Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie białek subkomórkowych w Leptospira przy użyciu metody frakcjonowania opartej na Triton X-114

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

8 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

W tym artykule

Podsumowanie

Chociaż prokariota nie mają układu organellarnego, istnieją regiony subkomórkowe ze zlokalizowanymi białkami. Ilościowa i jakościowa analiza enzymów i białek w regionach subkomórkowych jest ważna dla opracowania celów dla leków i szczepionek. Tutaj ilustrujemy subkomórkowe frakcjonowanie białek leptospiralnych za pomocą Triton X-114 i jego analizę.

Streszczenie

Prokariota nie mają precyzyjnych organelli subkomórkowych, ale wykazują wyraźne regiony, takie jak cytoplazma, błona wewnętrzna, peryplazma i błona zewnętrzna, gdzie zorganizowana jest większość funkcji biochemicznych i fizjologicznych. W związku z tym zrozumienie cech funkcjonalnych białek wymaga wyjaśnienia ich lokalizacji subkomórkowej. Jednak ekstrakcja białek subkomórkowych z bakterii Gram-ujemnych stanowi wyzwanie ze względu na ich złożoną dwuwarstwę fosfolipidową. Chociaż Triton X-114 okazał się obiecujący w ekstrakcji białka błony zewnętrznej (OMP), zwięzły protokół pozostaje nieuchwytny. Protokół ten demonstruje krok po kroku proces ekstrakcji białek subkomórkowych przy użyciu krętka Leptospira jako modelu. Ta technika, obejmująca frakcjonowanie subkomórkowe i separację faz, daje wyraźne frakcje dla białek błony cytoplazmatycznej, zewnętrznej i wewnętrznej. Detergent Triton X-114 doskonale nadaje się do separacji faz ze względu na optymalną temperaturę punktu zmętnienia (~22 °C) i niskie krytyczne stężenie miceli (CMC), co umożliwia wydajną ekstrakcję i oczyszczanie natywnych białek przy minimalnej denaturacji. Warto zauważyć, że analiza ujawnia skuteczność w rozróżnianiu białek z błony wewnętrznej i zewnętrznej oddzielonych od cytoplazmy.

Wprowadzenie

Analizy proteomiki subkomórkowej (SCP) odgrywają kluczową rolę w wyjaśnianiu patogenezy bakterii poprzez analizę proteomu w określonych subkomórkowych przedziałach komórek bakteryjnych. To subkomórkowe podejście proteomiczne charakteryzuje białka bakteryjne w odrębnych przedziałach, zmniejszając złożoność poprzez wykluczenie bardzo obfitych białek i zapewnienie wglądu w ich organizację i proporcjonalną liczebność 1,2. Na przykład, wykorzystując frakcjonowanie subkomórkowe i techniki LC-MS/MS, badanie Shewanella oneidensis ujawniło znaczną część jej proteomu, dostarczając kluczowych szczegółów dotyczących architektury kompartmentów w obfitości komórek i białek. Badanie to służy jako podstawa dla dalszych badań nad organizacją subkomórkową w obrębie bakterii Gram-ujemnych3. W dziedzinie patogenezy bakteryjnej wyznaczenie proteomu bakteryjnego podczas infekcji in vivo jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów kierujących patogennością4. Badanie proteomu wewnątrzkomórkowej Salmonelli w komórkach nabłonka na różnych etapach infekcji odegrało zasadniczą rolę w odkryciu strategii adaptacyjnych stosowanych przez patogeny bakteryjne w ich środowisku wewnątrzkomórkowym 4,5. Strategie SCP zapewniają kompleksowy wgląd w dynamikę komórkową poprzez ocenę obfitości białek i translokacji w różnych przedziałach komórkowych. Metoda ta ułatwia obszerną identyfikację białek z różnych przedziałów bakteryjnych, usprawniając dokładną analizę proteomów bakteryjnych 6,7.

Subkomórkowa dystrybucja białek nie tylko dyktuje ich aktywność funkcjonalną, ale także zwiększa ich różnorodność funkcjonalną8. Na przykład enzymy wykazują różne mechanizmy regulacyjne i poziomy aktywności w zależności od ich lokalizacji subkomórkowej. Na przykład transglutaminazy (TGazy) wykazują odrębne role lub mechanizmy regulacyjne w różnych subkomórkowych przedziałach w łagiewkach pyłkowych: cytoplazmatyczne TGazy włączają pierwszorzędowe aminy do białek cytozolowych (np. aktyny i tubuliny) w sposób zależny od Ca(2+), oddziałując z cytoszkieletem; TGazy błonowe są związane z błonami Golgiego i plazmatycznymi, co sugeruje rolę w dostarczaniu egzocytotycznym; a TGazy związane ze ścianą komórkową regulują wzrost wierzchołkowy poprzez kolokalizację z markerami ściany komórkowej. Te funkcjonalne rozróżnienia są zapośredniczone przez role specyficzne dla przedziału9. Co więcej, naprawa utlenionych białek w otoczce bakteryjnej podkreśla krytyczną rolę systemów enzymatycznych w określonych przedziałach komórkowych narażonych na działanie reaktywnych form tlenu10. Weźmy pod uwagę śródbłonkową syntazę tlenku azotu (eNOS), której lokalizacja subkomórkowa jest modulowana przez modyfikacje lipidów, wpływając na jej interakcję z różnymi błonami komórkowymi11. Podział na przedziały enzymatyczne utrzymuje odrębne środowiska sprzyjające interakcjom między enzymami i substratami, ułatwiając w ten sposób procesy metaboliczne specyficzne dla przedziałów12.

Bakterie i inne prokariota nie mają wyraźnych organelli subkomórkowych; Istnieją odrębne regiony, w tym cytoplazma, błona wewnętrzna, peryplazma i błona zewnętrzna. Większość funkcji biochemicznych i fizjologicznych w organizmie jest zorganizowana w różnych przedziałach podpiwnicznych13. Tak więc subkomórkowa lokalizacja białek jest ważna do przewidywania ich cech funkcjonalnych. Jednak ekstrakcja białek subkomórkowych z bakterii Gram-ujemnych stanowi wyzwanie ze względu na ich złożoną, podwójnie błoniastą warstwę fosfolipidową. Konwencjonalne metody ekstrakcji, wykorzystujące detergenty, takie jak dodecylosiarczan sodu (SDS) i dodatki, takie jak mocznik, często naruszają integralność białek błonowych, wpływając na dalsze analizy14,15. Ponadto skład lipidowy odgrywa znaczącą rolę w kształtowaniu zmian konformacyjnych białek błonowych. Powodzenie solubilizacji zależy od takich czynników, jak stosunek detergentu do lipidów i białek, ponieważ proces ten obejmuje wprowadzenie detergentu do dwuwarstwy lipidowej, a następnie solubilizację białka16. Wybór detergentu ma kluczowe znaczenie dla skutecznego rozpuszczania białek błonowych, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak temperatura punktu zmętnienia i czas inkubacji17. Środowisko lipidowe może wpływać na zmiany konformacyjne białek błonowych18,19.

Detergenty są niezbędne do ekstrakcji białek błonowych z błon biologicznych i zapewnienia ich rozpuszczalności w roztworach wodnych, co jest warunkiem wstępnym późniejszego oczyszczania białek. Jednak oczyszczanie białek błonowych jest często trudne, ponieważ są one usuwane z ich natywnego środowiska błony lipidowej i umieszczane w buforze detergentu, który tylko częściowo odtwarza właściwości fizyczne i chemiczne błony20. Po ekstrakcji białka błonowe są zwykle oczyszczane w kolejnych procesach przy użyciu dializy, wytrącania białek i niektórych metod chromatograficznych jako białka rozpuszczalne 20,21. Separacja faz stanowi potężną alternatywę lub uzupełnienie protokołów oczyszczania opartych na chromatografii i może być stosowana bezpośrednio do rozpuszczonych białek. Zasadniczo, separacja faz umożliwia integralnym białkom błonowym podział na fazę wzbogacającą detergent i białka cytozolowe w fazie wodnej zubożonej w detergent20,22. Kilka detergentów zostało opisanych jako stosowane w solubilizacji białek błonowych we wcześniejszych badaniach20. Należą do nich rodzina Triton (Triton X-100 i Triton X-114), rodzina Tween (Tween-20 i -80), detergenty anionowe, detergenty kationowe, detergenty z monoeterem glikolu polioksyetylenowegoitp., ale mają one swoje wady i zalety pod względem struktury i funkcji białek. Właściwości fizykochemiczne tych detergentów mają duży wpływ na podział faz i solubilizację białek błonowych20. Detergenty to amfipatyczne cząsteczki z polarną grupą główną i hydrofobowym łańcuchem węglowodorowym. W niskich stężeniach występują jako monomery w wodzie. Powyżej krytycznego stężenia miceli (CMC) tworzą micele, których wielkość zależy od rodzaju detergentu, przy czym liczba agregacji wskazuje liczbę cząsteczek na miceli (zwaną również masą cząsteczkową miceli). Innym ważnym czynnikiem jest "punkt zmętnienia", który można osiągnąć, zmieniając temperaturę wodnego roztworu płynu do micelarnego detergentu, który staje się mętny i ostatecznie tworzy dwie odrębne fazy. Proces ten jest znany jako separacja faz lub ekstrakcja punktu zmętnienia. Wysoki CMC może dać więcej białek błonowych odpowiadających wysokim stężeniom detergentu o słabszym wiązaniu, które mogą być dializowane z buforem o określonym stężeniu detergentu20. Jednak osiągnięcie wysokiego CMC w większości detergentów wymaga wysokiej temperatury punktu zmętnienia, co może wpływać na strukturę i funkcję ekstrahowanego białka oraz wpływać na dalsze procesy. Nawet wysokie stężenie detergentu w tej fazie może być szkodliwe dla białka i powodować problemy w obchodzeniu się z płynami w celu precyzyjnego pipetowania ze względu na wysoką lepkość. Na przykład triton X-100 charakteryzuje się wysoką wydajnością białek błonowych w miceli detergentu powyżej temperatury punktu zmętnienia wynoszącej 64-65 °C. Aby utrzymać temperaturę roboczą, dodatek 9%-23% (NH4)2SO4 lub 16%-25% NaCl można zmniejszyć do temperatury pokojowej (RT), co skutkuje wysokim stężeniem detergentu, co prawdopodobnie wpływa na stabilność białka. Podobnie ekstrakcja oparta na Tween wykorzystuje wysoką temperaturę punktu zmętnienia (76 °C dla animacji 20 i 93 °C dla animacji 80). Anionowy detergent SDS jest często stosowany w zastosowaniach białkowych, ale zwykle denaturuje białka20. Naukowcy, dążąc do efektywnej ekstrakcji białek błonowych, zidentyfikowali Triton X-114 jako klasyczny detergent ze względu na optymalną temperaturę punktu zmętnienia wynoszącą około 22 °C, idealną do badań białek błonowych. Po raz pierwszy wprowadzony przez Bordiera w 1981 roku, Triton X-114 jest od tego czasu szeroko stosowany do ekstrakcji i oczyszczania białek błonowych z różnych źródeł, w tym tkanek zwierzęcych i roślinnych, a także mikroorganizmów20,22. Niski CMC Tritona X-114 zapobiega jego usunięciu przez dializę; Jednak jego łagodny charakter minimalizuje denaturację białek błonowych w fazie wzbogaconej detergentem. Dodatkowo Triton X-114 tworzy mniejsze micele (n = 7-8) w porównaniu do Triton X-10020. W protokole badawczym Jamesa G. Pryde'a wykorzystano Triton X-114 do ekstrakcji białek błonowych z hodowanych komórek ssaków. Stosując temperaturę punktu zmętnienia powyżej 20 °C (inkubacja w temperaturze 30 °C przez 3 minuty), integralne białka błonowe podzieliły się na fazę wzbogaconą detergentem, podczas gdy białka obwodowe i cytozolowe zostały odzyskane z fazy wodnej22 zubożonej w detergent. Ponadto David A. Haake i in. użyli Triton X-114 do ekstrakcji białek błony zewnętrznej (OMP) z Leptospira interrogans, z CaCl2 i bez niego jako dodatku23,24. Późniejsze badania potwierdziły, że Triton X-114 skutecznie ekstrahuje OMP z przedziałów subkomórkowych bez dodatków takich jak glicerol lub CaCl225,26. Jednak włączenie soli może zwiększyć stężenie detergentu, co może wpłynąć na badania proteomu na dużą skalę przy użyciu wysokoprzepustowej spektrometrii mas20. W naszej pracy nad analizą proteomu subkomórkowego zastosowaliśmy Triton X-114 sprzężony z tandemową spektrometrią mas, osiągając znaczne wzbogacenie we wszystkich przedziałach subkomórkowych, w tym białkach cytoplazmatycznych, błony wewnętrznej i błony zewnętrznej25,26. Głównym celem niniejszego protokołu jest skuteczne wzbogacenie subkomórkowych przedziałów typowej komórki bakteryjnej Gram-ujemnej przy jednoczesnej minimalizacji problemów w dalszych procesach. Ponadto protokół został zaprojektowany tak, aby był opłacalny i oszczędzał czas. W tym miejscu omawiamy opracowany przez laboratorium zoptymalizowany protokół izolacji białek subkomórkowych i omawiamy każde wąskie gardło napotkane podczas procesu ekstrakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje Leptospira interrogans do eksperymentu ekstrakcji białek subkomórkowych. Chociaż protokół ten można dostosować do stosowania z innymi bakteriami Gram-ujemnymi, w zależności od konkretnych celów badawczych może być konieczna optymalizacja. Tabela materiałów i tabela 1 zawierają wykaz substancji chemicznych i sprzętu wraz ze składem odpowiednio i roztworów odczynników, podczas gdy tabela 2 przedstawia obiekty laboratoryjne.

1. Szczep Leptospira i warunki hodowli

  1. Otrzymać serogrupę L. interrogans Icterohaemorrhagiae serowar Copenhageni szczep Fiocruz L1-130.
    UWAGA: Szczep ten został uzyskany z Indyjskiej Rady Badań Medycznych - Regionalnego Centrum Badań Medycznych w Port Blair w Indiach, centrum współpracującego z WHO specjalizującego się w diagnostyce, odniesieniach, badaniach i szkoleniach leptospirozy.
  2. Hoduj Leptospira (inokulum zawierające ~1 × 106 komórek/ml) w 50 ml pożywki Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) uzupełnionej 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C do momentu, gdy kultura osiągnie środkową fazę wzrostu (3,5 ×10,8 komórek/ml). Przetestuj podwielokrotności pożywki na płytkach agarowych z pożywką, aby upewnić się, że podłoże pozostaje nieskażone.
    UWAGA: Wykorzystaj mikroskopię ciemnego pola i komorę liczącą Petroffa-Haussera do policzenia komórek. Szczegółowe informacje można znaleźć w wcześniej opublikowanym artykule27.

2. Pobieranie komórek

  1. Po 7-dniowym okresie inkubacji przenieść trzy powtórzenia biologiczne kultury L. interrogans do probówek wirówkowych w równych objętościach (po 25 ml każdy).
    UWAGA: Podczas transferu posiew Leptospira obchodzono się w okapie z laminarnym przepływem powietrza w laboratorium BSL-2.
  2. Odwirować wszystkie probówki o stężeniu 2500 × g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zdekantować supernatant do zlewki zawierającej środek dezynfekujący i wyrzucić go. Użyj granulki komórkowej do następnego kroku.
  3. Przepłukać granulki komórek trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (za każdym razem 1 ml) uzupełnionym 5 mM MgCl2, odwirowując przy 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C po każdym płukaniu.
    UWAGA: Ten krok usunie niepożądane BSA obecne w pożywce EMJH z powierzchni osadu komórkowego.

3. Ekstrakcja białek subkomórkowych

  1. Ekstrakcja Triton X-114
    1. Osad komórkowy Leptospira , otrzymany po zbiorze, należy potraktować buforem ekstrakcyjnym zawierającym 10 mM Tris-Cl (pH 8), 1% Triton X-114 i 150 mM NaCl w ilości 1 ml na zebraną osadę (Tabela 1) (opcjonalnie -koktajl inhibitorów proteazy można dodać zgodnie z celem eksperymentalnym).
      UWAGA: Procedura polega po prostu na wystawieniu bakterii na działanie roztworu detergentu poprzez dodanie buforu ekstrakcyjnego w celu ekstrakcji białek błonowych.
    2. Delikatnie wymieszać bufor ekstrakcyjny z osadem za pomocą mikropipety o temperaturze poniżej 25 °C, aż roztwór stanie się wizualnie mętny.
    3. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C.
    4. Otrzymany ekstrakt należy ponownie wymieszać za pomocą mikropipety i odwirować w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zdekantować supernatant do innej fiolki i zachować osad komórkowy do kolejnych procesów ekstrakcji.
      UWAGA: Ten supernatant zawiera mieszaninę białek hydrofilowych i hydrofobowych obficie pochodzących z cytoplazmy i błony zewnętrznej i jest używany do separacji faz.
    6. Dodać 50 μl buforu zawierającego 10 mM Tris-Cl (pH 8), 8 M mocznika, koktajl inhibitorów proteazy i 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) do osadu komórkowego.
    7. Mieszać mieszaninę w sposób ciągły przez 5 minut po dodaniu buforu ekstrakcyjnego, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 minut.
    8. Ponownie odwirować mieszaninę w temperaturze 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i oznaczyć otrzymany supernatant jako frakcję osadu (P).
      UWAGA: Stwierdzono, że frakcja osadu zawiera dużą ilość białek błony wewnętrznej w Leptospira25,26.
  2. Partycja fazowa
    1. Dostosować stężenie Triton X-114 w supernatantze otrzymanym z ekstrakcji do 2%. Na przykład, jeśli objętość supernatantu wynosi 900 μl, dodaj 9 μl detergentu Triton X-114, aby osiągnąć pożądane stężenie.
    2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, następnie odwirować w temperaturze 2000 × g przez 5 minut w temperaturze 30 °C. To wirowanie z niską prędkością może przyspieszyć separację faz.
    3. Pozwól, aby mieszanina rozdzieliła się na dwie odrębne fazy: wodną i detergentową. Zapewnij prawidłowe wirowanie przy niskiej prędkości, aby uzyskać widoczną separację. W razie potrzeby pozostaw go na 1 minutę przed izolacją. Jeżeli separacja nie nastąpi, w razie potrzeby powtórzyć krok 3.2.2.
      UWAGA: Separację faz można obserwować wizualnie, poprzez pomiary zmętnienia za pomocą spektrofotometru lub poprzez statyczne rozpraszanie światła. Aby zwiększyć dokładność testu punktu zmętnienia, dodaj do roztworu barwnik hydrofobowy (5-heksadekanyloaminoeozynę) o stężeniu 500 nM i przeanalizuj go za pomocą spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej (UV-VIS).
    4. Wyizolować górną fazę wodną, przekłuwając granicę jałową strzykawką i przenosząc ją do oddzielnej fiolki. Odizolować dolną fazę detergentu za pomocą mikropipety i przechowywać ją w osobnej fiolce.
      UWAGA: Podczas procesu rozdzielania należy ostrożnie obchodzić się z fiolką zawierającą obie fazy. Przed przekłuciem fiolki strzykawką należy otworzyć jej pokrywkę, aby zapobiec złamaniu igły lub trudnościom w ekstrakcji górnej fazy wodnej. Użycie strzykawki zapewnia dokładniejszy pomiar objętości każdej fazy po rozdzieleniu i minimalizuje zanieczyszczenie krzyżowe białek między fazami.
    5. Oznacz fazy jako wodne (A) i detergentowe (D) i przechowuj je w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.

4. Ocena białka

  1. Ocenić stężenia białka w każdej frakcji Triton X-114 (w postaci wodnej, detergentu i granulatu) za pomocą testu bicynchoninowego28 lub innych odpowiednich metod.

5. Elektroforeza w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) elektroforeza w żelu

UWAGA: Białka z każdej frakcji (wodnej, detergentowej, osadu) muszą być poddane działaniu beta-merkaptoetanolu w celu ich redukcji, a następnie oddzielone za pomocą 10% SDS-PAGE (trzy kontrpróby biologiczne). Przepis na 10% SDS-PAGE można znaleźć w Tabeli 1. W przypadku celowania w próbkę białka wszelkie analizy aktywności enzymatycznej muszą być wykonane w formie natywnej, którą można rozwiązać w natywnym PAGE.

  1. Zawiesić próbkę białka w lodowatym acetonie, używając czterokrotności objętości próbki. Inkubować mieszaninę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny, a następnie odwirować w temperaturze 14 000 × g przez 10 minut. Dodatkowo ponownie zawiesić frakcję osadu w 80% lodowatym acetonie, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wirować przy 14 000 × g przez 10 minut w celu usunięcia nadmiaru kryształów soli mocznika.
  2. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć sklarowany osad i umieścić osad białka w suchej kąpieli, aż wszystkie pozostałości acetonu odparują z fiolek.
  3. Próbki białek inkubować w 20 μl buforze zawierającym beta-merkaptoetanol, a następnie ogrzewać je w temperaturze 95 °C przez 10 minut w łaźni wodnej lub suchej.
    UWAGA: Tutaj próbki białek reprezentują frakcję wodną (A) zawierającą białka cytoplazmatyczne, frakcję detergentu (D) zawierającą białka błony zewnętrznej oraz frakcję granulek (P) zawierającą białka błony wewnętrznej.
  4. Załaduj próbki zawierające A, D i P do każdej studzienki 10% żelu SDS-PAGE wraz ze wstępnie wybarwionym markerem białkowym (M) i białkiem całkowitym (T).
    UWAGA: Białko całkowite można przygotować, zbierając wszystkie trzy frakcje razem do jednej fiolki przy użyciu 20 μl buforu do próbki.
  5. Użyj 1x bufor elektrod w aparacie do elektroforezy (Tabela 1). Ustaw parametry pracy żelu na 6 mA dla żelu układającego się w stos i 12 mA dla żelu rozdzielczego. Uruchom elektroforezę w temperaturze pokojowej.
  6. Zabarwić żel barwnikiem Coomassie Brilliant Blue G lub innymi barwnikami białkowymi dostępnymi w laboratorium.

6. Immunoblotting

  1. Po rozdzieleniu żelu inkubować niezabarwiony żel w buforze transferowym (25 mM zasada Tris, 190 mM glicyna, 20% metanolu) przez 5 minut.
  2. Inkubuj bibułki o odpowiedniej wielkości w buforze do przenoszenia immunoblot przez 5 minut, a następnie złóż je jako dolną warstwę kanapki.
  3. Wykorzystaj membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) lub membrany nitrocelulozowe do przenoszenia białek z niebarwionych żeli. Rozpocznij od zanurzenia membrany PVDF w absolutnym metanolu na 30 s, a następnie zanurz się w 5-minutowym buforze transferowym immunoblot. Następnie zintegruj go z kanapką bibułkową.
  4. Teraz umieść niezabarwiony żel, który został usunięty z bufora transferowego i użyj go w kanapce do bibuły transferowej.
  5. Na koniec przykryj kanapkę, kładąc ją na innej bibule, uwolnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza za pomocą wałka do bibuły i uruchom transfer metodą transferu półsuchego.
    UWAGA: Inne podejścia, w tym transfer na sucho i na mokro, mogą być stosowane w zależności od wyposażenia laboratorium.
  6. Zanurzyć błonę w buforze blokującym (8% beztłuszczowego mleka w TBS-0,1% Tween 20 [TBS-T]) na 2 godziny, a następnie przez noc inkubować w temperaturze 4 °C z monospecyficznymi surowicami odpornościowymi* ukierunkowanymi na lipoproteinę Leptospira LipL41 (1:5000) lub białko rdzeniowe z włókna wiciowego 35 kDa (FlaB) (1:4000) (*przeciwciało niestandardowe). Przepłukać membranę trzykrotnie za pomocą TBS-T, pozwalając, aby każde płukanie trwało 5 minut.
    UWAGA: Użyj dowolnego przeciwciała, które Cię interesuje. Współczynnik rozcieńczenia przeciwciał może się różnić.
  7. Inkubować błonę z mysim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi sprzężonemu z IgG peroksydazy chrzanowej (HRP) (rozcieńczenie 1:20000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  8. Wystaw membranę na działanie odczynnika elektrochemiluminescencyjnego (ECL), aby uwidocznić prążki białkowe.
  9. Umieść membranę pod niebieskoczułą kliszą rentgenowską w ciemnym pomieszczeniu.
    UWAGA: Można również zastosować wszelkie inne metody opracowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym doświadczeniu wykorzystaliśmy krętkowca Leptospira jako organizm modelowy do ekstrakcji frakcji subkomórkowych. Zastosowaliśmy strategiczną metodologię opartą na punkcie zmętnienia oraz krytycznym stężeniu micelarnym (CMC), wykorzystując skuteczność Triton X-114, detergentu niejonowego (Rycina 1). Przed dalszą procedurą przeprowadzono oznaczanie białek w celu oceny stężenia w każdej frakcji dla pojedynczego powtórzenia biologicznego. Zaobserwowano stosunek stężeń 3:1:1,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Techniki frakcjonowania subkomórkowego odgrywają kluczową rolę w izolacji dyskretnych składników komórkowych do późniejszej analizy. Triton X-114, niejonowy detergent, jest powszechnie stosowany w tych technikach ze względu na jego zdolność do dzielenia próbek na odrębne fazy, co pozwala na oddzielenie różnych składników komórkowych32. Triton X-114 okazał się szczególnie przydatny w ekstrakcji białek błonowych (w formie natywnej) z różnych źródeł, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu, błon ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczyli, że nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy wyrażają szczerą wdzięczność Indyjskiej Radzie Badań Medycznych w New Delhi w Indiach za wsparcie finansowe udzielone w ramach grantu nr 1. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 oraz Departamentowi Nauki i Technologii, Radzie Badawczej ds. Nauki i Inżynierii, New Delhi, Indie, za wsparcie finansowe w postaci grantu nr SR/SO/HS/0108/2012 do M.G.M. Ponadto autorzy wyrażają swoje uznanie dla Indyjskiej Rady Badań Medycznych w New Delhi w Indiach za przyznanie stypendium Senior Research Fellowship w ramach grantu nr 1. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 odpowiednio dla HP, AS i AS oraz Department of Science and Technology, Science and Engineering Research Board, New Delhi, Indie, nr grantu. PDF/2017/000343 do S.A.D.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowy  Sigma  695092
Aceton    Sigma  32201
Akrylamid    Sigma  A-3553
Nadsiarczan amonu    Sigma  A-3678
Saldo  SHIMADUZ (SHIMADUZ)  Z741079
Bis Akrylamid    Sigma  Zobacz materiał M7279
Surowica bydlęca frakcja albuminy V (BSA)  Sigma  A-8022 powiedział:
Błękit bromofenolowy    Sigma  B-8026
Probówka wirówkowa (50 ml)Tarsonowie500020
Kolba stożkowa z nakrętką (150 mL)Tarsonowie431030
Wirówka chłodząca  Eppendorf powiedział:  5355316200
Coomassie brylantowy niebieski    Sigma1.12553
Mikroskop ciemnego pola  ZEISS  GmbH37081 powiedział:
Delikatne chusteczki do zadańNauka Kimtech34155
Sucha kąpiel  Eppendorf powiedział:  535531620
Ellinghausen– McCullough– Johnson– Harris (EMJH) średnie, Difco  Firma Difco  279410
Tacki żelowe: Tacki żelowe muszą mieć co najmniej 2 cm szersze wymiary i mieć gładką i płaską powierzchnię z pokrywką.  Hoefer powiedział:  Nie dotyczy
Szklany dziób (150 mL)Tarsonowie421030
Glicyna G8790    Sigma  G-8898 powiedział:
Bibuła filtracyjna Immobilon BlottingMiliporyIBFP0813C
Półsuchy zestaw Immunoblot  ATTA  AE-6675 powiedział:
Inkubator - Do inkubacji tacek żelowych przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.  OKO  SLI-700
Laminarny przepływ powietrza  Nie dotyczy  Nie dotyczy
Luminol (Luminol)  Sigma  09253
Chlorek magnezu M8266  Sigma  Zobacz materiał M8266
Mieszadło magnetyczne  TARSONOWIE  6040
Metanol    Sigma  17995-7
Końcówki do mikropipet (10 i mikro; L– 10 ml)Axygen (Axigen)T-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
Mikropipety  Eppendorf powiedział:  EP2231300010
Mikroprobówki (1,5 ml Safe-Lock)Eppendorf powiedział:EP022363212
Mini wirowanie  Genaxy (Dyrekcja Generalna)  GENERACJA-MINI-6K
Czytnik wielomodowyBMG LABTECH  Nr kat. 413-3877
Mleko beztłuszczowe w proszku bydlęceSigma-AldrichZobacz materiał M7409 TGL
Kwas p-kumarowy    Sigma  Zobacz materiał C9008
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami    SigmaP4417 
Lodówka  LG  GC-B217BLJ2
Rocker - Wytrząsarka wahadłowa lub obrotowa o niskiej prędkości do barwienia żelu.  TARSONOWIE  4080
SDS-PAGE SETUP- Aparatura do elektroforezy  Hoefer, Inc.  Zobacz materiał SE300-10A-1.0  Model Hoefera ' miniVE' który może odlewać żel o wymiarach 10 cm x 8 cm i grubości 1 mm.
Chlorek sodu      Sigma  5886
Dodecylosiarczan sodu (SDS)    Sigma  L-4396
TEMED    Sigma  T-9281 powiedział:
Tryton X-114    Sigma648468
Podstawa Trizma (TRIS) T6066    Sigma  Zobacz materiał T6066
Wir  TARSONOWIE  3020

Bibliografia

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

frakcjonowanie subkom rkoweekstrakcja Tritonem X 114bia ka Leptospirabia ka b ony zewn trznejbia ka b ony wewn trznejrozdzia fazlokalizacja bia ekSDS PAGEimmunoblottingspektrometria mas
Wzbogacanie białek subkomórkowych w Leptospira przy użyciu metody frakcjonowania opartej na Triton X-114
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.