Barwienie immunologiczne
- Wysiewać komórki na płytkach dołkowych P4 i inkubować przez co najmniej 24 godziny przed utrwaleniem, aby umożliwić prawidłowe przyłączenie komórek do powierzchni.
- Umyj komórki 3x PBS, aby usunąć wszelkie martwe komórki, a także składniki pożywki, a następnie utrwal przy użyciu 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,3% trytonu X-100, a następnie blokowanie niespecyficznego wiązania za pomocą 2% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Próbki należy inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami (OCT4, NANOG, SOX2, KI67, PAX6, Brachuary, FOXA2) rozcieńczonymi w 1% BSA przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przemyć komórki 3x PBS i inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (Koza anty-mysia 488, Koza anty-królik 488, Koza anty-mysz 546, Koza anty-królik 546) rozcieńczonymi w 1% BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Na koniec umyj próbki PBS 3x i przebarwij je przeciw DAPI i zobrazuj za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
Wyniki
Klonowanie sgRNA dla L2HGDH w wektorze lentiCRISPRv2 puro
Wektor lentiCRISPRv2 puro pozyskano komercyjnie (patrz Tabela materiałów) i poddano trawieniu enzymem BsmB1, co doprowadziło do uwolnienia fragmentu wypełniającego (stuffer fragment) o wielkości 1,8 Kb. Jak pokazano na Rysunku 2A, zaobserwowano całkowite trawienie wektora. W przypadku każdej konstrukcji przesiewowo sprawdzono sześć klonów pod kątem obecności lub braku wstawki, wykorzystując jako primery odwróconą sekwencję sgRNA oraz primer forward (U6-459F) z sekwencji wektora. Stosując tę metodę, produkt PCR o wielkości 288 bp uzyskano tylko w klonach posiadających wstawkę, natomiast klony negatywne, które nie zawierały odwróconej sekwencji sgRNA, nie dały produktu PCR, co przedstawiono na Rysunku 2B.
Infekcje linii H9, selekcje stabilne i Western blot
hESC zainfekowano cząsteczkami lentiwirusowymi wykazującymi dwa różne sgRNA celujące w ekson 1 genu L2HGDH, a następnie poddano selekcji puromycyną. Analizę Western blot przeprowadzono na heterogenicznych populacjach komórek stabilnie koekspresjonujących sgRNA i Cas9, aby ustalić, który z dwóch użytych sgRNA był bardziej efektywny w indukowaniu delecji genu. Jak pokazano na Rysunku 3A, L2HGDH-sgRNA-1 był bardziej efektywny od drugiej sekwencji w redukcji ekspresji L2HGDH w heterogenicznych populacjach komórek.
Selekcja klonalna, ekspansja i analiza białek
Selekcję pojedynczych komórek oraz ekspansję klonalną przeprowadzono dla komórek wykazujących ekspresję L2HGDH-sgRNA-1. Studzienki, w których uzyskano pojedyncze klony, oznaczono i inkubowano do momentu osiągnięcia przez kolonie wystarczającej wielkości (zazwyczaj 2 tygodnie), aby umożliwić ich dalszą ekspansję, kriokonserwację i analizę (Rysunek 3B). Łącznie 22 klony przeanalizowano za pomocą metody Western blot, co pozwoliło na wyłonienie pięciu homozygotycznych knockoutów (23%) dla genu L2HGDH. Wynik ten wskazuje na wysoką wydajność nokautowania genu przy użyciu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusów w celu stabilnej koekspresji zarówno sgRNA, jak i Cas9 z jednej kasety. Rysunek 4 przedstawia analizę Western blot pięciu homozygotycznych klonów knockout wraz z komórkami kontrolnymi, wykazując 100% redukcję ekspresji w wybranych klonach w porównaniu z kontrolą.
Analiza na poziomie DNA
W celu zmapowania miejsca mutacji CRISPR powyżej sekwencji rozpoznawania PAM białka Cas9 przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z zastosowaniem starterów specyficznych dla miejsc mutacji (MS-BSP PCR), wykorzystując DNA genomiczne z komórek kontrolnych oraz z pięciu różnych klonów. Jak pokazano na Rycynie 5, dwa klony (A5 i B4) posiadają mutacje znajdujące się bezpośrednio obok sekwencji rozpoznawania PAM, natomiast w pozostałych trzech klonach (A1, A9 i B12) wykazano, że mutacja może nie znajdować się w bezpośrednim sąsiedztwie miejsca PAM i leży dalej powyżej 20-pzm sekwencji sgRNA w obrębie eksonu 1 genu L2HGDH.
W celu zidentyfikowania dokładnych mutacji w DNA, oczyszczone produkty PCR z komórek kontrolnych (zakażonych samym wektorem H9) oraz trzech różnych klonów CRISPR (A5, A1 i B4) poddano sekwencjonowaniu metodą Sangera, a miejsca mutacji zmapowano za pomocą narzędzia do wielokrotnego dopasowania clustalw powyżej sekwencji PAM8. Wyniki wykazały mutację delecyjną w klonie A5 powyżej sekwencji PAM. Pozostałe dwa klony, A1 i B4, wykazały mutację insercyjną powyżej sekwencji PAM, co przedstawiono na Rysunku 6.
Analiza funkcjonalna klonów
Po wygenerowaniu linii komórkowych z knockoutem CRISPR w hESC, kolejnym krokiem jest potwierdzenie ich pluripotencji i potencjału różnicowania. W tym celu przetestowano różne markery pluripotencji dla trzech różnych klonów: A1, A5 i B4, a wyniki porównano z komórkami kontrolnymi (H9 zainfekowane samym wektorem). Wyniki nie wykazały zmian w potencjale pluripotencji linii komórkowych z knockoutem, co określono za pomocą immunobarwienia markerów OCT4, NANOG i SOX2. Następnie linie kontrolne i z knockoutem poddano barwieniu na marker proliferacji komórkowej KI67, który również nie wykazał zmian w liniach z knockoutem w porównaniu z kontrolą. Wyniki te pokazują, że knockout CRISPR nie wpłynął na właściwości samoodnawiania tych komórek. Dodatkowo, nie odnotowano wpływu na tworzenie ciałek zarodkowych (EB) oraz kolonii (Rycina 7). Wykorzystując metody in vitro opracowane w naszym laboratorium, wszystkie klony zostały pomyślnie zróżnicowane w komórki trzech listków zarodkowych, co potwierdzono immunobarwieniem markerów PAX6 (marker neuroektodermy), Brachyury (marker mezodermy) i FOXA2 (marker endodermy). W porównaniu z komórkami kontrolnymi nie zaobserwowano zmian w potencjale różnicowania linii komórkowych z knockoutem, co wykazało, że komórki z knockoutem zachowały swój potencjał różnicowania (Rycina 8).
Rycina 1: Schemat przedstawiający plan badania w 5 krokach. Krok 1: Projektowanie i klonowanie sgRNA do wektora V2 CRISPR trawionego enzymem Bsmb1. Krok 2: Generowanie cząsteczek lentiwirusowych z wykorzystaniem wektora wejściowego niosącego sgRNA oraz plazmidów pakujących poprzez ko-transfekcję komórek HEK293T z użyciem polyfections i zagęszczanie wirusa za pomocą ultrawirowania. Krok 3: Infekcja hESCs cząsteczkami lentiwirusowymi przy MOI 10-20 i selekcja stabilnych komórek za pomocą puromycyny, a następnie analiza heterogennych populacji komórek w celu oceny wydajności sgRNA. Krok 4: Klonowanie pojedynczych komórek metodą rozcieńczeń ograniczających z komórek, które wykazały maksymalny knockdown w populacjach heterogennych, oraz selekcja pojedynczych klonów. Krok 5: Ekspansja pojedynczych klonów oraz analiza na poziomie DNA, białek i analiza funkcjonalna klonów pod kątem pluripotencji i potencjału różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Klonowanie sgRNA w wektorze lentiCRISPR V2.puro. (A) Trawienie wektora lentiCRISPR V2.puro enzymem restrykcyjnym BsmB1. Strzałka wskazuje fragment wypełniający (stuffer fragment) o wielkości 1.8 Kb uwalniany podczas trawienia wektora. (B) Analiza Colony PCR dla różnych klonów konstruktów L2HGDH sgRNA 1 i 2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Western bloty i propagacja klonalna z wykorzystaniem selekcji pojedynczych komórek. (A) Analiza Western blot z dwóch różnych powtórzeń biologicznych (S1 i S2) heterogenicznych populacji stabilnie koekspresujących sgRNA (L2H-1 i L2H-2) oraz Cas9 wraz z kontrolnymi (C) H9 hESCs. (B) Selekcja pojedynczych komórek i ekspansja klonalna komórek H9 stabilnie ekspresujących L2HGDH-sgRNA-1. Strzałki wskazują studzienki płytek 96-dołkowych zawierające wyłącznie pojedyncze klony. Pasek skali = 100 µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 4: Analiza Western blot z różnych klonów H9. (A-C) Analiza Western blot z całkowitych lizatów komórkowych 22 klonów pozwoliła na uzyskanie pięciu homozygotycznych nokautów (23%) dla L2HGDH. (D) Potwierdzenie nokautów L2HGDH w innym eksperymencie z powtórzeniem biologicznym przy użyciu Western blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Analiza PCR metodą MSBSP różnych klonów H9. (A) Analiza sekwencji eksonu 1 genu L2HGDH wykorzystanego do analizy PCR metodą MSBSP. (B) Optymalizacja temperatury przyłączania dla analizy PCR metodą MSBSP z wykorzystaniem kontroli oraz klonu B4 H9 V2 L2HGDH KO. W temperaturze 96,8°C kontrola wykazuje prążek, natomiast klon B4 nie wykazuje prążka, co zaznaczono strzałkami. (C) Analiza wszystkich homozygotycznych klonów KO pozwoliła na poniższe zmapowanie miejsca mutacji w obrębie eksonu 1. A1 = In/Del daleko od miejsca PAM; A5 = In/Del blisko miejsca PAM; A9 = In/Del dość blisko miejsca PAM; B4 = In/Del bardzo blisko miejsca PAM; B12 = In/Del daleko od miejsca PAM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Dopasowanie produktów PCR sekwencjonowanych metodą Sangera do sekwencji referencyjnej eksonu 1 genu L2HGDH. Wykonano dopasowania wielosekwencyjne produktów PCR z linii A1, A5 i B4 oraz komórek kontrolnych wraz z sekwencją referencyjną pierwszego eksonu L2HGDH z bazy danych NCBI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 7: Charakterystyka funkcjonalna linii komórkowych z nokautem CRISPR. (A) Komórki poddano immunobarwieniu na markery pluripotencji (OCT4, NANOG, SOX2), samoodnawiania (KI67), ciała embroidalne (EBs) oraz tworzenie kolonii w odniesieniu do kontrolnych zainfekowanych hESC H9. Paski skali: 100 µM. (B) Odsetek komórek wykazujących pozytywną (+ve) ekspresję obliczono w stosunku do barwienia DAPI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 8: Potencjał różnicowania linii komórkowych z knockoutem CRISPR. Charakterystyka funkcjonalna linii komórkowych z knockoutem CRISPR pod kątem ich potencjału różnicowania z wykorzystaniem markerów PAX6 (neuroektoderma), Brachyury (mezoderma) i FOXA2 (endoderma) w odniesieniu do kontrolnych zakażonych komórek H9. Paski skali: 100 µM. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
| Krok protokołu | Wymagany czas |
| Klonowanie sgRNA w wektorze LentiCRISPRv2 | 4 dni |
| Produkcja lentiwirusów i oznaczanie miana | 5 dni |
| infekcje hESC, selekcja stabilnych linii komórkowych i ekspansja | 2 tygodnie |
| Klonowanie i ekspansja pojedynczych komórek | 2 tygodnie |
| Analiza funkcjonalna klonów | 2 tygodnie |
Tabela 1: Harmonogram etapów protokołu i szacowany czas wymagany do ich wykonania.
Dyskusja
Badanie to ustandaryzowało metodę, która umożliwia wysoce wydajne i opłacalne delecje genów w hESC za pomocą technologii CRISPR-Cas9. Metoda ta z powodzeniem doprowadziła do homozygotycznej delecji genu L2HGDH w hESC w ciągu 3-4 tygodni, począwszy od zakażenia hESC do selekcji i namnażania klonów jednokomórkowych (Tabela 1). Chociaż manipulacje genami za pośrednictwem CRISPR-Cas9 można osiągnąć poprzez przejściowe transfekcje w większości komórek, staje się to wyzwaniem w komórkach macierzystych ze względu na słabą wydajność transfekcji i wysoką toksyczność komórek. Różne badania wykazały, że do 10% odzyskanych klonów wykazuje delecje. Na przykład Mali i in. odnotowali od 2% do 4% skuteczności edycji genomu w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych po ukierunkowaniu na locus3 AAVS1. Inne badanie wykazało skuteczność edycji na poziomie 1,3%-8,4% u naiwnych komórek macierzystych Hescent ukierunkowanych na TUNA, długie, niekodujące RNA zaangażowane w pluripotencję i różnicowanie neuronalne14. Skuteczność do 10% została zgłoszona po celowaniu w gen CFTR w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przez Ocana i wsp.15 Dlatego do osiągnięcia wydajnej edycji genów wymagana jest wydajna metoda dostarczania Cas9-gRNA, a jest to szczególnie prawdziwe w przypadku komórek macierzystych, ponieważ komórki te wykazują zwiększony poziom wrażliwości i odporności na przejściowe metody dostarczania w porównaniu z typowymi komórkami somatycznymi i unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi5.
W niniejszym badaniu opisano wysoce skuteczny sposób uzyskania homozygotycznych linii komórkowych nokautujących CRISPR poprzez zastosowanie dostarczania sgRNA za pośrednictwem lentiwirusa do hESC. Wykorzystanie wektorów lentiwirusowych do dostarczania CRISPR-Cas9 do hESC okazało się znacznie bardziej efektywne i mniej czasochłonne w osiąganiu delecji genów niż stosowanie transfekcji wektorów niewirusowych za pomocą środków chemicznych lub mechanicznych (dane nie pokazane). Skutkowało to znacznie wyższą wydajnością edycji genomu (~23%) po selekcji klonalnej i rozmnażaniu poszczególnych klonów. W związku z tym, łącząc dostarczanie sgRNA i Cas9 do hESC za pośrednictwem lentiwirusa, a także opłacalne podejście do produkcji lentiwirusa, obecna metoda jest nie tylko wysoce wydajna i mniej czasochłonna, ale także opłacalna.
Oto kilka zaleceń dotyczących skutecznego podejścia: (1) Użycie pojedynczego systemu wektorów lentiwirusowych wyrażającego zarówno Cas9, jak i sgRNA. (2) Obecność markera selekcji antybiotyków, takiego jak puromycyna, na tym samym plazmidzie, który wyraża Cas9 i sgRNA, zapewnia, że prawie 100% komórek jest dodatnich pod względem ekspresji Cas9-sgRNA. To znacznie zwiększa prawdopodobieństwo udanych zdarzeń związanych z edycją genów. (3) Aby zakażenia hESC były użyteczne w przypadku zakażeń hESC, niezbędna jest koncentracja wektorów lentiwirusowych w celu uzyskania wysokich mian wirusów. Spośród różnych stosowanych technik najbardziej ekonomicznym podejściem jest użycie dużych objętości LVS i zagęszczenie ich 100-500 razy w stosunku do pierwotnej objętości w celu uzyskania miana w zakresie 107 do 108 IU/ml. (4) W przypadku opłacalnej i efektywnej metody transfekcji komórek HEK293T plazmidami, stosowanie PEI (polietylenoiminy) do transfekcji wektorów lentiwirusowych w celu pakowania wirusów jest równie skuteczne, a zatem opłacalne w porównaniu z powszechnie stosowanym odczynnikiem do transfekcji lipofektaminą7. (5) Średnie miana lentiwirusa muszą mieścić się w zakresie od 5 × 107 j.m./ml. (6) Rozmnażanie klonalne przez selekcję pojedynczych komórek jest wymagane do osiągnięcia homozygotycznych delecji genu będącego przedmiotem zainteresowania w tych komórkach. (7) Chociaż poprzednie badania wykazały, że edycja genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych powoduje bardzo niewiele mutacji poza celem16,17, nadal rozsądne jest sprawdzenie miejsc poza celem. Można to osiągnąć dzięki wydajnym narzędziom do projektowania gRNA w celu zminimalizowania efektów poza celem i sekwencjonowaniu całego genomu edytowanych linii komórkowych18, szczególnie w przypadku eksperymentów o znaczeniu klinicznym. (8) Wreszcie, normalny kariotyp wybranych klonów powinien zostać zweryfikowany przy użyciu metod takich jak pasma G i analiza w wysokiej rozdzielczości, aby upewnić się, że nie ma zmian genomowych na dużą skalę. Można również przeprowadzić test mikrojądrowy w celu oceny częstotliwości powstawania mikrojąder, co może wskazywać na niestabilność genomu.
Jednym z głównych ograniczeń tej metody jest zastosowanie systemu wektorów lentiwirusowych, co doprowadziło do stabilnej integracji genomowej Cas9 i sgRNA, prowadząc do ich konstytutywnej ekspresji po edycji, co jest niepożądane. W przyszłości metoda ta może zostać ulepszona poprzez zastąpienie konstytutywnych promotorów promotorem indukowanym lekiem napędzającym ekspresję genu Cas9, takim jak system Tet-on z leczeniem doksycykliną w celu kontrolowanej ekspresji Cas9.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Uniwersytetu Zjednoczonych Emiratów Arabskich (ZEA) - grant #12M105, grant #12R167 (Zayed Center for Health Sciences), 21R105 (Zayed Bin Sultan Charitable and Humanitarian Foundation (ZCHF)) oraz ASPIRE, filar zarządzania programami technologicznymi Rady Badań nad Zaawansowanymi Technologiami w Abu Dhabi (ATRC), za pośrednictwem ASPIRE Precision Medicine Research Institute Abu Dhabi (ASPIREPMRIAD) grant numer VRI-20-10.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-MERKAPTOETANOL | Invitrogen | 31350010 | |
| > | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Technologie komórek macierzystych | 7920 | |
| bFGF Rekombinowany ludzki | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury Rabbit mAb | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel Matryca błony podstawnej, wolna od LDEV | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine Technologie | komórek macierzystych | 72074 | |
| Pożywka DMEM | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM NUTRIENT MIX F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca i Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Surowica na ciało płodu | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) Przeciwciało mAb królika | CST | 2118S | |
| Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórek | Technologie komórek macierzystych | 7174 | |
| Hyklon Aminokwasy endogenne (NEAA) 100x roztwór | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) MAb królika | CST | 9129 | |
| Zamiennik | surowicy nokautującejInvitrogen | 10828028 | |
| L GLUTAMINE, 100x | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH Przeciwciało poliklonalne | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Makrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Makrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Makrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Makrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Makrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 kompletne media | Technologie komórek macierzystych | 85850 | |
| Nanog Przeciwciało | CST | 3580 | |
| NEUROBASAL MEDIUM 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Suplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Suplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 Przeciwciało | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP Rabbit mAb | CST | 60433 | |
| PENICYLINA STREPTOMYCYNA SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G Addgene | 12259 | ||
| Odczynnik do infekcji polibrenem | Sigma | TR1003- G | |
| Polietyleninamina, rozgałęziona | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR Lentivirus Titer Kit | Abm | LV900 | |
| Inhibitor skały Y-27632 dichlorowodorek | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Przeciwciało Sox2 | CST | 2748 | |
| Sacharoza | Sigma | 57-50-1 | |
| TRYPSYNA .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNA | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
Bibliografia
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
- Zhang, Z., et al. CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects. Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).
- Qiu, Z., et al. MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome. Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).
- Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI). J Vis Exp. (183), e63953(2022).
- Guo, J., et al. A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants. Plant Methods. 14 (1), 40(2018).
- Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells. J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation. Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).
- Parween, S., et al. Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis. Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).
- Varghese, D. S., et al. Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features. Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).
- Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor. Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).
- Jacobs, E. Z., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells. Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).
- Cuevas-Ocaña, S., et al. A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells. Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).
- Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
- Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).
Przedruki i uprawnienia
