Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Korzenie przybyszowe topoli indukowane przez patogeny raka łodygi: eksperymentalny system do badania biologii korzeni i procesów związanych z reakcją na światło

751 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67304

⸱

11 października 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Beijing Haidian Kaiwen Academy High School, 4State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół indukowania produkcji korzeni przybyszowych (AR) poprzez szlak inokulacji patogenów grzybów łyka lub naskórka, który jest odpowiedni do badania biologii korzeni i procesów fizjologicznych związanych z reakcją na światło w topoli.

Streszczenie

Valsa sordida i Botryosphaeria dothidea to dwa kluczowe nekrotroficzne patogeny grzybowe, które uszkadzają wielu gospodarzy roślinnych, zwłaszcza gatunki z rodzaju Populus. Te dwa patogeny grzybowe występują głównie w gałęziach, łodygach i gałązkach topoli, powodując klasyczne objawy, takie jak zmiany rakowe, zamieranie baldachimu i więdnięcie. Inokulacja patogenów jest najskuteczniejszą ścieżką badania mechanizmu chorób roślin. Oprócz zmian rakowych wokół miejsc inokulacji na łodygach, u gatunków topoli po inokulacji patogenem raka łodygi zaobserwowano nowe zjawisko rozwojowe, obfite korzenie przybyszowe (AR) o jaskrawoczerwonym kolorze. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę indukowania AR za pomocą patogenów grzybowych u topoli. Kluczowym etapem tej metody jest inokulacja patogenu po manipulacji opasaniem (łyka lub naskórka). Drugim kluczowym krokiem jest aplikacja materiału nawilżającego. W porównaniu z manipulacją nawilżającą za pomocą Parafilm, owijanie zaszczepionych miejsc folią z polietylenu domowego (PE) może wytworzyć kolorowe, liczne i mocne AR w ciągu 20 dni po zaszczepieniu. Wreszcie, białe AR wyrosły z zaszczepionych pierścieni w łodygach topoli po zabiegu cieniowania (owinięciu łodyg folią aluminiową). Metoda ta wprowadza nowatorski eksperymentalny system do badania rozwoju i morfogenezy korzeni, który ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii rozwoju korzeni, morfogenezy i odpowiedzi na stres chorobowy. Co więcej, w połączeniu z leczeniem cieniowania, badanie to może zapewnić wygodny system eksperymentalny do badania procesów związanych z reakcją na światło, na przykład biosyntezy flawonoidów, antocyjanów lub innych pokrewnych metabolitów oraz genów lub czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w te procesy.

Wprowadzenie

Choroby raka łodyg topoli wywoływane przez nekrotroficzne patogeny grzybowe, Valsa sordida i Botryosphaeria dothidea, to dwie kluczowe choroby drzew w północnych Chinach, które poważnie zaszkodziły rozwojowi ekologicznych i ekonomicznych plantacji gatunków topoli. Choroby raka topoli zawsze występują na korze pni i gałęzi, natomiast zmiany rakowe są ich typowymi objawami. Po wystąpieniu chorób rozszerzające się zmiany rakowe stopniowo uszkadzały łyko, kambium i ksylem gospodarzy. Ponadto wpływały one na transport przyswajanych produktów i wody przez układ naczyniowy. Jednak sposób, w jaki patogeny rakowe utrudniają transport łyka i ksylemu, pozostaje niejasny.

Aby ujawnić mechanizmy transportu węglowodanów i wody w topolach zakażonych patogenami rakowymi, zaproponowaliśmy metody inokulacji łyka lub epidermyopasającej 1,2, które łączyły klasyczną manipulację pasem ogrodowym i metodę inokulacji patogenów (inokulacja zranień bloku grzybni). Metody te mogą symulować proces porażenia i zablokowania wody i węglowodanów wywołanego przez patogeny rakowe.

Nasze badania wykazały, że patogeny grzybowe powodowały zamieranie koron topoli, początkowo wywołując głód węgla, a nie awarię hydrauliczną 1,3,4,5. Co zaskakujące, zaobserwowaliśmy szczególną ryzogenezę na łodygach topoli, która była związana z inokulacją patogenów raka łodygi: obfite czerwone korzenie przybyszowe (AR) wyrastają z dolnego końca górnych łodyg (naprzeciwko górnej krawędzi łyka lub pierścieni opasujących naskórek). Co więcej, nasze eksperymenty wykazały, że produkcja AR jest uniwersalna w interakcji patogenu topola z rakiem. Mogą być wytwarzane z różnych gatunków topoli lub klonów w różnym wieku (1-, 2-, a nawet 6-letni) i mogą być wywoływane przez różne patogeny rakowe (V. sordida i B. dothidea) lub ich izolaty. Ponadto zbadaliśmy mechanizmy kolorystyczne AR topoli, a wyniki wykazały, że jest ona związana z biosyntezą flawonoidów i antocyjanów, a także regulacją ekspresji genów związanych ze światłem (lub modułów genowych) w warunkach oświetleniowych6. Dlatego te AR topoli indukowane przez patogeny mogą być wykorzystywane jako stabilny i idealny system eksperymentalny do badania interakcji roślina-patogen, biologii korzeni oraz funkcji i ekspresji genów związanych ze światłem.

W tym badaniu przedstawimy i dostarczymy protokół ustanowienia eksperymentalnego systemu AR topoli poprzez opasującą ścieżkę inokulacji; ponadto wskazujemy na kluczowe czynniki, które wpływają na powstawanie AR i wyjaśniamy potencjalne zastosowanie inokulacji opasającej w badaniach biologii korzeni topoli i innych procesów fizjologicznych związanych z reakcją na światło.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Indukcja AR topoli poprzez inokulację opasającą

  1. Kultura patogenu raka grzyba
    1. Rozpuść 6 g ekstraktu ziemniaczanego, 20 g dekstrozy i 20 g agaru w 1000 ml wody, aby przygotować podłoże z agarem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA). Sterylizować pożywkę w temperaturze 121,1 °C przez 30 minut i wlać pożywkę do szalek Petriego (o średnicy 9 cm), z których każda zawiera około 20 ml pożywki PDA.
    2. Zaszczepić aktywowaną kostkę grzybni grzybów (~0,5 cm) w środku szalki Petriego PDA.
    3. Inkubować zaszczepione płytki PDA w ciemności w temperaturze 28 °C przez 7-10 dni.
    4. Pokrój inkubowane podłoże PDA z grzybnią w paski (1,2 cm szerokości; około 3-6 cm długości).
  2. Przygotowanie materiałów topolowych
    1. Wybierz 1-2 letnie, silnie rosnące sadzonki topoli.
    2. Wybierz dojrzałe łodygi/gałęzie z sadzonek topoli (o średnicy 1-2 cm, wolne od chorób i inwazji szkodników).
    3. Umyć obszary inokulacji (około 30 cm wysokości nad ziemią lub podstawą gałęzi) łodyg/gałęzi topoli; Wysterylizuj łodygi/gałęzie 75% roztworem alkoholu.
  3. Indukcja AR poprzez inokulację łykiem
    1. Ostrożnie opasać naskórek i łyko wysterylizowanych łodyg/gałęzi topoli, usunąć opasane pierścienie łyka (o szerokości 1 cm, w tym częściowe kambium) i odsłonić białe, wewnętrzne tkanki kambium/ksylemu.
      UWAGA: Kroki 1.3.2-1.3.4 szczegółowo opisują alternatywne metody inokulacji.
    2. Całkowicie przykryj obszar opasywania paskami grzybni (1,2 cm szerokości) jako zabieg inokulacji baldemu opasanego (GP). Strzępki grzybów są zwrócone w stronę odsłoniętego ksylemu.
    3. Zeskrob i uszkodzić odsłoniętą wewnętrzną tkankę kambium za pomocą wysterylizowanych noży, a następnie zaszczepij paski PDA (1,2 cm szerokości) na obszarach opasywania jako zabieg usuwania kambium opasującego (GR).
    4. Zaszczepij obszary opasania bezpośrednio za pomocą niehodowanych pasków PDA (1,2 cm szerokości) jako kontroli opasania (GC).
    5. Owiń zaszczepione łodygi/gałęzie rozciągliwą, bezbarwną i przezroczystą taśmą do szczepienia (lub folią z tworzywa sztucznego PE). Owiń 4 warstwy, aby zatrzymać wilgoć w środku.
    6. Zaszczepone łodygi/gałęzie zwiąż patyczkami (metalowymi, plastikowymi lub zdrewniałymi) (powyżej 50 cm), aby nie chroniły przed wiatrem.
    7. Podczas eksperymentu uprawiaj opasane materiały topolowe z regularnym nawadnianiem.
    8. Obserwuj z zewnątrz i rejestruj powstawanie topoli AR 14-30 dni po inokulacji.
  4. Indukcja AR poprzez opasanie naskórka-inokulację
    1. Wybierz i przygotuj zaszczepiony materiał zgodnie z opisem w kroku 1.2.
    2. Ostrożnie opasać naskórek łodyg/gałęzi topoli.
    3. Usuń pierścienie naskórka (1,0 cm szerokości) i odsłoń zieloną tkankę łyka.
    4. Lekko i pionowo zeskrob tkankę łyka cztery razy i odsłoń wewnętrzną strukturę łyka.
    5. Zaszczep opasany obszar naskórka grzybnią (eGP) i paskami PDA (eGC). Wykonaj czynności związane z zaszczepianiem podobne do kroków 1.3.2-1.3.4.
    6. Owinąć zaszczepione łodygi taśmą do szczepienia (lub folią z tworzywa sztucznego PE) zgodnie z opisem w kroku 1.3.5.
    7. Zarządzaj topolami i obserwuj AR zgodnie z opisem w krokach 1.3.6-1.3.8.

2. Stworzenie eksperymentalnego systemu do badań genów związanych ze światłem metodą inokulacji opasającej

  1. Indukować cz.d.a. topoli za pomocą metody inokulacji opasanej łykiem (kroki 1.3.2-1.3.4).
  2. Alternatywnie, indukować AR topoli za pomocą metody inokulacji opasywania naskórka, jak opisano w kroku 1.4.5.
  3. Owinąć zaszczepione patogenami obszary łodyg/gałęzi topoli (15 cm wysokości) folią aluminiową (zabieg zacieniający, S) lub bez folii aluminiowej (obróbka światłem, L).
  4. Przywiąż łodygi/gałęzie do patyków o długości >50 cm, aby chronić je przed wiatrołomem. Regularnie uprawiaj topole i zarządzaj nimi oraz utrzymuj je dobrze nawodnione podczas eksperymentu, jak opisano w krokach 1.3.6-1.3.7.
  5. Usuń folię aluminiową z łodyg po ~20 dniach od inokulacji.
  6. Natychmiast obserwuj i fotografuj zacienione folią aluminiową (S) i niezacienione topole AR (L).
  7. Uprawiaj zacienione topole AR w świetle słonecznym lub innych sztucznych źródłach/warunkach światła.
  8. Usuń taśmy do szczepienia (lub folie z tworzywa sztucznego PE) i zbierz topole AR po 1-5 dniach od ekspozycji na światło.
  9. Owiń wszystkie próbki AR folią aluminiową. W przypadku AR topoli, które zostały poddane zabiegowi zacieniania, próbki należy zbierać w ciemności.
  10. Zanurzyć próbki (cz.a.) w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C do dalszych badań.
  11. Zebrać naświetlone lub nienaświetlone AR topoli (prowadzone w ciemności) po owinięciu ich folią aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C do badań morfologicznych i innych badań in situ .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebieg procesu indukowania korzeni przybyszowych przez patogeny powodujące raka pędów za pomocą inokulacji poprzez pierścieniowanie przedstawiono na Rysunku 1. Przeprowadzone tutaj eksperymenty wykazały, że oba patogeny powodujące raka pędów, V. sordida, B. dothidea oraz ich izolaty (pochodzące z różnych gospodarzy, regionów lub o różnej patogenności) mogą indukować tworzenie się korzeni przybyszowych (AR) u gatunków topoli. W niniejszym protokole wykorzystano izolat CZC ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Gatunki topoli są zdolne do wytwarzania AR lub korzeni bocznych (LR) z sadzonek łodygowych, co przyczynia się do ich rozmnażania i jako model do badań biologii korzeni roślin drzewiastych 7,8. Co więcej, badania wykazały, że inokulacja określonych mikroorganizmów, takich jak pożyteczne bakterie (Agrobacterium rhizogenes 9,10; Ryzobakterie wspomagające wzrost roślin [PGPR]11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały wspólnie sfinansowane przez Centralną Instytucję Naukową Pożytku Publicznego Basal Research Fund of State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (grant nr CAFYBB2020ZY001-2) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu 32171776) dla Jiaping Zhao.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSolarbio (Słoneczna Biologia)A8190   Zapewnij odżywianie dla wzrostu grzybów
Folia aluminiowaOstrze biologiczneZobacz materiał BS-QT-027BAby zapewnić zacienienie zainfekowanego obszaru
Nóż do opasywaniaFirmy narzędziowe MoGongOpasuj naskórek łodyg/gałęzi topoli
Taśma do szczepieniaCAPI5cmAby naprawić grzyby na roślinach
PD (Ekstrakcja ziemniaków, dekstroza) Solarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał P7360Zapewnij odżywianie dla wzrostu grzybów
Folia z tworzywa sztucznego PEMiaoJie powiedział:413703Aby naprawić grzyby na roślinach
Szalki PetriegoBkman biological Co., Ltd 90mmPrzygotuj podłoże PDA
Inkubator termostatycznySzanghaj Kuntian Laboratory Instrument Co., LtdKTD-6000Zapewnij środowisko do rozwoju grzybów

Bibliografia

  1. Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).
  2. Xing, J., et al. Stem canker pathogen Botryosphaeria dothidea inhibits poplar leaf photosynthesis in the early stage of inoculation. Front Plant Sci. 13, 1008834(2022).
  3. Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9, 10111(2019).
  4. Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. Pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
  5. Xing, J., et al. Comparisons of photosythetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis infected by the stem canker pathogen Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea at Early Stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
  6. Li, M. Physiological and molecular mechanisms of adventitious root formation in poplar induced by stem canker pathogens [Master's Thesis]. , Chinese Academy of Forestry. (2023).
  7. Ahkami, A. H. Systems biology of root development in Populus: Review and perspectives. Plant Sci. 335, 111818(2023).
  8. Dickmann, D. I. Silviculture and biology of short-rotation woody crops in temperate regions: then and now. Biomass Bioenergy. 30, 696-705 (2006).
  9. De Almeida, M. R., et al. Environmental control of adventitious rooting in Eucalyptus and Populus cuttings. Trees. 31, 1377-1390 (2017).
  10. Zavattieri, M. A., Ragonezi, C., Klimaszewska, K. Adventitious rooting of conifers: influence of biological factors. Trees. 30, 1021-1032 (2016).
  11. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28, 1327-1350 (2012).
  12. Khan, Z., et al. Growth enhancement and drought tolerance of hybrid poplar upon inoculation with endophyte consortia. Curr Plant Biol. 6, 38-47 (2016).
  13. Paz, I. C., et al. Eucalyptus growth promotion by endophytic Bacillus spp. Genet Mol Res. 11, 3711-3720 (2012).
  14. Olah, B., Briere, C., Becard, G., Denarie, J., Gough, C. Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DMI1/DMI2 signalling pathway. Plant J. 44, 195-207 (2005).
  15. Maillet, F., et al. Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature. 469, 58-63 (2011).
  16. Felten, J., et al. The ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor stimulates lateral root formation in poplar and Arabidopsis through auxin transport and signaling. Plant Physiol. 151, 1991-2005 (1991).
  17. Splivallo, R., Fischer, U., Gobel, C., Feussner, I., Karlovsky, P. Truffles regulate plant root morphogenesis via the production of auxin and ethylene. Plant Physiol. 150, 2018-2029 (2009).
  18. Druege, U., et al. Molecular and physiological control of adventitious rooting in cuttings: phytohormone action meets resource allocation. Ann Bot. 123, 929-949 (2019).
  19. Steffens, B., Rasmussen, A. The physiology of adventitious roots. Plant Physiol. 170, 603-617 (2016).
  20. Bannoud, F., Bellini, C. Adventitious rooting in Populus species: update and perspectives. Front Plant Sci. 12, 668837(2021).
  21. Li, Y., et al. Signal communication during microbial modulation of root system architecture. J Exp Bot. 75 (2), 526-537 (2024).
  22. Pascale, A., Proietti, S., Pantelides, I. S., Stringlis, I. A. Modulation of the root microbiome by plant molecules: the basis for targeted disease suppression and plant growth promotion. Front Plant Sci. 10, 1741(2020).
  23. Zoratti, L., Karppinen, K., Luengo Escobar, A., Häggman, H., Jaakola, L. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits. Front Plant Sci. 5, 534(2014).
  24. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  25. Sorin, C., et al. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17 (5), 1343-1359 (2005).
  26. Jung, J. K., McCouch, S. Getting to the roots of it: Genetic and hormonal control of root architecture. Front Plant Sci. 4, 186(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Rakien łodygi topoliinokulacja patogenemrozwój korzenipatogeny grzybowemorfogeneza korzenitraktowanie zacienieniembiosynteza flawonoidówbiosynteza antocyjanów
Korzenie przybyszowe topoli indukowane przez patogeny raka łodygi: eksperymentalny system do badania biologii korzeni i procesów związanych z reakcją na światło
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.