Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Streszczenie

Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na zrównoważone biotechnologie, mieszane konsorcja zawierające fototroficzne mikroby i heterotroficzne gatunki partnerskie są badane jako metoda bioprodukcji napędzanej energią słoneczną. Jedno z podejść polega na wykorzystaniu cyjanobakterii wiążących CO₂ , które wydzielają węgiel organiczny w celu wsparcia metabolizmu współhodowanego heterotrofu, który z kolei przekształca węgiel w towary lub usługi o wyższej wartości. W niniejszym protokole przedstawiono opis techniczny, który ma pomóc eksperymentatorowi w ustanowieniu wspólnej kultury łączącej szczep sinic wydzielający sacharozę z partnerem (partnerami) grzyba, reprezentowanym przez modelowe gatunki drożdży. Protokół opisuje kluczowe warunki wstępne dla ustanowienia wspólnej kultury: określenie składu pożywki, monitorowanie cech wzrostu poszczególnych partnerów oraz analiza mieszanych kultur z wieloma gatunkami połączonymi w tym samym naczyniu wzrostowym. Podsumowano podstawowe techniki laboratoryjne do monitorowania kohodowli, w tym mikroskopię, licznik komórek i jednokomórkową cytometrię przepływową, a także przedstawiono przykłady niezastrzeżonego oprogramowania do analizy danych z plików standardowej cytometrii przepływowej surowej (FCS) zgodnie z zasadami FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable). Na koniec zamieszczono komentarz na temat wąskich gardeł i pułapek często napotykanych podczas prób ustanowienia wspólnej kultury z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier i nowym heterotroficznym partnerem. Protokół ten stanowi zasób dla naukowców próbujących ustalić nową parę współhodowanych drobnoustrojów, która obejmuje cyjanobakterię i drobnoustroję heterotroficzną.

Wprowadzenie

Dzięki szybkiemu rozwojowi narzędzi genomicznych i technologii DNA w ostatnich latach, wysiłki bioinżynieryjne są coraz częściej w stanie uznać mieszane społeczności mikrobów za opłacalne dla strategii bioprodukcji, zamiast skupiać się wyłącznie na kulturach aksonicznych. Konsorcja mikrobiologiczne mają wiele potencjalnych zalet w stosunku do kultur jednogatunkowych, w tym specjalizację i podział pracy, zdolność adaptacji i wytrzymałość oraz efektywność wykorzystania substratów¹. Jednak przewidywalna inżynieria konsorcjów wielogatunkowych jest skomplikowana przez niepewności spowodowane zachowaniami wyższego rzędu, które wyłaniają się z interakcji międzygatunkowych². Sygnalizacja międzygatunkowa i wymiana metabolitów leżą u podstaw zasady podziału pracy, ale prowadzą również do nieoczekiwanych synergii i antagonizmów między uczestnikami konsorcjów³. Znaczny postęp w tej dziedzinie jest konieczny, jeśli można w pełni wykorzystać potencjał mieszanych konsorcjów mikrobiologicznych, w tym wykorzystanie elastycznych platform kohodowli z 2 i 3 partnerami, które można wykorzystać do lepszego scharakteryzowania i zrozumienia interaktywności drobnoustrojów od "dołu do góry".

Obecnie w tej dziedzinie używa się kilku dominujących typów platform kokulturowych, w tym uzupełniających partnerów auksotroficznych i mikrobów, które wydzielają metabolity, które są ogólnie korzystne dla szerokiego zakresu gatunków drobnoustrojów. W tej drugiej kategorii cyjanobakterie zostały zmodyfikowane tak, aby stały się ulepszonymi producentami pierwotnymi poprzez wprowadzenie szlaków, które prowadzą do wydzielania łatwo metabolizowanych węglowodanów, a obecnie są badane w różnych racjonalnie zaprojektowanych konsorcjach. Krótko mówiąc, w tak zmodyfikowanych zbiorowiskach mikrobiologicznych partner cyjanobakteryjny jest w stanie wykorzystywać światło i CO₂ jako główne wejściówki, a dzięki procesowi fotosyntezy tlenowej szczepy te mogą wydzielać centralne cukry węglowe jako dobro publiczne. Jedną z klas takich zmodyfikowanych szczepów sinic są te, które zostały zaprojektowane do wydzielania disacharydu sacharozy⁴. Takie szczepy prawdopodobnie odniosły sukces, ponieważ sacharoza jest metabolitem, który jest bliski centralnemu metabolizmowi węgla u wielu gatunków, a także często jest nadmiernie akumulowany jako tak zwana "kompatybilna substancja rozpuszczona", aby przystosować się do różnych środowiskowych stresów abiotycznych⁵. Minimalna liczba interwencji genetycznych może prowadzić do efektywnego wydzielania sacharozy w szeregu organizmów modelowych sinicowatych⁴.

Sinice wydzielające sacharozę są użyteczną platformą do badania racjonalnie zaprojektowanych konsorcjów mikrobiologicznych, ponieważ szeroki zakres gatunków heterotroficznych może metabolizować sacharozę jako dominujące źródło węgla i energii. Rzeczywiście, wykorzystując kilka modelowych cyjanobakterii o zdolnościach wydzielania sacharozy, wiele laboratoriów racjonalnie zaprojektowało mieszane gatunki kokultur i konsorcja, które zawierają jeden lub więcej heterotroficznych mikroorganizmów i które są ostatecznie wspierane przez podstawowe dane wejściowe światła i CO₂ bez suplementacji organicznych surowców węglowych⁴. Szczepy heterotroficzne mogą po prostu przetrwać na węglowodanach pochodzących z sinic lub mogą być wykorzystane do przekształcenia sacharozy w bioprodukty o wyższej wartości (np. paliwa, polimery, pigmenty itp.). Takie uproszczone współkultury mogą być nie tylko potencjalną strategią na rzecz zrównoważonej bioprodukcji, ale także jako platforma do badania pojawiających się interakcji między niespokrewnionymi gatunkami drobnoustrojów.

Ten artykuł wideo skupia się na metodologiach i wymaganiach wstępnych dotyczących wykorzystania cyjanobakterii produkujących cukier jako elastycznej platformy do projektowania prostych konsorcjów mikrobiologicznych, które mogą być stabilne poprzez uzupełnianie tylko lekkiego i nieorganicznego węgla wejściowego. Podczas gdy konfiguracja i monitorowanie kultur zawierających pojedyncze mikroorganizmy jest w większości proste i można je łatwo osiągnąć przy użyciu metodologii gęstości optycznej (OD) lub rozpraszania wstecznego, nie jest to wykonalne, gdy dwa lub więcej organizmów zostanie połączonych w jednym naczyniu. Głównym powodem jest to, że metody te nie rozróżniają różnych mikroorganizmów, a zatem zapewniają jedynie ogólny obraz kultury i nie rozwiązują problemu wzrostu poszczególnych organizmów. Co więcej, cyjanobakterie mają szerokie spektrum absorpcji w zakresie 400-750 nm, więc pomiar OD₆₀₀ heterotrofu doprowadziłby do fałszywych wyników z powodu fikocyjaniny (która absorbuje się w 620 nm). W związku z tym zapewniono szczegółowe protokoły tworzenia mieszanych zbiorowisk sinic i heterotrofów w laboratorium, a także przydatne protokoły ogólne do analizy wydajności tych konsorcjów w czasie. Podczas gdy protokoły koncentrują się na konkretnym parowaniu modelowych, wydzielających sacharozę gatunków sinic z jednym lub kilkoma modelowymi mikroorganizmami heterotroficznymi, celem tej pracy jest zapewnienie zasobów dla badaczy, którzy mogą chcieć zaprojektować nowe pary gatunków i przyspieszyć fazę optymalizacji w celu ustanowienia takich kultur. W związku z tym, oprócz protokołów specyficznych dla gatunku, zawarte są informacje i strategie, które można wykorzystać do adaptacji i uogólnienia tych protokołów dla niestandardowych społeczności, zgodnie z potrzebami czytelnika.

Ze względu na elastyczność opisanej tutaj platformy do współhodowli, opisano protokoły dla wielu różnych gatunków heterotroficznych, które wcześniej były zgłaszane w ko-hodowli z cyjanobakteriami wydzielającymi cukier. Na przykład przedstawiono protokół krok po kroku dla kohodowli Synechococcus elongatus PCC 7942 z powszechnymi drożdżami laboratoryjnymi Saccharomyces cerevisiae. Jednak artykuł zawiera również protokoły, które są odpowiednie do oznaczania wydajności kokultur zawierających inne gatunki modelowe, w tym formę drożdży Ustilago maydis.

Artykuł skupia się na podstawowym zestawie protokołów niezbędnych do ustanowienia kokultury cyjanobakterii/heterotroficznej i przeprowadzenia podstawowej charakterystyki wydajności tych mieszanych konsorcjów w czasie. W szczególności położono nacisk na cytometrię przepływową pojedynczej komórki i metody liczenia cząstek odpowiednie do przeprowadzenia dokładnego spisu różnych gatunków, a także podejścia mikroskopowe do oceny morfologii komórek. Protokoły te mają służyć jako podstawa do dostosowania do potrzeb i dostępnego sprzętu. Co ważne, dostarczane są uwagi techniczne i inne kwestie, które są ważne dla ustanawiania i monitorowania kokultur w laboratorium. Na koniec zamieszczono przykłady niezastrzeżonych alternatyw dla analiz danych surowych plików FCS⁶ przy użyciu pakietów Pythona. Podsumowując, celem jest uczynienie technik współhodowli opartych na sinicach bardziej dostępnymi dla szerszego grona naukowców.

Protokół

UWAGA: Ten protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak skonfigurować i określić ilościowo kokultury wydzielających cukier S. elongatus i heterotroficzne modelowe gatunki drożdży. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ma zastosowanie do wszystkich gatunków drożdży podatnych na manipulacje genetyczne.

1. Zakładanie kokultur łączących fototroficzne cyjanobakterie i heterotroficzne drożdże

1. Preparaty do wspólnej uprawy: Pożywki i uprawa wstępna
   UWAGA: Przygotuj wszystkie podłoża i roztwory podstawowe przy użyciu ultraczystej przefiltrowanej wody. Wszystkie naczynia szklane (miarki, cylindry miarowe, butelki do przechowywania i kolby uprawowe) należy oczyścić i sterylizować w autoklawie. Sterylne podłoża można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT). Musi być dostępne urządzenie zgodne z wymogami uprawy fotoautotroficznej.
   1. Pożywkę do kohodowli należy przygotować co najmniej 3-4 dni przed planowanym rozpoczęciem kohodowli. Większość receptur podłoży do wspólnej hodowli to wariacje na temat popularnego BG-11 pożywki class<="xref">7 wykorzystywanej do rutynowej hodowli wielu gatunków modeli sinic. Ten protokół wykorzystuje wcześniej zgłoszone medium CoYBG-11 jako przykład (⁸; Patrz Tabela 1). W autoklawie (121 °C, 20 min) lub z filtrem wysterylizować (wielkość porów 0,22 μm) przygotowane podłoże, w zależności od potrzeb.
      UWAGA: Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać sugestie dotyczące dostosowania podłoża odpowiedniego dla innych par gatunków.
   2. Przygotuj odczynniki molekularne: Do indukcji ekspresji cscB i eksportu sacharozy^9,10,11, przygotuj 1 M zapas izopropylo-β-tiogalaktozydu (IPTG).
      UWAGA: Stosowanie antybiotyków podczas kohodowli nie jest optymalne, ale jeśli wszystkie szczepy mają kasety oporności, można je zastosować. W takim przypadku należy przygotować zapasy antybiotyków zgodnie z potrzebami zastosowanych szczepów.
   3. Przygotować wstępną hodowlę cyjanobakterii: Co najmniej 3 dni przed rozpoczęciem kohodowli przenieść komórki z prekultury szczepu cyjanobakterii wydzielającego cukier rosnącego w pożywce BG-11 do świeżej kolby z przegrodami zawierającej pożywkę CoY^BG-11 (tabela 1).
      UWAGA: Wiele gatunków i szczepów cyjanobakterii zostało zmodyfikowanych tak, aby wydzielały cukry. Aby zapoznać się z kompleksowym przeglądem szczepów dostępnych w momencie pisania tego tekstu, zobacz⁴. W piśmiennictwie tym wymieniono również gatunki heterotroficzne (patrz ppkt 1.1.4), w odniesieniu do których wcześniej opisano kokulturę sinic.
      1. Zmierz OD₇₅₀ w prekulturze. Obliczyć wymaganą objętość kultury wstępnej, aby osiągnąć docelową OD₇₅₀ wynoszącą 0,3 (C₁) przy użyciu równania V₁ = C₂ x V₂/C₁, gdzie C₂ = docelowa OD, V₂ = objętość docelowa, a V₁ = wymagana objętość prekultury. Na przykład podczas inokulacji 30 ml kultury (V₂) ilość x płynnej kultury do użycia wynosi V₁ (ml) = (0,3 x 30)/(zmierzona OD₇₅₀).
         UWAGA: Gęstość optyczna jest przybliżeniem gęstości komórek i zależy od warunków wzrostu i morfologii komórki; W związku z tym konieczne jest, aby badacze stosowali metody korelacji gęstości optycznej z bezwzględną liczbą komórek (patrz sekcje 2.1, 2.2 i 2.3) w celu prawidłowej oceny wydajności kohodowli. W przypadku cyjanobakterii długości fal światła w widmie aktywnym fotosyntetycznie (tj. 400-700 nm) nie powinny być używane do określania gęstości optycznej, ponieważ są one pochłaniane przez chlorofil i inne pigmenty; Dlatego rutynowo stosuje się fale dalekiej czerwieni (np. 750 nm).
      2. Inkubować rozcieńczoną kulturę w odpowiednim fotoinkubatorze. Typowa inkubacja
         warunki dla modelowych sinic są następujące: 30 °C, 150 obr./min (rzut 25 mm), 2% przestrzeni nad głową_CO2, ~200 μmol fotonów ^m-2·^s-1 Oświetlenie LED, wilgotność 75%.
         UWAGA: Suplementacja CO₂ jest wysoce zalecana w celu optymalizacji ilości uwalnianej sacharozy.
      3. Powtarzaj ten proces rozcieńczania codziennie przez co najmniej 3 dni przed założeniem kokultury, aby upewnić się, że sinice rosną wykładniczo. Pomoże to poprawić spójność wyników współhodowli między eksperymentami w różnych dniach.
   4. Co najmniej 2 dni przed rozpoczęciem kokultury należy przygotować prekulturę heterotroficzną. Jak już wspomniano, wiele gatunków i podszczepów drożdży było wcześniej hodowanych w kokulturze z sinicami^8,12,13.
      1. Przenieść komórki w rozcieńczeniu 1:100 (250 μl) z płynnej kultury gatunków heterotroficznych rosnących w bogatym bulionie uprawowym (patrz Tabela 1) do 50 ml pożywki CoY^BG-11 uzupełnionej 20 g/l sacharozy w kolbie z przegrodami o pojemności 250 ml.
      2. Inkubować przez noc w tej samej temperaturze, w jakiej panują warunki uprawy zastosowane dla partnera sinicowego.
   5. Sprawdzić OD₆₀₀ co najmniej 24 godziny przed planowanym czasem inokulacji kokultury, aby upewnić się, że szczep heterotroficzny urósł wystarczająco do potrzeb doświadczalnych (patrz ppkt 1.2): rozcieńczyć w świeżej pożywce, aby utrzymać wykładniczy wzrost, jeśli to konieczne.
2. Inokulacja i utrzymanie kohodowli
   UWAGA: Zapoznaj się z sekcją Dyskusja, aby zapoznać się ze stosunkiem inokulacji między mikroorganizmami foto- i heterotroficznymi.
   1. W celu zaszczepienia kokultury należy wzbogacić obie prekultury przez odwirowanie.
      1. Obliczyć objętość zagęszczonej zawiesiny komórkowej w celu osiągnięcia pożądanej gęstości początkowej dla obu gatunków, stosując standardowe równanie C₁ x V₁ = C₂ x V₂, gdzie C₁ = OD wzbogaconej kultury. Na przykład, aby uzyskać 25 ml kultury S. elongatus z początkowym OD₇₅₀ 0,5 (z hodowli aksonicznej 1,5 OD) i S. cerevisiae z początkową OD₆₀₀ 0,05 (z hodowli aksonicznej 0,7 OD), w oparciu o powyższe równanie, potrzebne jest 8,33 ml kultury wyjściowej S. elongatus, 1,79 ml wzbogaconej kultury heterotroficznej, i 14,88 ml pożywki^{CoY BG-11}.
      2. Odwirować kultury przy użyciu 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W sterylnych warunkach zdekantować i wyrzucić supernatant.
         UWAGA: Mniejsza względna siła odśrodkowa (RCF; xg) może być użyta do osadzania S. cerevisiae, ponieważ są to większe komórki (2x-3x razy) w porównaniu do S. elongatus, ale należy uważać, aby supernatant stał się przezroczysty. Do zbierania biomasy sinic można również użyć mniej niż 13 000 x g, ale wymagałoby to dłuższego czasu na odwirowanie (np. 4 000 x g można użyć przez 20 minut).
      3. Zawiesić osad z sinicami w 25 ml sterylnego podłoża CoY^BG-11. Stosować te same warunki wirowania, co poprzednio, następnie odrzucić i zdekantować supernatant.
      4. Powtórz ten proces dwa razy dla S. elongatus i jeszcze 4 razy dla S. cerevisiae.
         UWAGA: Ważne jest, aby umyć osady cyjanobakterii i heterotrofu (S. cerevisiae) w celu usunięcia resztek składników pożywki. Ponieważ S. cerevisiae rosła wcześniej w obecności sacharozy, zwiększona liczba etapów mycia zapewni usunięcie ewentualnego cukru resztkowego.
      5. Po zweryfikowaniu OD połączyć objętości S. elongatus i S. cerevisiae w kolbie z przegrodą o pojemności 250 ml w sterylnych warunkach i dodać CoY^BG-11 do końcowej objętości 50 ml. Rozcieńczyć z uprzednio przygotowanego 1 M zapasu IPTG do końcowego stężenia 1 mM (ma to na celu skłonienie sinic do eksportu sacharozy do pożywki). W przypadku hodowli 50 ml należy użyć 50 μl z 1 M IPTG stock.
         UWAGA: Kolby z przegrodami są zwykle lepsze, ponieważ zapewniają lepsze napowietrzanie i mieszanie sinic.
      6. Umieścić kolbę z poprzedniego kroku w oświetleniu LED o natężeniu 200 μmol fotonów·^m-2·^s-1 uzupełnionym 2% CO₂ w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem orbitalnym przy 150 obr./min (rzut 25 mm) i wilgotności 75%.
         UWAGA: Wyżej wymienione warunki mogą się różnić i muszą być zoptymalizowane w oparciu o wynik eksperymentu.
      7. Monitorować wzrost kultury poprzez jałowe pobieranie próbek (1 ml) co 12 godzin lub 24 godziny (patrz sekcja 2). Opcjonalnie można użyć próbek do wykonania standardowej mikroskopii żywych komórek oraz do określenia jednostek tworzących kolonie (CFU¹⁴) komórek drożdży na odpowiednim podłożu w celu śledzenia morfologii i dopasowania komórek oraz monitorowania ilości żywych komórek heterotroficznych, a także zanieczyszczenia.
         UWAGA: CFU nie są zalecane jako metoda precyzyjnego monitorowania gęstości komórek gatunków sinic, które mogą doświadczać znacznego stresu podczas przejścia od hodowli w pożywce ciekłej do stałej. W związku z tym należy wybrać płytki agarowe z odpowiednią bogatą pożywką dla wzrostu gatunku (partnerów) drożdży, takiego jak dekstroza peptonu z ekstraktem drożdżowym (YEPD)¹⁵.

szt. szt. Rozdział Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. TGL TGL pkt. pkt. pkt. pkt. )

związek chemiczny	BG-11 (stężenie mg/L)	CoY BG-11 (stężenie mg/L)
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	Rozdział 40	Rozdział 40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
Kwas cytrynowy	6	6
Cytrynian żelazowo-amonowy	6	6
EDTA (sól disodowa)	1	1
Na2CO3	20	20
Skład metali śladowych
H3BO3	Z drugiej strony, 2,86	Z drugiej strony, 2,86
ZnSO4·7H2O	0,222	0,222
Co(NO3)2 · 6H2O	0,0494	0,0494
MnCl2·4H2O	Pytanie 1,81	Pytanie 1,81
CuSO4 · 5H2O	0,079	0,079
NaMoO4·2H2O	0,39	0,39
dodatkowy
HEPPSO (HEPPSO	Numer katalogowy: 7160	Numer katalogowy: 7160
Drożdżowa zasada azotowa (YNB), bez aminokwasów, bez siarczanu amonu	–	tel. 3608, 120013
Miareczkowanie pH 8,3	Koh	Koh
KPO 3	–	Rozdział 118
Sacharoza (tylko dla heterotrofów)	–	Numer katalogowy: 13690

Tabela 1: Skład mediów BG-11 i CoY^BG-11. Podane stężenia zasad azotu drożdżowego w CoY^BG-11 pochodzą z opublikowanych zasobów^8,12,13.

2. Narzędzia i metodologia do monitorowania rozwoju kokultur

UWAGA: Ten protokół jest wytyczną do analizy i monitorowania wspólnej hodowli, od prostych, ale pracochłonnych technik, takich jak mikroskopia i komory liczące, po aplikacje o wysokiej przepustowości, takie jak liczniki cząstek i cytometria przepływowa jednokomórkowa. Oprócz właściwej kokultury wskazane jest uwzględnienie kultur aksenicznych pojedynczych mikroorganizmów, aby umożliwić kompleksową analizę. Jako ogólny punkt wyjścia do analizy należy określić OD kultur. W tej sekcji szczegółowo opisano różne metodologie, które można wykorzystać do przekształcenia względnych miar gęstości komórek (tj. OD) na bezwzględne wartości liczby komórek na objętość. Pomiar OD₇₅₀ jest często stosowany do określania gęstości komórek kultur sinic (ze względu na absorpcję fal o długości 400-700 nm), podczas gdy OD₆₀₀ jest używany do organizmów heterotroficznych. Oba pomiary podają przybliżone wartości orientacyjne z dowolnymi jednostkami. Należy pamiętać, że wartości mogą się znacznie różnić między instrumentami.

1. Mikroskopowa ocena ilościowa z komorami zliczającymi
   UWAGA: Komory zliczające (tj. Neubauer (ulepszone)/hemocytometry) są prostym i niedrogim sposobem do określenia składu kokultur złożonych z komórek, które można łatwo odróżnić morfologicznie, tj. po ich kształtach komórek (Rysunek 1A). Składa się z grubego szkła mikroskopowego i szkła nakrywkowego. Jeśli szkło nakrywkowe zostanie prawidłowo umieszczone na szkiełku, utworzy dwie precyzyjne komory objętościowe z wygrawerowanymi siatkami ( Rysunek 1B-D). Zliczając zdefiniowany obszar siatki, można obliczyć stężenie komórek w zawiesinie. Komory liczące są dostępne w różnych głębokościach. W zależności od grubości ogniwa należy dobrać odpowiednią głębokość komory. W przypadku komórek grzybów, takich jak U. maydis lub S. cerevisiae, dobrze sprawdza się głębokość 0,1 mm. Ta głębokość komory jest zbyt duża dla mniejszych komórek, takich jak cyjanobakterie, a komórki unoszą się w komorze. Komora o głębokości 0,02 mm jest odpowiednia zarówno dla sinic, jak i kokultur sinic i grzybów.
   1. Upewnij się, że komora licząca i szkło nakrywkowe są wolne od kurzu i komórek.
      UWAGA: Bezpośrednio przed użyciem zaleca się czyszczenie 70% etanolem (v/v) i niestrzępiącymi się chusteczkami.
   2. Aby prawidłowo ustawić szkło nakrywkowe, wsuń je na dwie pręty nośne z lekkim naciskiem, ale należy uważać, aby uniknąć pęknięcia.
      UWAGA: Do tego zastosowania wymagane jest specjalne, grube szkło osłonowe (patrz instrukcja obsługi komory). Ponieważ szkło nakrywkowe czasami pęka podczas montażu, dobrze jest mieć pod ręką zamienniki.
   3. Gdy szkło nakrywkowe jest prawidłowo umieszczone, obserwuj tak zwane pierścienie Newtona (Rysunek 1B) między dwiema powierzchniami szkła i upewnij się, że szkło nakrywkowe już się nie ślizga.
      UWAGA: Delikatne wciągnięcie szkła nakrywkowego przed montażem często poprawia wynik.
   4. Dokładnie wymieszaj zawiesinę komórkową i nałóż kilka mikrolitrów (~2-10 μl w zależności od głębokości komory) zawiesiny komórkowej na krawędź komory i pozwól jej całkowicie się napełnić za pomocą siły kapilarnej. Użyj odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny komórek, aby umożliwić wiarygodne liczenie, np. w wyniku czego uzyskasz od 20 do 200 komórek na duży kwadrat (Rysunek 1D, czerwony prostokąt).
   5. Użyj odpowiedniego (np. 10x) obiektywu mikroskopu świetlnego (tryb jasnego pola lub kontrastu fazowego) i skup się na liniach siatki komory zliczającej. Orientacja jest zapewniona przez siatkę. Rozpocznij liczenie komórek w kwadratach odpowiednich dla danego rozmiaru komórki.
      UWAGA: Korzystaj z pomocy technicznej, takiej jak ręczny licznik lub odpowiednia aplikacja na smartfona do liczenia (np. ogólny "licznik rzeczy" lub specjalistyczne aplikacje hemocytometryczne zapewniające niezwykle przydatne funkcje). Zdefiniuj regułę zliczania komórek znajdujących się na obramowaniach siatki, aby uniknąć podwójnego zliczania. Na przykład komórki znajdujące się na górnej i lewej krawędzi każdego kwadratu mogą być liczone z wyłączeniem komórek znajdujących się na prawej i dolnej krawędzi. Istnieją alternatywne reguły¹⁶. Jeśli używany jest mikroskop fluorescencyjny, komórki można również rozróżnić na podstawie ich markerów autofluorescencyjnych lub fluorescencyjnych.
   6. Po zliczeniu, na przykład, wszystkich czterech dużych kwadratów w rogach, określ średnią wartość dla każdego typu komórki. Przy tych średnich wartościach, powierzchni użytego kwadratu i głębokości danej komory (zapoznaj się z informacjami producenta), oblicz stężenia komórek (patrz Reprezentatywne wyniki).
      UWAGA: W zależności od rozmiaru komórki do liczenia można używać różnych kwadratów. W przypadku komórek drożdży i sinic dobrze działają cztery duże kwadraty w rogach (Rysunek 1D, czerwony prostokąt).
   7. Po użyciu należy oczyścić komorę, biorąc pod uwagę wymagania dotyczące próbek (np. odpowiednio unieszkodliwić organizmy zmodyfikowane genetycznie).
2. Kwantyfikacja za pomocą liczników cząstek
   UWAGA: W zależności od charakterystyki komórek w kokulturze, licznik cząstek może być zastosowany do określenia liczby komórek partnerów. Aby można było zastosować tę metodę, komórki muszą znacznie różnić się wielkością; Na przykład można osiągnąć dyskryminację komórek bakteryjnych i drożdży. Aby umożliwić interpretację wyników, należy uwzględnić hodowle akseniczne pojedynczych mikroorganizmów wchodzących w skład konsorcjum. Hodowle kozależne, w których znajdują się komórki o podobnych rozmiarach lub więcej niż 2 partnerach, powinny być analizowane zgodnie z metodologią opisaną w sekcjach 2.1 lub 2.3.
   1. Preparaty
      1. Dostosować OD kultury do 0,1 i rozcieńczyć próbkę 1,000-krotnie izotonicznym buforem miarowym (patrz instrukcja obsługi urządzenia) w całkowitej objętości 10 ml. Przygotować techniczne trzy egzemplarze wszystkich próbek.
      2. Wybierz odpowiednią wielkość porów kapilary do eksperymentu.
         UWAGA: Wielkość porów powinna mieścić się w zakresie najmniejszych komórek w kohodowli, ale powinna również obejmować większe komórki. Nie przesadzaj, ponieważ pory mogą się zatkać z powodu agregacji komórek, która może wystąpić w wyniku podziału komórek. Dostępne rozmiary porów różnią się. Na przykład kapilara o wielkości 45 μm zaczyna wykrywać komórki o średnicy 0,7 μm (U. maydis i S. cerevisiae 3,5 μm-5,5 μm, S. elongatus/Synechocystis sp. ~1-2,5 μm).
   2. Kwantyfikacja komórek w liczniku cząstek
      1. Uruchom urządzenie. Na koniec wykonaj autotest w celu kontroli jakości (zapoznaj się z instrukcją obsługi konkretnego urządzenia).
      2. Załaduj próbki do kubków na próbki, zabezpiecz pokrywę i wymieszaj próbkę, lekko przechylając kubek.
         UWAGA: Staraj się unikać pienienia i bąbelków. Zawsze używaj jednej filiżanki do każdego pomiaru. Kubki można wielokrotnie czyścić i używać ponownie. Wyrzuć kubki, jeśli pozostały jakiekolwiek pozostałości, których nie można usunąć. Jeśli próbka pozostaje w kubku przez dłuższy czas, należy ją ponownie wymieszać przed pomiarem.
      3. Zapis w zakresie 0-30 μm ze względu na to, że agregaty komórek mogą być większe niż pojedyncze komórki.
         UWAGA: Najpierw użyj każdej z kultur aksenicznych partnerów współhodowli, aby zorientować się w wielkości komórek i określić, czy można je odróżnić na podstawie ich wielkości.
      4. Po dokonaniu oceny określ skład kokultury w ten sam sposób.
3. Kwantyfikacja konsorcjum z wykorzystaniem jednokomórkowej cytometrii przepływowej
   UWAGA: Jednokomórkowa cytometria przepływowa jest metodą wysokoprzepustową, którą można zastosować do określenia liczby komórek poszczególnych partnerów we wspólnej hodowli, biorąc pod uwagę, że partnerów można rozróżnić na podstawie wielkości/ich właściwości rozpraszania światła i/lub fluorescencji. Co ważne, do ustalenia metody potrzebne są kultury aksoniczne partnerów kokulturowych, aby przeanalizować ich właściwości w cytometrze i odpowiednio dostosować bramki populacji. W przypadku szczepów posiadających reporter fluorescencyjny, szczepy bez reportera fluorescencyjnego są potrzebne jako kontrole ujemne. Podstawowa znajomość aplikacji cytometru ułatwi pomyślne wdrożenie poniższego protokołu^{17,18,19,20,21}. W tym przykładzie analizowana jest sztuczna mieszanina 3 mikroorganizmów (patrz Reprezentatywne wyniki): Synechocystis (wyrażający cytozolowy fluorofor reporterowy, mVenus) oraz dwa drożdże S. cerevisiae i U. maydis. W celu precyzyjnego rozróżnienia S. cerevisiae i U. maydis wprowadzono markery fluorescencyjne w postaci cytoplazmatycznego białka zielonej fluorescencji (GFP) (U. maydis eGFP) i białka czerwonej fluorescencji (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) przy użyciu podstawowych technik klonowania molekularnego. Jeśli to możliwe, należy preferować szczepy z genomową integracją reporterów, aby uniknąć wymogu ciągłych nacisków selekcyjnych.
   1. Przygotowanie próbki
      1. Zmierz OD kultur na danym etapie wzrostu, które mają być analizowane.
      2. Dostosuj średnicę zewnętrzną próbek do zakresu odpowiedniego do pomiaru. Użyj przybliżonego OD₇₅₀ 0,05-0,5 dla cyjanobakterii i OD₆₀₀ 0,2-1,5 dla drożdży przy użyciu świeżej pożywki hodowlanej (końcowa objętość: co najmniej 500 μl). W przypadku kokultur należy dążyć do OD₇₅₀ między ~0,1 a 0,5 i zapisać współczynnik rozcieńczenia. Do obliczeń należy zastosować wzór podany w kroku 1.1.3.1. Zapewni to, że liczba komórek pozostanie w zakresie 1 000 - 10 000 komórek/s przy natężeniu przepływu 10 μl/min (co odpowiada 6 000 - 60 000 komórek/μl).
         UWAGA: Do rozcieńczania można użyć pożywki lub buforu bez autofluorescencji i cząstek stałych (np. BG-11). Uważaj na podłoża zawierające złożone składniki, takie jak ekstrakt drożdżowy, które mogą pojawić się jako cząstki podczas pomiaru.
      3. Przenieść 300 μl zawiesiny każdej próbki do indywidualnego dołka w 96-dołkowej płytce (standardowa okrągła studzienka, przezroczysta, z płaskim dnem).
         UWAGA: Alternatywnie, przenieść 0,5-2 ml do probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), jeśli używany jest półautomatyczny tryb próbki zamiast trybu czytnika płytek.
   2. Pomiar cytometryczny
      1. Uruchom cytometr i wykonaj program rozruchowy oraz kontrolę jakości (QC) zgodnie z instrukcjami producenta.
      2. Załadować (ładowarkę płytkową lub półautomatyczne pobieranie próbek) i uruchomić próbki. Zacznij od próbek kontrolnych, używając kultur aksenicznych każdego partnera w kokulturze, aby zidentyfikować każdy gatunek na podstawie ich właściwości, zanim będziesz dążyć do oddzielenia ich w próbce współkultury.
      3. Otwarte wykresy punktowe i/lub histogramy dla kanałów fluorescencji i rozproszenia (np. rozproszenie do przodu [FSC] lub rozproszenie boczne [SSC] o wysokości [-H] lub powierzchni [-A]) istotnych dla próbek.
      4. Poszukaj wymaganych populacji komórek i dostosuj próg, aby wykluczyć szum techniczny i małe cząstki z podłoża.
         UWAGA: Zaleca się wyszukiwanie populacji komórek na wykresie punktowym FSC-H na szerokości FSC lub FSC-H na wykresie kropkowym SSC-H i dostosowanie skali od liniowej do logarytmicznej dla małych komórek, takich jak bakterie (zwykle 1-3 μm). Ustaw próg w kanale FSC-H lub SSC-H. W przypadku ogniw o średnicy mniejszej niż 1 μm należy użyć fioletowego SSC (VSSC) w fioletowym laserze o długości fali 405 nm, aby uzyskać lepszą rozdzielczość.
      5. Dostosuj wzmocnienie dla każdego kanału zainteresowania ręcznie w zakresie 25-2,500. Dostosuj wzmocnienia w taki sposób, aby kontrola ujemna (np. bez markera fluorescencyjnego) mieściła się w zakresie 1 x 10^2-1 x 10³, a kontrola pozytywna (np. ze znacznikiem fluorescencyjnym) mieściła się w zakresie 1 x 10^5-1 x 10⁶, aby uzyskać najlepszą separację i pozostać w zakresie 1 x 10^1-1 x 10⁷,
         UWAGA: Standardowe zyski z kontroli jakości mogą być również przechowywane jako dobre odniesienie.
      6. Aby określić stężenie komórek w próbce, należy zapisać zdefiniowaną objętość próbki za pomocą funkcji zapisu (np. 10 μl przy natężeniu przepływu 10 μl/min). Później podziel liczbę pojedynczych komórek zmierzoną dla tej objętości przez zarejestrowaną objętość, aby uzyskać liczbę komórek na μl dla każdej populacji.
         UWAGA: Przy obliczaniu stężenia komórek w kulturze/próbce należy pamiętać o początkowym współczynniku rozcieńczenia.
   3. Bramkowanie/selekcja populacji komórek
      UWAGA: Niezależnie od urządzenia użytego do przeprowadzenia pomiarów, analizę i bramkowanie można przeprowadzić w oprogramowaniu operacyjnym cytometru lub komercyjnym oprogramowaniu do analizy, jak pokazano poniżej²². Dodatkowo, analiza danych cytometrii przepływowej przy użyciu niezastrzeżonego oprogramowania może być efektywnie wykonana za pomocą różnych narzędzi typu open source, takich jak FlowCytometryTools²³ lub FlowKit, wykorzystujących pakiety FlowUtils^{24 w Pythonie}. W duchu otwartej nauki protokół ten udostępnia przykładowy JupyterNotebook pokazujący użycie tych pakietów do podstawowej eksploracji danych. Oczywiście, alternatywne oprogramowanie może być równie dobrze odpowiednie do wykonywania bioinformatyki cytometrii przepływowej²⁵.
      1. Wybierz określone populacje komórek, rysując bramki wokół nich na wykresie kropkowym lub ustawiając segmenty dzielnika lub linii wokół szczytów na histogramie (Rysunek 4).
         UWAGA: Funkcja automatycznej bramki programu może być używana jako odniesienie.
      2. Rozdziel sygnały dla organizmów foto- i heterotroficznych na podstawie autofluorescencji organizmu fototroficznego (spowodowanej głównie przez chlorofil) w czerwonym obszarze widma. Przykład: Użyj histogramu kanału APC-H (wzbudzenie (np.) przy 638 nm, emisja (em.) przy 660/10 nm) i ustaw pionowy separator między prawym pikiem (fototroficzny = populacja dodatnia autofluorescencji chlorofilu) a lewym pikiem/ami (heterotroficzny = populacja ujemna autofluorescencji chlorofilu) (Rysunek 4A).
         UWAGA: Markery fluorescencyjne mogą być również używane do rozróżniania dwóch (lub więcej) partnerów fototroficznych w tej samej kulturze (np. mVenus dla Synechocystis).
      3. Rozdziel dwa organizmy heterotroficzne na podstawie ich markerów fluorescencyjnych lub właściwości rozpraszania (FSC, SSC, jeśli to możliwe).
         UWAGA: Separacja na podstawie właściwości rozproszenia ma zastosowanie tylko wtedy, gdy komórki mają, na przykład, różną wielkość komórki lub morfologię, co powoduje widoczne zmiany w rozpraszaniu (np. Synechocystis: kuliste komórki o średnicy ~1,5-3 μm vs. U. maydis wydłużone komórki o długości 10 μm i średnicy około 1-2 μm²⁶).
      4. Przykład: Użyj histogramu kanału FITC-H (np. 488 nm, em.: 525/40 nm) wyświetlającego tylko populację "heterotroficzną", aby odróżnić komórki heterotroficzne zawierające GFP (np. U. maydis eGFP) od tych bez GFP (np. S. cerevisiae RFP/mKate2) (Rysunek 4B). Alternatywnie można użyć histogramu kanału PC5.5-H (np. 561 nm, em.: 710/50 nm) wyświetlającego tylko populację "heterotroficzną", aby odróżnić komórki heterotroficzne zawierające RFP (np. S. cerevisiae RFP/mKate2) od tych bez RFP (np. U. maydis GFP)(Rysunek 4C).
         UWAGA: Należy pamiętać, że dwa (lub więcej) różnych typów komórek mogą "sklejać się" ze sobą podczas pomiaru. Te "dublety" lub "wielokrotności" można łatwo wykryć na wykresach punktowych obu markerów fluorescencyjnych (np. APC-H nad FITC-H w celu identyfikacji dubletów fototroficznych i heterotroficznego partnera oznaczonego GFP).
      5. Aby uzyskać podstawową analizę danych w języku Python, postępuj zgodnie z instrukcjami w tym Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
         UWAGA: Ten notebook obsługuje trzy kroki analizy danych. i) Import danych: Import plików FCS. ii) Przeprowadź kontrolę jakości: Sprawdź integralność danych i liczbę zdarzeń. iii) Wizualizacja danych: Użyj wykresów, takich jak histogramy, wykresy punktowe i wykresy gęstości, aby zwizualizować dane. Ponadto wyświetlana jest procedura wykonywania bramkowania w celu wyizolowania interesujących populacji rozmnażających się Rysunek 4.
         Aby ułatwić analizę kokultur w projektach długoterminowych, zaleca się badaczowi stosowanie powyższych metod do liczenia liczby komórek i tworzenia standardowych krzywych w celu porównania wartości OD z bezwzględną liczbą komórek. Gęstość optyczna to względny pomiar, który może się różnić w zależności od gatunku, szczepu, warunków wzrostu i spektrometru. W związku z tym generowanie "wewnętrznych" krzywych standardowych jest niezbędne do dokładnej konwersji wartości OD na numery komórek.

Rysunek 1: Mikroskopijna kwantyfikacja morfologicznie rozróżnialnych komórek. (A) Komora liczenia Neubauera. (B) Pierścienie Newtona wskazują prawidłowe położenie specjalnego szkiełka nakrywkowego. (C) Schematyczne przedstawienie architektury komory z centralną wnęką o określonej objętości do zliczania komórek. (D) Siatka przedstawionej komory liczącej Neubauera składa się z dziewięciu dużych kwadratów o wielkości 1^mm2 (czerwony). Cztery duże kwadraty w rogach są dalej podzielone na 16 kwadratów (niebieski). Centralny duży kwadrat jest podzielony na 25 grupowych kwadratów o rozmiarze 0,04^mm2 (pomarańczowy). Każdy kwadrat grupowy składa się z 16 najmniejszych kwadratów (zielonych). Liczba ta została wygenerowana na podstawie publicznie dostępnych informacji od producentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Zakładanie kokultur fototroficznych drożdży S. elongatus i heterotroficznych
Wcześniej informowaliśmy o szczegółowych wynikach wspólnej hodowli Synechococcus elongatus PCC 7942 z różnymi podszczepami S. cerevisiae. Aby uzyskać pełny opis wyników kohodowli z tą parą sinic/drożdży, zobacz⁸. Ze względu na zwięzłość i dokładność, wyniki te nie są tutaj odtwarzane. Krótko mówiąc, wcześniejsze wyniki wskazują na szereg czynników, które są ważne dla ustanowienia długoterminowych kokultur cyjanobakterii i drożdży. Podstawowym problemem jest to, że zdolność drożdży do przetrwania w warunkach, w których cyjanobakterie dostarczają jedynych form związanego węgla, jest silnie zależna od wydajności, z jaką szczep drożdży może wykorzystywać sacharozę. Szczepy S. cerevisiae, które zostały wyewoluowane lub zmodyfikowane w celu bardziej efektywnego metabolizowania sacharozy^27,28 miały większe szanse na przetrwanie przejścia do trybu wzrostu opartego na kokulturze, osiągnęły wyższą gęstość komórek i wykazały wyższą odporność w długoterminowych (dni do tygodni) eksperymentach z kokulturą cyjanobakterii⁸. Początkowa faza inokulacji kokultury była szczególnie ważna dla żywotności drożdży, prawdopodobnie ze względu na stres związany z rozcieńczeniem hodowli, zmianą składu pożywki i/lub wycofaniem bardziej skoncentrowanego źródła węgla. W związku z tym wysiłki mające na celu ułatwienie przejścia od bogatszej pożywki wzrostowej do minimalnej dostępności węgla na początku wspólnej hodowli mogą poprawić wydajność i spójność doświadczeń (zob. etap 1.2.1.1). Dodatkowo, S. cerevisiae wykazywał reakcje stresowe zgodne z hiperoksją po zaszczepieniu w gęstych kulturach S. elongatus, co jest zgodne z tworzeniem O₂ jako głównego produktu ubocznego fotosyntezy tlenowej. W związku z tym wysiłki mające na celu zapobieżenie nadmiernemu wzrostowi partnera sinic i/lub naprzemiennym cyklom świetlnym "dzień/noc" mogą znacznie wydłużyć żywotność S. cerevisiae w długoterminowych kokulturach. Zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać dodatkowe podsumowanie zjawisk powszechnych w kokulturach w odniesieniu do aksenicznych próbek kontrolnych.

Monitorowanie wzrostu kokultur przy użyciu różnych metodologii
W poniższej sekcji opisano przykładową ocenę ilościową sztucznie zmieszanego trójstronnego konsorcjum Synechocystis i dwóch drożdży S. cerevisiae i U. maydis przy użyciu trzech różnych metod. Dla mieszaniny oznaczono OD₇₅₀ (dla sinic) i OD₆₀₀ (dla heterotrofów) pojedynczych kultur i dostosowano je do OD 0,1. Pojedyncze kultury mieszano w stosunku 1:1:1 przy użyciu gęstości optycznej (która różni się od liczby komórek, patrz wyżej). Aby ułatwić rozróżnianie drożdży w cytometrze, szczepy reporterowe genetycznie zmodyfikowanego S. cerevisiae FY1679-O1B²⁹ konstytutywnie wytwarzające cytoplazmatyczne mKate2 (genotyp: URA3Δ/pTDH3::mKate2; szczep: S. cerevisiae mKate2³⁰) i U. maydis szczep AB33³¹ konstytutywnie wytwarzające eGFP (genotyp: pep4Δ/pRpl40::egfp; szczep: U. maydis eGFP³²) zostały użyte. Warto zauważyć, że szczep sinicy został wyposażony w replikacyjny plazmid promujący konstytutywną, silną ekspresję żółtej fluorescencyjnej wersji białka mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, szczep Synechocystis mVenus, podobny do³³) i dodatkowo wykazuje typową silną autofluorescencję ze względu na obecność maszynerii fotosyntetycznej.

Mikroskopowa kwantyfikacja za pomocą komór zliczających: Wszystkie typy komórek w użytej sztucznej mieszance trzech mikroorganizmów mogą być łatwo rozróżniane mikroskopowo (Rysunek 2A): Synechocystis i S. cerevisiae są reprezentowane przez kuliste komórki, które jednak znacznie różnią się średnicą (Synechocystis: ok. średnica 1,5-3 μm, S. cerevisiae: średnica ok. 3-6 μm), podczas gdy komórki U. maydis mają wydłużoną, cygaro-kształtną morfologię i długość co najmniej 10 μm (Ryc. 2A). Te wyraźne cechy morfologiczne pozwalają na dokładne określenie ilościowe każdego partnera w mieszaninie. Jako ilustracyjny przykład, 37, 18, 36 i 21 komórek S. cerevisiae jest zliczonych odpowiednio w czterech dużych kwadratach (Rysunek 2B). Średnia wartość to 28 komórek. Ponieważ duży kwadrat zastosowanego hemocytometru ma powierzchnię 1^mm2, a głębokość komory wynosiła 0,02 mm, daje to 28 komórek na 0,02 μl. Odpowiada to 1,400 komórkom/μl, co odpowiada 1,4 x 10⁶ komórek/ml. Pozostałe typy komórek zostały policzone, a stężenia odpowiednio określone (Rysunek 2C, Tabela 2).

Rysunek 2: Mikroskopowa kwantyfikacja trójstronnego konsorcjum składającego się z Synechocystis oraz drożdży S. cerevisiae i U. maydis. (A) Obraz mikroskopowy z kontrastem różnicowym (DIC) sztucznie połączonej mieszaniny wskazanych mikroorganizmów. Wszystkie gatunki można łatwo odróżnić na podstawie ich morfologii. Podziałka skali: 10 μm. (B) Przykładowe wyniki zliczania dla sztucznie zmontowanej mieszanki wskazanych szczepów opartych na kulturach aksenicznych o OD 0,1. Przeanalizowano cztery duże kwadraty na krawędziach siatki (czerwony znak w Rysunek 1D). (C) Średnia wartość różnych komórek zliczonych w czterech kwadratach została wykorzystana do obliczenia stężenia komórek w zawiesinie za pomocą następującego równania: Wartość średnia/(głębokość komory [0,02 mm] x rozmiar policzonego kwadratu [1 mm²] x 1,000). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kwantyfikacja za pomocą liczników cząstek: Liczniki cząstek określają liczbę cząstek w zawiesinie w zależności od ich wielkości. W przykładowym zbiorze danych użyto licznika cząstek z kapilarą 45 μm. Ponieważ komórki S. cerevisiae i U. maydis mają podobne wymiary, nie można ich rozróżnić w liczniku cząstek, podczas gdy mniejsze komórki Synechocystis można wyraźnie rozdzielić. Analiza pojedynczych kultur pokazuje zatem piki w identycznych pozycjach odnoszących się do 3 do 6 μm dla dwóch drożdży (Rysunek 3A). Podczas pomiaru stosowane jest podciśnienie, które powoduje wejście komórek do kapilary. To na krótko zmienia opór elektryczny, dzięki czemu urządzenie może określić wielkość cząstek na podstawie zmiany. W mieszanej kulturze można wykryć dwa wyraźne piki, jeden związany z mniejszymi komórkami sinicowymi, a drugi reprezentujący wspólną frakcję dwóch gatunków drożdży (Ryc. 3B). Co ważne, oprócz pików odbijających żywe komórki, wykryto dodatkowe piki na poziomie około 1 μm (Rysunek 3), odpowiadające szczątkom komórek i mniejszym cząstkom. Sygnały, które pojawiłyby się przy większych średnicach niż oczekiwano, mogą być spowodowane agregacjami komórek. Warto zauważyć, że kształt pików odzwierciedla jednorodność komórek: ostry pik pokazuje bardzo jednorodne komórki, co jest mało prawdopodobne w przypadku kokultury. W kokulturze oczekuje się, że szczyt będzie bardzo szeroki, a nawet dwa, jeśli partnerzy w kokulturze wyraźnie różnią się wielkością. W przypadku aksenicznych kultur grzybów heterotroficznych szczyt może być średnio szeroki.

Rysunek 3: Kwantyfikacja trójstronnego konsorcjum składającego się z Synechocystis mVenus i drożdży S. cerevisiae mKate2 i U. maydis eGFP za pomocą licznika cząstek. (A) Wizualny wynik analiz kultur aksenicznych trzech szczepów, jak pokazano na wykresach (licznik komórek z kapilarą 45 μm). (B) Przykładowy plik wyników wizualnych do analizy sztucznego trójstronnego konsorcjum przy użyciu identycznych warunków. Licznik cząstek nie potwierdza dyskryminacji dwóch gatunków drożdży, które są reprezentowane przez drugi pik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kwantyfikacja za pomocą cytometrii jednokomórkowej: Korzystając z jednokomórkowego cytometru przepływowego, można łatwo rozróżnić różne populacje komórek na podstawie ich (auto)fluorescencji i właściwości rozpraszania światła. Komórki fototroficzne (Synechocystis) można odróżnić od komórek heterotroficznych (U. maydis i S. cerevisiae) na podstawie czerwonej autofluorescencji pigmentów fotosyntetycznych, która jest mierzona w kanale APC-H (Rysunek 4A). Opierając się na początkowym rozdzieleniu komórek fototroficznych i heterotroficznych, dwie populacje heterotroficzne można rozróżnić na podstawie ich markerów fluorescencyjnych eGFP w kanale FITC-H i mKate2 w kanale PC5.5 (Rysunek 4B, C). Na wykresie kropkowym przedstawiającym właściwości rozpraszania wszystkich trzech populacji (FSC-H i FSC-Width) można również rozróżnić populacje z niewielkimi nakładającymi się na siebie populacjami (Rysunek 4D).

Za pomocą tej metody, 10 μL rozcieńczonych próbek zostało przeanalizowanych z szybkością przepływu 10 μL/min, co pozwoliło na ilościowe określenie około 70 000 komórek w ciągu 1 minuty. Około 60% tych komórek można było przypisać do Synechocystis (4,23 x 10⁶ komórek/mL), podczas gdy pozostałe 40% było równo rozmieszczone między U. maydis (1,35 x 10⁶ komórek/mL) i S. cerevisiae (1,36 x 10⁶ komórek/ml,& #160; Rysunek 4E, Tabela 2).

Rysunek 4: Kwantyfikacja trójstronnego konsorcjum składającego się z cyjanobakterii Synechocystis mVenus oraz drożdży U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 przy użyciu jednokomórkowej cytometrii przepływowej. Przykładowe wykresy otrzymane po pomiarze mieszanej kultury Synechocystis mVenus (ciemnozielony), U. maydis eGFP (jasnozielony) i S. cerevisiae mKate2 (czerwony) w stosunku 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ na cytometrze (A) pokazujący histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale APC-H (np.: 638 nm, em.: 660/10 nm) wszystkich komórek wykorzystywanych do różnicowania komórek fototroficznych i heterotroficznych na podstawie ich autofluorescencji. (B) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale FITC-H (np. 488 nm, em.: 525/40 nm) wszystkich komórek heterotroficznych wykorzystywanych do różnicowania komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie ich właściwości zielonej fluorescencji. (C) Histogram liczby zdarzeń i fluorescencji w kanale PC5,5-H (np. 561 nm, em.: 710/50 nm) wszystkich komórek heterotroficznych używanych do różnicowania komórek U. maydis eGFP i S. cerevisiae mKate2 na podstawie ich właściwości czerwonej fluorescencji. (D) Wykres punktowy sygnałów rozpraszania w szerokości FSC nad kanałem FSC-H używany do identyfikacji populacji komórek bez właściwości fluorescencyjnych. (E) Dane statystyczne dotyczące populacji, w tym liczba zdarzeń, procenty, średnie arytmetyczne i odchylenia standardowe (SD) odpowiednich kanałów fluorescencyjnych. Całkowita ilość komórek, wraz z ich wielkością i fluorescencją, została określona w objętości 10 μL przy natężeniu przepływu 10 μL/min. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Aby porównawczo zobrazować wyniki różnych metod kwantyfikacji, określone numery komórek są przedstawione w następujących dwóch tabelach (Tabela 2 i Tabela 3). Końcowe stężenia komórek wyznaczone za pomocą trzech wcześniej opisanych metod mieszczą się w podobnym zakresie dla wszystkich metod. Cytometr zapewnia największą wielkość próbki, następnie licznik cząstek i mikroskopowe oznaczanie ilościowe, ze spadkiem o około jeden rząd wielkości między metodami.

jedn. osób jedn. osób jedn. osób TGL

Współkultura 1:1:1		Fotometr	Cytometr		Licznik cząstek		Mikroskopowa komora licząca
Organizm		OD750/600	Liczba komórek	komórek/ml	Liczba komórek	komórek/ml	Liczba komórek	komórek/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0,0333	13 618	1,36 x 106	1,546*	2.58 x 106*	Rozdział 112	1,40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0,0333	13 541	1,35 x 106			Rozdział 89	1,11 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0,0333	42 330	4,23 x 106	3 094	5,16 x 106	Rozdział 271	3,39 x 106

Tabela 2: Porównanie różnych metod kwantyfikacji: Sztuczna kultura mieszana. Zauważ, że U. maydis i S. cerevisiae nie mogą być rozróżniane za pomocą licznika cząstek (*).

osób szt. TGL osób osób TGL TGL osób

Pojedyncza kultura		Fotometr	Cytometr		Licznik cząstek		Mikroskopowa komora licząca
Organizm		OD750/600	Liczba komórek	komórek/ml	Liczba komórek	komórek/ml	Liczba komórek	komórek/ml
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0,1	38 936	3,89 x 106	1 928	3,21 x 106	Rejon 403	4,03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0,1	36 927	3,69 x 106	2 465	4,11 x 106	Lokal mieszkalny 307	3,07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0,1	127 864	1,28 x 107	8 186	1,36 x 107	Z numerem 428	1,07 x 107

Tabela 3: Porównanie różnych metod kwantyfikacji: Kalibracja z kulturami pojedynczymi/aksenicznymi.

Dyskusja

Postępowanie z mikroorganizmami w kulturach jednoaksenicznych w kontekście laboratoryjnym jest znane od dziesięcioleci dla wielu modeli mikrobiologicznych. Mimo że dominującą formą życia w przyrodzie są zbiorowiska mikrobiologiczne, połączenie dwóch lub więcej partnerów w jednym naczyniu uprawowym jest mniej ugruntowane, a wyzwania wynikają z luk w istniejącej wiedzy i metodologii. Trudniej jest również przewidzieć zachowanie komórek w społeczności, ponieważ między komórkami zachodzą emergentne interakcje i wymiana metabolitów, co silnie wpływa na los kokultury^34,35. W związku z tym ustanowienie wspólnej kultury nie jest trywialne, w tym na poziomie definicji pożywki wzrostowej, identyfikacji wspólnych warunków wzrostu, międzygatunkowej wymiany śladowych metabolitów/sygnałów i wynikającego z tego składu kokultury w czasie. Postęp, jaki dokonał się w ostatnich latach w łączeniu fototroficznych, wydzielających cukier sinic z heterotroficznymi partnerami, pozwala teraz wydedukować pierwsze zasady i metodologię, które mogą stanowić pomocną wskazówkę przy projektowaniu nowych par kohodowlanych. W oparciu o tę wiedzę, w pierwszej części niniejszego protokołu przedstawiono wytyczne krok po kroku dotyczące łączenia kokultur zawierających sinicę cyjanobakterię wydzielającą sacharozę i jedne lub więcej drożdży.

Jedną z kluczowych kwestii przy pierwszej próbie ustanowienia wspólnej kultury między niespokrewnionymi mikroorganizmami jest skład wspólnej pożywki, która spełnia wszystkie wymagania dotyczące składników odżywczych dla dwóch lub więcej gatunków. Ze względu na ograniczenia przestrzenne nie jest możliwe przedstawienie tutaj w pełni szczegółowego protokołu dla tego procesu, który w niektórych przypadkach może również wymagać wysokiego stopnia dostosowania, ale zamiast tego poniżej przedstawiono ważne kwestie, o których należy pamiętać. Jedno z prostych początkowych podejść polega na porównaniu typowej pożywki wzrostowej sinic (np. BG11; patrz Tabela 1) z dowolnymi ustalonymi minimalnymi pożywkami złożonymi dla interesujących gatunków heterotroficznych. Uzupełnienie wzorcowej pożywki sinicowej wszelkimi brakującymi składnikami, które są zawarte w pożywce heterotroficznej minimalnej, jest dobrym punktem wyjścia do wstępnych badań ^8,36. Należy pamiętać, że ponieważ minimalne pożywki są często uzupełniane znaczącym źródłem węgla organicznego dla wzrostu heterotroficznego (np. 1%-4% glukozy), często są one zaprojektowane tak, aby wspierać wyższą gęstość komórek heterotrofalnych, niż jest to prawdopodobne w początkowych eksperymentach z kokulturą. Podobnie, niektóre popularne składniki pożywki mogą również działać jako źródło węgla organicznego niezależnie od fotosyntezy dostarczanej przez partnera cyjanobakteryjnego (np. cytrynian), co może komplikować późniejszą analizę kokultur sinic/heterotrofów. W związku z tym może nie być konieczne uzupełnianie minimalnej pożywki sinicowej o pełną koncentrację brakujących elementów podczas projektowania pożywki do kohodowli. Na przykład wiele organizmów różni się efektywnością wykorzystania różnych form azotu środowiskowego (np. N₂, azotan, azotyny, mocznik) i może być całkowicie niezdolnych do wykorzystania niektórych bardziej utlenionych źródeł azotu. Podobnie wiele drobnoustrojów może wymagać suplementacji niezbędnych witamin (np. witaminy B₁₂), kofaktorów lub aminokwasów egzogennych, ponieważ brakuje im kompletnych szlaków biosyntezy do bezpośredniej syntezy tych związków. Z tych powodów najbardziej praktyczne może być rozpoczęcie od prostego "połączenia" ustalonej minimalnej pożywki partnera sinicowego (np. BG11) z dobrze zdefiniowaną minimalną pożywką heterotrofu (np. syntetyczną zdefiniowaną [SD]). Późniejsze cykle wielokrotnego usuwania/redukowania zbędnych składników mogą być wykorzystane do optymalizacji pożywki i zmniejszenia obfitości wszelkich związków, które mogą hamować wzrost jednego z partnerów. Użytecznym punktem wyjścia jest buforowanie pożywki o neutralnym lub lekko zasadowym pH, ponieważ są to warunki preferowane przez większość modelowych gatunków sinic.

W tym momencie często pomocne jest przeprowadzenie wstępnych testów wzrostu wspieranego heterotrofu w nowej pożywce do kohodowli, gdy dostarczany jest nadmiar sacharozy. Oczywiście, wybierając potencjalny heterotrof, ważne jest, aby wybrać taki, który jest zdolny do katabolizowania głównego źródła (źródeł) węgla organicznego, który będzie dostarczany przez partnera sinicowego. Warto w tym miejscu zauważyć, że sacharoza, jako dominujący węglowodan dostarczany w wielu zmodyfikowanych kulturach sinicowych/heterotroficznych⁴, nie jest węglowodanem tak powszechnie wykorzystywanym przez drobnoustroje heterotroficzne jak glukoza: dedykowane transportery sacharozy muszą być kodowane przez gatunki heterotroficzne lub inwertazy zewnątrzkomórkowe mogą być niezbędne do przekształcenia sacharozy we fruktozę i glukozę, które są często rozpoznawane przez transportery o wyższym powinowactwie⁸. Ważną obserwacją często zgłaszaną przez wiele laboratoriów badających mieszane społeczności drobnoustrojów jest to, że między partnerami fototroficznymi i heterotroficznymi pojawiają się synergie i antagonizmy wyższego rzędu ^4,8,13. Na przykład inne naturalnie wydzielane metabolity (np. kwasy organiczne, zredukowane formy azotu) lub kofaktory (np. siderofory) mogą umożliwiać wyższe tempo wzrostu jednego lub obu partnerów, gdy są hodowane w tym samym podłożu w porównaniu z kontrolami aksenicznymi. I odwrotnie, donoszono, że potencjalnie szkodliwe metaboliczne produkty uboczne, takie jak hiperoksygenacja pożywki przez fotosyntetyczne rozszczepianie wody, powodują międzygatunkowe hamowanie wzrostu u jednego lub obu partnerów⁸. W związku z tym kontrole akseniczne mogą stanowić użyteczny punkt odniesienia, ale wydajność kokultury może różnić się od oczekiwań ze względu na te wyłaniające się właściwości.

W zależności od partnera heterotroficznego i zdolności S. elongatus do wydalania sacharozy (w zależności od poziomu indukcji, zastosowanego stężenia IPTG), należy zbadać różne proporcje obu organizmów. Sukces kultur zależy przede wszystkim od zdolności S. elongatus do utrzymania wzrostu heterotroficznego partnera (tj. czy może on wyprodukować wystarczającą ilość źródła węgla). Podczas gdy przerost szczepu heterotroficznego jest zwykle ograniczony przez brak węgla organicznego w pożywce do kohodowli, cyjanobakterie mogą wyprzedzić heterotrof, co może prowadzić do nagłych interakcji hamujących (np. warunki hiperoksyczne ^8,13). Przy próbie wstępnego określenia odpowiednich proporcji gęstości komórek dla drożdży cyjanobakterii, dobrą przybliżoną zasadą jest to, że partner cyjanobakteryjny może wspierać równą komórkę objętość towarzyszących komórek heterotroficznych. Ponieważ drożdże eukariotyczne mają zwykle znacznie większą objętość komórek niż modelowe cyjanobakterie wydzielające sacharozę, może to prawdopodobnie oznaczać, że gęstość komórek sinic będzie znacznie wyższa (np. 50-100 razy w przypadku S. cerevisiae) w stanie ustalonym. Dlatego dobrym punktem wyjścia do tworzenia nowej kokultury w warunkach laboratoryjnych i gatunkowych specyficznych dla badacza byłoby obliczenie średniej objętości komórek zarówno dla cyjanobakterii, jak i drożdży (na podstawie opublikowanych wartości; np. patrz B10NUMB3R5³⁷) w celu oszacowania stosunku objętościowego. Początkowe kolby mogą być wysiewane z takim stosunkiem komórek. Aby zbadać przestrzeń roztworu, badacz może chcieć utrzymać stężenie cyjanobakterii na stałym poziomie (np. OD₇₅₀ = 0,3), jednocześnie zmieniając stężenie komórek drożdży w górę lub w dół o około rząd wielkości w krokach w oparciu o przepustowość dostępną dla badacza przestrzeń do uprawy fototroficznej. Oczywiście, ta wolumetryczna "reguła kciuka" zależy od szybkości, z jaką partner fototroficzny jest zdolny do wydzielania organicznych fotosyntez (np. sacharozy), które mogą być wykorzystane przez heterotroficznego partnera. Po ustaleniu warunków wspólnej uprawy, dokładne monitorowanie wydajności wzrostu obu partnerów w czasie dostarczy cennych danych dotyczących idealnych proporcji gatunków, zwłaszcza jeśli wczesne kokultury mogą być utrzymywane przez dni lub tygodnie, co pozwoli badaczowi określić stosunek stanu ustalonego osiągnięty pod koniec kokultury. Informacje te mogą być wykorzystane przy wyborze początkowej gęstości inokulacji dla każdego gatunku partnerskiego w kolejnych eksperymentach, aby pomóc kulturze szybciej osiągnąć samodzielnie ustalony idealny stosunek gatunków.

W drugiej części protokołu znajdują się szczegółowe instrukcje dotyczące analizy współkultur. Wiarygodna kwantyfikacja kokultur jest kluczem do ich pomyślnego wdrożenia: wzrost (lub przynajmniej aktywność metaboliczna) fototropowego partnera wydzielającego węgiel jest niezbędny do utrzymania heterotrofów. Podczas gdy stosunek cyjanobakterii do heterotrofu użytego do zaszczepienia kultury może nie zawsze być krytyczny do optymalizacji, ponieważ długoterminowe kokultury mają tendencję do zbliżania się do stabilnych proporcji, ważne może być zintegrowanie metod kontroli nieograniczonego wzrostu któregokolwiek z partnerów poprzez rozcieńczenie kultury lub enkapsulację jednego lub więcej gatunków 36,38,39,40. Jak wspomniano powyżej, produkty uboczne partnera sinicowego mogą hamować heterotrof w wysokich stężeniach (np._O2), a niektóre produkty metabolizmu heterotroficznego mogą być również szkodliwe dla zdrowia sinic. Większość opublikowanych kokultur wykorzystuje heterotrofy, które mają szybsze tempo wzrostu niż większość modelowych gatunków sinic; W związku z tym tempo wzrostu heterotroficznego jest zwykle ograniczane przez dostarczanie węgla organicznego wytwarzanego przez Sinicę. Niemniej jednak określenie dynamiki liczebności gatunków w czasie jest krytyczną wartością dla wyjaśnienia błędów w stabilności i optymalizacji pod kątem solidnych kokultur w uprawie długoterminowej.

Dostępne są protokoły oznaczania ilościowego przy użyciu komór zliczających, liczników cząstek i jednokomórkowej cytometrii przepływowej. Wszystkie techniki są cennymi narzędziami do charakteryzowania współkultur, jednak z różnymi warunkami wstępnymi, zaletami i ograniczeniami. Komory liczące mają bardzo szerokie zastosowanie do kwantyfikacji współkultur, pod warunkiem, że wszyscy partnerzy w kulturze mogą być wizualnie odróżnieni na podstawie kształtów komórek lub innych właściwości. Ogromną zaletą jest niska cena tego urządzenia, dzięki czemu jest ono w zasadzie osiągalne dla każdego laboratorium. Oprócz informacji na temat składu i proporcji różnych partnerów w kokulturze, można uzyskać wrażenie morfologii i dopasowania komórki oraz wykryć potencjalne zanieczyszczenia. Jednak zastosowanie komory liczącej jest również bardzo czasochłonne, wiąże się z dużym obciążeniem pracą i może obsługiwać tylko niską przepustowość.

Zarówno liczniki cząstek, jak i jednokomórkowa cytometria przepływowa zapewniają ogromne korzyści w postaci wysokiej przepustowości i wygodnej, oszczędzającej czas obsługi. Podczas gdy licznik komórek opiera się na wyraźnych różnicach w rozmiarach komórek partnerów we wspólnej hodowli, cytometria jednokomórkowa może również rozróżniać znaczniki fluorescencyjne, co daje możliwość ilościowego określenia kokultur z więcej niż dwoma członkami tego samego rozmiaru lub nawet dwoma różnymi mutantami tego samego organizmu na podstawie różnych markerów fluorescencyjnych. W podanym przykładzie sztucznego złożenia Synechocystis z S. cerevisiae i U. maydis, do rozróżnienia dwóch drożdży użyto wewnątrzkomórkowych reporterów fluorescencji mKate2 i eGFP. Te same reportery fluorescencyjne mogą być również wykorzystane do rozróżnienia dwóch genetycznie zmodyfikowanych szczepów tego samego organizmu (np . S. cerevisiae), których nie można było rozdzielić na podstawie samych ich właściwości rozpraszania światła. Podobne strategie zostały wdrożone w celu śledzenia konsorcjów bakterii syntetycznych⁴¹. W zależności od typu komórki, liczby partnerów w konsorcjum i ich potencjalnego zakresu autofluorescencji, wybór markerów fluorescencyjnych wymaga dodatkowej uwagi, aby uniknąć nakładania się jakości widmowych, szczególnie biorąc pod uwagę właściwości autofluorescencyjne cyjanobakterii. ^{42 Rozdział 42}

Opowiadamy się tutaj za przestrzeganiem zasad przewodnich FAIR w zakresie przechowywania, zarządzania i udostępniania danych naukowych. FAIR to akronim oznaczający Findable, Accessible, Interoperable i Reusable⁴³. W miarę jak zasady te zyskują coraz szerszą akceptację, obiecują przekształcić krajobraz badań biologicznych, promując bardziej otwarte, oparte na współpracy i efektywne podejście do zarządzania danymi i ich wykorzystania. Chociaż kluczowe elementy dostępności można zapewnić poprzez deponowanie danych w anotowanym kontekście badawczym (ARC)⁴⁴, ważne jest, aby umożliwić odtworzenie etapów przetwarzania danych za pomocą oprogramowania o otwartym dostępie. Surowe pliki FCS przechowują zarówno dane, jak i metadane (informacje o laserach i detektorach, w tym długości fal, filtry itp.) dotyczące eksperymentów z cytometrią przepływową⁴⁵. Mogą być ładowane i odczytywane poza zastrzeżonym oprogramowaniem, które pozwala na zaawansowaną analizę danych, np. dostępnych jest wiele pakietów do pracy z surowymi danymi w środowisku Pythona. Opracowany pakiet pokazuje, jak ładować, odczytywać i wizualizować surowe pliki .fcs zawierające dane cytometryczne poza zastrzeżonym oprogramowaniem przy użyciu jednego z wielu dostępnych pakietów w Pythonie²³. Korzystanie z otwartego oprogramowania, takiego jak opisane powyżej, eliminuje konieczność ponoszenia kosztownych opłat licencyjnych związanych z oprogramowaniem własnym, zapewnia pełną kontrolę nad przetwarzaniem danych (np. transformacja, kompensacja, bramkowanie) oraz dodatkowo umożliwia integrację wielu narzędzi w jednym miejscu.

Cenną dodatkową korzyścią płynącą z zastosowania cytometrii jednokomórkowej w połączeniu z sortownikiem komórek jest możliwość zbierania komórek innego typu za pomocą FACS. Może to być niezwykle cenne dla zastosowania wszelkich technologii -omicznych w celu uzyskania szczegółowego wglądu w interakcje gatunków w obrębie kokultury, takich jak RNASeq lub metabolomika. Wyraźnym minusem tych urządzeń są ich wysokie ceny, więc przystępność cenowa i dostępność takich maszyn może być pozornym ograniczeniem w niektórych laboratoriach.

Co ciekawe, bezpośrednie porównanie przedstawionych metod kwantyfikacji trzech partnerów w konsorcjum wykazało bardzo dobrą zgodność między różnymi technikami, co wskazuje, że mieszanina, która została zebrana na podstawie pomiarów OD, jest wiarygodnie określana ilościowo wszystkimi opisanymi metodami. Co ciekawe, całkowita liczba cyjanobakterii była około 3-4 razy wyższa niż liczba dwóch gatunków drożdży, co prawdopodobnie wynika z ich mniejszego rozmiaru komórek. Spostrzeżenie to jest w pełni zgodne z powszechną wiedzą, że OD nie dostarczają informacji o rzeczywistej liczbie komórek bez kalibracji⁴⁶. Drożdże wykazały jednak liczebność na porównywalnym poziomie (tab. 2 i tabela 3). Ponadto porównanie z oznaczaniem ilościowym pojedynczych kultur pokazuje, że wszystkie trzy metody są wiarygodnymi narzędziami do rozróżniania typów komórek, z wyjątkiem licznika cząstek, który nie oddzielił dwóch gatunków drożdży.

Zasadniczo zastosowania cytometrii jednokomórkowej są zdecydowanie najpotężniejszym narzędziem do monitorowania składu kokultur, pozwalającym na liczenie 1000-10 000 komórek na sekundę. Jest to szczególnie ważne, jeśli liczba partnerów wzrasta do więcej niż dwóch lub jeśli partnerzy są podobni pod względem kształtu i/lub średnicy. Warto zauważyć, że istnieje wiele alternatyw, które umożliwiają monitorowanie kokultur. Wzrost drobnoustrojów znakowanych fluorescencyjnie w kokulturach można na przykład śledzić w sposób ciągły za pomocą fluorymetrii lub mikrobioreaktorów⁴⁷. Są one jednak często ograniczone do wspólnej hodowli dwóch partnerów i wymagają starannego zaprojektowania eksperymentalnego, na przykład przy wyborze markerów fluorescencyjnych. Sekwencjonowanie amplikonów (sekwencjonowanie 16S rRNA) i inne techniki sekwencjonowania nowej generacji w połączeniu z zaawansowaną bioinformatyką to kolejna opcja charakterystyki społeczności syntetycznych 48,49,50. Techniki te są odpowiednie dla podejść o wysokiej przepustowości i mogą zajmować się ustalonymi interakcjami w długoterminowych uprawach, pytaniach ewolucyjnych lub śledzeniu mutacji z wieloma partnerami mikrobiologicznymi.

Podsumowując, uproszczone współkultury mikrobiologiczne, które są racjonalnie zaprojektowane, zapewniają potężne "oddolne" podejście do badania dynamiki międzygatunkowej, która może być trudniejsza do podejścia w społecznościach wielogatunkowych, które dominują w świecie przyrody 51,52,53. W niniejszym dokumencie przedstawiono uproszczony protokół, który może być łatwo zaadaptowany przez społeczność naukową do tworzenia i analizy nowych par cyjanobakterii i partnerów heterotroficznych. Oczywiste jest, że potrzeba wielu badań, zarówno aby wykorzystać potencjalne fundamentalne spostrzeżenia, które można uzyskać ze sztucznych współkultur mikroorganizmów, jak i określić, czy syntetycznie zaprojektowane konsorcja mikrobiologiczne mogą dorównać potencjałowi często przypisywanemu im w literaturze do zastosowań biotechnologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x obiektyw Ph1	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm Filtr pasmowo-przepustowy	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	Filtr FITC (w laserze 488 nm)
Filtr pasmowo-przepustowy 660/10 nm	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	Kanał APC (w laserze 638 nm)
Filtr pasmowo-przepustowy 710/50 nm	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 kanałowy (w laserze 561 nm)
Akcesoria do Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	A35473	Kubki na próbki z pokrywkami
Rurka z otworem 30 μ M jak Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	C92760
Autoklaw	kapilarny Lab Associates	EQM-ARBP	do sterylizacji materiału
Kolby z przegrodami ROTILABO®, Prosta szyjka, 250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 komponenty	różni dostawcy		patrz tabela 1
Sterylny filtr butelkowy	Sigmaaldrich	Z222593	do sterylnych pożyw, jeśli nie chcesz używać autoklawu
Kapila 45 i mikro; m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Licznik komórek Model TTC	Schaerfe Systems
Kubki CASY	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	Roztwór czyszczący
CASYton Omni	Life Science	OLS 5651808	Roztwór izotoniczny
Probówki wirówkowe (50 ml)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	do dostarczania kultur aksenowych i kokultur sinic
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	Roztwór do głębokiego czyszczenia
Szkło nakrywkowe 20 i razy; 26 x 0,4 mm	VWR International GmbH	631-1190	Szkło nakrywkowe do komory liczenia
Kuwety	Sarstedt	67.742
Cyjanobakterie BG-11 Roztwór słodkowodny	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		Oprogramowanie aplikacyjne cytometru
CytoFLEX Sheath Fluid	Beckman Coulter, Inc.	B51503	płynu Sheat
CytoFLEX S	Beckman Coulter, Inc.
Środek czyszczący DxH do Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	628022	Roztwór czyszczący
Wirówka probówkowa Eppendorf (mała)	Labstac	CEN16-15	do odwirowania mniej niż 2 ml kultury
Etanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
Probówki FACS	Beckman Coulter, Inc.	2523749	tubki do półautomatycznego
środka czyszczącego FlowClean, 500ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	Codzienny czysty roztwór
Cylindry miarowe	Sigmaaldrich	Z131121	do przygotowania pożywek
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron fotoinkubator	Infors AG		białe światło LED
IPTG	Merck KGaA	I6758	Przygotować porcje, przechowywać w temperaturze -20° C, rozmrozić i trzymać na lodzie
Isoton II do Multisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	8448011	Roztwór izotoniczny
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	Oprogramowanie do analizy danych cytometrycznych
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	Niestrzępiące się chusteczki
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
Zlewki miarowe	VWR	213-3747
Mikropłytka testowa, 96-dołkowa, wsuwana pokrywa, płaska podstawa, PS, przezroczysta	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
Podstawa mikroskopu	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
Głowica mikroskopowa	Carl Zeiss AG	47 30 14
System oczyszczania wody Milli-Q	Merck Millipore	C85358
Licznik cząstek Mulitisizer 4e	Beckman Coulter, Inc.	B23005	Alternatywa dla licznika komórek CASY
Neubauer ulepszony, głębokość 0,02 mm	Assistent Niemcy		Komora licząca
Neubauer ulepszona, głębokość 0,1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	Komora licząca
gotowa do użycia Codzienna kontrola jakości fluorosfer	Beckman Coulter, Inc.	C65719	Odniesienie do
butelek QC SCHOTT	Dutscher	90347	do przechowywania
Specord® Spektrofotometr 200 Plus	Analytic Jena GmbH		OD600/750
Sacharoza	Merck KGaA	84100
Wirówka stołowa (duża)	Labstac	CEN18-06R	zbiera biomasę kulturową
Drożdże Azot Zasada, bez aminokwasów, bez siarczanu amonu	Thermo Fisher Scientific Inc.