Artykuł metodologiczny

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67311

⸱

27 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Synthetic Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Institute of Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 3Department of Microbiology, Genetics, & Immunology, Michigan State University, 4Computational Life Science, Department of Biology, RWTH Aachen University, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Streszczenie

Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na zrównoważone biotechnologie, mieszane konsorcja zawierające fototroficzne mikroby i heterotroficzne gatunki partnerskie są badane jako metoda bioprodukcji napędzanej energią słoneczną. Jedno z podejść polega na wykorzystaniu cyjanobakterii wiążących CO2 , które wydzielają węgiel organiczny w celu wsparcia metabolizmu współhodowanego heterotrofu, który z kolei przekształca węgiel w towary lub usługi o wyższej wartości. W niniejszym protokole przedstawiono opis techniczny, który ma pomóc eksperymentatorowi w ustanowieniu wspólnej kultury łączącej szczep sinic wydzielający sacharozę z partnerem (partnerami) grzyba, reprezentowanym przez modelowe gatunki drożdży. Protokół opisuje kluczowe warunki wstępne dla ustanowienia wspólnej kultury: określenie składu pożywki, monitorowanie cech wzrostu poszczególnych partnerów oraz analiza mieszanych kultur z wieloma gatunkami połączonymi w tym samym naczyniu wzrostowym. Podsumowano podstawowe techniki laboratoryjne do monitorowania kohodowli, w tym mikroskopię, licznik komórek i jednokomórkową cytometrię przepływową, a także przedstawiono przykłady niezastrzeżonego oprogramowania do analizy danych z plików standardowej cytometrii przepływowej surowej (FCS) zgodnie z zasadami FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Na koniec zamieszczono komentarz na temat wąskich gardeł i pułapek często napotykanych podczas prób ustanowienia wspólnej kultury z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier i nowym heterotroficznym partnerem. Protokół ten stanowi zasób dla naukowców próbujących ustalić nową parę współhodowanych drobnoustrojów, która obejmuje cyjanobakterię i drobnoustroję heterotroficzną.

Wprowadzenie

Dzięki szybkiemu rozwojowi narzędzi genomicznych i technologii DNA w ostatnich latach, wysiłki bioinżynieryjne są coraz częściej w stanie uznać mieszane społeczności mikrobów za opłacalne dla strategii bioprodukcji, zamiast skupiać się wyłącznie na kulturach aksonicznych. Konsorcja mikrobiologiczne mają wiele potencjalnych zalet w stosunku do kultur jednogatunkowych, w tym specjalizację i podział pracy, zdolność adaptacji i wytrzymałość oraz efektywność wykorzystania substratów1. Jednak przewidywalna inżynieria konsorcjów wielogatunkowych jest skomplikowana przez niepewności spowodowane zachowaniami wyższego rzędu, które wyłaniają się z interakcji międzygatunkowych2. Sygnalizacja międzygatunkowa i wymiana metabolitów leżą u podstaw zasady podziału pracy, ale prowadzą również do nieoczekiwanych synergii i antagonizmów między uczestnikami konsorcjów3. Znaczny postęp w tej dziedzinie jest konieczny, jeśli można w pełni wykorzystać potencjał mieszanych konsorcjów mikrobiologicznych, w tym wykorzystanie elastycznych platform kohodowli z 2 i 3 partnerami, które można wykorzystać do lepszego scharakteryzowania i zrozumienia interaktywności drobnoustrojów od "dołu do góry".

Obecnie w tej dziedzinie używa się kilku dominujących typów platform kokulturowych, w tym uzupełniających partnerów auksotroficznych i mikrobów, które wydzielają metabolity, które są ogólnie korzystne dla szerokiego zakresu gatunków drobnoustrojów. W tej drugiej kategorii cyjanobakterie zostały zmodyfikowane tak, aby stały się ulepszonymi producentami pierwotnymi poprzez wprowadzenie szlaków, które prowadzą do wydzielania łatwo metabolizowanych węglowodanów, a obecnie są badane w różnych racjonalnie zaprojektowanych konsorcjach. Krótko mówiąc, w tak zmodyfikowanych zbiorowiskach mikrobiologicznych partner cyjanobakteryjny jest w stanie wykorzystywać światło i CO2 jako główne wejściówki, a dzięki procesowi fotosyntezy tlenowej szczepy te mogą wydzielać centralne cukry węglowe jako dobro publiczne. Jedną z klas takich zmodyfikowanych szczepów sinic są te, które zostały zaprojektowane do wydzielania disacharydu sacharozy4. Takie szczepy prawdopodobnie odniosły sukces, ponieważ sacharoza jest metabolitem, który jest bliski centralnemu metabolizmowi węgla u wielu gatunków, a także często jest nadmiernie akumulowany jako tak zwana "kompatybilna substancja rozpuszczona", aby przystosować się do różnych środowiskowych stresów abiotycznych5. Minimalna liczba interwencji genetycznych może prowadzić do efektywnego wydzielania sacharozy w szeregu organizmów modelowych sinicowatych4.

Sinice wydzielające sacharozę są użyteczną platformą do badania racjonalnie zaprojektowanych konsorcjów mikrobiologicznych, ponieważ szeroki zakres gatunków heterotroficznych może metabolizować sacharozę jako dominujące źródło węgla i energii. Rzeczywiście, wykorzystując kilka modelowych cyjanobakterii o zdolnościach wydzielania sacharozy, wiele laboratoriów racjonalnie zaprojektowało mieszane gatunki kokultur i konsorcja, które zawierają jeden lub więcej heterotroficznych mikroorganizmów i które są ostatecznie wspierane przez podstawowe dane wejściowe światła i CO2 bez suplementacji organicznych surowców węglowych4. Szczepy heterotroficzne mogą po prostu przetrwać na węglowodanach pochodzących z sinic lub mogą być wykorzystane do przekształcenia sacharozy w bioprodukty o wyższej wartości (np. paliwa, polimery, pigmenty itp.). Takie uproszczone współkultury mogą być nie tylko potencjalną strategią na rzecz zrównoważonej bioprodukcji, ale także jako platforma do badania pojawiających się interakcji między niespokrewnionymi gatunkami drobnoustrojów.

Ten artykuł wideo skupia się na metodologiach i wymaganiach wstępnych dotyczących wykorzystania cyjanobakterii produkujących cukier jako elastycznej platformy do projektowania prostych konsorcjów mikrobiologicznych, które mogą być stabilne poprzez uzupełnianie tylko lekkiego i nieorganicznego węgla wejściowego. Podczas gdy konfiguracja i monitorowanie kultur zawierających pojedyncze mikroorganizmy jest w większości proste i można je łatwo osiągnąć przy użyciu metodologii gęstości optycznej (OD) lub rozpraszania wstecznego, nie jest to wykonalne, gdy dwa lub więcej organizmów zostanie połączonych w jednym naczyniu. Głównym powodem jest to, że metody te nie rozróżniają różnych mikroorganizmów, a zatem zapewniają jedynie ogólny obraz kultury i nie rozwiązują problemu wzrostu poszczególnych organizmów. Co więcej, cyjanobakterie mają szerokie spektrum absorpcji w zakresie 400-750 nm, więc pomiar OD600 heterotrofu doprowadziłby do fałszywych wyników z powodu fikocyjaniny (która absorbuje się w 620 nm). W związku z tym zapewniono szczegółowe protokoły tworzenia mieszanych zbiorowisk sinic i heterotrofów w laboratorium, a także przydatne protokoły ogólne do analizy wydajności tych konsorcjów w czasie. Podczas gdy protokoły koncentrują się na konkretnym parowaniu modelowych, wydzielających sacharozę gatunków sinic z jednym lub kilkoma modelowymi mikroorganizmami heterotroficznymi, celem tej pracy jest zapewnienie zasobów dla badaczy, którzy mogą chcieć zaprojektować nowe pary gatunków i przyspieszyć fazę optymalizacji w celu ustanowienia takich kultur. W związku z tym, oprócz protokołów specyficznych dla gatunku, zawarte są informacje i strategie, które można wykorzystać do adaptacji i uogólnienia tych protokołów dla niestandardowych społeczności, zgodnie z potrzebami czytelnika.

Ze względu na elastyczność opisanej tutaj platformy do współhodowli, opisano protokoły dla wielu różnych gatunków heterotroficznych, które wcześniej były zgłaszane w ko-hodowli z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier. Na przykład przedstawiono protokół krok po kroku dla kohodowli Synechococcus elongatus PCC 7942 z powszechnymi drożdżami laboratoryjnymi Saccharomyces cerevisiae. Jednak artykuł zawiera również protokoły, które są odpowiednie do oznaczania wydajności kokultur zawierających inne gatunki modelowe, w tym formę drożdży Ustilago maydis.

Artykuł skupia się na podstawowym zestawie protokołów niezbędnych do ustanowienia kokultury cyjanobakterii/heterotroficznej i przeprowadzenia podstawowej charakterystyki wydajności tych mieszanych konsorcjów w czasie. W szczególności położono nacisk na cytometrię przepływową pojedynczej komórki i metody liczenia cząstek odpowiednie do przeprowadzenia dokładnego spisu różnych gatunków, a także podejścia mikroskopowe do oceny morfologii komórek. Protokoły te mają służyć jako podstawa do dostosowania do potrzeb i dostępnego sprzętu. Co ważne, dostarczane są uwagi techniczne i inne kwestie, które są ważne dla ustanawiania i monitorowania kokultur w laboratorium. Na koniec zamieszczono przykłady niezastrzeżonych alternatyw dla analiz danych surowych plików FCS6 przy użyciu pakietów Pythona. Podsumowując, celem jest uczynienie technik współhodowli opartych na sinicach bardziej dostępnymi dla szerszego grona naukowców.

Protokół

UWAGA: Niniejszy protokół zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania i kwantyfikacji kokultur wydzielającego cukry S. elongatus oraz heterotroficznych modelowych gatunków drożdży. Ogólnie protokół ten można zastosować do każdego gatunku drożdży podatnego na manipulacje genetyczne.

1. Tworzenie kokultur łączących fototroficzne sinice i heterotroficzne drożdże

  1. Przygotowania do kokultywacji: Pożywki i prekultywacja
    UWAGA: Wszystkie pożywki i roztwory zapasowe należy przygotowywać przy użyciu wody filtrowanej do poziomu ultrapure. Całe szkło laboratoryjne (zlewki pomiarowe, cylindry miarowe, butelki do przechowywania i kolby hodowlane) powinno być oczyszczone i autoklawowane. Sterylne pożywki można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT). Niezbędne jest zapewnienie urządzenia zgodnego z wymogami hodowli fotoautotroficznej.
    1. Pożywkę do kokultywacji należy przygotować co najmniej 3-4 dni przed planowanym rozpoczęciem kokultywacji. Większość receptur pożywek do kokultywacji stanowi wariacje powszechnie stosowanej pożywki BG-117, wykorzystywanej do rutynowej hodowli wielu modelowych gatunków cyjanobakterii. W niniejszym protokole jako przykład wykorzystano wcześniej opisaną pożywkę CoYBG-11 (8; patrz Tabela 1). Przygotowaną pożywkę należy poddać sterylizacji w autoklawie (121 °C, 20 min) lub sterylizacji przez filtr (porowatość 0,22 µm), zależnie od potrzeb.
      UWAGA: Sugestie dotyczące dostosowania pożywki do innych par gatunków znajdują się w sekcji Dyskusja.
    2. Przygotowanie odczynników molekularnych: W celu indukcji ekspresji cscB i eksportu sacharozy9,10,11, należy przygotować 1 M roztwór zapasowy izopropyl-β-D-1-tiogalaktosydy (IPTG).
      UWAGA: Stosowanie antybiotyków podczas kokultywacji jest nieoptymalne, jednak można ich użyć, jeśli wszystkie szczepy posiadają kasety oporności. W takim przypadku należy przygotować zapasy antybiotyków zgodnie z potrzebami zastosowanych szczepów.
    3. Przygotowanie prekultury cyjanobakterii: Co najmniej 3 dni przed rozpoczęciem kokultywacji należy przenieść komórki z prekultury wydzielającego cukry szczepu cyjanobakterii rosnącego na pożywce BG-11 do nowej kolby z przegrodami zawierającej pożywkę CoYBG-11 (Tabela 1).
      UWAGA: Obecnie zmodyfikowano wiele gatunków i szczepów cyjanobakterii w celu wydzielania cukrów. Kompleksowy przegląd szczepów dostępnych w momencie opracowywania tego tekstu znajduje się w pozycji4. W tej referencji wymieniono również gatunki heterotroficzne (patrz 1.1.4), dla których wcześniej opisano kokultywację z cyjanobakteriami.
      1. Zmierzyć OD750 prekultury. Obliczyć wymaganą objętość prekultury niezbędną do osiągnięcia docelowej wartości OD750 wynoszącej 0,3 (C1), korzystając z równania V1 = C2 x V2/C1, gdzie C2 = docelowe OD, V2 = objętość docelowa, a V1 = wymagana objętość prekultury. Na przykład, przy szczepieniu 30 mL kultury (V2), ilość x płynnej kultury do użycia to V1 (mL) = (0,3 x 30)/(zmierzony OD750).
        UWAGA: Gęstość optyczna jest przybliżeniem gęstości komórkowej i zależy od warunków wzrostu oraz morfologii komórek; dlatego badacze muszą stosować metody korelujące gęstość optyczną z bezwzględną liczbą komórek (patrz sekcje 2.1, 2.2 i 2.3) w celu prawidłowej oceny wydajności kokultywacji. W przypadku cyjanobakterii do wyznaczania gęstości optycznej nie należy używać długości fal światła z widma aktywności fotosyntetycznej (tj. 400-700 nm), ponieważ są one absorbowane przez chlorofil i inne pigmenty; dlatego rutynowo stosuje się długości fal z zakresu dalekiej czerwieni (np. 750 nm).
      2. Inkubować rozcieńczoną kulturę w odpowiednim fotoinkubatorze. Typowe warunki inkubacji
        dla modelowych cyjanobakterii są następujące: 30 °C, 150 rpm (promień wytrącenia 25 mm), 2% CO2 w przestrzeni nad cieczą, oświetlenie LED ~200 µmol fotonów m-2·s-1, wilgotność 75%.
        UWAGA: Suplementacja CO2 jest wysoce zalecana w celu zoptymalizowania ilości uwalnianej sacharozy.
      3. Powtarzać ten proces rozcieńczania codziennie przez co najmniej 3 dni przed ustawieniem kokultywacji, aby upewnić się, że cyjanobakterie znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego. Pomoże to poprawić spójność wyników kokultywacji w eksperymentach przeprowadzanych w różne dni.
    4. Co najmniej 2 dni przed rozpoczęciem kokultywacji należy przygotować prekulturę heterotrofa. Jak wspomniano, szereg gatunków i podszczepów drożdży był wcześniej hodowany w kokultywacji z cyjanobakteriami8,12,13.
      1. Przenieść komórki w rozcieńczeniu 1:100 (250 µL) z płynnej kultury gatunku heterotroficznego rosnącego w bogatej pożywce hodowlanej (patrz Tabela 1) do 50 mL pożywki CoYBG-11 uzupełnionej o 20 g/L sacharozy w 250 mL kolbie z przegrodami.
      2. Inkubować przez noc w tej samej temperaturze, co w warunkach hodowli partnera cyjanobakteryjnego.
    5. Sprawdzić OD600 co najmniej 24 h przed planowanym czasem szczepienia kokultywacji, aby upewnić się, że szczep heterotroficzny urósł w stopniu wystarczającym dla potrzeb eksperymentalnych (patrz 1.2): w razie potrzeby rozcieńczyć w świeżej pożywce, aby utrzymać wzrost wykładniczy.
  2. Szczepienie i prowadzenie kokultywacji
    UWAGA: Rozważania dotyczące stosunku szczepienia między mikroorganizmami fototroficznymi a heterotroficznymi znajdują się w sekcji Dyskusja.
    1. Do szczepienia kokultywacji należy zagęścić obie prekultury poprzez wirowanie.
      1. Obliczyć objętość skoncentrowanej zawiesiny komórkowej, aby uzyskać pożądaną gęstość początkową dla obu gatunków, korzystając ze standardowego równania C1 x V1 = C2 x V2, gdzie C1 = OD zagęszczonej kultury. Na przykład, aby przygotować 25 mL kultury S. elongatus z początkowym OD750 wynoszącym 0,5 (z kultury aksenicznej o OD 1,5) oraz S. cerevisiae z początkowym OD600 wynoszącym 0,05 (z kultury aksenicznej o OD 0,7), na podstawie powyższego równania potrzeba 8,33 mL kultury początkowej S. elongatus, 1,79 mL zagęszczonej kultury heterotrofa oraz 14,88 mL pożywki CoYBG-11.
      2. Wirować kultury przy 13 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. W warunkach sterylnych zlać i odrzucić nadsącz.
        UWAGA: Do wytrącenia S. cerevisiae można użyć mniejszej względnej siły odśrodkowej (RCF; xg), ponieważ są to komórki większe (2-3 razy) w porównaniu do S. elongatus, należy jednak zadbać o to, aby nadsącz stał się przezroczysty. Do zbierania biomasy cyjanobakteryjnej można również użyć wartości mniejszych niż 13 000 x g, ale wymagałoby to dłuższego czasu wirowania (np. można zastosować 4 000 x g przez 20 min).
      3. Resuspendować osad cyjanobakterii w 25 mL sterylnej pożywki CoYBG-11. Zastosować takie same warunki wirowania jak poprzednio, a następnie zlać i odrzucić nadsącz.
      4. Powtórzyć ten proces dwukrotnie dla S. elongatus i czterokrotnie dla S. cerevisiae.
        UWAGA: Ważne jest przemywanie osadów cyjanobakterii i heterotrofa (S. cerevisiae) w celu usunięcia pozostałości składników pożywki. Ponieważ S. cerevisiae wcześniej rosły w obecności sacharozy, zwiększona liczba etapów przemywania zapewni usunięcie ewentualnego pozostałego cukru.
      5. Po zweryfikowaniu OD połączyć objętości S. elongatus i S. cerevisiae w 250 mL kolbie z przegrodami w warunkach sterylnych i dodać CoYBG-11 do końcowej objętości 50 mL. Rozcieńczyć z wcześniej przygotowanego 1 M roztworu zapasowego IPTG do stężenia końcowego 1 mM (ma to na celu indukowanie eksportu sacharozy z cyjanobakterii do pożywki). Dla 50 mL kultury użyć 50 µL z 1 M zapasu IPTG.
        UWAGA: Kolby z przegrodami są zazwyczaj lepsze, ponieważ zapewniają lepsze napowietrzanie i mieszanie dla cyjanobakterii.
      6. Umieścić kolbę z poprzedniego kroku w oświetleniu LED 200 µmol fotonów·m-2·s-1 z suplementacją 2% CO2 w temperaturze 30 °C, przy wytrząsaniu orbitalnym 150 rpm (promień wytrącenia 25 mm) i wilgotności 75%.
        UWAGA: Powyższe warunki mogą się różnić i muszą zostać zoptymalizowane na podstawie wyników eksperymentalnych.
      7. Monitorować wzrost kultury poprzez sterylną próbkę (1 mL) co 12 h lub 24 h (patrz sekcja 2). Opcjonalnie wykorzystać próbki do standardowej mikroskopii żywych komórek i oznaczenia jednostek tworzących kolonie (CFU14) komórek drożdżowych na odpowiedniej pożywce, aby śledzić morfologię i kondycję komórek oraz monitorować liczbę żywych komórek heterotroficznych, jak i zanieczyszczenia.
        UWAGA: Metoda CFU nie jest zalecana do monitorowania dokładnej gęstości komórkowej gatunków cyjanobakterii, które mogą odczuwać znaczny stres podczas przejścia z pożywki ciekłej na stałą. Dlatego należy wybrać płytki agarowe z odpowiednią bogatą pożywką dla wzrostu gatunków partnerów drożdżowych, taką jak ekstrakt drożdżowy, pepton i dekstroza (YEPD)15.
Związek chemicznyBG-11 (stężenie mg/L)CoY BG-11 (stężenie mg/L)
NaNO315001500
K2HPO (mikroskopia świetlna o wysokiej rozdzielczości)44040
MgSO₄4·7H2O7575
CaCl₂2 · 2 h2O3636
Kwas cytrynowy66
Cytrynian żelaza(III) i amonu66
EDTA (sól disodowa)11
Na2Tlenek węgla32020
Skład metali śladowych
H3BO32.862.86
ZnSO₄4·7H2O0.2220.222
Co(NO₃)₂3)2 · 6 h2O0.04940.0494
MnCl224h2O1.811.81
CuSO₄4 5H2O0.0790.079
NaMoO4·2H2O0.390.39
Dodatkowe
HEPPSO71607160
Pożywka azotowa dla drożdży (YNB), bez aminokwasów, bez siarczanu amonu–3608, 120013
czynnik miareczkujący o pH 8,3KOHKOH
KPO3–118
Sacharoza (tylko dla heterotrofów)–13690

Tabela 1: Skład pożywek BG-11 oraz CoYBG-11. Podane stężenia bazy azotowej z drożdży w pożywce CoYBG-11 zostały zaczerpnięte z opublikowanych źródeł8,12,13.

2. Narzędzia i metodologia monitorowania wzrostu kokultur

UWAGA: Niniejszy protokół stanowi wytyczną dotyczącą analizy i monitorowania kokultur, obejmującą zarówno proste, lecz pracochłonne techniki, takie jak mikroskopia i komory licznikowe, jak i aplikacje wysokoprzepustowe, takie jak liczniki cząstek i cytometria przepływowa pojedynczych komórek. Poza właściwą kokulturą zaleca się uwzględnienie kultur aksenicznych poszczególnych mikroorganizmów, aby umożliwić kompleksową analizę. Jako ogólny punkt wyjścia dla analizy należy wyznaczyć OD kultur. W tej sekcji szczegółowo opisano różne metodologie, które mogą być wykorzystane do przeliczenia względnych miar gęstości komórek (tj. OD) na wartości bezwzględne liczby komórek w jednostce objętości. Pomiar OD750 jest często stosowany do wyznaczania gęstości komórek w kulturach cyjanobakterii (ze względu na absorpcję fal o długości 400-700 nm), natomiast OD600 stosuje się dla organizmów heterotroficznych. Oba pomiary dostarczają przybliżonych wartości orientacyjnych w jednostkach arbitralnych. Należy pamiętać, że wartości te mogą się znacznie różnić w zależności od użytego urządzenia.

  1. Kwantyfikacja mikroskopowa z użyciem komór licznikowych
    UWAGA: Komory licznikowe (np. ulepszona komora Neubauera/hemocytometry) stanowią prosty i niedrogi sposób określania składu ko-kultur składających się z komórek, które można łatwo odróżnić morfologicznie, t. j., ze względu na kształt komórek (Rycina 1A). Składa się ona z grubej szkiełkowej lameli oraz szkiełka nakrywkowego. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostanie prawidłowo umieszczone na lameli, powstają dwie komory o precyzyjnej objętości z wygrawerowanymi siatkami (Rycina 1B-D). Poprzez odliczenie komórek w określonym obszarze siatki można obliczyć stężenie komórek w zawiesinie. Komory licznikowe są dostępne w różnych głębokościach. W zależności od wielkości komórek należy wybrać odpowiednią głębokość komory. W przypadku komórek grzybów, takich jak U. maydis lub S. cerevisiae, Głębokość 0,1 mm jest odpowiednia. Ta głębokość komory jest zbyt duża dla mniejszych komórek, takich jak sinice, przez co komórki unoszą się w komorze. Komora o głębokości 0,02 mm jest odpowiednia zarówno dla sinic, jak i dla kultur współdzielonych sinic i grzybów.
    1. Należy upewnić się, że komora licznikowa i szkiełko nakrywkowe są wolne od kurzu i komórek.
      UWAGA: Przed bezpośrednim użyciem zaleca się czyszczenie 70% (v/v) etanolem przy użyciu tkanek niepozostawiających włókien.
    2. Aby prawidłowo umieścić szkiełko nakrywkę, należy nasunąć je na dwie listwy wsporcze, wywierając niewielki nacisk, uważając jednak, aby go nie stłuc.
      UWAGA: Do tej aplikacji wymagane jest zastosowanie specjalnego, grubego szkiełka nakrywkowego (należy odnieść się do instrukcji obsługi komory). Ponieważ szkiełko nakrywkowe czasami pęka podczas montażu, zaleca się posiadanie zapasowych egzemplarzy pod ręką.
    3. Gdy szkiełko nakrywką zostanie odpowiednio ułożone, można zaobserwować tzw. pierścienie Newtona (Rycina 1B) pomiędzy dwiema szklanymi powierzchniami i że szkiełko nakrywowe nie przesuwa się już dalej.
      UWAGA: Delikatne dmuchnięcie na szkiełko nakrywką przed montażem często poprawia końcowy wynik.
    4. Dokładnie wymieszać zawiesinę komórkową i nanieść kilka mikrolitrów (~2-10 µL (w zależności od głębokości komory) zawiesiny komórkowej do krawędzi komory i poczekać, aż zostanie ona całkowicie wypełniona siłą kapilarną. Należy zastosować odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórkowej, aby umożliwić wiarygodne liczenie, np. takie, które daje od 20 do 200 komórek na jeden duży kwadrat (Rysunek 1D, czerwony prostokąt).
    5. Użyj odpowiedniego (np. 10x) obiektywu mikroskopu świetlnego (w trybie jasnego pola lub kontrastu fazowego) i ustaw ostrość na liniach siatki komory licznej. Orientację zapewnia siatka. Rozpocznij liczenie komórek w polach odpowiednich dla danej wielkości komórek.
      UWAGA: Do liczenia należy użyć pomocy technicznej, takiej jak licznik ręczny lub odpowiednia aplikacja na smartfona (np. ogólny licznik przedmiotów lub specjalistyczne aplikacje do hemocytometru oferujące niezwykle przydatne funkcje). Należy określić zasadę liczenia komórek znajdujących się na granicach siatki, aby uniknąć podwójnego liczenia. Na przykład można liczyć komórki znajdujące się na górnej i lewej krawędzi każdego kwadratu, pomijając te na prawym i dolnym brzegu. Istnieją również alternatywne zasady.16W przypadku użycia mikroskopu fluorescencyjnego komórki można również rozpoznać na podstawie ich autofluorescencji lub markerów fluorescencyjnych.
    6. Po przeliczeniu, na przykład wszystkich czterech dużych kwadratów w narożnikach, wyznacz wartość średnią dla każdego typu komórek. Na podstawie tych wartości średnich, pola powierzchni wykorzystanego kwadratu oraz głębokości danej komory (należy sprawdzić informacje producenta), oblicz stężenia komórek (patrz Reprezentatywne wyniki).
      UWAGA: W zależności od wielkości komórek do liczenia można wykorzystać różne pola. W przypadku komórek drożdży i cyjanobakterii dobrze sprawdzają się cztery duże pola w narożnikach (Rycina 1D, czerwony prostokąt).
    7. Po użyciu należy wyczyścić komorę, uwzględniając wymagania dotyczące próbek (np. odpowiednio inaktywując organizmy zmodyfikowane genetycznie).
  2. Ilościowe oznaczanie za pomocą liczników cząstek
    UWAGA: W zależności od charakterystyki komórek w ko-kulturze można zastosować licznik cząsteczek w celu określenia liczebności partnerów komórkowych. Aby ta metoda była możliwa do zastosowania, komórki muszą znacznie różnić się rozmiarem; np. możliwe jest rozróżnienie komórek bakteryjnych i drożdżowych. W celu interpretacji wyników należy uwzględnić kultury akseniczne pojedynczych mikroorganizmów z konsorcjum. Ko-kultury zawierające komórki o podobnych rozmiarach lub więcej niż dwóch partnerów należy analizować zgodnie z metodologią opisaną w rozdziałach 2.1 lub 2.3.
    1. Przygotowania
      1. Dostosuj OD hodowli do poziomu 0,1, a następnie rozcieńcz próbkę 1000-krotnie w izotonicznym buforze pomiarowym (zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia) do całkowitej objętości 10 ml. Przygotuj powtórzenia techniczne w trzech kopiach dla wszystkich próbek.
      2. Wybierz odpowiednią wielkość porów kapilary do przeprowadzenia eksperymentu.
        UWAGA: Wielkość porów powinna mieścić się w zakresie wielkości najmniejszych komórek w ko-kulturze, ale powinna również umożliwiać przejście większym komórkom. Nie należy wybierać zbyt małych porów, ponieważ mogą one zostać zatkane w wyniku agregacji komórek, która może wystąpić wskutek podziału komórkowego. Dostępne wielkości porów są zróżnicowane. Kapilara o 45 µmna przykład, zaczyna wykrywać komórki o średnicy 0.7 µm. (U. maydis i S. cerevisiae 3.5 µm-5.5 µm, *S. elongatus*/Synechocystis gat. ~1-2.5 µm).
    2. Kwantyfikacja komórek w liczniku cząstek
      1. Uruchom urządzenie. Następnie przeprowadź autotest w celu kontroli jakości (skonsultuj się z instrukcją obsługi konkretnego urządzenia).
      2. Należy wprowadzić próbki do kubeczków na próbki, zabezpieczyć pokrywkę, a następnie wymieszać próbkę, lekko przechylając kubeczek.
        UWAGA: Należy starać się unikać pienienia i powstawania pęcherzyków powietrza. Do każdego pomiaru należy zawsze używać osobnego kubka. Kubki można myć i używać wielokrotnie. Należy wyrzucić kubki, jeśli pozostaną w nich nieusuwalne osady. Jeśli próbka pozostaje w kubku przez dłuższy czas, należy ją ponownie wymieszać przed pomiarem.
      3. Zapisz w zakresie 0-30 µm ze względu na fakt, że agregaty komórkowe mogą być większe niż pojedyncze komórki.
        UWAGA: W pierwszej kolejności należy przeanalizować każdą z aksenicznych kultur partnerów współhodowli, aby zapoznać się z wielkością komórek i ustalić, czy można je rozróżnić na podstawie ich rozmiaru.
      4. Po przeprowadzeniu oceny należy w ten sam sposób określić skład kokultury.
  3. Ilościowe określanie konsorcjum za pomocą cytometrii przepływowej pojedynczych komórek
    UWAGA: Cytometria przepływowa pojedynczych komórek to metoda wysokoprzepustowa, którą można wykorzystać do określenia liczby komórek poszczególnych partnerów w kokulturze, pod warunkiem, że partnerzy ci mogą być rozróżnieni na podstawie rozmiaru, właściwości rozpraszania światła i/lub fluorescencji. Co istotne, do opracowania metody niezbędne są kultury akseniczne partnerów kokultury, aby przeanalizować ich właściwości w cytometrze i odpowiednio dostosować bramki populacyjne. W przypadku szczepów posiadających reporter fluorescencyjny, jako kontrole negatywne wymagane są szczepy pozbawione tego reportera. Podstawowa znajomość obsługi cytometru ułatwi prawidłowe wdrożenie poniższego protokołu.17,18,19,20,21W tym przykładzie analizowana jest sztuczna mieszanina 3 mikroorganizmów (patrz Reprezentatywne wyniki): Synechocystis (wyrażający cytoplazmatyczny fluorofor reporterowy, mVenus) oraz dwa szczepy drożdży S. cerevisiae i U. maydisW celu precyzyjnego rozróżnienia S. cerevisiae i U. maydiswprowadzono markery fluorescencyjne w postaci cytoplazmatycznej zielonej białkowej fluorescencji (GFP) (*U. maydis* białko GFP (eGFP) oraz czerwoną białko fluorescencyjne (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) przy użyciu podstawowych technik klonowania molekularnego. Jeśli to możliwe, należy preferować szczepy z integracją reporterów w genomie, aby uniknąć konieczności stosowania ciągłej presji selekcyjnej.
    1. Przygotowanie próbek
      1. Zmierz OD kultur na określonym etapie wzrostu przeznaczonych do analizy.
      2. Dostosuj wartość OD próbek do zakresu odpowiedniego dla pomiaru. Przyjmij przybliżoną wartość OD750 od 0,05 do 0,5 dla cyjanobakterii oraz OD600 od 0,2 do 1,5 dla drożdży, stosując świeżą pożywkę (objętość końcowa: co najmniej 500 µL). W przypadku kokultur należy dążyć do uzyskania wartości OD750 między ~0,1 a 0,5 i zapisz czynnik rozcieńczenia. Do obliczeń zastosuj wzór podany w kroku 1.1.3.1. Pozwoli to zapewnić, aby liczba komórek utrzymywała się w zakresie 1 000 – 10 000 komórek/s przy szybkości przepływu wynoszącej 10 µL/min  (odpowiednio 6 000 – 60 000 komórek/µL).
        UWAGA: Do rozcieńczania można użyć pożywek lub buforów bez autofluorescencji i cząstek (np. BG-11). Należy zachować ostrożność w przypadku pożywek zawierających złożone składniki, takie jak ekstrakt drożdżowy, które mogą pojawić się w pomiarze jako cząstki.
      3. Transfer 300 µL zawiesiny komórkowej z każdej próbki do oddzielnej studzienki płytki 96-dołkowej (standardowa studzienka okrągła, przezroczysta, z płaskim dnem).
        UWAGA: Alternatywnie, w przypadku zastosowania półautomatycznego trybu analizy próbek zamiast trybu odczytu z płytki, należy przenieść 0,5–2 ml do probówki do sortowania komórek metodą FACS (fluorescence-activated cell sorting).
    2. Pomiar cytometryczny
      1. Uruchom cytometr, a następnie przeprowadź program startowy oraz kontrolę jakości (QC) zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Załaduj próbki (za pomocą automatycznego załadnika płytek lub półautomatycznego pobierania próbek) i przeprowadź analizę. Rozpocznij od próbek kontrolnych z wykorzystaniem kultur aksenicznych każdego z partnerów współuprawy, aby zidentyfikować poszczególne gatunki na podstawie ich właściwości przed próbą ich rozdzielenia w próbce współuprawy.
      3. Otwórz wykresy kropkowe i/lub histogramy dla kanałów fluorescencji oraz rozpraszania (np. wysokość [-H] lub pole [-A] rozpraszania w przód [FSC] lub rozpraszania bocznego [SSC]) istotnych dla badanych próbek.
      4. Należy zlokalizować wymaganą populację (populacje) komórek i dostosować próg odcięcia, aby wykluczyć szum techniczny oraz małe cząstki obecne w medium.
        UWAGA: Zaleca się poszukiwanie populacji komórek na wykresie kropkowym FSC-H względem FSC-width lub FSC-H względem SSC-H oraz zmianę skali z liniowej na logarytmiczną w przypadku małych komórek, takich jak bakterie (zazwyczaj 1-3 µm). Ustaw próg w kanale FSC-H lub SSC-H. Dla komórek z liczbą mniejszą niż 1 µm średnica, należy użyć fioletowego SSC (VSSC) w laserze fioletowym o długości fali 405 nm w celu uzyskania lepszej rozdzielczości.
      5. Ręcznie dostosuj wzmocnienie (gain) dla każdego interesującego kanału do zakresu od 25 do 2500. Dostosuj wzmocnienia w taki sposób, aby kontrola negatywna (np. bez znacznika fluorescencyjnego) znajdowała się w zakresie 1 x 102-1 x 103 a kontrola pozytywna (np. z markerem fluorescencyjnym) mieści się w zakresie 1 x 105-1 x 106 aby uzyskać najlepszą separację i pozostać w zakresie 1 x 101-1 x 107.
        UWAGA: Standardowe wartości przyrostów z kontroli jakości (QC) mogą być również przechowywane jako wartości referencyjne.
      6. Aby określić stężenie komórek w próbce, należy odmierzyć określoną objętość próbki, korzystając z funkcji rejestracji (np. 10 µL przy szybkości przepływu wynoszącej 10 µL/min). Następnie należy podzielić liczbę komórek zmierzoną dla tej objętości przez odnotowaną objętość, aby uzyskać liczbę komórek na µL dla każdej populacji.
        UWAGA: Przy obliczaniu stężenia komórek w kulturze/próbce należy uwzględnić początkowy czynnik rozcieńczenia.
    3. Gating/selekcja populacji komórek
      UWAGA: Niezależnie od urządzenia użytego do przeprowadzenia pomiarów, analiza i bramkowanie mogą być wykonywane w oprogramowaniu obsługującym cytometr lub w komercyjnym oprogramowaniu analitycznym, zgodnie z poniższym przykładem.22Dodatkowo analizę danych z cytometrii przepływowej przy użyciu oprogramowania nieopatentowanego można efektywnie przeprowadzić za pomocą różnych narzędzi otwartoźródłowych, takich jak FlowCytometryTools.23 lub FlowKit z wykorzystaniem FlowUtils24 pakiety w języku Python. W duchu otwartej nauki niniejszy protokół udostępnia przykładowy notatnik JupyterNotebook, który demonstruje wykorzystanie tych pakietów do podstawowej eksploracji danych. Oczywiście do analizy bioinformatycznej danych z cytometrii przepływowej równie dobrze można zastosować alternatywne oprogramowanie25.
      1. Wybierz określone populacje komórek, rysując wokół nich bramki na wykresie kropkowym lub ustawiając dzielniki bądź odcinki linii wokół pików na histogramie (Rysunek 4).
        UWAGA: Funkcja automatycznego bramowania (auto-gate) programu może służyć jako punkt odniesienia.
      2. Oddziel sygnały organizmów fototroficznych i heterotroficznych na podstawie autofluorescencji organizmu fototroficznego (wywoływanej głównie przez chlorofil) w czerwonej części widma. Przykład: użyj histogramu kanału APC-H (wzbudzenie (ex.) 638 nm, emisja (em.) 660/10 nm) i ustaw pionowy podział między prawym pikiem (fototrofy = populacja dodatnia pod kątem autofluorescencji chlorofilu) a lewym pikiem/pikami (heterotrofy = populacja ujemna pod kątem autofluorescencji chlorofilu) (Rycina 4A).
        UWAGA: Markery fluorescencyjne można również wykorzystać do rozróżnienia dwóch (lub więcej) partnerów fototroficznych w obrębie tej samej kultury (np. mVenus dla Synechocystis).
      3. Oddziel dwa organizmy heterotroficzne na podstawie ich markerów fluorescencyjnych lub właściwości rozpraszania światła (FSC, SSC, jeśli to możliwe).
        UWAGA: Separacja oparta na właściwościach rozproszenia jest możliwa tylko wtedy, gdy komórki różnią się na przykład wielkością lub morfologią, co skutkuje widocznymi zmianami w rozproszeniu (np. Synechocystiskomórki o kształcie sferycznym o rozmiarach ok. 1,5-3 µm średnica w funkcji U. maydis wydłużone komórki o długości 10 µm i około 1-2 µm średnica26).
      4. Przykład: Użyj histogramu kanału FITC-H (podstawa: 488 nm, emisja: 525/40 nm), wyświetlającego wyłącznie populację „heterotroficzną”, aby odróżnić heterotroficzne komórki zawierające GFP (np. U. maydis eGFP) oraz te bez GFP (np. S. cerevisiae RFP/mKate2) (Rycina 4B). Alternatywnie można wykorzystać histogram kanału PC5.5-H (podstawa: 561 nm, emisja: 710/50 nm), wyświetlający wyłącznie populację „heterotroficzną”, aby odróżnić heterotroficzne komórki zawierające RFP (np. *S. cerevisiae* RFP/mKate2) oraz te bez RFP (np. U. maydis GFP)Rycina 4C).
        UWAGA: Należy pamiętać, że podczas pomiaru dwa (lub więcej) różne typy komórek mogą „skleić się” ze sobą. Takie „dublety” lub „multiplety” można łatwo wykryć na wykresach kropkowych (dot plots) obu markerów fluorescencyjnych (np. APC-H względem FITC-H w celu zidentyfikowania dubletów fototrofa i heterotroficznego partnera znakowanego białkiem GFP).
      5. W celu przeprowadzenia podstawowej analizy danych w języku Python należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w tym notebooku Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
        UWAGA: Ten notatnik obsługuje trzy etapy analizy danych. i) Import danych: Import plików FCS. ii) Przeprowadzenie kontroli jakości: Sprawdzenie spójności danych oraz liczby zdarzeń. iii) Wizualizacja danych: Wykorzystanie wykresów, takich jak histogramy, wykresy punktowe i wykresy gęstości, do wizualizacji danych. Dodatkowo opisano procedurę wykonywania bramkowania (gatingu) w celu izolacji interesujących populacji w sposób odtwarzalny. Rysunek 4 jest wyświetlane.
        Aby ułatwić analizę kokultur w projektach długoterminowych, badaczowi zaleca się stosowanie powyższych metod do zliczania komórek oraz tworzenie krzywych wzorcowych w celu porównania wartości OD z bezwzględną liczbą komórek. Gęstość optyczna jest pomiarem względnym, który może różnić się w zależności od gatunku, szczepu, warunków hodowli i spektrometru. W związku z tym niezbędne jest opracowanie własnych krzywych wzorcowych, aby zapewnić dokładną konwersję wartości OD na liczbę komórek.

Schemat hemocytometru z komorą liczbową do liczenia komórek i pomiaru ich stężenia.
Rysunek 1: Mikroskopowa kwantyfikacja morfologicznie rozróżnialnych komórek. (A) Komora liczbową Neubauera. (B) Pierścienie Newtona wskazują na prawidłowe ułożenie specjalistycznego szkiełka nakrywkowego. (C) Schematyczna przedstawienie architektury komory z centralną jamą o określonej objętości do liczenia komórek. (D) Siatka przedstawionej komory Neubauera składa się z dziewięciu dużych kwadratów o powierzchni 1 mm2 (czerwone). Cztery duże kwadraty w narożnikach są dalej podzielone na 16 kwadratów (niebieskie). Centralny duży kwadrat jest podzielony na 25 kwadratów grupowych o powierzchni 0,04 mm2 (pomarańczowe). Każdy kwadrat grupowy składa się z 16 najmniejszych kwadratów (zielone). Rysunek został przygotowany na podstawie ogólnodostępnych informacji producenta. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Ustanowienie kokultur fototroficznego S. elongatus i heterotroficznych drożdży
Wcześniej przedstawiliśmy szczegółowe wyniki kokultywacji Synechococcus elongatus PCC 7942 z różnymi podszczepami S. cerevisiae. Kompleksowy opis wyników kokultur dla tej pary sinic i drożdży znajduje się w8. Ze względu na zwięzłość i dokładność wyniki te nie zostały tutaj powtórzone. W skrócie, wcześniejsze wyniki wskazują na szereg kwestii istotnych dla ustanowienia długoterminowych kokultur sinic i drożdży. Kluczową kwestią jest zdolność drożdży do przeżycia w warunkach, w których sinice stanowią jedyne źródło węgla organicznego, co w dużym stopniu zależy od wydajności, z jaką szczep drożdży potrafi wykorzystać sacharozę. Szczepy S. cerevisiae, które ewoluowały lub zostały zmodyfikowane genetycznie w celu bardziej wydajnego metabolizowania sacharozy27,28, wykazywały większą szansę na przeżycie przejścia do trybu wzrostu w kokulturze, osiągały wyższe gęstości komórkowe i wykazywały większą odporność w długoterminowych (od kilku dni do kilku tygodni) eksperymentach z kokulturami sinic8. Początkowa faza szczepienia kokultury była szczególnie istotna dla żywotności drożdży, prawdopodobnie ze względu na stresy wynikające z rozcieńczenia hodowli, zmiany składu pożywki i/lub wycofania bardziej skoncentrowanego źródła węgla. Dlatego działania mające na celu ułatwienie przejścia z bogatego pożywki do warunków minimalnej dostępności węgla podczas inicjacji kokultury mogą poprawić wydajność i powtarzalność eksperymentów (patrz krok 1.2.1.1). Dodatkowo S. cerevisiae wykazywały odpowiedzi stresowe charakterystyczne dla hiperoksji po zaszczepieniu do gęstych kultur S. elongatus, co jest zgodne z powstawaniem O2 jako głównego produktu ubocznego tlenowej fotosyntezy. W związku z tym działania mające na celu zapobieganie nadmiernemu rozrostowi partnera sinicowego i/lub stosowanie naprzemiennych cykli świetlnych „dzień/noc” mogłyby znacznie wydłużyć żywotność S. cerevisiae w długoterminowych kokulturach. Dodatkowe podsumowanie zjawisk powszechnych w kokulturach w odniesieniu do aksenicznych próbek kontrolnych znajduje się w sekcji Dyskusja.

Monitorowanie wzrostu kokultur przy użyciu różnych metodologii
W następnej sekcji opisano przykładową kwantyfikację sztucznie zmieszanego, trójskładnikowego konsorcjum Synechocystis oraz dwóch drożdżowych gatunków S. cerevisiae i U. maydis przy użyciu trzech różnych metod. Dla mieszaniny wyznaczono i dostosowano do OD 0,1 wartości OD750 (dla cyjanobakterii) oraz OD600 (dla heterotrofów) kultur pojedynczych. Kultury pojedyncze zmieszano w stosunku 1:1:1, opierając się na gęstości optycznej (co różni się od liczenia komórek, patrz wyżej). Aby ułatwić rozróżnienie drożdży w cytometrze, zastosowano szczepy reporterowe genetycznie zmodyfikowanych S. cerevisiae FY1679-O1B29 konstytutywnie produkujących cytoplazmatyczne mKate2 (genotyp: URA3Δ/pTDH3::mKate2; szczep: S. cerevisiae mKate230) oraz szczep U. maydis AB3331 konstytutywnie produkujący eGFP (genotyp: pep4Δ/pRpl40::egfp; szczep: U. maydis eGFP32). Należy zaznaczyć, że szczep cyjanobakterii posiadał plazmid replikacyjny promujący konstytutywną, silną ekspresję wersji żółtego białka fluorescencyjnego mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, szczep Synechocystis mVenus, podobnie jak w33), a ponadto wykazuje typową silną autofluorescencję ze względu na obecność aparatu fotosyntetycznego.

Ilościowe oznaczanie mikroskopowe z użyciem komór licznikowych: Wszystkie typy komórek w zastosowanej sztucznej mieszaninie trzech mikroorganizmów można łatwo rozróżnić pod mikroskopem (Rycina 2A): Synechocystis i S. cerevisiae reprezentowane są przez komórki sferyczne, które różnią się jednak znacząco pod względem średnicy (Synechocystisśrednica ok. 1,5-3 µm, S. cerevisiae: przybliżona średnica 3-6 µm), podczas gdy U. maydis komórki mają wydłużoną morfologię w kształcie cygara i długość co najmniej 10 µm (Rysunek 2A). Te wyraźne cechy morfologiczne pozwalają na dokładną kwantyfikację każdego partnera w mieszaninie. Jako przykład ilustracyjny, 37, 18, 36 i 21 S. cerevisiae komórki są zliczane odpowiednio w czterech dużych kwadratach (Rysunek 2B). Wartość średnia wynosi 28 komórek. Ponieważ duży kwadrat użytego komory licznikowej ma powierzchnię 1 mm2 a głębokość komory wynosiła 0,02 mm, co przekłada się na 28 komórek na 0.02 µLOdpowiada to 1400 komórkom/µL, co odpowiada wartości 1,4 x 106 komórek/ml. Policzono pozostałe typy komórek i odpowiednio określono ich stężenia (Rysunek 2C, Tabela 2).

Identyfikacja drobnoustrojów przy użyciu obrazowania SEM, tabeli danych, analizy wykresu kwadrantowego cytometrii przepływowej.
Rysunek 2: Mikroskopowa kwantyfikacja konsorcjum trójdzielnego składającego się z Synechocystis oraz drożdży S. cerevisiae i U. maydis. (A) Obraz mikroskopowy w kontraście różnicowym (DIC) sztucznie połączonej mieszaniny wskazanych mikroorganizmów. Wszystkie gatunki można łatwo rozróżnić na podstawie ich morfologii. Pasek skali: 10 µm. (B) Przykładowe wyniki zliczeń dla sztucznie przygotowanej mieszaniny wskazanych szczepów na podstawie kultur aksenicznych o OD wynoszącej 0.1. Przeanalizowano cztery duże kwadraty na krawędziach siatki (czerwki znacznik na Rysunku 1D). (C) Średnią wartość różnych komórek policzonych w czterech kwadratach wykorzystano do obliczenia stężenia komórek w zawiesinie za pomocą następującego równania: Wartość średnia/(głębokość komory [0.02 mm] x rozmiar liczonego kwadratu [1 mm2] x 1,000). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Ilościowe oznaczenie za pomocą liczników cząstek: Liczniki cząstek określają liczbę cząstek w zawiesinie w zależności od ich rozmiaru. W przykładowym zestawie danych wykorzystano licznik cząstek z kapilarą o średnicy 45 µm. Ponieważ komórki S. cerevisiae i U. maydis wykazują podobne wymiary, nie można ich rozróżnić w liczniku cząstek, natomiast mniejsze komórki Synechocystis mogą zostać wyraźnie odseparowane. Analiza monokultur wykazuje zatem piki w tych samych pozycjach, odpowiadające przedziałowi od 3 do 6 µm dla obu drożdży (Rysunek 3A). Podczas pomiaru przyłożone jest podciśnienie, które powoduje wniknięcie komórek do kapilary. Powoduje to krótkotrwałą zmianę oporności elektrycznej, dzięki czemu urządzenie może określić rozmiar cząstki na podstawie tej zmiany. W kulturze mieszanej można wykryć dwa wyraźne piki: jeden związany z mniejszymi komórkami sinic, a drugi reprezentujący wspólną frakcję obu gatunków drożdży (Rysunek 3B). Co istotne, oprócz pików odzwierciedlających żywe komórki, wykryto dodatkowe piki przy około 1 µm (Rysunek 3), odpowiadające szczątkom komórkowym i mniejszym cząstkom. Sygnały pojawiające się przy średnicach większych niż oczekiwano mogą być spowodowane agregacją komórek. Należy zauważyć, że kształt pików odzwierciedla homogeniczność komórek: ostry pik wskazuje na bardzo homogeniczne komórki, co jest mało prawdopodobne w przypadku kokultury. W kokulturze oczekuje się zobaczenia bardzo szerokiego piku lub nawet dwóch pików, jeśli partnerzy kokultury wyraźnie różnią się rozmiarem. Dla kultur aksenicznych grzybów heterotroficznych pik może być średnio szeroki.

Wykresy rozkładu średnicy komórek dla Synechocystis, Ustilago i Saccharomyces w analizie kokultury.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie konsorcjum trzech gatunków składającego się z Synechocystis mVenus oraz drożdży S. cerevisiae mKate2 i U. maydis eGFP przy użyciu licznika cząsteczek. (A) Wynik wizualny analiz kultur aksenicznych trzech szczepów przedstawionych na wykresach (licznik komórek z kapilarą 45 µm). (B) Przykładowy plik z wynikiem wizualnym dla analizy sztucznego konsorcjum trzech gatunków w identycznych warunkach. Licznik cząsteczek nie pozwala na rozróżnienie dwóch gatunków drożdży, które oba są reprezentowane przez drugi piki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Ilościowe oznaczenie za pomocą cytometrii pojedynczych komórek: Wykorzystując cytometr przepływowy do analizy pojedynczych komórek, można łatwo rozróżnić poszczególne populacje komórek na podstawie ich właściwości (auto-)fluorescencji oraz rozpraszania światła. Komórki fototroficzne (Synechocystis) można odróżnić od komórek heterotroficznych (U. maydis oraz S. cerevisiae) na podstawie czerwonej autofluorescencji pigmentów fotosyntetycznych, która jest mierzona w kanale APC-H (Rysunek 4A). W oparciu o tę wstępną separację komórek fototroficznych i heterotroficznych, dwie populacje heterotroficzne można rozróżnić na podstawie ich markerów fluorescencyjnych: eGFP w kanale FITC-H oraz mKate2 w kanale PC5.5 (Rysunek 4B,C). Na wykresie kropkowym przedstawiającym właściwości rozpraszania wszystkich trzech populacji (FSC-H i FSC-Width) populacje te można również odróżnić, przy jedynie niewielkich nakładaniach między nimi (Rysunek 4D).

Przy zastosowaniu tej metody analizowano 10 µL rozcieńczonych próbek przy szybkości przepływu 10 µL/min, co pozwoliło na kwantyfikację około 70 000 komórek w ciągu 1 min. Około 60% tych komórek można było przypisać do Synechocystis (4,23 x 106 komórek/mL), podczas gdy pozostałe 40% rozłożyło się równomiernie pomiędzy U. maydis (1,35 x 106 komórek/mL) i S. cerevisiae (1,36 x 106 komórek/mL, Rycina 4E, Tabela 2).

Wyniki cytometrii przepływowej; wykresy populacji komórek w kulturze mieszanej: heterotroficznych, eGFP, mKate2.
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie konsorcjum trójdzielnego składającego się z cyjanobakterii Synechocystis mVenus oraz drożdży U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 przy użyciu cytometrii przepływowej pojedynczych komórek. Przykładowe wykresy uzyskane po pomiarze kultury mieszanej Synechocystis mVenus (ciemnozielony), U. maydis eGFP (jasnozielony) i S. cerevisiae mKate2 (czerwony) w stosunku ⅓ OD750 / ⅓ OD600 / ⅓ OD600 na cytometrze (A) przedstawiający histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale APC-H (ex.: 638 nm, em.: 660/10 nm) wszystkich komórek, służący do rozróżnienia komórek fototroficznych i heterotroficznych na podstawie ich autofluorescencji. (B) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale FITC-H (ex.: 488 nm, em.: 525/40 nm) wszystkich komórek heterotroficznych, służący do rozróżnienia komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie właściwości ich zielonej fluorescencji. (C) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale PC5.5-H (ex.: 561 nm, em.: 710/50 nm) wszystkich komórek heterotroficznych, służący do rozróżnienia komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie właściwości ich czerwonej fluorescencji. (D) Wykres kropkowy sygnałów rozproszenia w kanale FSC-Width względem FSC-H, służący do identyfikacji populacji komórek bez właściwości fluorescencyjnych. (E) Statystyki populacji, w tym liczba zdarzeń, wartości procentowe, średnie arytmetyczne i odchylenia standardowe (SD) odpowiednich kanałów fluorescencji. Całkowita liczba komórek wraz z ich rozmiarem i fluorescencją została określona w objętości 10 µL przy szybkości przepływu 10 µL/min. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

W celu porównawczej wizualizacji wyników różnych metod ilościowych, wyznaczone liczby komórek przedstawiono w poniższych dwóch tabelach (Tabela 2 i Tabela 3). Końcowe stężenia komórek określone przy użyciu trzech opisanych wcześniej metod mieszczą się w podobnym zakresie dla wszystkich metod. Cytometr wskazuje największą liczbę próbek, następnie licznik cząstek i analiza mikroskopowa, przy czym między metodami występuje spadek o około jeden rząd wielkości.

Współhodowla 1:1:1FotometrCytometrLicznik cząstekKomora licznikowa do mikroskopii
OrganizmOD750/600liczenie komórekkomórek/mlliczba komórekkomórek/mlliczenie komórekkomórek/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate20.033313,6181,36 x 1061,546*2,58 x 106*1121,40 x 106
Ustilago maydis eGFP0.033313,5411,35 x 106891,11 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus0.033342,3304,23 x 1063,0945,16 x 1062713,39 x 106

Tabela 2: Porównanie różnych metod ilościowych: sztuczna kultura mieszana.Należy zauważyć, że U. maydis oraz S. cerevisiae nie można rozróżnić przy użyciu licznika cząstek (*).

Kultura jednorodnaFotometrCytometrLicznik cząstekKomora licznikowa do mikroskopii
OrganizmOD (gęstość optyczna)750/600liczenie komórekkomórek/mlliczenie komórekkomórek/mlliczba komórekkomórek/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate20.138,9363,89 x 1061,9283,21 x 1064034,03 x 106
Ustilago maydis eGFP0.136,9273,69 x 1062,4654,11 x 1063073,07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus0.1127,8641,28 x 1078,1861,36 x 1074281,07 x 107

Tabela 3: Porównanie różnych metod ilościowych: Kalibracja z kulturami pojedynczymi/aksenicznymi.

Dyskusja

Postępowanie z mikroorganizmami w kulturach jednoaksenicznych w kontekście laboratoryjnym jest znane od dziesięcioleci dla wielu modeli mikrobiologicznych. Mimo że dominującą formą życia w przyrodzie są zbiorowiska mikrobiologiczne, połączenie dwóch lub więcej partnerów w jednym naczyniu uprawowym jest mniej ugruntowane, a wyzwania wynikają z luk w istniejącej wiedzy i metodologii. Trudniej jest również przewidzieć zachowanie komórek w społeczności, ponieważ między komórkami zachodzą emergentne interakcje i wymiana metabolitów, co silnie wpływa na los kokultury34,35. W związku z tym ustanowienie wspólnej kultury nie jest trywialne, w tym na poziomie definicji pożywki wzrostowej, identyfikacji wspólnych warunków wzrostu, międzygatunkowej wymiany śladowych metabolitów/sygnałów i wynikającego z tego składu kokultury w czasie. Postęp, jaki dokonał się w ostatnich latach w łączeniu fototroficznych, wydzielających cukier sinic z heterotroficznymi partnerami, pozwala teraz wydedukować pierwsze zasady i metodologię, które mogą stanowić pomocną wskazówkę przy projektowaniu nowych par kohodowlanych. W oparciu o tę wiedzę, w pierwszej części niniejszego protokołu przedstawiono wytyczne krok po kroku dotyczące łączenia kokultur zawierających sinicę cyjanobakterię wydzielającą sacharozę i jedne lub więcej drożdży.

Jedną z kluczowych kwestii przy pierwszej próbie ustanowienia wspólnej kultury między niespokrewnionymi mikroorganizmami jest skład wspólnej pożywki, która spełnia wszystkie wymagania dotyczące składników odżywczych dla dwóch lub więcej gatunków. Ze względu na ograniczenia przestrzenne nie jest możliwe przedstawienie tutaj w pełni szczegółowego protokołu dla tego procesu, który w niektórych przypadkach może również wymagać wysokiego stopnia dostosowania, ale zamiast tego poniżej przedstawiono ważne kwestie, o których należy pamiętać. Jedno z prostych początkowych podejść polega na porównaniu typowej pożywki wzrostowej sinic (np. BG11; patrz Tabela 1) z dowolnymi ustalonymi minimalnymi pożywkami złożonymi dla interesujących gatunków heterotroficznych. Uzupełnienie wzorcowej pożywki sinicowej wszelkimi brakującymi składnikami, które są zawarte w pożywce heterotroficznej minimalnej, jest dobrym punktem wyjścia do wstępnych badań 8,36. Należy pamiętać, że ponieważ minimalne pożywki są często uzupełniane znaczącym źródłem węgla organicznego dla wzrostu heterotroficznego (np. 1%-4% glukozy), często są one zaprojektowane tak, aby wspierać wyższą gęstość komórek heterotrofalnych, niż jest to prawdopodobne w początkowych eksperymentach z kokulturą. Podobnie, niektóre popularne składniki pożywki mogą również działać jako źródło węgla organicznego niezależnie od fotosyntezy dostarczanej przez partnera cyjanobakteryjnego (np. cytrynian), co może komplikować późniejszą analizę kokultur sinic/heterotrofów. W związku z tym może nie być konieczne uzupełnianie minimalnej pożywki sinicowej o pełną koncentrację brakujących elementów podczas projektowania pożywki do kohodowli. Na przykład wiele organizmów różni się efektywnością wykorzystania różnych form azotu środowiskowego (np. N2, azotan, azotyny, mocznik) i może być całkowicie niezdolnych do wykorzystania niektórych bardziej utlenionych źródeł azotu. Podobnie wiele drobnoustrojów może wymagać suplementacji niezbędnych witamin (np. witaminy B12), kofaktorów lub aminokwasów egzogennych, ponieważ brakuje im kompletnych szlaków biosyntezy do bezpośredniej syntezy tych związków. Z tych powodów najbardziej praktyczne może być rozpoczęcie od prostego "połączenia" ustalonej minimalnej pożywki partnera sinicowego (np. BG11) z dobrze zdefiniowaną minimalną pożywką heterotrofu (np. syntetyczną zdefiniowaną [SD]). Późniejsze cykle wielokrotnego usuwania/redukowania zbędnych składników mogą być wykorzystane do optymalizacji pożywki i zmniejszenia obfitości wszelkich związków, które mogą hamować wzrost jednego z partnerów. Użytecznym punktem wyjścia jest buforowanie pożywki o neutralnym lub lekko zasadowym pH, ponieważ są to warunki preferowane przez większość modelowych gatunków sinic.

W tym momencie często pomocne jest przeprowadzenie wstępnych testów wzrostu wspieranego heterotrofu w nowej pożywce do kohodowli, gdy dostarczany jest nadmiar sacharozy. Oczywiście, wybierając potencjalny heterotrof, ważne jest, aby wybrać taki, który jest zdolny do katabolizowania głównego źródła (źródeł) węgla organicznego, który będzie dostarczany przez partnera sinicowego. Warto w tym miejscu zauważyć, że sacharoza, jako dominujący węglowodan dostarczany w wielu zmodyfikowanych kulturach sinicowych/heterotroficznych4, nie jest węglowodanem tak powszechnie wykorzystywanym przez drobnoustroje heterotroficzne jak glukoza: dedykowane transportery sacharozy muszą być kodowane przez gatunki heterotroficzne lub inwertazy zewnątrzkomórkowe mogą być niezbędne do przekształcenia sacharozy we fruktozę i glukozę, które są często rozpoznawane przez transportery o wyższym powinowactwie8. Ważną obserwacją często zgłaszaną przez wiele laboratoriów badających mieszane społeczności drobnoustrojów jest to, że między partnerami fototroficznymi i heterotroficznymi pojawiają się synergie i antagonizmy wyższego rzędu 4,8,13. Na przykład inne naturalnie wydzielane metabolity (np. kwasy organiczne, zredukowane formy azotu) lub kofaktory (np. siderofory) mogą umożliwiać wyższe tempo wzrostu jednego lub obu partnerów, gdy są hodowane w tym samym podłożu w porównaniu z kontrolami aksenicznymi. I odwrotnie, donoszono, że potencjalnie szkodliwe metaboliczne produkty uboczne, takie jak hiperoksygenacja pożywki przez fotosyntetyczne rozszczepianie wody, powodują międzygatunkowe hamowanie wzrostu u jednego lub obu partnerów8. W związku z tym kontrole akseniczne mogą stanowić użyteczny punkt odniesienia, ale wydajność kokultury może różnić się od oczekiwań ze względu na te wyłaniające się właściwości.

W zależności od partnera heterotroficznego i zdolności S. elongatus do wydalania sacharozy (w zależności od poziomu indukcji, zastosowanego stężenia IPTG), należy zbadać różne proporcje obu organizmów. Sukces kultur zależy przede wszystkim od zdolności S. elongatus do utrzymania wzrostu heterotroficznego partnera (tj. czy może on wyprodukować wystarczającą ilość źródła węgla). Podczas gdy przerost szczepu heterotroficznego jest zwykle ograniczony przez brak węgla organicznego w pożywce do kohodowli, cyjanobakterie mogą wyprzedzić heterotrof, co może prowadzić do nagłych interakcji hamujących (np. warunki hiperoksyczne 8,13). Przy próbie wstępnego określenia odpowiednich proporcji gęstości komórek dla drożdży cyjanobakterii, dobrą przybliżoną zasadą jest to, że partner cyjanobakteryjny może wspierać równą komórkę objętość towarzyszących komórek heterotroficznych. Ponieważ drożdże eukariotyczne mają zwykle znacznie większą objętość komórek niż modelowe cyjanobakterie wydzielające sacharozę, może to prawdopodobnie oznaczać, że gęstość komórek sinic będzie znacznie wyższa (np. 50-100 razy w przypadku S. cerevisiae) w stanie ustalonym. Dlatego dobrym punktem wyjścia do tworzenia nowej kokultury w warunkach laboratoryjnych i gatunkowych specyficznych dla badacza byłoby obliczenie średniej objętości komórek zarówno dla cyjanobakterii, jak i drożdży (na podstawie opublikowanych wartości; np. patrz B10NUMB3R537) w celu oszacowania stosunku objętościowego. Początkowe kolby mogą być wysiewane z takim stosunkiem komórek. Aby zbadać przestrzeń roztworu, badacz może chcieć utrzymać stężenie cyjanobakterii na stałym poziomie (np. OD750 = 0,3), jednocześnie zmieniając stężenie komórek drożdży w górę lub w dół o około rząd wielkości w krokach w oparciu o przepustowość dostępną dla badacza przestrzeń do uprawy fototroficznej. Oczywiście, ta wolumetryczna "reguła kciuka" zależy od szybkości, z jaką partner fototroficzny jest zdolny do wydzielania organicznych fotosyntez (np. sacharozy), które mogą być wykorzystane przez heterotroficznego partnera. Po ustaleniu warunków wspólnej uprawy, dokładne monitorowanie wydajności wzrostu obu partnerów w czasie dostarczy cennych danych dotyczących idealnych proporcji gatunków, zwłaszcza jeśli wczesne kokultury mogą być utrzymywane przez dni lub tygodnie, co pozwoli badaczowi określić stosunek stanu ustalonego osiągnięty pod koniec kokultury. Informacje te mogą być wykorzystane przy wyborze początkowej gęstości inokulacji dla każdego gatunku partnerskiego w kolejnych eksperymentach, aby pomóc kulturze szybciej osiągnąć samodzielnie ustalony idealny stosunek gatunków.

W drugiej części protokołu znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące analizy współkultur. Wiarygodna kwantyfikacja kokultur jest kluczem do ich pomyślnego wdrożenia: wzrost (lub przynajmniej aktywność metaboliczna) fototropowego partnera wydzielającego węgiel jest niezbędny do utrzymania heterotrofów. Podczas gdy stosunek cyjanobakterii do heterotrofu użytego do zaszczepienia kultury może nie zawsze być krytyczny do optymalizacji, ponieważ długoterminowe kokultury mają tendencję do zbliżania się do stabilnych proporcji, ważne może być zintegrowanie metod kontroli nieograniczonego wzrostu któregokolwiek z partnerów poprzez rozcieńczenie kultury lub enkapsulację jednego lub więcej gatunków 36,38,39,40. Jak wspomniano powyżej, produkty uboczne partnera sinicowego mogą hamować heterotrof w wysokich stężeniach (np.O2), a niektóre produkty metabolizmu heterotroficznego mogą być również szkodliwe dla zdrowia sinic. Większość opublikowanych kokultur wykorzystuje heterotrofy, które mają szybsze tempo wzrostu niż większość modelowych gatunków sinic; W związku z tym tempo wzrostu heterotroficznego jest zwykle ograniczane przez dostarczanie węgla organicznego wytwarzanego przez Sinicę. Niemniej jednak określenie dynamiki liczebności gatunków w czasie jest krytyczną wartością dla wyjaśnienia błędów w stabilności i optymalizacji pod kątem solidnych kokultur w uprawie długoterminowej.

Dostępne są protokoły oznaczania ilościowego przy użyciu komór zliczających, liczników cząstek i jednokomórkowej cytometrii przepływowej. Wszystkie techniki są cennymi narzędziami do charakteryzowania współkultur, jednak z różnymi warunkami wstępnymi, zaletami i ograniczeniami. Komory liczące mają bardzo szerokie zastosowanie do kwantyfikacji współkultur, pod warunkiem, że wszyscy partnerzy w kulturze mogą być wizualnie odróżnieni na podstawie kształtów komórek lub innych właściwości. Ogromną zaletą jest niska cena tego urządzenia, dzięki czemu jest ono w zasadzie osiągalne dla każdego laboratorium. Oprócz informacji na temat składu i proporcji różnych partnerów w kokulturze, można uzyskać wrażenie morfologii i dopasowania komórki oraz wykryć potencjalne zanieczyszczenia. Jednak zastosowanie komory liczącej jest również bardzo czasochłonne, wiąże się z dużym obciążeniem pracą i może obsługiwać tylko niską przepustowość.

Zarówno liczniki cząstek, jak i jednokomórkowa cytometria przepływowa zapewniają ogromne korzyści w postaci wysokiej przepustowości i wygodnej, oszczędzającej czas obsługi. Podczas gdy licznik komórek opiera się na wyraźnych różnicach w rozmiarach komórek partnerów we wspólnej hodowli, cytometria jednokomórkowa może również rozróżniać znaczniki fluorescencyjne, co daje możliwość ilościowego określenia kokultur z więcej niż dwoma członkami tego samego rozmiaru lub nawet dwoma różnymi mutantami tego samego organizmu na podstawie różnych markerów fluorescencyjnych. W podanym przykładzie sztucznego złożenia Synechocystis z S. cerevisiae i U. maydis, do rozróżnienia dwóch drożdży użyto wewnątrzkomórkowych reporterów fluorescencji mKate2 i eGFP. Te same reportery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do rozróżnienia dwóch genetycznie zmodyfikowanych szczepów tego samego organizmu (np . S. cerevisiae), których nie można było rozdzielić na podstawie samych ich właściwości rozpraszania światła. Podobne strategie zostały wdrożone w celu śledzenia konsorcjów bakterii syntetycznych41. W zależności od typu komórki, liczby partnerów w konsorcjum i ich potencjalnego zakresu autofluorescencji, wybór markerów fluorescencyjnych wymaga dodatkowej uwagi, aby uniknąć nakładania się jakości widmowych, szczególnie biorąc pod uwagę właściwości autofluorescencyjne cyjanobakterii. 42 Rozdział 42

Opowiadamy się tutaj za przestrzeganiem zasad przewodnich FAIR w zakresie przechowywania, zarządzania i udostępniania danych naukowych. FAIR to akronim oznaczający Findable, Accessible, Interoperable i Reusable43. W miarę jak zasady te zyskują coraz szerszą akceptację, obiecują przekształcić krajobraz badań biologicznych, promując bardziej otwarte, oparte na współpracy i efektywne podejście do zarządzania danymi i ich wykorzystania. Chociaż kluczowe elementy dostępności można zapewnić poprzez deponowanie danych w anotowanym kontekście badawczym (ARC)44, ważne jest, aby umożliwić odtworzenie etapów przetwarzania danych za pomocą oprogramowania o otwartym dostępie. Surowe pliki FCS przechowują zarówno dane, jak i metadane (informacje o laserach i detektorach, w tym długości fal, filtry itp.) dotyczące eksperymentów z cytometrią przepływową45. Mogą być ładowane i odczytywane poza zastrzeżonym oprogramowaniem, które pozwala na zaawansowaną analizę danych, np. dostępnych jest wiele pakietów do pracy z surowymi danymi w środowisku Pythona. Opracowany pakiet pokazuje, jak ładować, odczytywać i wizualizować surowe pliki .fcs zawierające dane cytometryczne poza zastrzeżonym oprogramowaniem przy użyciu jednego z wielu dostępnych pakietów w Pythonie23. Korzystanie z otwartego oprogramowania, takiego jak opisane powyżej, eliminuje konieczność ponoszenia kosztownych opłat licencyjnych związanych z oprogramowaniem własnym, zapewnia pełną kontrolę nad przetwarzaniem danych (np. transformacja, kompensacja, bramkowanie) oraz dodatkowo umożliwia integrację wielu narzędzi w jednym miejscu.

Cenną dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania cytometrii jednokomórkowej w połączeniu z sortownikiem komórek jest możliwość zbierania komórek innego typu za pomocą FACS. Może to być niezwykle cenne dla zastosowania wszelkich technologii -omicznych w celu uzyskania szczegółowego wglądu w interakcje gatunków w obrębie kokultury, takich jak RNASeq lub metabolomika. Wyraźnym minusem tych urządzeń są ich wysokie ceny, więc przystępność cenowa i dostępność takich maszyn może być pozornym ograniczeniem w niektórych laboratoriach.

Co ciekawe, bezpośrednie porównanie przedstawionych metod kwantyfikacji trzech partnerów w konsorcjum wykazało bardzo dobrą zgodność między różnymi technikami, co wskazuje, że mieszanina, która została zebrana na podstawie pomiarów OD, jest wiarygodnie określana ilościowo wszystkimi opisanymi metodami. Co ciekawe, całkowita liczba cyjanobakterii była około 3-4 razy wyższa niż liczba dwóch gatunków drożdży, co prawdopodobnie wynika z ich mniejszego rozmiaru komórek. Spostrzeżenie to jest w pełni zgodne z powszechną wiedzą, że OD nie dostarczają informacji o rzeczywistej liczbie komórek bez kalibracji46. Drożdże wykazały jednak liczebność na porównywalnym poziomie (tab. 2 i tabela 3). Ponadto porównanie z oznaczaniem ilościowym pojedynczych kultur pokazuje, że wszystkie trzy metody są wiarygodnymi narzędziami do rozróżniania typów komórek, z wyjątkiem licznika cząstek, który nie oddzielił dwóch gatunków drożdży.

Zasadniczo zastosowania cytometrii jednokomórkowej są zdecydowanie najpotężniejszym narzędziem do monitorowania składu kokultur, pozwalającym na liczenie 1000-10 000 komórek na sekundę. Jest to szczególnie ważne, jeśli liczba partnerów wzrasta do więcej niż dwóch lub jeśli partnerzy są podobni pod względem kształtu i/lub średnicy. Warto zauważyć, że istnieje wiele alternatyw, które umożliwiają monitorowanie kokultur. Wzrost drobnoustrojów znakowanych fluorescencyjnie w kokulturach można na przykład śledzić w sposób ciągły za pomocą fluorymetrii lub mikrobioreaktorów47. Są one jednak często ograniczone do wspólnej hodowli dwóch partnerów i wymagają starannego zaprojektowania eksperymentalnego, na przykład przy wyborze markerów fluorescencyjnych. Sekwencjonowanie amplikonów (sekwencjonowanie 16S rRNA) i inne techniki sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z zaawansowaną bioinformatyką to kolejna opcja charakterystyki społeczności syntetycznych 48,49,50. Techniki te są odpowiednie dla podejść o wysokiej przepustowości i mogą zajmować się ustalonymi interakcjami w długoterminowych uprawach, pytaniach ewolucyjnych lub śledzeniu mutacji z wieloma partnerami mikrobiologicznymi.

Podsumowując, uproszczone współkultury mikrobiologiczne, które są racjonalnie zaprojektowane, zapewniają potężne "oddolne" podejście do badania dynamiki międzygatunkowej, która może być trudniejsza do podejścia w społecznościach wielogatunkowych, które dominują w świecie przyrody 51,52,53. W niniejszym dokumencie przedstawiono uproszczony protokół, który może być łatwo zaadaptowany przez społeczność naukową do tworzenia i analizy nowych par cyjanobakterii i partnerów heterotroficznych. Oczywiste jest, że potrzeba wielu badań, zarówno aby wykorzystać potencjalne fundamentalne spostrzeżenia, które można uzyskać ze sztucznych współkultur mikroorganizmów, jak i określić, czy syntetycznie zaprojektowane konsorcja mikrobiologiczne mogą dorównać potencjałowi często przypisywanemu im w literaturze do zastosowań biotechnologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - SFB1535 - Project ID 458090666 (projekt B03 do KS, AM i IA), oraz Major Research Instrumentation INST 208/808-1. DCD przebywa obecnie w HHU Düsseldorf jako Mercator Fellow w SFB1535. Dodatkowego wsparcia dla EJK udzieliły nagrody National Science Foundation Awards #1845463 i #2334680.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x obiektyw Ph1Carl Zeiss AG46 04 01-9904
525/40 nm Filtr pasmowo-przepustowyBeckman Coulter, Inc.A01-1-0051Filtr FITC (w laserze 488 nm)
Filtr pasmowo-przepustowy 660/10 nmBeckman Coulter, Inc.A01-1-0055Kanał APC (w laserze 638 nm)
Filtr pasmowo-przepustowy 710/50 nmBeckman Coulter, Inc.B71092PC5.5 kanałowy (w laserze 561 nm)
Akcesoria do Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.A35473Kubki na próbki z pokrywkami
Rurka z otworem 30 μ M jak Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.C92760
Autoklawkapilarny Lab AssociatesEQM-ARBPdo sterylizacji materiału
Kolby z przegrodami ROTILABO®, Prosta szyjka, 250 mlCarl Roth GmbH + Co. KGLY95.1
BG11 / CoYBG11 komponentyróżni dostawcypatrz tabela 1 
Sterylny filtr butelkowySigmaaldrichZ222593do sterylnych pożyw, jeśli nie chcesz używać autoklawu
Kapila 45 i mikro; mOmni Life ScienceOLS 5651738
CASY Licznik komórek Model TTCSchaerfe Systems
Kubki CASYOmni Life ScienceOLS 5651794
CASYcleanOmni Life ScienceOLS 5651786Roztwór czyszczący
CASYton OmniLife ScienceOLS 5651808Roztwór izotoniczny 
Probówki wirówkowe (50 ml)SigmaaldrichCLS430828
CO2BOC270182-Ldo dostarczania kultur aksenowych i kokultur sinic
CONTRAD® 70Beckman Coulter, Inc.81911Roztwór do głębokiego czyszczenia
Szkło nakrywkowe 20 i razy; 26 x 0,4 mmVWR International GmbH631-1190Szkło nakrywkowe do komory liczenia
KuwetySarstedt 67.742
Cyjanobakterie BG-11 Roztwór słodkowodnyMerck KGaAC3061
CytExpert Software v. 2.6Beckman Coulter, Inc.Oprogramowanie aplikacyjne cytometru
CytoFLEX Sheath FluidBeckman Coulter, Inc.B51503płynu Sheat
CytoFLEX SBeckman Coulter, Inc.
Środek czyszczący DxH do Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.628022Roztwór czyszczący
Wirówka probówkowa Eppendorf (mała)LabstacCEN16-15do odwirowania mniej niż 2 ml kultury
EtanolCarl Roth GmbH + Co. KGK928.1
Probówki FACSBeckman Coulter, Inc.2523749tubki do półautomatycznego
środka czyszczącego FlowClean, 500mlBeckman Coulter, Inc.C48093Codzienny czysty roztwór
Cylindry miaroweSigmaaldrichZ131121do przygotowania pożywek
HEPPSOMerck KGaAR426725
Infors MultiTron fotoinkubatorInfors AGbiałe światło LED
IPTGMerck KGaAI6758Przygotować porcje, przechowywać w temperaturze -20° C, rozmrozić i trzymać na lodzie 
Isoton II do Multisizer 4eBeckman Coulter, Inc.8448011Roztwór izotoniczny 
Kaluza v. 2.2Beckman Coulter, Inc.B16406Oprogramowanie do analizy danych cytometrycznych
KimWipesVWR International GmbH115-2221Niestrzępiące się chusteczki
KOHMerck KGaA221473
KPO3Noah Chemicals7790-53-6
Zlewki miaroweVWR213-3747
Mikropłytka testowa, 96-dołkowa, wsuwana pokrywa, płaska podstawa, PS, przezroczystaSARSTEDT AG & Co. KG82.1581.001
Podstawa mikroskopuCarl Zeiss AG47 09 18-9902/16
Głowica mikroskopowaCarl Zeiss AG47 30 14
System oczyszczania wody Milli-QMerck MilliporeC85358
Licznik cząstek Mulitisizer 4eBeckman Coulter, Inc.B23005Alternatywa dla licznika komórek CASY
Neubauer ulepszony, głębokość 0,02 mmAssistent NiemcyKomora licząca
Neubauer ulepszona, głębokość 0,1 mmPaul Marienfeld GmbH & Co. KG640010Komora licząca
gotowa do użycia Codzienna kontrola jakości fluorosferBeckman Coulter, Inc.C65719Odniesienie do
butelek QC SCHOTTDutscher90347do przechowywania
Specord® Spektrofotometr 200 PlusAnalytic Jena GmbHOD600/750
SacharozaMerck KGaA84100
Wirówka stołowa (duża)LabstacCEN18-06Rzbiera biomasę kulturową
Drożdże Azot Zasada, bez aminokwasów, bez siarczanu amonuThermo Fisher Scientific Inc.
Cytometr BE5118011743014

Bibliografia

  1. Roell, G. W., Zha, J., Carr, R. R., Koffas, M. A., Fong, S. S., Tang, Y. J. Engineering microbial consortia by division of labor. Microb Cell Factories. 18 (1), 35(2019).
  2. Grandel, N. E., Reyes Gamas, K., Bennett, M. R. Control of synthetic microbial consortia in time, space, and composition. Trends Microbiol. 29 (12), 1095-1105 (2021).
  3. Weiland-Bräuer, N. Friends or Foes-Microbial Interactions in Nature. Biology. 10 (6), (2021).
  4. Santos-Merino, M., Yun, L., Ducat, D. C. Cyanobacteria as cell factories for the photosynthetic production of sucrose. Front Microbiol. 14, 1126032(2023).
  5. Klähn, S., Hagemann, M. Compatible solute biosynthesis in cyanobacteria. Environ Microbiol. 13 (3), 551-562 (2011).
  6. Dean, P. N., Bagwell, C. B., Lindmo, T., Murphy, R. F., Salzman, G. C. Introduction to flow cytometry data file standard. Cytometry. 11 (3), 321-322 (1990).
  7. Rippka, R., Stanier, R. Y., Deruelles, J., Herdman, M., Waterbury, J. B. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  8. Hays, S. G., Yan, L. L. W., Silver, P. A., Ducat, D. C. Synthetic photosynthetic consortia define interactions leading to robustness and photoproduction. J Biol Eng. 11, 4(2017).
  9. Ducat, D. C., Avelar-Rivas, J. A., Way, J. C., Silver, P. A. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2660-2668 (2012).
  10. Thiel, K., et al. Redirecting photosynthetic electron flux in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 by the deletion of flavodiiron protein Flv3. Microb Cell Factories. 18 (1), 189(2019).
  11. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  12. Feng, J., et al. Generation and comprehensive analysis of Synechococcus elongatus-Aspergillus nidulans co-culture system for polyketide production. Biotechnol Biofuels Bioprod. 16 (1), 32(2023).
  13. Li, T., et al. Mimicking lichens: incorporation of yeast strains together with sucrose-secreting cyanobacteria improves survival, growth, ROS removal, and lipid production in a stable mutualistic co-culture production platform. Biotechnol Biofuels. 10, 55(2017).
  14. JoVE Science Education Database. Microbiology. Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  15. Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YEPD). (9), Cold Spring Harb Protoc. (2015).
  16. Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. J Clin Lab Anal. 34 (1), e23024(2020).
  17. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eu J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  18. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eu J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).
  19. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
  20. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  21. JoVE Science Education Database. Flow Cytometry. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  22. Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
  23. Yurtsev, E., Friedman, J., Gore, J. FlowCytometryTools: Version 0.4.5. , Available from: https://pypi.org/project/FlowCytometryTools/ (2021).
  24. White, S., et al. FlowKit: A Python Toolkit for Integrated Manual and Automated Cytometry Analysis Workflows. Front Immunol. 12, 768541(2021).
  25. O'Neill, K., Aghaeepour, N., Spidlen, J., Brinkman, R. Flow cytometry bioinformatics. PLoS Comput Biol. 9 (12), e1003365(2013).
  26. Klement, T., Milker, S., Jäger, G., Grande, P. M., Domínguez de María, P., Büchs, P. Biomass pretreatment affects Ustilago maydis in producing itaconic acid. Microb Cell Factories. 11, 43(2012).
  27. Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicellularity. PLoS Biol. 9 (8), e1001122(2011).
  28. Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Improved use of a public good selects for the evolution of undifferentiated multicellularity. ELife. 2, e00367(2013).
  29. Winston, F., Dollard, C., Ricupero-Hovasse, S. L. Construction of a set of convenient Saccharomyces cerevisiae strains that are isogenic to S288C. Yeast. 11 (1), 53-55 (1995).
  30. Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
  31. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 42 (4), 1047-1063 (2001).
  32. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec), 33-38 (1996).
  33. Behle, A., Saake, P., Germann, A. T., Dienst, D., Axmann, I. M. Comparative dose-response analysis of inducible promoters in cyanobacteria. ACS Synth Biol. 9 (4), 843-855 (2020).
  34. Lindemann, S. R., et al. Engineering microbial consortia for controllable outputs. ISME J. 10 (9), 2077-2084 (2016).
  35. Duncker, K. E., Holmes, Z. A., You, L. Engineered microbial consortia: strategies and applications. Microb Cell Factories. 20 (1), 211(2021).
  36. Fedeson, D. T., Saake, P., Calero, P., Nikel, P. I., Ducat, D. C. Biotransformation of 2,4-dinitrotoluene in a phototrophic co-culture of engineered Synechococcus elongatus and Pseudomonas putida. Microb Biotechnol. 13 (4), 997-1011 (2020).
  37. Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers-the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38 (suppl_1), D750-D753 (2009).
  38. Tóth, G. S., et al. Photosynthetically produced sucrose by immobilized Synechocystis sp. PCC 6803 drives biotransformation in E. coli. Biotechnol Biofuels Bioprod. 15 (1), 146(2022).
  39. Weiss, T. L., Young, E. J., Ducat, D. C. A synthetic, light-driven consortium of cyanobacteria and heterotrophic bacteria enables stable polyhydroxybutyrate production. Metabol Eng. 44, 236-245 (2017).
  40. Zhang, L., Chen, L., Diao, J., Song, X., Shi, M., Zhang, W. Construction and analysis of an artificial consortium based on the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973 to produce the platform chemical 3-hydroxypropionic acid from CO2. Biotechnol Biofuels. 13, 82(2020).
  41. Jorrin, B., et al. Stable, fluorescent markers for tracking synthetic communities and assembly dynamics. Microbiome. 12 (1), 81(2024).
  42. Yokoo, R., et al. Live-cell imaging of cyanobacteria. Photosynth Res. 126, 36-46 (2015).
  43. Wilkinson, M. D., et al. The FAIR guiding principles for scientific data management and stewardship. Sci Data. 3, 160018(2016).
  44. Venn, B., et al. Fostering the democratization of research data by using the Annotated Research Context (ARC) as practical implementation. E-Science-Tage 2021: Share Your Research Data. , (2021).
  45. Ortolani, C. The Cytometric File. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. , Springer. Cham. (2022).
  46. Beal, J., et al. Robust estimation of bacterial cell count from optical density. Communi Biol. 3 (1), 512(2020).
  47. Funke, M., et al. Microfluidic biolector-microfluidic bioprocess control in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 107 (3), 497-505 (2010).
  48. Zhang, P., Spaepen, S., Bai, Y., Hacquard, S., Garrido-Oter, R. Rbec: a tool for analysis of amplicon sequencing data from synthetic microbial communities. ISME Commun. 1 (1), 73(2021).
  49. Ezzamouri, B., Shoaie, S., Ledesma-Amaro, R. Synergies of systems biology and synthetic biology in human microbiome studies. Front Microbiol. 12, 681982(2021).
  50. Zaramela, L. S., Tjuanta, M., Moyne, O., Neal, M., Zengler, K. synDNA-a synthetic DNA spike-in method for absolute quantification of shotgun metagenomic sequencing. mSystems. 7 (6), e0044722(2022).
  51. Bittihn, P., Din, M. O., Tsimring, L. S., Hasty, J. Rational engineering of synthetic microbial systems: from single cells to consortia. Curr Opin Microbiol. 45, 92-99 (2018).
  52. San León, D., Nogales, J. Toward merging bottom-up and top-down model-based designing of synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 69, 102169(2022).
  53. Fedeson, D. T., Ducat, D. C. Symbiotic Interactions of Phototrophic Microbes: Engineering Synthetic Consortia for Biotechnology. Role of Microbial Communities for Sustainability. , Springer. Singapore. (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie kokulturysinice wydzielające sacharozęmikroby fototroficznekonsorcja mikrobiologicznecytometria przepływowaliczenie komórekznakowanie fluorescencyjneliczenie cząstekkwantyfikacja mikroskopowa
Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.