Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67305

⸱

22 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

Autorzy korespondencyjni: Shangkun Ou <shangkun_ou@126.com>, Hao Gu <13765135577@139.com>

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Streszczenie

Zapalenie rogówki, szczególnie ciężkie zapalenie rogówki, odgrywa znaczącą rolę w rozwoju dysfunkcji komórek macierzystych rąbka rogówki. Skonstruowanie odpowiednich modeli zwierzęcych może pomóc nam skupić się na wpływie ciężkiego stanu zapalnego na komórki macierzyste rąbka rogówki. Odrdzewiacz o średnicy 2 mm został użyty do usunięcia środkowego nabłonka rogówki szczurów Sprague Dawley (SD) w celu spowodowania urazu. Następnie zszyto środkowe zrąb rogówki nylonowymi szwami w celu wywołania uporczywego stanu zapalnego. W ten sposób skonstruowano model zapalenia rogówki z centralnym ścieraniem nabłonka rogówki i szyciem zrębu centralnego, co wywołało ciężkie zapalenie rogówki. Zaobserwowano zmiany w stanie zapalnym rogówki i stanie rąbkowych komórek macierzystych po 1, 3 i 7 dniach od modelowania. W3 dniu po modelowaniu rąbek rogówki szczurów był poważnie obrzęknięty, z oczywistą neowaskularyzacją i miejscowym przerostem, które są typowymi objawami niedoboru rąbkowych komórek macierzystych. Do 7dnia obrzęk rogówki stopniowo się pogarszał, a neowaskularyzacja nadal się nasilała. Poprzez ilościową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i barwienie immunofluorescencyjne stwierdziliśmy, że czynniki zapalne nabłonka rogówki były znacznie regulowane w górę, różnicowanie nabłonka rogówki było nieprawidłowe, komórki macierzyste nabłonka rogówki były znacznie zmniejszone, a proliferacja komórek i łodyga również się zmniejszyły. Dlatego model ten pokazuje, że ciężki stan zapalny może wywołać uszkodzenie rąbkowych komórek macierzystych bez bezpośredniego uszkodzenia rąbkowych komórek macierzystych. Model jest korzystny dla obserwacji wpływu ciężkiego stanu zapalnego na mechanizmy biologiczne komórek macierzystych i stanowi idealną platformę do badania mechanizmów dysfunkcji komórek macierzystych nabłonka rogówki wywołanej stanem zapalnym.

Wprowadzenie

Dysfunkcja komórek macierzystych rąbka (LSCD) charakteryzuje się uporczywymi wadami nabłonka, unaczynieniem rogówki, przewlekłym stanem zapalnym, bliznowaceniem i spojówką rogówki1,2. Może wynikać z wyczerpania lub dysfunkcji rąbkowych komórek macierzystych po ciężkich chorobach powierzchni oka, takich jak oparzenia chemiczne, oparzenia termiczne, zespół Stevensa-Johnsona i jatrogenne uszkodzenia spowodowane operacjami oczu2,3,4. Mechanizmy chorobotwórcze LSCD obejmują głównie zmiany w komórkach macierzystych i zaburzenia w mikrośrodowisku komórek macierzystych5,6, co wpływa na homeostazę nabłonka rogówki2,7. Istnieją dwa podstawowe typy zmian losu w rąbkowych komórkach macierzystych w LSCD: 1) Kierunkowy potencjał różnicowania komórek macierzystych nabłonka rogówki staje się nieprawidłowy, co prowadzi do ich różnicowania się w komórki nabłonka skóry. Świadczy o tym spadek ekspresji czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla komórek nabłonka rogówki Pax6 oraz keratyny specyficznej dla rogówki Krt12 i Krt3, wraz ze znacznym wzrostem ekspresji markerów metaplazji nabłonka płaskiego związanych ze skórą Krt10, Krt1 i Sprr1b8; 2) Uraz powierzchni oka bezpośrednio niszczy komórki macierzyste rąbka rogówki, powodując martwicę lub apoptozę, a następnie powodując proliferację tkanki spojówki, która pokrywa rogówkę9. Doniesiono, że podczas rozwoju LSCD komórki zapalne, takie jak makrofagi, neutrofile i komórki dendrytyczne, znacznie zwiększają się w mikrośrodowisku komórek macierzystych nabłonka rogówki. Odpowiednio, cytokiny, takie jak interferon-gamma (IFN)-γ, czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α, interleukina (IL)-1β i białka zapalne makrofagów (MIP)-1α/β również wykazują znaczne wzrosty10.

Ustalono różne modele LSCD, w tym te wywołane szwami, urazami chemicznymi i plamami chlorku benzalkoniowego11. Każdy z tych modeli ma swoje wady i zalety. Urazy chemiczne mogą uszkodzić całą powierzchnię oka i bezpośrednio zniszczyć rąbkowe komórki macierzyste12. Chlorek benzalkoniowy działa podobnie do urazów chemicznych, ale ma stosunkowo powolny efekt13. Model szwu rogówkowego może wywołać stabilną i długotrwałą reakcję zapalną, ale reakcja zapalna jest stosunkowo łagodna i nie może powodować LSCD.

Aby zbadać rolę i mechanizmy zapalenia w rozwoju LSCD rogówki, stworzono model zwierzęcy, który łączy łyżeczkowanie środkowego nabłonka rogówki ze szwami rogówkowymi. Model ten indukuje uporczywe zapalenie nabłonka rogówki, nie uszkadzając bezpośrednio komórek macierzystych rąbka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury były zgodne z wytycznymi ARVO dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou (Zatwierdzenie nr 2305192). Szczury były trzymane w Centrum dla Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Guizhou, zgodnie z odpowiednimi przepisami dotyczącymi zarządzania zwierzętami.

1. Wybór zwierząt

  1. Używaj samic szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 7-8 tygodni. Upewnij się, że nie ma żadnych zmian na powierzchni oka podczas badania w lampie szczelinowej.
  2. Wysterylizuj narzędzia za pomocą szybkiego sterylizatora. Wymagane narzędzia obejmują środek do usuwania pierścieni rdzy rogówki, marker do pobierania próbek skóry o rozmiarze 2 mm, uchwyty do igieł, noże do warstw płytek, okulistyczne nożyczki chirurgiczne i kleszcze.
  3. Znieczulić szczury 1,25% tribromoetanolem we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce 0,3 ml na 100 g masy ciała. Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca. Wkraść jedną kroplę tropikamidowych kropli do oczu w celu rozszerzenia źrenic. Krople do oczu z chlorowodorkiem bupiwakainy należy stosować do oka. Użyj maści nawilżającej do oczu na przeciwległe oko, aby utrzymać wilgoć.
  4. Zdezynfekuj skórę i włosy wokół oczu jodoforem.
  5. Ustal model stanu zapalnego.
    1. Umieść szczura w bocznej pozycji odleżynowej. Wystaw gałkę oczną pod mikroskopem operacyjnym.
    2. Centralna rogówka została oznaczona za pomocą markera do pobierania próbek skóry o rozmiarze 2 mm, a oznaczony centralny nabłonek rogówki został zeskrobany za pomocą środka do usuwania pierścienia rdzy rogówki.
    3. Umieść trzy szwy rogówki 120° za pomocą drutu nylonowego 10-0, uchwytu igły oraz okulistycznych nożyczek chirurgicznych i kleszczy około 3 mm od rąbka, nie penetruj rogówki14,15.
  6. Pod koniec zabiegu nałóż maść do oczu z ofloksacyną, aby zapobiec infekcji.
  7. Obserwuj i fotografuj rogówkę w 1, 3i 7 dniu po operacji za pomocą lampy szczelinowej z 10-krotnym powiększeniem. Rejestruj objawy, takie jak gojenie się nabłonka rogówki, przekrwienie spojówek, obrzęk rogówki, przekrwienie rąbka rogówki i neowaskularyzacja rogówki.

2. Obliczanie wskaźnika stanu zapalnego

  1. Oblicz wskaźnik zapalny powierzchni oka po ustaleniu modelu zwierzęcego.
    1. Oceń przekrwienie ciała rzęskowego w następujący sposób: brak przekrwienia (0 punktów); obecność przekrwienia mniejszego niż 1 mm (1 punkt); przekrwienie między 1 mm a 2 mm (2 punkty); przekrwienie między 1 mm a 2 mm (3 punkty).
    2. Oceń centralny obrzęk rogówki w następujący sposób: brak obrzęku (0 punktów); obrzęk z wyraźną widocznością tęczówki (1 punkt); obrzęk z niewyraźną widocznością tęczówki (2 punkty); obrzęk z niewidoczną tęczówką (3 punkty).
    3. Oceń przyśrodkowy obrzęk rogówki w następujący sposób: brak obrzęku (0 punktów); obrzęk z wyraźną widocznością tęczówki (1 punkt); obrzęk z niewyraźną widocznością tęczówki (2 punkty); obrzęk z niewidoczną tęczówką (3 punkty).
    4. Oblicz wskaźnik stanu zapalnego, dodając wszystkie wyniki i dzieląc go przez 9.

3. Ocena neowaskularyzacji rogówki

  1. Obserwuj neowaskularyzację rogówki za pomocą lampy szczelinowej.
    1. Analizuj i przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów w lampie szczelinowej16.
    2. Rejestruj wzrost neowaskularyzacji rogówki w każdym punkcie czasowym obserwacji, mierząc najdłuższą neowaskularyzację rogówki w kierunku środkowej rogówki przy minimalnej krzywiźnie.
    3. Oceń je w następujący sposób: Stopień 0: Unaczyniowy; Stopień 1: Mikro (<1 mm); Stopień 2: Łagodny (od 1 mm do 1,5 mm); Stopień 3: Umiarkowany (>1,5 mm do 2 mm); Stopień 4: Ciężki (>2 mm).

4. Analiza biologii modelu

  1. Przygotuj zamrożone próbki oczu.
    1. Znieczulij szczura 4-5% izofluranem i poddaj go eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    2. W bocznej pozycji odleżynowej podnieś gałkę oczną szczura na zewnątrz za pomocą mikropęsety i rozetnij spojówkę wzdłuż górnej i dolnej kopuły oka nożyczkami do oczu.
    3. Przetnij nerw wzrokowy, zwracając uwagę na zachowanie integralności nabłonka rogówki.
    4. Osusz plamy krwi i wodę na powierzchni gałki ocznej bibułą filtracyjną i umieść je w pudełku do zatapiania z medium do zatapiania o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).
    5. Usuń bąbelki z pudełka do zatapiania za pomocą pipety o pojemności 200 μl, zamroź je za pomocą ciekłego azotu, a następnie zachowaj osadzone próbki w lodówce o bardzo niskiej temperaturze.
  2. Przygotuj zamrożone fragmenty gałek ocznych.
    1. Przed przygotowaniem zamrożonej części należy schłodzić kriostat do temperatury około -28 °C, a uchwyt próbki do temperatury -26 °C.
    2. Wyjmij zamrożone próbki z zimnej zamrażarki i umieść je w kriotomie na około 1 godzinę.
    3. Zamrożoną próbkę schłodzić w kriotomie przez 10 minut. Zaznaczyć próbkę ołówkiem, przymocować ją do podkładki na próbkę za pomocą OCT, a po schłodzeniu przymocować je do siebie na ruszcie do krojenia.
    4. Dostosuj położenie i kierunek zamrożonej próbki i napraw ją. Najpierw wytnij odcinki 20 μm, aż zobaczysz środkową rogówkę. Następnie należy uzyskać skrawki o grubości 6 μm przez ciągłe krojenie i zebrać je na wcześniej przygotowanych szkiełkach adhezyjnych.
    5. Zaznacz nazwę, materiał, czas sekcji, nazwę i numer tkanki na szkiełku. Umieść go w temperaturze pokojowej (RT) na około 30 minut.
    6. Po wysuszeniu odcinków włóż je do pudełka i przechowuj w lodówce o bardzo niskiej temperaturze w celu zachowania zapasu.
  3. Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną.
    1. Wyjmij wstępnie przygotowane zamrożone części z lodówki o bardzo niskiej temperaturze i umieść je w dygestorii w temperaturze RT do wyschnięcia.
    2. Utrwalić skrawki za pomocą 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać próbki 1x PBS przez 5 minut.
    3. Umieścić skrawki próbki zawierające szkiełka podstawowe na uchwycie szkiełka i zanurzyć je w cylindrze z roztworem barwnika hematoksyliny w temperaturze pokojowej na 5 minut.
    4. Powoli spłucz próbkę zawierającą szkiełka wodą z kranu, aby zmyć pływający barwnik, włóż je do zbiornika barwnika z 0,1% alkoholem kwasu solnego i usuń je szybko po 1-2 s.
    5. Powoli płukać próbkę wodą z kranu przez 15 minut.
    6. Wyjmij próbkę z wody i zanurz szkiełka w zbiorniku na barwnik eozyny; pozostaw w temperaturze RT na 3 minuty.
    7. Powoli spłucz próbkę wodą z kranu, zmyj nadmiar barwnika i wykonaj gradientowe odwodnienie alkoholowe przy użyciu 75% alkoholu, 80% alkoholu, 95% alkoholu, 100% alkoholu (jeden) i 100% alkoholu (dwa). Mieszaj sekcje w każdym stężeniu przez 2 min.
    8. Spraw, aby próbki były przezroczyste przez 2 minuty odpowiednio w ksylenie (1) i ksylenie (2).
    9. Wysuszyć próbkę w dygestorium, uszczelnić sekcje za pomocą środka uszczelniającego i uważać, aby nie powstały pęcherzyki.
    10. Umieść szkiełka w pudełku na slajdy w RT. Zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu.
  4. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne.
    1. Usuń zamrożone części i umieść je w pudełku w RT w dygestoriach do wyschnięcia.
    2. Zaznaczyć nazwę przeciwciała, które ma być barwione, na szkiełku podstawowym zamrożonej próbki.
    3. Utrwalić próbki 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Do pudełka dodano niewielką ilość wody z kranu, aby zapobiec wysychaniu próbki.
    4. Usunąć utrwalacz paraformaldehydu i przemyć próbkę trzykrotnie buforem 1x PBS. Uważaj, aby nie spłukać próbki.
    5. Osuszyć płyn wokół wycinka tkanki, przykryć próbkę roztworem błony komórkowej (0,2% TritonX-100) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    6. Usuń roztwór błony komórkowej i przemyj sekcje trzy razy po 5 minut każda z 1x buforem PBS.
    7. Wysuszyć skrawki tkanki, przykryć próbkę roztworem blokującym immunofluorescencję (2% BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    8. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe i rozcieńczalnik (1% BSA) podczas inkubacji zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Usuń płyn blokujący i osusz próbkę za pomocą pompy ssącej. Dodać przygotowane przeciwciało pierwszorzędowe, przykryć pudełko i inkubować w lodówce o temperaturze 4 °C przez noc (inkubować przez około 12-16 godzin) z dala od światła.
    10. Odrzucić przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć próbkę cztery razy przez 10 minut każdy w PBS.
    11. Na etapie czyszczenia należy przygotować drugorzędowe rozcieńczenie przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta.
    12. Usunąć PBS, wysuszyć próbkę i dodać przygotowane przeciwciało drugorzędowe do próbki. Przykryj próbkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z dala od światła.
    13. Usunąć przeciwciało drugorzędowe, przemyć próbkę 4 razy buforem 1x PBS przez 10 minut każdy i przykryć całe szkiełko buforem 1x PBS.
    14. Usuń PBS, osusz próbkę i uszczelnij sekcje medium montażowym zawierającym DAPI, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Zawiń szkiełka w folię aluminiową i trzymaj je w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    15. Rób zdjęcia za pomocą systemu laserowego mikroskopu konfokalnego lub systemu pionowej kamery mikroskopu fluorescencyjnego (prędkość skanowania: 4 μs/piksel, rozdzielczość skanowania: 1024 x 1024).
  5. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej nabłonka rogówki szczura
    1. Po eutanazji usuń gałki oczne pęsetą nasączoną 75% alkoholem i włóż je do 1x zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10% penicyliny-streptomycyny przygotowanej wcześniej.
    2. Oczyść gałki oczne i użyj 1x HBBS zawierającego 10% FBS i 10% penicyliny-streptomycyny dwa razy po 5 minut każdy.
    3. Usuń spojówkę wzdłuż brzegu twardówki; pozostaw brzeg twardówki na około 1 mm. Ponownie dwukrotnie przemyj tkankę rogówki 1x HBBS zawierającym 10% FBS i 10% penicyliny-streptomycyny.
    4. Przenieś czystą tkankę rogówki do uzupełnionego hormonalnego podłoża naskórkowego (SHEM) zawierającego 2U/ml leku Dispase II. Zamknij uszczelkę i umieść ją w temperaturze 4°C na 14-16 godzin.
    5. Przygotuj pęsetę, pęsetę bezzębną, urządzenie do odzyskiwania tęczówki i sterylizator chirurgiczny.
    6. Pod mikroskopem chirurgicznym delikatnie oddziel nabłonek rogówki wzdłuż krawędzi rogówki.
    7. Przemyć nabłonek rogówki 1x HBSS zawierającym 10% penicyliny-streptomycyny przez 5 min.
    8. Przenieść tkankę nabłonka rogówki do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 ml trypsyny i inkubować w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Co 5 minut trzykrotnie wstrząsaj probówką wirówkową, aby strawić arkusz nabłonka rogówki do zawiesiny jednokomórkowej.
    9. Dodać równą ilość pożywki SHEM, aby zatrzymać działanie roztworu trawiącego trypsynę i umieścić go w temperaturze pokojowej.
  6. Hodowla klonów komórek nabłonka rogówki
    1. Przygotuj komórki trofoblastu.
      1. Gdy gęstość wzrostu komórek myszy NIH 3T3 osiągnie 80-90%, wyrzuć pożywkę do hodowli komórek. Dodać wstępnie przygotowane podłoże hodowlane mitomycyny NIH 3T3 o stężeniu 10 mg/ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny.
      2. Usuń pożywkę, przepłucz komórki 1x HBSS, zastąp nową pożywką komórkową NIH 3T3 i kontynuuj inkubację w inkubatorze CO2 (5% CO2, 37 °C).
    2. Przygotować zawiesinę komórek nabłonka rogówki i policzyć komórki zgodnie z wymaganym stosunkiem.
    3. Przygotowując zawiesinę komórek nabłonka rogówki, przetwarzaj komórki NIH 3T3 traktowane mitomycyną.
      1. Odrzucić supernatant, przepłukać komórki 1x HBSS, dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
      2. Dodaj równą ilość uzupełniającego hormonalnego podłoża nabłonkowego (pożywka SHEM: DMEM/F12, 10 ng/ml mysiego naskórkowego czynnika wzrostu [EGF], 10 μg/ml insuliny-transferyny-selenu [ITS], 5% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 0,5% dimetylosulfotlenku [DMSO], 0,5 mg/ml hydrokortyzonu), delikatnie pipetą, aby przygotować zawiesinę komórek i policz komórki.
    4. Użyj 12-dołkowej płytki i dodaj 0,5 ml pożywki SHEM do każdego dołka.
    5. Wymieszaj komórki nabłonka rogówki z komórkami NIH 3T3 o gęstości 500 komórek nabłonka rogówki/cm2 i 5 x 105 komórek NIH 3T3 / cm2. Dodaj 1 ml pożywki SHEM do każdego dołka.
    6. Dodaj 1 ml mieszaniny komórek do każdego dołka i delikatnie pipetować, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
    7. Inkubować w inkubatorze (5% CO2, 37 °C), zmieniając podłoże co 2-3 dni. Kultura przez 12-14 dni.
  7. Barwienie fioletem krystalicznym
    1. Po około 12 dniach, gdy klony nabłonka rogówki są bliskie fuzji, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki, całkowicie pokrywając komórki. Napraw ogniwa na 15 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń 4% paraformaldehydu i umyj studzienki trzy razy 1x PBS przez 5 minut każda.
    3. Usuń 1x bufor PBS i dodaj 0,4% roztworu barwnika fioletu krystalicznego do każdej studzienki. Bejcować przez 30 minut w RT.
    4. Usuń lub poddaj recyklingowi roztwór barwnika fioletu krystalicznego i umyj go trzy razy 1x PBS przez 10 minut każdy.
    5. Wysuszyć studzienki na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż do całkowitego wyschnięcia.
    6. Użyj zwykłego systemu fotograficznego z mikroskopem pionowym (prędkość skanowania: 4 μs/piksel, rozdzielczość skanowania: 1024 x 1024).
  8. Ekstrakcja mRNA rogówki
    1. Zbierz nożyczki okulistyczne, nożyczki do rogówki, kleszcze zębate, elektryczny skrobak do nabłonka rogówki, Trizol, probówki wirówkowe 1,5 ml bez RNaz i pojemnik na lód.
    2. Akwizycja nabłonka
      1. Znieczulić szczura 4-5% izofluranem i poddać go eutanazji po zwichnięciu szyjki macicy. Umieść zwierzę w pozycji bocznej. Przytnij wąsy myszy nożyczkami do oczu, aby nie zasłaniać widoku.
      2. Umieść szczura pod mikroskopem chirurgicznym i ustaw go na odpowiednią wysokość, aby ustawić ostrość na gałce ocznej. Użyj kleszczyków zębatych, aby delikatnie popchnąć i odsłonić gałkę oczną. Podnieś spojówkę szczura i użyj czystego elektrycznego skrobaka do nabłonka rogówki, aby zeskrobać środkowy obszar nabłonka rogówki o grubości 2 mm.
      3. Zbierz zeskrobany nabłonek rogówki czystymi, ząbkowanymi kleszkami spryskanymi alkoholem. Pobraną tkankę umieścić w probówce wirówkowej zawierającej 1 ml Trizolu.
      4. Pracuj tak szybko, jak to możliwe, aby wypłukać pobraną tkankę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej podwójnie dejonizowaną wodę. Nadmiar wody należy wchłonąć bibułą filtracyjną. Spryskaj 75% alkoholem i przejdź do następnego kroku.
      5. Ponownie podnieś spojówkę szczura za pomocą kleszczy zębatych. Użyj nożyczek rogówkowych wklęsłą stroną do góry, aby przeciąć spojówkę wzdłuż rąbka, pozostawiając około 0,5 mm białej spojówki.
      6. Zeskrobać nabłonek rogówki w odległości 2 mm na rąbku rogówki za pomocą skrobaka elektrycznego. Zbierz tkankę zgodnie z wcześniejszym opisem. Zbierz centralny nabłonek rogówki z trzech gałek ocznych i nabłonek rąbka z trzech gałek ocznych.
      7. Umieść pobrane tkanki w oddzielnych probówkach z odczynnikiem do ekstrakcji RNA Trizol o pojemności 1 ml. Wykonaj całą operację na lodzie, aby zachować integralność RNA. Natychmiast należy przejść do kolejnych kroków lub przechowywać próbki w zamrażarce o bardzo niskiej temperaturze w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
    3. Rozmrozić próbkę na lodzie, użyć ultradźwiękowego homogenizatora tkankowego do lizy komórek. Ustaw moc homogenizatora ultradźwiękowego na 25%, czas na 2 s na serię, czas interwału na 5 s, a czas całkowity na 2 min. Odstaw na lód na 10 minut.
    4. Dodać chloroform (1/5 całkowitej objętości, około 200 μl) do każdej próbki, dokładnie wymieszać przez odwrócenie przez 30 s i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Wytrącanie RNA
      1. Po odwirowaniu ciecz wewnątrz probówki wirówkowej jest składana warstwami na trzy części. Górna przezroczysta warstwa to RNA, środkowa biała, mętna warstwa to DNA i białka, a dolna warstwa to Trizol. Ostrożnie odpipetować około 500 μl górnej przezroczystej warstwy do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, uważając, aby nie zassać białego osadu w środkowej warstwie. W przypadku nieumyślnego zassania powtórzyć wirowanie, aby ponownie zebrać przezroczystą warstwę.
      2. Dodać równą ilość wstępnie schłodzonego izopropanolu do probówki wirówkowej zawierającej przezroczystą warstwę, około 500 μl, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu dokładnego wymieszania, a następnie natychmiast umieścić ją w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 20-30 minut. Ten krok ma na celu przyspieszenie wytrącania się RNA.
    6. Wyjąć próbkę i natychmiast odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na dnie probówki wirówkowej widoczna jest niewielka ilość białego, łuszczącego się osadu; Odrzucić supernatant.
    7. Dodaj wstępnie przygotowany i schłodzony lodem 70% etanol do każdej tuby. Natychmiast odwirować w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem o sile 400 x g przez około 10 minut; Powtórz powyższe kroki raz, aby dokładnie umyć osad. Na tym etapie należy wstępnie wysterylizować wyciąg światłem UV przez 15 minut.
    8. Po wyjęciu probówek wirówkowych i odrzuceniu supernatantu, należy ponownie odwirować w temperaturze 4 °C przy około 250 x g przez 2 minuty. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl ostrożnie zassać nadmiar alkoholu ze strony przeciwnej do osadu, susząc tak dokładnie, jak to możliwe. Umieścić w dygestorium wysterylizowanym promieniami UV do wyschnięcia, wysuszyć osad na powietrzu przez około 15 minut.
    9. Przygotować roztwór, dodając 1 ml inhibitora RNazy do 40 ml wody z pirowęglanu dietylu (DEPC). Dodać odpowiednią ilość mieszaniny wody DEPC i inhibitora RNazy, około 20-30 μl, aby rozpuścić próbkę. Jeśli osadu jest dużo, dodaj 30-50 μl. Natychmiast przystąp do PCR z odwrotną transkrypcją.
  9. PCR z odwrotną transkrypcją
    1. Upewnij się, że te elementy są obecne: maszyna do PCR, probówki wirówkowe 1.5 ml bez RNaz, probówki do PCR 0.2 mL, łaźnia lodowa lub pojemnik na lód, pipeta i końcówki wolne od RNaz.
    2. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Dla każdej próbki należy upewnić się, że do układu reakcyjnego dodano 1 μg RNA.
    3. System odwrotnej transkrypcji ma całkowitą objętość 20 μl. Oblicz całkowitą ilość potrzebnych odczynników na podstawie liczby próbek. Wymieszać zgodnie z proporcjami określonymi w instrukcji.
    4. Przygotuj system reakcyjny na lodzie, zwiruj go i krótko odwiruj. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut i w temperaturze 90 °C przez 30 sekund.
    5. CDNA uzyskane w procesie odwrotnej transkrypcji należy wykorzystać bezpośrednio do ilościowej analizy PCR w czasie rzeczywistym lub przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C.
  10. Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym
    1. Użyj zestawu ilościowych odczynników do PCR w czasie rzeczywistym17 z systemem reakcyjnym 10 μl. Należy użyć sekwencji starterów pokazanych w Tabeli 1.
    2. Dodać opisany powyżej system reakcyjny do 96-dołkowej płytki lub ośmiopaskowej probówki przeznaczonej specjalnie do RT-PCR. Upewnij się, że próbki są dobrze wymieszane. Sprawdź, czy w probówkach nie ma pęcherzyków powietrza przed umieszczeniem ich na maszynie do PCR.
    3. Amplifikować gen za pomocą cyklu PCR (95 °C przez 5 min), 40 cykli (95 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s) i uzupełnić dane w celu obliczenia wartości 2-ΔΔ Ct. Przetwarzaj, analizuj i wykreślaj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano w Rycina 1Apoprzez badanie w lampie szczelinowej stwierdzono upośledzenie gojenia nabłonka rogówki. W warunkach prawidłowych nabłonek centralny rogówki uległby całkowitemu zagojeniu w ciągu 24–48 h po usunięciu, natomiast w modelu wycięcia centralnego nabłonka rogówki z jednoczesnym założeniem szwów, nowe naczynia krwionośne nadal występowały. W trzeciej dobie po utworzeniu modelu zaobserwowano znaczny obrzęk limbusa rogówki oraz neowaskularyzację, z miejscowym wystąpieniem typo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w rozwoju niedoboru rąbkowych komórek macierzystych18, ale jego specyficzne mechanizmy i skutki wymagają dalszych badań. Aby rozwiązać ten problem, wywołaliśmy LSCD poprzez zeskrobanie centralnego nabłonka rogówki i zszycie środkowego zrębu rogówki, aby spowodować poważne zapalenie rogówki. Obserwowaliśmy ewolucję stanu zapalnego rogówki i stan rąbkowych komórek macierzystych w 1, 3 i 7 dniu po modelowaniu. W trzecim dniu po modelowaniu zaobserwowano znaczny obrz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Projekty Nauki i Technologii Prowincji Guizhou (QKHJC-ZK[2024]ZD043), Fundusz Naukowy Prowincji Fujian dla Wybitnych Młodych Uczonych (2023J06053 [do S.O]); Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82101084 [do S.O.] oraz Chińską Radę Stypendialną (CSC, 202306310049 [do Y.W.]).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia szwów 10-0Alcon, Inc., USA8065698001
trepanacja rogówki 2 mmSuzhou XVI Vision Company, Chinyhttp://www.66vision.com/
20 μ L, 100 μ L, 1 mL głowice pistoletów do pipet, płytki do hodowli komórkowych, probówki wirówkoweGuangzhou Jiete Biological Co., Ltd., Chinyhttps://www.jetbiofil.com/index.html-20
/-80 ° Lodówka CQingdao Haier Company, Chinyhttps://www.haier.com/cn/
Strzykawka 10 ml  Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., Chinyhttps://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
Przestrzegaj slajduShiTai Company188105
alkoholu amylenowegow Szanghaju. Macklin Biochemical, Chinyhttp://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, Wielka Brytaniaab76318
Przeciwciało anty-keratynowe 12 EPR17882Abcam, Wielka Brytaniaab185627
Przeciwciało anty-PAX6Abcam, Wielka Brytaniaab195045
Szkiełka nakrywkoweJiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , Chinyhttps://cn.citotest.com/
AutoklawHirayama, Japoniahttps://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, Chinyhttps://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
ChloroformShanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinyhttps://www.siobp.com/web
Inkubator CO2 Oven, kruszarka ultradźwiękowa, wirówkaThermo Fisher Technologies Inc., Stany Zjednoczonehttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
Mikroskop konfokalnyShanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., Chinyhttps://www.clinx.cn/about
kleszcze nabłonkowe rogówkiSuzhou XVI Vision Company, Chiny53418D
DAPIVector. Inc., Stany ZjednoczoneH-1000
Woda DEPC  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., Chinyhttps://www.siobp.com/web
Krem pod oczy Dicuro (krem pod oczy z ofloksacyną)Santian Pharmaceutical Corporation, Japoniahttps://www.santen.com/asia
D-KSFM, pożywka hodowlana, podwójne przeciwciało i PBSThermo Fisher Scientific, Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, Wielka Brytania 
Waga elektronicznaShanghai Ohaus Biotechnology Company, Chinyhttp://shbio.com/company
Obudowa membranyParafilm, Inc., USAhttps://www.sigmaaldrich.cn
Pasek testowy sodu fluoresceiny zastosowano w okulistyceTianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., Chinyhttps://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
Fluorescencyjny system mikrograficzny z odwróconym kontrastem fazowymTE-2000U, Nikon, Japoniahttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
Wirówka stołowa do zamrażaniaEppendorf, Niemcyhttps://www.eppendorf.sh.cn 
Rama z tafli szkłaXiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., Chinyhttp://www.tagene.net/
H-1200 ze środkiem uszczelniającym DAPIXiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., Chinyhttps://www.bosonbio.com.cn/
Zestaw do barwienia HEAuragene, Chinyhttp://jushengwu.com/a048/
Zestaw roztworu barwnika Hematoksylina i eozynyAURAGEN, Stany ZjednoczoneP032IH
Waga elektroniczna o wysokiej i niskiej precyzjiSdolis, Niemcyhttps://www.solisinverters.com/global
IsopropanolShanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., Chinyhttps://en.reagent.com.cn/
Przeciwciało Ki-67Abcam, Wielka Brytaniaab16667
ciekły azotXiamen Yidong Gas Co., Ltd., Chinyhttps://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Uchwyt na mikrowskazówkiSuzhou XVI Vision Company, Chinyhttp://www.66vision.com/
Multiformaldehyd w proszkuSigm, Amerykahttps://www.sigmaaldrich.cn
Wirówka o normalnej temperaturze 46Eppendorf, Niemcyhttps://www.thermofisher.cn
OCTShanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., Chiny4583
Zwykły biologiczny system mikrograficznyEclipse 50i, Nikon, Japoniahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, ChinySH30256.01
PCR i aparatura reaktoraBiometra Thermocycler, Niemcyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
Pipety o różnych specyfikacjachEppendorf Company, Niemcyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primery do Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
Chlorowodorek promeainy 0,5% krople do oczuAlcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Szczurze przeciwciało PMNFitzgerald, Stany Zjednoczone20R-PR020
Ilościowa fluorescencja w czasie rzeczywistymApplied Biosystems,  Stany Zjednoczonehttps://www.thermofisher.cn
Zestaw do odwrotnej transkrypcjiTAKARA, Japoniahttps://www.takarabiomed.com.cn/
Lampa szczelinowaTOPCON, Japoniahttps://topconchina.cn/
Kleszcze gładkieSuzhou XVI Vision Company, Chinyhttp://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., Chinyhttp://chuangdianbio.com/
Ławka SupercleanNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, Singapurhttps://www.hi-p.com/
Kleszcze zębateSuzhou XVI Vision Company, Chinyhttp://www.66vision.com/
Toppicamidowe krople do oczu (Medol)Alcon, Inc., USAhttps://www.alcon.com/about-us
Śladowe białko kwasu nukleinowego tester stężeniaThermo Fisher Technologies Inc., USAhttps://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen Stany Zjednoczonehttps://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, z mikroskopem operacyjnymCarl ZEIS, Niemcyhttps://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
MCA341GA

Bibliografia

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

macularne komórki macierzystenowotwór naczyniowy rogówkiszczurzy model rogówkibarwienie immunofluorescencyjneanaliza RT-qPCRobrzęk rogówkidysfunkcja komórek macierzystych
Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.